Αφηρημένο

Δοκιμάσαμε για βλαστική παραλλαγών που δείχνουν συσχέτιση με άνω και κάτω τελεία μετάσταση του καρκίνου χρησιμοποιώντας μια μελέτη σύνδεσης του γονιδιώματος σε επίπεδο που συγκρίνεται Ασκενάζι Εβραϊκό άτομα με σταδίου IV καρκίνους του παχέος εντέρου μεταστατικό έναντι εκείνων με σταδίου Ι ή ΙΙ μη μεταστατικών καρκίνων του παχέος εντέρου. Σε ένα σχέδιο μελέτης δύο σταδίων, αποδείξαμε σημαντική συσχέτιση σε αναπτυσσόμενες μεταστατική νόσο για rs60745952, ότι στην ανακάλυψη και την επικύρωση ομάδες Ashkenazi, αντίστοιχα, έδειξαν μία αναλογία πιθανοτήτων (OR) = 2,3 (P = 2.73E-06) και OR = 1.89 (P = 8.05E-04) (που υπερβαίνει το όριο επικύρωση των 0,0044). Σημαντική συσχέτιση με μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από μια μετα-ανάλυση των rs60745952 σε αυτά τα σύνολα δεδομένων συν ένα ομάδα επικύρωσης επιπλέον Ασκενάζι (OR = 1,92? 95% CI: 1,28 – 2,87), και από ένα τεστ μετάθεση που επέδειξε σημαντικά μεγαλύτερη απλότυπος γύρω rs60745952 στα δείγματα στάδιο IV. rs60745952, που βρίσκεται σε μια διαγονιδιακή περιοχή στο χρωμόσωμα 4q31.1, και όχι προηγουμένως σχετίζεται με καρκίνο, είναι, ως εκ τούτου, ένας γενετικός δείκτης βλαστικής γραμμής για επιδεκτικότητας στην ανάπτυξη καρκίνου του παχέος εντέρου μεταστάσεων ανάμεσα στους Εβραίους Ashkenazi

Παράθεση:. Markowitz SD, Nock NL, Schmit SL, Stadler ZK, Joseph V, Zhang L, et al. (2016) βλαστικής σειράς Variant στο χρωμόσωμα 4q31.1 Associates με την ευαισθησία στην ανάπτυξη καρκίνου του παχέος εντέρου μετάσταση. PLoS ONE 11 (1): e0146435. doi: 10.1371 /journal.pone.0146435

Επιμέλεια: Ajay Goel, Πανεπιστήμιο Baylor Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 4, Φεβ 2015? Αποδεκτές: 3 Απρ 2015? Δημοσιεύθηκε: 11 του Ιανουαρίου 2016

Copyright: © 2016 Markowitz et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι διαθέσιμα από το NCBI (αριθμός ένταξης: PRJNA306392).

Χρηματοδότηση: το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγεί R01 CA144040 (SDM), Ρ50 CA150964 (SDM), Ρ30 CA043703, U19 CA148107 (SBG ), Ρ30 CA014089 (SBG), Κ07 CA129162 (NLN), Τ32 ES013678 (SLS), R01 CA160356 (PS και SDM) και R01CA136726 (LL)? και, από το Ίδρυμα Leonard και Joan Horvitz (SDM), τον Richard Horvitz και Erica Hartman-Horvitz Ίδρυμα (SDM), του Ιδρύματος Anton Β Burg στο USC Norris, ο Σαρόν Levine Corzine Ταμείο Έρευνας και ο Robert και η Kate Niehaus Κλινική γενετική Πρωτοβουλία στο MSKCC. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, National Institutes of Health υπό RFA # CA-09-002. Το περιεχόμενο αυτού του χειρογράφου δεν αντανακλά απαραίτητα τις απόψεις ή τις πολιτικές του Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου ή κάποιο από τα συνεργαζόμενα κέντρα στην κοινοπραξία Corect, ούτε αναφορά εμπορικών επωνυμιών, εμπορικών προϊόντων ή οργανισμών υποδηλώνει την έγκριση από την κυβέρνηση των Ηνωμένων Πολιτειών ή της Corect κοινοπραξία

