Αφηρημένο

Η πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο παχέος εντέρου (CRC) είναι γενικά κακή, λόγω της έλλειψης απλή, εύκολη, και μη επεμβατική εργαλεία για την ανίχνευση CRC κατά το αρχικό στάδιο. Η ανακάλυψη των microRNAs (miRNAs) και διαφορετικά προφίλ έκφρασης τους μεταξύ των διαφόρων ειδών των ασθενειών έχει ανοίξει ένα νέο δρόμο για τη διάγνωση των όγκων. Χτίσαμε ένα microRNA ορό υπογραφή προφίλ έκφρασης και δοκιμάζονται ειδικότητα και ευαισθησία του ως βιοδείκτη για τη διάγνωση της CRC. Μελετήσαμε επίσης πιθανό ρόλο της στην παρακολούθηση της εξέλιξης της CRC. Έχουμε πραγματοποίησε δοκιμή περίπτωση ελέγχου δύο φάσεων για τον εντοπισμό miRNAs ορού ως βιοδείκτες για CRC διάγνωση. Χρησιμοποιώντας ποσοτικές αντιδράσεις αντίστροφης αλυσίδας πολυμεράσης μεταγραφής, ελέγξαμε δέκα υποψήφιες miRNAs σε ένα σύνολο εκπαίδευσης (30 CRCs έναντι 30 ελέγχους). Ανάλυση βαθμολόγηση κινδύνου χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η διαγνωστική αξία των miRNA ορού σύστημα προφίλ. Άλλα ανεξάρτητα δείγματα, συμπεριλαμβανομένων 83 CRCs και 59 έλεγχοι, χρησιμοποιήθηκαν για την επικύρωση της διαγνωστικής μοντέλο. Στο σύνολο εκπαίδευσης, έξι miRNAs ορού (miR-21, ας-7g, miR-31, miR-92a, miR-181β, και miR-203) είχαν σημαντικά διαφορετικά επίπεδα έκφρασης μεταξύ των CRCs και υγιείς μάρτυρες. Ανάλυση βαθμολόγηση κινδύνου έδειξε ότι οι έξι-miRNA με βάση την υπογραφή βιοδείκτη είχε υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα για να διακρίνει τα δείγματα CRC από καρκίνο χωρίς ελέγχους. Οι περιοχές κάτω από την καμπύλη λειτουργικού χαρακτηριστικού δέκτη (ROC) από τα έξι-miRNA προφίλ υπογραφής ήταν 0.900 και 0.923 για τα δύο σύνολα δειγμάτων ορού, αντίστοιχα. Ωστόσο, για τα ίδια δείγματα ορού, οι περιοχές κάτω από την καμπύλη ROC που χρησιμοποιείται από το καρκινικών δεικτών καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο (CEA) και το αντιγόνο υδατάνθρακα 19-9 (CA19-9) ήταν μόνο 0.649 και 0.598, αντίστοιχα. Τα επίπεδα έκφρασης των έξι miRNAs ορού επίσης συσχετίστηκε με την εξέλιξη CRC. Έτσι, το προσδιόρισε έξι-miRNA υπογραφή μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μια μη επεμβατική βιοδεικτών για τη διάγνωση του CRC, με σχετικά υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα

Παράθεση:. Wang J, Huang Sk, Zhao Μ, Yang Μ, Zhong Jl , Gu Yy, et al. (2014) Αναγνώριση ενός Κυκλοφορούν Υπογραφή microRNA για την ανίχνευση του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (4): e87451. doi: 10.1371 /journal.pone.0087451

Επιμέλεια: Bernard Μαρί, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, Γαλλία

Ελήφθη: 30 Οκτωβρίου του 2013? Αποδεκτές: 28 Δεκέμβρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 7 του Απρίλη 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Key πρόγραμμα βασικής έρευνας της Κίνας (2007CB914700). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τρίτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στον κόσμο. Ευθύνεται για περίπου 50.000 θανάτους κάθε χρόνο και είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται [1], [2]. Εκτιμάται ότι, κάθε χρόνο, ένα και μισό εκατομμύριο νέες περιπτώσεις CRC θα διαγιγνώσκονται σε όλο τον κόσμο [2]. Μια μελέτη νηολογημένα στην Εποπτεύουσα Επιδημιολογίας του Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου και τα τελικά αποτελέσματα (SEER) βάση δεδομένων, διεξήχθη με 119.363 άνθρωποι διαγιγνώσκονται με καρκίνο του παχέος εντέρου μεταξύ 1991 και 2000. Η μελέτη διαπίστωσε ότι οι παρατηρούμενες ποσοστά επιβίωσης 5 ετών είχαν σχέση με το στάδιο της νόσου κατά τη διάγνωση? για ασθενείς που διαγνώστηκαν στο στάδιο Ι /IIa η επιβίωση ήταν πολύ καλύτερη από ό, τι για ασθενείς που διαγνώστηκαν σε μεταγενέστερα στάδια [3]. Αν και τα προγράμματα ειδική φροντίδα και διαλογή παίζουν σημαντικό ρόλο στην επιβίωση των ασθενών με CRC, χειρουργική εκτομή στο πρώιμο στάδιο είναι η πιο αποτελεσματική θεραπεία και παρατείνει την επιβίωση των ασθενών. Δυστυχώς, CRCs πρώιμου σταδίου είναι δύσκολο να ανιχνευθούν λόγω της λιγότερα συμπτώματα.

Σήμερα, ενδοσκόπηση και κοπράνων εξετάσεις αίματος (FOBT) χρησιμοποιούνται συχνά σε κλινικές για τη διάγνωση των ασθενών CRC. Ωστόσο, δεν είναι μόνο τυχαία βιοψία, αλλά μπορεί να συμβεί μια επεμβατική διαδικασία ενδεχόμενα σφάλματα δειγματοληψίας, η οποία περιορίζει περαιτέρω την αποτελεσματικότητά τους. Εν τω μεταξύ, αν και FOBT είναι απλή, φθηνή και μη επεμβατική, παρουσιάζει ιδιαίτερη μικρή ευαισθησία για την ανίχνευση των αρχικών σταδίων CRC [4], [5]. Η πρωτεώματος του κυκλοφορούντος αίματος έχει εφαρμοστεί επίσης για την ανίχνευση βιολογικών δεικτών για CRC όπως καρκινοεμβρυονικό αντιγόνο (CEA) και το αντιγόνο υδατάνθρακα 19-9 (CA19-9), αλλά η ευαισθησία του και την εξειδίκευση, ειδικά κατά την πρώιμη φάση ορθοκολικό καρκίνο, φαίνεται να είναι ανεπαρκής [6]. Ως εκ τούτου, νέες μεθόδους και τα νέα διαγνωστικά βιοδεικτών απαιτούνται επειγόντως για τη μαζική έρευνες της πρόωρης γεγονότα της CRC.

microRNA (miRNA) είναι ~ 22-nt μακρύ μη-κωδικοποίησης του RNA, το οποίο παίζει αρνητικό ρόλο στην έκφραση του γονιδίου [7], [8]. Η αλλαγμένη έκφραση του miRNAs έχει συσχετιστεί με διάφορες ασθένειες, ιδιαίτερα του καρκίνου. έχουν miRNAs δειχθεί ότι διαφοροποιούνται επιτυχώς ποικίλες καρκίνους και να προβλέψουν τα αποτελέσματα τόσο σε στερεά όσο και αιματολογικές κακοήθειες [7]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι υπάρχουν μεγάλες ποσότητες miRNAs στην κυκλοφορία. Αυτά κυκλοφορούν miRNAs είναι σε θέση να αντέχουν δυσμενείς φυσιολογικές συνθήκες, όπως ακραίες διακυμάνσεις του ρΗ, της θερμοκρασίας, και πολλαπλούς κύκλους κατάψυξης /απόψυξης [9], [10]. Επιπλέον, ορισμένοι ερευνητές επεσήμανε ότι τα προφίλ των κυκλοφορούντων miRNA έδειξε σταθερά επίπεδα έκφρασης σε όλη φυσιολογικά υγιή άτομα [11]. Επειδή ορού και πλάσματος είναι σχετικά εύκολη πρόσβαση, κυκλοφορεί miRNA είναι μία από τις πλέον υποσχόμενες υποψηφίους για τη διάγνωση του καρκίνου. Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι τα πρότυπα έκφρασης των miRNAs ορού μπορεί δυνητικά να προσδιορίσει διάφορες μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα, καρκίνο του προστάτη, καρκίνο του μαστού, καρκίνο των ωοθηκών, και καρκίνο του ήπατος [12], [13]. Ως εκ τούτου, ο προσδιορισμός ενός προφίλ έκφρασης των miRNAs μοναδικό ορό για CRC θα είναι χρήσιμη για τη διάγνωση και την παρακολούθηση της θεραπείας των όγκων.

Για να ενισχυθεί η διαγνωστική αποτελεσματικότητα των miRNAs κυκλοφορία, νέες μεθόδους για να ανυψώσει διαγνωστική αξία τους για την CRC απαιτούνται. Πολλοί ερευνητές διαπίστωσαν ότι ο συνδυασμός διαφόρων miRNAs ως βιοδείκτη θα μπορούσε να βελτιώσει τη διαγνωστική αποτελεσματικότητα [14], [15]. Ωστόσο, αυτές οι μελέτες επικεντρώθηκαν κυρίως στην επάνω-ρυθμίζονται miRNAs. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε ως στόχο να συνδυάσει και τα δύο πάνω και κάτω-ρυθμίζονται miRNAs, για να οικοδομήσουμε ένα διαγνωστικό μοντέλο για CRC. Εμείς επικυρωθεί πρώτα δέκα miRNAs έχουν αναφερθεί στο παρελθόν να σχετίζεται με CRC, δηλαδή miR-21, miR-31, miR-203, miR-92a, miR-181β, miR-145, miR-143, miR-30c, miR-17, και αφήστε-7 γρ. Στη συνέχεια, από τη στατιστική ανάλυση, έχουμε εντοπίσει ένα προφίλ που συνδυάζεται έξι miRNAs ορού, η οποία μπορεί να χρησιμεύσει ως μια νέα μη επεμβατική βιοδείκτη για CRC διάγνωση.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς και υγιείς εθελοντές πριν από τη μελέτη, καθώς και όλα τα δείγματα συλλέχθηκαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα εγκεκριμένα από την Κλινική Επιτροπή Ερευνητικής Δεοντολογίας του Ινστιτούτου για τον Καρκίνο και το Νοσοκομείο, κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών.