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι ο τρίτος συχνότερος καρκίνος και η δεύτερη κύρια αιτία του καρκίνου θανάτου στις Ηνωμένες Πολιτείες, με 136.830 νέες περιπτώσεις διαγιγνώσκονται και 50.310 θανάτους ετησίως [1]. Παγκοσμίως, καρκίνο του παχέος εντέρου είναι η τρίτη πιο συχνά διαγιγνώσκεται καρκίνος στους άνδρες και τη δεύτερη στις γυναίκες, με 746.000 περιπτώσεις και 614.000 περιπτώσεις, αντίστοιχα [2].

Σε όλες σχεδόν τις περιπτώσεις, του παχέος θανάτου από καρκίνο προκαλείται από την ανάπτυξη του καρκίνου μεταστάσεων σε απομακρυσμένα όργανα, κυρίως το ήπαρ συνήθως [3]. Σε προηγούμενες μελέτες, δείξαμε ότι όλες οι σωματικές μεταλλάξεις που υπάρχουν στον καρκίνο του παχέος εντέρου ηπατικές μεταστάσεις ήταν ήδη παρούσες στην πρωτογενή συμφωνημένα προγενέστερες καρκίνο του παχέος εντέρου όγκων-δηλαδή, νέες γονιδιακές μεταλλάξεις δεν είναι υποχρεωμένη να κινήσει τον καρκίνο του παχέος εντέρου μεταστάσεις [4].

στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε ένα εναλλακτικό γενετικό μοντέλο για την ανάπτυξη του παχέος εντέρου μεταστάσεων καρκίνου, μία η οποία ελέγχει αν γενετικές παραλλαγές στην ανθρώπινη βλαστική σειρά μπορεί να προσδώσει ένα άτομο ευαισθησία στη μεταστατική εξάπλωση του καρκίνου του παχέος εντέρου. Για να δοκιμάσετε αυτό το μοντέλο, αναλάβαμε μια Γονιδιώματος Wide Association Μελέτη (GWAS) που αφορούν την αξιολόγηση της βλαστικής σειράς πολυμορφισμούς μονών νουκλεοτιδίων (SNPs) σε Ashkenazi ασθενείς εβραϊκή καταγωγή με Stage IV μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου σε σύγκριση με εκείνους με καρκίνους σταδίου Ι ή σταδίου ΙΙ του παχέος εντέρου που έκανε δεν μεταστάσεις. Έχουμε επιλέξει το εβραϊκό πληθυσμό Ashkenazi για τη μελέτη αυτή, επειδή αλληλόμορφα ιδρυτής, τα οποία είναι ιδιαίτερα ανιχνεύσιμα από GWAS, είναι ήδη καλά πρωτοφανή για πολλές άλλες ασθένειες σε αυτόν τον πληθυσμό [5,6]. Χρησιμοποιώντας τα δεδομένα από την ανακάλυψη ομάδα μας, έχουμε αναπτύξει μια προκαταρκτική ανάλυση δύναμη που μας έδωσε τη δυνατότητα να προ-καθορίσετε έναν περιορισμένο αριθμό των SNPs οποίων η εξέταση σε μια ομάδα επικύρωσης θα παρέχει για την αντιγραφή με εύλογη δύναμη σε επίπεδο σημαντικότητας 5%. Οι κορυφαίοι SNPs που προσδιορίζονται στο σύνολο δεδομένων ανακάλυψη αξιολογήθηκαν στη συνέχεια σε άλλο πληθυσμό ασθενών ορθοκολικό καρκίνο των Ασκενάζι εβραϊκής καταγωγής (επικύρωση σύνολο δεδομένων # 1). Με βάση τα αποτελέσματα από την ανακάλυψη και την επικύρωση συνόλων δεδομένων, η κορυφή SNP ενδιαφέροντος αξιολογήθηκε περαιτέρω σε ένα τρίτο του παχέος πληθυσμό ασθενούς με καρκίνο των Ασκενάζι εβραϊκής καταγωγής (επικύρωση σύνολο δεδομένων # 2), και μια συνδυασμένη ανάλυση (μετα-ανάλυση) του παρόντος κορυφή SNP ολοκληρώθηκε με τη χρήση των αποτελεσμάτων από τις τρεις καταγωγής Ασκενάζι σύνολα δεδομένων. Ως περαιτέρω πρόσθετη δοκιμή, το μήκος του απλότυπου γύρω από αυτό το SNP βρέθηκε να είναι σημαντικά μεγαλύτερη μεταξύ των μεταστατικών έναντι των μη-μεταστατικών καρκίνων του παχέος εντέρου.

Αποτελέσματα

Λεπτομερείς περιγραφές της ανακάλυψης και οι ομάδες επικύρωση παρέχονται στο παρακάτω μεθόδους. Κατά μέσο όρο, οι ασθενείς στη μελέτη πληθυσμού ανακάλυψη ήταν 71 ετών, η οποία ήταν παρόμοια με τη μέση ηλικία των 72 και 65 στα σύνολα δεδομένων επικύρωσης # 1 και # 2, αντίστοιχα (Πίνακας 1). Ο πληθυσμός ανακάλυψη περιελάμβανε 52% άνδρες και 48% γυναίκες και τις διανομές των φύλων σε σύνολα δεδομένων επικύρωσης ήταν παρόμοια. Οι κατανομές του σταδίου IV και το στάδιο Ι και II περιπτώσεις ήταν επίσης παρόμοιες στις τρεις σύνολα δεδομένων (Πίνακας 1).

Η

Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2 και το Σχ 1, η πιο σημαντική συσχέτιση παρατηρήθηκε κατά τη σύγκριση στάδιο IV στο στάδιο I /II ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου στην ανακάλυψη GWAS ήταν για rs2024846 στο χρωμόσωμα 6 (OR = 2,62? 95% CI: 1,76 – 3,92? p = 1.2×10

-6). Η επόμενη πιο σημαντική συσχέτιση που παρατηρήθηκε ήταν με δύο SNPs (rs72737810, rs60745952) στο χρωμόσωμα 4q31.1 (OR = 2,83? 95% CI: 1,81 – 4,44? P = 2.73×10

-6), τα οποία διαχωρίζονται από 5 kb και είναι σε ισχυρή ανισορροπία συνδέσεως (βλέπε σχήμα 2). Αυτές οι δύο SNPs βρίσκονται σε μία διαγονιδιακή περιοχή απομακρυσμένη από το πλησιέστερο γονίδιο,

NR3C2

, με 380kb (Σχήμα 2). Αν και η στατιστική σημαντικότητα για την ένωση για αυτές τις κορυφαίες SNPs δεν υπερβαίνουν τα στάνταρ επίπεδα σημαντικότητας γονιδίωμα-ευρεία, μακροσκοπική εξέταση του οικοπέδου QQ των παρατηρούμενων p-τιμές σε σχέση με την αναμενόμενη κατανομή δείχνουν ότι οι κορυφαίες SNPs άξιζαν την αξιολόγηση περαιτέρω (S1 αρχείου) , παρακινώντας μας να προχωρήσουμε με μια μελέτη αναπαραγωγής έχουν σχεδιαστεί για να εξετάσει κορυφαίες 20 SNPs (Πίνακας 2) που είχαν προεπιλεγεί από την εξουσία για την αντιγραφή, όπως περιγράφεται στις μεθόδους παρακάτω.

ο κάθετος άξονας δείχνει το (-log

10 μετασχηματισμένα) παρατηρήθηκε τιμή Ρ και ο οριζόντιος άξονας υποδεικνύει τη χρωμοσωμική θέση κάθε SNP. Βέλος υποδηλώνει τη θέση της rs60745952 και rs72737810, τα οποία δεν είναι μεμονωμένα διακριτά σε αυτή την κλίμακα της παρουσίασης.