σχεδιασμός μελέτης και ασθενείς

για να προσδιορίσει ένα υποκατάστατο βιοδείκτη για CRC, μια μελέτη ασθενών-μαρτύρων πολλαπλών σταδίων σχεδιάστηκε για να προσδιορίσει ένα διαγνωστικό προφίλ των miRNAs ορού (βλέπε Εικόνα 1). Ένα σύνολο 113 ασθενών με πρωτοπαθή CRCs (στάδια Ι-IV) και 89 άτομα της ομάδας ελέγχου είχαν προσληφθεί για τη μελέτη αυτή. Όλα τα 113 ασθενείς με καρκίνο οι οποίοι θα προσλαμβάνονται από το Ινστιτούτο και το Νοσοκομείο του καρκίνου, Κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών μεταξύ 2008 και 2010. Οι ασθενείς με προηγούμενο ιστορικό κακοήθων όγκων, κληρονομική CRC μη πολυποδίαση, ή οικογενή αδενωματώδη πολυποδίαση, αποκλείστηκαν. Δείγματα ορού συλλέχθηκαν πριν από οποιαδήποτε εκτομή του όγκου, όπως η χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία, και /ή ακτινοθεραπεία. Κάθε ασθενής είχε ιστολογικά επιβεβαιωμένη διάγνωση, και το στάδιο όγκου προσδιορίστηκε βασίζεται κυρίως στην ευρημάτων χειρουργική επέμβαση, ή σε βιοψία και την τεχνολογία απεικόνισης όταν ο όγκος δεν ήταν κατάλληλη για χειρουργική θεραπεία. Υγιείς μάρτυρες χωρίς γνωστή κακοήθεια ή ενεργή φλεγμονώδη κατάσταση αντιστοιχήθηκαν με τους ασθενείς με βάση την ηλικία, το φύλο, και την εθνικότητα. Το σύστημα ταξινόμησης TNM χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει το στάδιο του όγκου, σύμφωνα με το σύστημα σταδιοποίησης των όγκων-κόμβο-μετάσταση του έκτη έκδοση της Αμερικανικής Κοινής Επιτροπής. Τα δημογραφικά και κλινικά χαρακτηριστικά της σειράς ασθενών της μελέτης παρατίθενται στον Πίνακα 1.

Η

Στο στάδιο της επιλογής των βιοδεικτών, μια ομάδα δέκα υποψήφιες miRNAs (miR-21, ας-7g, ΜΙΚ 31, miR-92a, επιλέχθηκαν miR-181β, miR-203, miR-17, miR-30c, miR-143 και miR-145) για την έρευνα σε δείγματα ορού που βασίζονται σε προηγούμενες αξιολογήσεις για καρκίνο του παχέος εντέρου [13], [ ,,,0],16]. Για το σύνολο εκπαίδευσης, επιλέξαμε τυχαία 30 CRCs και 30 υγιείς μάρτυρες και εκτελείται ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή αντιδράσεις αλυσίδας πολυμεράσης (qRT-ΡΟΚ) για να επιλέξετε υποψήφιο miRNAs. Στη συνέχεια, η επικύρωση έγινε χρησιμοποιώντας το υπόλοιπο 83 CRC και 59 δείγματα υγιούς δότη (σύνολο επικύρωσης).

συλλογή ορού, η απομόνωση του RNA, και qRT-PCR δοκιμασία

Τα δείγματα φλεβικού αίματος (≈5 ml ) συλλέχθηκαν σε σωλήνες συλλογής ορού, και αφέθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για περίπου 1 ώρα προτού φυγοκεντρήθηκε στα 820 g για 10 λεπτά στους 4 ° C. Το προκύπτον ορρός μεταφέρθηκε σε νέους σωλήνες, που ακολουθείται από περαιτέρω φυγοκέντρηση στα 16.000 χ

g

για 10 λεπτά στους 4 ° C, για να απομακρυνθεί εντελώς οποιαδήποτε κυτταρικών υπολειμμάτων. Ολικό RNA απομονώθηκε από 250 μΙ ορού χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ LS (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) τεχνική συν-καθαρισμός. Για κάθε 250 μΐ ορού, διαχωρισμού φάσης πραγματοποιήθηκε με την προσθήκη 750 μΙ ΤπζοΙ LS. Στη συνέχεια, 200 μλ τριχλωρομεθανίου προστέθηκε για να αυξήσει τη διαδικασία διαχωρισμού φάσης RNA. Ολικό RNA καταβυθίστηκε χρησιμοποιώντας ισοπροπανόλη και πλύθηκε με 75% αιθανόλη, και ακολούθως 30 μΐ ΚΝάσης ελεύθερου νερού προστέθηκαν για διαλυτοποίηση. Κάθε 250 μΙ ορού απέδωσαν 30 μΐ συνολικού διαλύματος RNA, το οποίο φυλάχθηκε στους -80 ° C. Τρία μΐ ολικού RNA πολυαδενυλιωμένα με πολυ (Α) πολυμεράση και αντίστροφη μεταγραφή σε cDNA χρησιμοποιώντας το κιτ μεταγραφής TaKaRa microRNA (Takara, Ιαπωνία), ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα μεταγράφηκε αντίστροφα προϊόντα αραιώθηκαν στο ένα πέμπτο με RNase-free νερό και χρησιμοποιήθηκαν ως μήτρες για περαιτέρω ανάλυση PCR. PCR πραγματοποιήθηκε με χρήση του κιτ SYBR Premix Ex Taq II (Takara) σε ένα ΑΒΙ 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) με τον κατασκευαστή που παρέχονται καθολικό εκκινητή και miRNA-ειδική προς τα εμπρός εκκινητή. Οι αλληλουχίες εκκινητή που παρατίθενται στον Πίνακα 2. Κάθε αντίδραση διεξήχθη σε ένα σύστημα όγκο 20 μΐ που περιέχει 2 cDNA μΙ, 0,4 μΙ εκάστου εκκινητή (10 μΜ), 0.4 μΙ χρωστικής αναφοράς ROX (50 ×), 6,8 μl στείρου απεσταγμένου ύδατος, και 2 × SYBR Προμίγματα Ex Taq II. Το πρόγραμμα PCR ήταν: μετουσίωση στους 95 ° C για 30 δευτερόλεπτο, ακολουθούμενη από 40 κύκλους αποδιάταξης για 5 s στους 95 ° C, και επέκταση για 31 s στους 60 ° C. Στο τέλος των κύκλων PCR, που τήκεται αναλύσεις καμπύλη διεξήχθησαν για την επικύρωση της ειδικότητας του αναμενόμενου προϊόντος PCR. Κάθε αντίδραση διεξήχθη εις τριπλούν, και η αραίωση cDNA χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα για τον αρνητικό έλεγχο.