Η

Ο οριζόντιος άξονας δείχνει SNPs κατά μήκος της χρωμοσωμικής περιοχής και τα αριστερά του άξονα δείχνει κατακόρυφη (-log

10 μεταμορφωθεί) παρατηρήθηκε P-αξίας. SNPs κοντά στην πιο σημαντική SNP (rs60745952) είναι χρώμα που κωδικοποιείται για να απεικονίσουν LD τους με αυτό το SNP (που προέρχεται ως ζεύγη τιμές R2 από τα δεδομένα HapMap CEU). rs60745952, το οποίο εμφανίζεται στην μοβ κύκλο, είναι σε ισχυρή LD με rs72737820, η οποία απεικονίζεται από το κόκκινο κύκλο. Τα εκτιμώμενα ποσοστά ανασυνδυασμού από HapMap απεικονίζονται στο δεξί κάθετο άξονα σε κυανό για να αντικατοπτρίζουν την τοπική δομή LD.

Η

Ο Πίνακας 2 παραθέτει τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν σε επικύρωση σύνολο δεδομένων # 1 για τους 20 SNPs προεπιλεγεί για δοκιμή σύνδεσης με το στάδιο IV έναντι σταδίου Ι ή ΙΙ καρκίνο του παχέος εντέρου. Replication παρατηρήθηκε για τους δύο SNPs στο χρωμόσωμα 4q31.1, rs72737810 και rs60745952. Στην επικύρωση σύνολο δεδομένων # 1, αυτές οι δύο SNPs έδειξε συσχέτιση με την ανάπτυξη της μεταστατικής νόσου στο p = 9.12×10

-4 (OR = 1,89? 95% CI: 1,27 – 2,82) και p = 8.05×10

-4 (OR = 1,89? 95% CI: 1,27 – 2,80), αντίστοιχα (Πίνακας 2). Η δύναμη του συνεταιρίζεσθαι για τις δύο αυτές συσχετίζονται SNPs υπέρβαση τόσο P & lt? 0,0044, η οποία ήταν προ-καθορισμένο όριο σημαντικότητας μας για την αντιγραφή (όπως περιγράφεται λεπτομερώς στο μεθόδους). Με δεδομένη την ισχυρή LD μεταξύ αυτών των SNPs, μπορούμε αυθαίρετα επιλεγμένο rs60745952 να αξιολογήσει στο δεύτερο σύνολο δεδομένων επικύρωσης. Στην μικρότερες, λιγότερο υψηλά τροφοδοτείται επικύρωση συνόλου δεδομένων # 2, η συσχέτιση μεταξύ rs60745952 και ανάπτυξης της μεταστατικής νόσου δεν ήταν στατιστικά σημαντική, αλλά η εκτίμηση επίδραση ήταν στην ίδια κατεύθυνση με αυξημένο κίνδυνο για την ελάσσονα αλληλόμορφο (OR = 1,31? 95% CI:. 0,81 – 2,12) (Σχήμα 3, Πίνακας Α)

η

Καθώς το σύνολο δεδομένων ανακάλυψη και τα δύο σύνολα δεδομένων επικύρωσης όλων έδειξε αυξημένο κίνδυνο της μεταστατικής νόσου στο παχύ έντερο ή κόλον και ασθενείς με καρκίνο του ορθού οι οποίοι μεταφέρουν το έλασσον αλληλόμορφο του rs60745952, μια μετα-ανάλυση διεξήχθη για να ληφθεί η καλύτερη δυνατή εκτίμηση του συνολικού μεγέθους αποτελέσματος. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3 (Πίνακας Β), η εκτίμηση περίληψη επίδραση για τη συνδυασμένη ανάλυση (μετα-ανάλυση) κάτω από ένα σταθερό μοντέλο επιδράσεις ήταν στατιστικά σημαντική (OR = 1,93? 95% CI: 1,50 – 2,49? Ρ = 5,20 χ 10

-7). Από τη στιγμή που παρατηρείται κάποια στοιχεία για ετερογένεια στην δοκιμασία της ομοιογένειας (Q-στατιστική = 5,01? Df = 2? Ρ = 0,08? Σχήμα 3, Πίνακας Α), αξιολογήσαμε επίσης την τυχαία μοντέλο εφέ και διαπίστωσε ότι οι εκτιμήσεις περίληψη επίδραση ήταν παρόμοια (OR = 1,92? 95% CI: 1,28, 2,87? p = 0.001)? Ωστόσο, όπως ήταν αναμενόμενο, το διάστημα εμπιστοσύνης ήταν αυστηρότεροι για το σταθερό μοντέλο εφέ.