Η

Η ενδογενής miR-16 χρησιμοποιήθηκε ως normalizer για την κυκλοφορία miRNA ποσοτικοποίηση. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των miRNAs υπολογίστηκαν με τη συγκριτική 2-

μέθοδος ΔΔCT όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17], [18].

Serum CA19-9 και CEA ανάλυση

Η όγκου δείκτες CEA και CA-199 αναλύθηκαν με έναν αναλυτή ανοσοπροσδιορισμού Elecsys (Roche, Βασίλειος, Ελβετία). Τα ανώτερα φυσιολογικά όρια για τους δείκτες όγκου ήταν 6,5 ng /ml για CEA και 39 U /ml για CA-199.

Η στατιστική ανάλυση

Η σύγκριση των δημογραφικών και κλινικών χαρακτηριστικών μεταξύ των ασθενών CRC και οι υγιείς μάρτυρες προσδιορίστηκε με t-test του Student, μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA), ή δοκιμή χι-τετραγώνου.

ανάλυση βαθμολογίας κινδύνου διεξήχθη για να αξιολογηθεί η συσχέτιση μεταξύ των δειγμάτων CRC και η τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs. Η βαθμολογία επικινδυνότητας της κάθε miRNA στο σύνολο κατάρτισης συμβολίζεται ως

s

. Για τα επάνω ρυθμισμένη miRNAs, η βαθμολογία κινδύνου ορίστηκε ως 1 εάν το επίπεδο έκφρασης ήταν υψηλότερη στα δείγματα CRC από το ανώτερο διάστημα αναφοράς 95% για το αντίστοιχο επίπεδο miRNA στους ελέγχους, καθώς και για τις κάτω-ρυθμίζονται miRNAs, το σκορ κίνδυνος ήταν οριστεί ως -1 εάν το επίπεδο έκφρασης ήταν χαμηλότερη στα δείγματα CRC από το κατώτερο διάστημα αναφοράς 95% των ομάδων ελέγχου? Αλλιώς, η βαθμολογία ορίστηκε ως 0. Για τη συσχέτιση της κάθε miRNA με CRC κίνδυνο, κάθε ασθενής είχε ανατεθεί μια λειτουργία βαθμολόγηση κινδύνου (RSF) με βάση ένα γραμμικό συνδυασμό των επιπέδων έκφρασης των miRNAs. Χρησιμοποιώντας τις πληροφορίες από έξι miRNAs, την RSF για το δείγμα

i

έχει ως εξής: Στην παραπάνω εξίσωση,

sij

είναι η βαθμολογία κινδύνου για miRNA

ι

για δείγμα

i

, και W

ι

είναι το βάρος του σκορ κινδύνου miRNA

ι

. Για τον προσδιορισμό των Ws, έξι μονομεταβλητών μοντέλα λογιστικής παλινδρόμησης ήταν εξοπλισμένα με την κατάσταση της νόσου με κάθε μία από τις βαθμολογίες των κινδύνων. Ο συντελεστής παλινδρόμησης της κάθε βαθμολογίας κινδύνου χρησιμοποιήθηκε ως το βάρος για να δείξει τη συμβολή του κάθε miRNA στην RSF. Ο πίνακας συχνότητα και χαρακτηριστικό λειτουργίας λήπτη (ROC) καμπύλες στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση των διαγνωστικών αποτελεσμάτων της προφίλ και να βρει ένα κατάλληλο σημείο αποκοπής. Επικύρωση της διαδικασίας και τις αποκοπές έγιναν στο σύνολο επικύρωσης.

Μια ανεξάρτητη δείγματα t-test χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τις συγκεντρώσεις miRNA στον ορό μεταξύ του καρκίνου και υγιή δείγματα. Λόγω του μεγέθους και του εύρους των σχετικών επιπέδων έκφρασης των miRNAs που παρατηρήθηκαν, τα δεδομένα αποτελέσματα log-μετασχηματιστεί για ανάλυση (log

2). Όλες οι δοκιμές ήταν 2 όψεων και ένα επίπεδο σημαντικότητας p-value & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) και γραφήματα δημιουργήθηκαν με Graphpad Prism 5.0 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USA). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος. Για την ανάλυση διασποράς, ιεραρχική ομαδοποίηση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Cluster 3.0 (Berkeley, CA, USA) με την πλήρη μέθοδο σύνδεσης.

Αποτελέσματα

Περιγραφή των ασθενών

Όλα τα 113 ασθενείς που συμμετείχαν στην παρούσα μελέτη είχαν κλινικά και παθολογικά διάγνωση της CRC. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, δεν υπήρξε σημαντική διαφορά στην κατανομή των ηλικία, το φύλο και άλλες ασθένειες, όπως η καρδιακή δυσλειτουργία ή νευρολογική ασθένεια, μεταξύ των ασθενών και των CRC υγιείς ελέγχους στα σύνολα κατάρτισης και επικύρωσης. Αυξημένα επίπεδα του CEA (& gt? 6,5 ng /ml) και CA19-9 (& gt? 39 U /ml) βρέθηκαν σε 40 και 26 ασθενείς, αντίστοιχα

έκφραση Αξιολόγηση των miRNA σε ασθενείς CRC και υγιείς μάρτυρες. με ανάλυση σε πραγματικό χρόνο qRT-PCR