Σας περαιτέρω αιτιολογημένη ότι, αν ένωση του rs6074592 σε κίνδυνο ανάπτυξης μεταστατικής νόσου οδηγήθηκε από ανισορροπία σύνδεσης με ένα αλληλόμορφο ευαισθησίας ιδρυτής μετάσταση, και αν αυτό αλληλόμορφο ιδρυτής είχε προκύψει πιο πρόσφατα από τον πληθυσμό Ashkenazi ως σύνολο, αυτό το αλληλόμορφο θα διαχωρισμού σε ένα μπλοκ απλότυπος αυξημένο μέγεθος υπάρχει στην μετάσταση έναντι μη μετάσταση συνδέεται γονιδιώματα. Για να δοκιμάσετε τη δυνατότητα αυτή, εξετάσαμε τη δομή LD της περιοχής κοντά στο SNP rs60745952 σε άτομα με σταδίου IV σε σχέση με το στάδιο Ι ή ΙΙ καρκίνων του παχέος εντέρου. Σχήμα 4 δείχνει οικόπεδα της Δ ‘μεταξύ rs60745952 (μπλε γραμμή) και όλες τις άλλες SNPs στην περιοχή. Η ομαδοποίηση των SNPs με D ‘= 1 έως rs60745952 ορίζει ένα απλότυπος που είναι σαφώς μεγαλύτερη σε άτομα με σταδίου IV σε σχέση με το στάδιο I /II καρκίνων του παχέος εντέρου, τόσο στην ανακάλυψη και τα σύνολα δεδομένων επικύρωσης # 1 (κόκκινοι κύκλοι στο σχήμα 4 δείχνουν την SNPs στο κοινό και στις δύο ανακάλυψη και την επικύρωση # 1 σύνολα δεδομένων). Πιο συγκεκριμένα, παρατηρήσαμε ότι ο αριθμός των SNPs με D ‘= 1 στο στάδιο IV (58, μετάθεση διακύμανσης = 11,71) ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από αυτή που παρατηρήθηκε στο στάδιο I /II (41, μετάθεση διακύμανσης = 7.60) στο σύνολο δεδομένων ανακάλυψη ( ρ = 2,73 × 10-5) (Πίνακας 3? S4 File). Τα αποτελέσματα στο σύνολο δεδομένων επικύρωσης # 1 ήταν παρόμοια, μόνο λίγο λιγότερο σημαντική (p = 5,00 × 10-5).

Κάθετος άξονας είναι η LD ως D »για τη rs60745952 SNP (μπλε γραμμή) και άλλες SNPs και κατάντη αυτής της τοποθεσίας διαθέσιμα στις συστοιχίες γονότυπου. Κόκκινες κουκκίδες υποδεικνύουν SNPs που ήταν στις συστοιχίες του γονότυπου τόσο στο Discovery συνόλου δεδομένων και επικύρωση Σύνολο δεδομένων # 1.

Η

Επιπλέον, εξετάσαμε την πιθανή συσχέτιση μεταξύ rs6074592 και Σταδίου IV έναντι της φάσης Ι /καρκίνο του παχέος εντέρου II σε έναν Καυκάσιο πληθυσμό των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου από το Κεντάκι και διαπίστωσε ότι η ένωση δεν ήταν στατιστικά σημαντική (OR = 0,89? 95% CI: 0,55 – 1,46? p = 0.65), γεγονός που υποδηλώνει τη σύνδεση μεταξύ rs6074592 και μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου είναι ειδικά για ασθενείς με Ασκενάζι εβραϊκής καταγωγής.

Συζήτηση

για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που αναφέρουν γενετικές συσχετίσεις της ανθρώπινης βλαστικής σειράς παραλλαγές με τον κίνδυνο ανάπτυξης μεταστάσεων του καρκίνου του παχέος εντέρου, ειδικά σε Η μελέτη αυτή παρατηρώντας ότι, μεταξύ των Ασκενάζι εβραϊκή άτομα με καρκίνο του παχέος εντέρου, μεταφορά ανηλίκου αλληλόμορφο για rs60745952 συσχετίστηκε σημαντικά με τις αναπτυσσόμενες στάδιο IV της νόσου, με μεταστάσεις μακρινό όργανο, έναντι εντοπισμένη σταδίου Ι ή ΙΙ της νόσου, με μια ή σχεδόν 2. Η έλασσον αλληλόμορφο για rs60745952 φέρεται από το 31% του γενικού πληθυσμού Ashkenazi, και έως και περίπου το 50% των Ashkenazi άτομα με καρκίνο του παχέος εντέρου σταδίου IV, και ως εκ τούτου συμβάλλει σημαντικά στην ανάπτυξη της μετάστασης του καρκίνου του παχέος εντέρου σε αυτόν τον πληθυσμό. Η πιθανότητα ότι υπάρχει σε αυτό τον πληθυσμό μια παραλλαγή ιδρυτής ευαισθησία μετάσταση σε ισχυρή ανισορροπία σύνδεσης (LD) με rs60745952 ανεξάρτητα προτείνεται από την παρατήρηση ότι στην Ασκενάζι άτομα με καρκίνο του παχέος εντέρου σταδίου IV, rs60745952 βρίσκεται σε ένα μπλοκ LD που είναι σημαντικά μεγαλύτερη από ό, τι παρατηρείται σε άτομα με μη μεταστατικό στάδιο Ι ή II ασθένεια. Εμείς περαιτέρω ότι η σύνδεση της rs60745952 με μεταστατική νόσο είναι πιθανό ειδικά για το εβραϊκό πληθυσμό Ashkenazi, καθώς δεν παρατηρήθηκε αυτή η ένωση, όταν αξιολογούνται στο γενικό Καυκάσιο πληθυσμό των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου από το Κεντάκι. Υπό το φως της πολύ διαφορετική εξελικτική ιστορία του εβραϊκού πληθυσμού Ashkenazi, οι διαφορές που παρατηρούνται δεν είναι έκπληξη.

Προηγούμενες μελέτες από την ομάδα μας [4] κατέδειξε ότι όλες οι σωματικές μεταλλάξεις ανιχνεύονται σε μεταστάσεις καρκίνου του παχέος εντέρου ήταν ήδη παρούσες σε προγενέστερες όγκους τους πρωτοπαθή καρκίνο του παχέος εντέρου. Έτσι μεταστάσεις του καρκίνου του παχέος εντέρου δεν απαιτούν την απόκτηση νέων μεταλλάξεων «οδηγός μετάσταση». Σε αυτή τη μελέτη, παρουσιάζουμε στοιχεία ότι ένα γενετικό στοιχείο της εξέλιξης μετάσταση μπορεί να κωδικοποιούνται στο γονιδίωμα του ξενιστή. Ενώ οι κερδοσκοπικές, είναι δυνατόν υποδοχής κωδικοποιημένα παράγοντες που σχετίζονται με τη μεταστατική διαδικασία θα περιλαμβάνει τα στοιχεία του ανοσοποιητικού συστήματος επιτήρησης, τα στοιχεία της αγγειακής διαπερατότητας ή /και την αγγειογένεση, και θεωρητικά στοιχεία μέσα σε καταρράκτες σηματοδότησης που θα μπορούσε να καθορίσει κυτταρικές αποκρίσεις σε ενεργοποιημένα ογκογονίδια ή απενεργοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων. Παρόμοια με τα ευρήματα πολλών μελετών GWAS, rs60745952 βρίσκεται σε μια διαγονιδιακή περιοχή, και δεν έχουμε άμεση απόδειξη των λειτουργικές διαφορές που σχετίζονται με τη μεταφορά αυτού του SNP. Μελλοντικές έρευνες αυτού του ζητήματος θα πρέπει να πραγματοποιείται σε βιολογικά δείγματα που λαμβάνονται συγκεκριμένα από τον πληθυσμό Ashkenazi.