Μια δοκιμή case-control δύο φάσεων σχεδιάστηκε για να προσδιορίσει miRNAs ορού ως υποψήφιος βιοδείκτες για CRC διάγνωση. Έχουμε επιλέξει τις δέκα υποψήφιες miRNAs αναφερθεί σε προηγούμενες μελέτες, και χρησιμοποιούνται δοκιμασίες qRT-PCR για να επιβεβαιωθεί η έκφραση τους στις 30 περιπτώσεις CRC και 30 την ηλικία και το φύλο υγιείς μάρτυρες στο σύνολο εκπαίδευσης. MiR-16 έκφραση χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση των δεδομένων qRT-PCR. Καμία σημαντική διαφορά δεν παρατηρήθηκε στα επίπεδα του miR-17, miR-145, miR-143, miR-30c μεταξύ του CRC και δείγματα ελέγχου (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Ωστόσο, τα επίπεδα έκφρασης των έξι από τα miRNAs ήταν σημαντικά διαφορετικές μεταξύ των δειγμάτων CRC και ελέγχου? δύο miRNAs, miR-21 και αφήστε-7g, ήταν up-ρύθμιση, και τέσσερις miRNAs, miR-31, miR-92a, miR-181β, και miR-203, ήταν κάτω-ρυθμιζόμενη (Πίνακας 3). Οι συγκεντρώσεις των έξι διαφορικά εκφρασμένων miRNAs εξετάστηκαν με qRT-PCR στους 83 ασθενείς CRC και 59 μάρτυρες στο σύνολο επικύρωσης. Οι μεταβολές στα πρότυπα έκφρασης miRNA παρατηρήθηκε στο σύνολο επικύρωσης ήταν σύμφωνα με εκείνα που βρέθηκαν στο σύνολο εκπαίδευσης. Η διαφορική έκφραση των έξι miRNAs στις 113 περιπτώσεις CRC σε σύγκριση με τις 89 ελέγχους δείχνεται στο Σχήμα 2. Έτσι, αυτή η διαδικασία δοκιμής και ανάλυση δύο φάσεων που δημιουργείται ένα προφίλ του έξι miRNAs ορού που χρησίμευσε ως πιθανό βιοδείκτη για CRC. Οι έξι υποψήφια βιοδείκτες στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε περαιτέρω δοκιμές και αναλύσεις.

Τα επίπεδα έκφρασης στον ορό των έξη επιλεγμένων miRNAs μετρήθηκαν σε 113 περιπτώσεις CRC και 89 υγιείς μάρτυρες (τόσο στο σύνολο εκπαίδευσης και το σύνολο επικύρωσης) χρησιμοποιώντας SYBR που βασίζεται δοκιμασία qRT-PCR. Κάθε αντίδραση διεξήχθη εις τριπλούν.

Η

Διαχωρισμός των περιπτώσεων CRC και υγιείς μάρτυρες με βαθμολογία κίνδυνο την ανάλυση

Για να αξιολογηθεί η διαγνωστική αξία της υπογραφής έκφρασης των miRNAs που περιλαμβάνει το έξι προσδιορίζονται miRNAs, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση βαθμολόγηση κινδύνου να γίνει διάκριση μεταξύ των δειγμάτων ορού CRC και τα δείγματα ορού από τους υγιείς ελέγχους. Κατ ‘αρχάς, η βαθμολογία κινδύνου για καθένα από τα miRNAs στο σετ εκπαίδευσης υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο σκορ κινδύνου. Στο βέλτιστη αποκοπής προγνωστική αξία των 9.595 για τη λειτουργία βαθμολόγηση κινδύνου, όταν η ευαισθησία και η ειδικότητα ήταν στο μέγιστο τους, τα δείγματα ορού χωρίστηκαν σε μια ομάδα χαμηλού κινδύνου και μιας ομάδας υψηλού κινδύνου που αντιπροσωπεύουν τις υγιείς δότες και CRC περιπτώσεις, αντίστοιχα, . Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε την τιμή αποκοπής για την ανάλυση των 142 δειγμάτων στο σύνολο επικύρωσης. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 4, η θετική προγνωστική αξία και αρνητική προγνωστική αξία της υπογραφής έξι-miRNA στην εκπαίδευση που ήταν 0,96 και 0,85, αντίστοιχα, και στην επικύρωση που οι θετικές και αρνητικές τιμές πρόβλεψης ήταν 0,95 και 0,92 αντίστοιχα. Κατασκευάσαμε επίσης καμπύλες ROC για την εκτίμηση της ευαισθησίας και της ειδικότητας των βιοσημειωτών miRNA με βάση. Οι περιοχές κάτω από τις καμπύλες (τιμές AUC) ήταν 0.900 και 0.923 για το σύνολο εκπαίδευσης και σύνολο επικύρωσης, αντίστοιχα (Εικόνα 3Α και 3Β). Χρησιμοποιώντας τα ίδια δείγματα ορού, συγκρίναμε τις AUCs για την υπογραφή έξι miRNA με τα AUC για την καρκινικών δεικτών CEA και CA19-9, τα οποία χρησιμοποιούνται επί του παρόντος σε κλινικές για ανίχνευση CRC. Οι τιμές AUC για την υπογραφή έξι-miRNA ήταν σημαντικά υψηλότερα από τα AUC για το CEA (0,649) και CA19-9 (0,598) (Εικόνα 3C και 3D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η υπογραφή έξι-miRNA είναι μια πιο ακριβής βιοδείκτης από CEA και CA19-9 για CRC διάγνωση.