Τα ευρήματα που αναφέρονται εδώ δεν θα ήταν πιθανόν να έχουν έρθει στο φως, εκτός για την πρόσληψη μας μια εξουσία καθοδηγείται σχεδιασμό για την αντιγραφή που επέτρεψε μας να διατηρήσει επαρκή εξουσία για να καταδείξει τη σημασία της σύνδεσης ακόμη και σε μια μέτρια ομάδα αντιγραφή μέγεθος. Η προσέγγιση αυτή θα είναι πιθανότατα αξία για άλλους ερευνητές που προσπαθούν να εμπλουτίσουν γενετικά για ένα σήμα σύνδεσης με τη μελέτη που επιλέγεται, αλλά μικρότερους πληθυσμούς, από εκείνα που έχουν τυπικά χρησιμοποιούνται για GWASs. Δοκιμές για τις διαφορές στη δομή LD συνάδει με παραλλαγές ιδρυτή της νόσου μπορεί επίσης να είναι χρήσιμες για GWASs σε αυτές τις μικρότερες, αλλά ιδιαίτερα επιλεγμένους πληθυσμούς.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι συμμετέχοντες στη μελέτη

Επισκόπηση.

ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου από τέσσερα διαφορετικά σύνολα δεδομένων χρησιμοποιήθηκαν σε αυτήν την αξιολόγηση. Όλοι οι ασθενείς είχαν διαπιστωθεί στο πλαίσιο ερευνητικά πρωτόκολλα εγκεκριμένα από τις Institutional Review Boards των αντίστοιχων θεσμών (Carmel Ιατρικό Κέντρο (Χάιφα), το Πανεπιστήμιο της Νότιας Καλιφόρνιας, Memorial Sloan-Kettering, και πανεπιστημιακά νοσοκομεία υπόθεση Medical Center), όπως περιγράφεται παρακάτω. Όλοι οι ασθενείς με την προϋπόθεση ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση. Όλες οι διαδικασίες συναίνεσης είχαν εγκριθεί από τις αντίστοιχες προαναφερθείσες Institutional Review Boards.

Discovery συνόλου δεδομένων.

Οι συμμετέχοντες προέρχονταν από τη μοριακή επιδημιολογία της παχέος μελέτη για τον καρκίνο (MECC), το οποίο είναι μια υπόθεση βασισμένη στον πληθυσμό -Έλεγχος μελέτη του περιστατικού του παχέος εντέρου και του ορθού περιπτώσεις καρκίνου που έχει περιγραφεί προηγουμένως [7]. Εν συντομία, οι ασθενείς από το βόρειο Ισραήλ έχουν προσληφθεί σε MECC από το 1998. Στο πλαίσιο της μελέτης MECC, ελήφθησαν βασικές δημογραφικές και κλινικές πληροφορίες, καθώς και δείγματα αίματος. Περιπτώσεις που έχουν επιλεγεί για προσδιορισμό του γονότυπου είχαν ιστολογικά επιβεβαιωμένο, μικροδορυφόρων σταθερή καρκίνου του παχέος εντέρου. Συγκεκριμένα, ο πληθυσμός της μελέτης που χρησιμοποιείται στο σύνολο δεδομένων ανακάλυψη για την αξιολόγηση αυτή αποτελούνταν από 89 άτομα με σταδίου IV καρκίνο του παχέος εντέρου με μεταστάσεις μακρινό όργανο, όλα σχετίζονται με το ήπαρ, και 234 άτομα με σταδίου Ι ή σταδίου II καρκίνων του παχέος εντέρου που είχαν περιοριστεί οργάνων και χωρίς μεταστατική διάδοση. Τα άτομα αυτά επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω ως υπόλοιπο μετάσταση-δωρεάν κατά τη διάρκεια κλινική παρακολούθηση διάρκειας τουλάχιστον 3 ετών. Έλεγχοι στον πληθυσμό της μελέτης ανακάλυψη σύνολο δεδομένων MECC αποτελούνταν από άτομα χωρίς προηγούμενο ιστορικό του παχέος εντέρου ή του ορθού καρκίνου και ατομικά ταιριαστό στις περιπτώσεις με βάση την ηλικία, το φύλο, και την πρωτοβάθμια ιστοσελίδα κλινική. 139 έλεγχοι γονότυπος και χρησιμοποιείται για την ποσοτικοποίηση του ανηλίκου συχνότητα αλληλόμορφο για την κορυφή SNPs. Όλοι οι ασθενείς είχαν αυτο-αναφερόμενη Ασκενάζι εβραϊκής καταγωγής.