(Α) ROC ανάλυση καμπύλης για το προφίλ της εξάμηνης υπογραφή miRNA στο σύνολο εκπαίδευσης απέδωσε η τιμή της AUC 0,900 (95% CI: 0,812 – 0,988) με 83,3% ευαισθησία και 96,7% ειδικότητα (cut-off value = 9,595). (Β) Ανάλυση ROC καμπύλη για το προφίλ της υπογραφής έξι-miRNA στο σύνολο επικύρωσης έδωσε μια τιμή AUC 0,923 (95% CI: 0,869 – 0,976) με 96,4% ευαισθησία και 88,1% ειδικότητα (cut-off value = 9,595) . (Γ) καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο (CEA) απέδωσε μια τιμή AUC του 0,649 (95% CI): 0,574 – 0,724) με 35,4% ευαισθησία και 94,4% ειδικότητα και (αντιγόνο D) υδατάνθρακα 19-9 (CA19-9) απέδωσε μια τιμή AUC από 0,598 (95% CI: 0,521 – 0,676). με 23% ευαισθησία και 96,6% ειδικότητα, για τα ίδια δείγματα ορού

Η

σύνδεσης με δημογραφικούς και κλινικούς παράγοντες

για τον προσδιορισμό του ρόλου των έξι καρκινικών δεικτών miRNA που βασίζεται στην ανάπτυξη CRC, οι περιπτώσεις CRC περαιτέρω κατηγοριοποιημένα βάσει των TNM στάσης τους. Σε αυτή την ανάλυση, τα δείγματα CRC από σύνολο εκπαίδευσης και σετ επικύρωσης ενώθηκαν και τα επίπεδα έκφρασης των έξι miRNAs συσχετίστηκαν με το στάδιο του όγκου των ασθενών CRC. Βρήκαμε ότι οι τιμές βαθμολόγηση κινδύνου ήταν διαφορετικές μεταξύ CRC περιπτώσεις σε διάφορα στάδια όγκου (βλέπε Εικόνα S1 Α). Η μέση βαθμολογία κίνδυνος περιπτώσεις CRC σε μεταγενέστερα στάδια (ΙΙβ, ΙΙΙ, και IV) ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι το σκορ σε προγενέστερα στάδια (Ι και ΙΙα). Δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ των έξι miRNAs και το φύλο, την ηλικία, κομβική θέση, και του όγκου επεμβατική βάθους (βλέπε Εικόνα S1B-Ε).

Ανεξέλεγκτη σύμπλεγμα ανάλυση

Για την ανάλυση της διαφορικής έκφρασης των τα miRNAs μεταξύ του CRC και τα δείγματα ορού ελέγχου, πραγματοποιήσαμε μια ανεξέλεγκτη διαδικασία ομαδοποίησης που ήταν τυφλός στις κλινικές σχολιασμούς. Το δενδρόγραμμα έδειξε σαφή διαχωρισμό των δειγμάτων CRC από τα δείγματα ελέγχου με βάση την εξάμηνη προφίλ υπογραφής miRNA (βλέπε Εικόνα S2). Στο σύνολο εκπαίδευσης, κανένα από τα 30 δείγματα CRC και μόνο τέσσερα από τα 30 δείγματα ελέγχου είχαν ταξινομηθεί εσφαλμένα (Σχήμα S2A). Στο σύνολο επικύρωσης, οι 83 περιπτώσεις CRC και 59 μάρτυρες που κατατάσσονται σε δύο βασικές κατηγορίες? Μόνο σε μία περίπτωση CRC και τρεις έλεγχοι ταξινομηθεί εσφαλμένα (Σχήμα S2B)

Συζήτηση

Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι η έκφραση των miRNAs είναι παρεκκλίνουσα στην ανάπτυξη CRC.? Ωστόσο, οι περισσότερες από αυτές τις μελέτες επικεντρώθηκαν στην έκφραση των miRNAs σε ιστούς και τα κύτταρα του όγκου. Παρά το γεγονός ότι miRNAs ιστού μπορεί να παρέχει μια ακριβή διάγνωση για διάφορους τύπους καρκίνου, η δυσκολία στη συλλογή δειγμάτων ιστού περιορίζει την εφαρμογή της για την ανίχνευση βιοδεικτών του καρκίνου. Η απόκτηση δείγματα ιστού είναι μια επεμβατική διαδικασία και εξαρτάται από χειρουργικές τομές μετά την αρχική κλινική ταξινόμηση. Η έρευνα για μη επεμβατική εργαλεία για τη διάγνωση του καρκίνου του είναι από καιρό ένα στόχος πολλών ερευνητών, και ένα μεγάλο μέρος του ενδιαφέροντος υπήρξε για την κυκλοφορία των νουκλεϊκών οξέων στο πλάσμα και τον ορό. Σε σύγκριση με το DNA και mRNA, που κυκλοφορεί miRNAs δείχνουν αξιοσημείωτη σταθερότητα μετά από παρατεταμένη επώαση σε θερμοκρασία δωματίου ή /και πολλαπλές διεργασίες ψύξης-απόψυξης. Ωστόσο, ο προστατευτικός μηχανισμός του κυκλοφορούντος miRNAs είναι ακόμα άγνωστη. Ορισμένοι ερευνητές ανέφεραν ότι κυκλοφορούν miRNAs ήταν υπό τη μορφή Argonaute 2 (ago2) -miRNA συγκροτήματα που θα μπορούσε να αποφευχθεί η RNase πέψη [19]. MiRNAs στο πλάσμα μπορεί να εκκρίνεται από τα κύτταρα και η διαδικασία απελευθέρωσης μπορεί να είναι ένας επιλεκτικός μηχανισμός που συσχετίζεται με κακοήθεια [20]. Υπάρχουν πολλά πλεονεκτήματα στη χρήση κυκλοφορούν miRNAs για ανίχνευση CRC. Συλλογή δειγμάτων είναι εύκολη και χαμηλού κόστους, και το σημαντικότερο, είναι μια σχετικά μη επεμβατική διαδικασία που μπορεί να εφαρμοστεί εύκολα στην διαλογή και την παρακολούθηση των ασθενών με καρκίνο. Επιπλέον, τα προφίλ miRNAs είναι συνεπείς κυρίως μεταξύ των υγιών ατόμων και είναι πολύ σταθερά στο αίμα.

Early αναζητήσεων για μη επεμβατική εργαλεία για τη διάγνωση των καρκίνων επικεντρώθηκαν κυρίως σε μία ή λίγες μόνο ογκοειδικό miRNAs [9] [21] – [23]. Για παράδειγμα, Liu et al. [21] μελέτησαν τα προφίλ miRNA στον ορό των ασθενών με γαστρικό καρκίνο, ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο, και υγιή άτομα. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαν ότι κυκλοφορούν miR-378 είχε σχέση με γαστρικό καρκίνο, αλλά δεν συνδέονται με άλλες γαστρεντερικών καρκίνων. Ανέφεραν ότι τα επίπεδα έκφρασης miR-378 θα μπορούσε να διακρίνει ασθενείς με γαστρικό καρκίνο από υγιείς ελέγχους, με 87,5% ευαισθησία και 70,73% ειδικότητα [21]. Ορός miR-1246 και μόνο έδωσε μία περιοχή κάτω από την καμπύλη ROC του 0.754, με 71,3% ευαισθησία και 73,9% ειδικότητα για τη διάκριση τους ασθενείς με καρκίνο του οισοφάγου από υγιείς ελέγχους [23]. Παρά το γεγονός ότι αυτού του είδους η προσέγγιση είναι απλή και διαθέσιμη, η ιδιαιτερότητα των βιοδεικτών βασίζεται σε ένα ενιαίο miRNA όγκου-ειδικά είναι γενικά κακή. Η έναρξη και η ανάπτυξη των καρκίνων περιλαμβάνουν πολλά διαφορετικά και πολύπλοκα μοριακά γεγονότα που θα επηρεάσουν τον πολλαπλασιασμό, κυτταρικούς κύκλους, και την απόπτωση. Ως εκ τούτου, ο συνδυασμός των πολλαπλών miRNAs ορού θα πρέπει να είναι πιο αξιόπιστη για την ανίχνευση όγκων από τους συμβατικούς ενιαία βιοδείκτες που βασίζονται σε πρωτεΐνη ή με βάση υδατάνθρακα. Σε αυτή τη μελέτη, εντοπίσαμε δύο up-ρυθμίζονται miRNAs ορού (miR-21, ας-7g), και τέσσερα κάτω-ρυθμίζονται miRNAs (miR-31, miR-181β, miR-92a, miR-203). Για το καλύτερο της γνώσης μας, αυτή είναι η πρώτη μελέτη για να περιγράψει μια υπογραφή ορού miRNA-based που χτίστηκε συνδυάζοντας υπερ- και υπο-εκφράζεται miRNAs, τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό του όγκου, τη μετανάστευση και την εισβολή. Η υπογραφή έξι-miRNA θα μπορούσε να ανιχνεύσει τα δείγματα ορού CRC με ευαισθησία και ειδικότητα 93% και 91%, αντιστοίχως (βλέπε πίνακα S2), σημαντικά υψηλότερο από ό, τι οποιαδήποτε βιοδεικτών μονού παράγοντα, όπως CA19-9 ή CEA. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι, για τα ίδια δείγματα ορού, η ευαισθησία της ανίχνευσης CRC από CA19-9 και CEA ήταν 35% και 23%, αντίστοιχα. Σαφώς, η συνδυασμένη έξι-miRNA υπογραφή μπορεί να διαχωρίσει επιτυχώς τους ασθενείς CRC από τους ελέγχους, και θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως ακριβής βιολογικός δείκτης για CRC διάγνωση. Ειδικότερα, αυτό βιοδεικτών έδειξε ένα διαφορετικό προφίλ έκφρασης μεταξύ των κανονικών ελέγχων και ασθενείς CRC με μόνο σταδίου Ι /ΙΙ καρκίνους (Πίνακας S1). ασθενείς CRC με σταδίου Ι /ΙΙ μπορεί να υποβληθεί σε πλήρη εκτομή του όγκου, και θα έχει καλύτερη πρόγνωση. Τα δεδομένα μας υποδεικνύουν έντονα ότι η εφαρμογή της υπογραφής έξι-miRNA ως βιοδείκτη για τον καθορισμό των αρχικών σταδίων CRC μπορεί να είναι ένας αποτελεσματικός τρόπος για να αλλάξετε τα αποτελέσματα και τη βελτίωση της πρόγνωσης. Βρήκαμε ότι η έκφραση miRNA συσχετίζεται με το στάδιο του όγκου, και το miRNA υπογραφή ορού μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση του σταδίου εξέλιξης του CRC. Δεν βρέθηκαν διαφορές όταν οι περιπτώσεις CRC στρωματοποιήθηκαν από τις δημογραφικές και κλινικές παράγοντα, όπως το φύλο, η ηλικία, κομβική θέση, και του όγκου επεμβατική βάθος? Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι μια βαθμολογία υψηλού κινδύνου σχετίστηκε με τις προηγμένες κλινικά στάδια της νόσου (Εικόνα S1). Επί του παρόντος, TNM σύστημα σταδιοποίησης είναι το κύριο εργαλείο που χρησιμοποιείται από τους κλινικούς ιατρούς να εκτιμηθεί το φορτίο του όγκου και η πρόβλεψη πρόγνωση και την επιβίωση. Προτείνουμε ότι η υπογραφή έξι-miRNA σε δείγματα ορού θα μπορούσε να γίνει μια σημαντική προγνωστική παράμετρο στην επιλογή του καλύτερου συνδυασμού των τρόπων θεραπείας, όπως η χειρουργική επέμβαση, ακτινοβολία, και /ή χημειοθεραπεία. Ωστόσο, τα στοιχεία μας είναι εν μέρει αντιφατικές με τα αποτελέσματα ορισμένων προηγούμενες μελέτες? για παράδειγμα, τα επίπεδα έκφρασης του miR-181β, miR-92a, miR-31, και miR-203 αναφέρθηκαν ότι είναι αυξημένα σε δείγματα ιστού CRC σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Η διαφορά αυτή μπορεί να αποδοθεί σε διαφορετικά επίπεδα έκφρασης miRNA μεταξύ των ιστών και του πλάσματος. Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι η έκφραση miRNA σε δείγματα ιστού άλλαξε προς την αντίθετη κατεύθυνση από την έκφρασή τους σε δείγματα ορού [21], [24]. Αυτό μπορεί να προκληθεί από τον μηχανισμό κυτταρικής επιλογή των miRNA απελευθέρωσης [20]? για παράδειγμα, τα καρκινικά κύτταρα μπορεί επιλεκτικά να διατηρούν ορισμένα miRNAs, με αποτέλεσμα τη μείωση των miRNAs στον ορό. Πιο ενδιαφέρον, η έκφραση αυτών των τεσσάρων κάτω ρυθμισμένα miRNAs βρέθηκε επίσης να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε κάποια άλλα είδη καρκίνου. Για παράδειγμα, miR-31, το οποίο βρίσκεται στο χρωμόσωμα 9p21.3, ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης [25], του καρκίνου του μαστού [26], γαστρικού καρκίνου [27], καρκίνωμα του προστάτη [28], και CRC με μετάσταση στον εγκέφαλο [ ,,,0],29]. Πολλοί ερευνητές έχουν διαπιστώσει ότι miR-31 μπορεί να αναστείλει την μετάσταση του καρκίνου του μαστού [26], [30], και η απορρύθμιση του miR-31 έχει συσχετιστεί με την εξέλιξη του καρκίνου και μετάσταση. Η υψηλή έκφραση του miR-92a έχει συσχετιστεί με την ανάπτυξη και την εξέλιξη πολλών καρκίνων [31]? Ωστόσο, Shigoka et al. [32] βρήκαν ότι miR-92a ήταν εντόνως εκφρασμένο σε ιστό ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, ήταν χαμηλότερη στο πλάσμα αυτών των ασθενών, αλλά ήταν αυξημένη στο πλάσμα τους μετά από χειρουργική θεραπεία. Nilsson et al. [33] έδειξε ότι τα χαμηλά επίπεδα miR-92a σε όγκους που συνδέονται με το στάδιο του όγκου και ότι κάτω ρύθμιση της αυξήθηκαν κυτταρική μετανάστευση. MiR-181β έχει δειχθεί ότι δρα ως ογκοκατασταλτικό γονίδιο, και ρυθμισμένα προς τα κάτω σε ανθρώπινα γλοιώματα [34], [35].

Εν συντομία, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που αναφέρει την κλινικά διαγνωστική αξία υπογραφής έξι-miRNA με βάση βιοδεικτών στον ορό που περιέχει τόσο πάνω και κάτω-ρυθμίζονται miRNAs. Το έργο μας θα χρησιμεύσει ως βάση για περαιτέρω έρευνα, κατά προτίμηση επικύρωση μεγάλης κλίμακας κλινικές δοκιμές, πριν miRNAs ορού μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ένα εργαλείο ρουτίνας ελέγχου για CRC.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

η συσχέτιση των επιπέδων έκφρασης των έξι miRNAs με δημογραφικούς και κλινικούς παράγοντες των ασθενών CRC. (Α) Όταν περιπτώσεις CRC ομαδοποιήθηκαν από TNM στάσης τους, η μέση βαθμολογία των κινδύνων από τις περιπτώσεις CRC σε μεταγενέστερα στάδια (ΙΙβ, ΙΙΙ, και IV) ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι σε προηγούμενα στάδια (Ι και ΙΙα) (p & lt? 0,05). (Β-Ε) Δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ των έξι miRNAs και όγκου επεμβατική βάθος, κομβική θέση, το φύλο και την ηλικία

doi:. 10.1371 /journal.pone.0087451.s001

(DOCX)

Εικόνα S2.

δενδρόγραμμα των χωρίς επίβλεψη αποτελέσματα ομαδοποίησης. Το δενδρόγραμμα δείχνει σαφή διαχωρισμό των δειγμάτων CRC από τα δείγματα ελέγχου με βάση την υπογραφή έξι-miRNA τόσο στο σύνολο εκπαίδευσης (Α) και το σύνολο επικύρωσης (Β)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0087451. S002

(DOCX)

πίνακα S1.

διαφορικά εκφρασμένο miRNAs στο στάδιο I /II δείγματα ορού CRC σε σύγκριση με τα δείγματα ορού ελέγχου. Τα κανονικοποιημένα επίπεδα miRNAs έκφρασης παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD

doi:. 10.1371 /journal.pone.0087451.s003

(DOCX)

Πίνακας S2.

ευαισθησία και η ειδικότητα της βιοδεικτών υπογραφής έξι-miRNA σε σύγκριση με την CEA και δείκτες CA19-9

doi:. 10.1371 /journal.pone.0087451.s004

(DOCX)