Επικύρωση Σύνολο δεδομένων # 1.

Το πρώτο σύνολο δεδομένων επικύρωσης προήλθε από ένα δεύτερο ανεξάρτητο δείγμα των συμμετεχόντων στη μελέτη MECC που επιλέχθηκαν με λιγότερο περιοριστικά κριτήρια από ό, τι στο σύνολο δεδομένων ανακάλυψη. Συγκεκριμένα, η επικύρωση του συνόλου δεδομένων # 1 αποτελείται περαιτέρω άτομα είτε του παχέος εντέρου ή καρκίνο του ορθού, το στάδιο Ι και ΙΙ περιπτώσεις για τις οποίες μετεγχειρητική παρακολούθηση δεν ήταν διαθέσιμη, και τα άτομα των οποίων οι καρκίνοι δεν είχαν δοκιμαστεί για μικροδορυφορικού αστάθεια. Επιπλέον, το δείγμα αυτό περιλαμβάνονται τα άτομα με αυτο-αναφερόμενη Σεφαραδιτών καθώς και Ασκενάζι εβραϊκής καταγωγής. Το σύνολο δεδομένων επικύρωσης στην αξιολόγηση αυτή περιλαμβάνονται 89 στάδιο IV του παχέος περιπτώσεις καρκίνου και 373 σταδίου Ι και σταδίου II του παχέος περιπτώσεις καρκίνου. Έλεγχοι στο # 1 πληθυσμό της μελέτης επικύρωσης σύνολο δεδομένων αποτελείται από επιπλέον ασθενείς χωρίς προηγούμενο ιστορικό του παχέος εντέρου ή του καρκίνου του ορθού και ατομικά ταιριαστό στις περιπτώσεις με βάση την ηλικία, το φύλο, την εβραϊκή εθνότητα και την πρωτοβάθμια ιστοσελίδα κλινική.

Επικύρωση συνόλου δεδομένων # 2.

οι ασθενείς στο δεύτερο σύνολο δεδομένων επικύρωσης υποβλήθηκαν σε θεραπεία στο Memorial Sloan-Kettering, (MSKCC) και είχαν επιβεβαιώσει ιστολογικά καρκίνο του παχέος εντέρου. Οι ασθενείς διαπιστώθηκαν στο πλαίσιο δύο κλινικών πρωτοκόλλων MSKCC μεταξύ 2000 και 2010. Αυτή η μελέτη πληθυσμός ήταν επίσης λιγότερο περιοριστικό από το σύνολο δεδομένων ανακάλυψη στην εν λόγω επικύρωση σύνολο δεδομένων # 2 περιλαμβάνονται τα άτομα είτε του παχέος εντέρου ή του καρκίνου του ορθού και τα άτομα των οποίων οι καρκίνοι δεν είχαν δοκιμαστεί για μικροδορυφορικού αστάθεια. Αυτό το σύνολο δεδομένων επικύρωσης αποτελούνταν από 86 άτομα με καρκίνο του παχέος εντέρου σταδίου IV με μεταστάσεις μακρινό όργανο, όλα σχετίζονται με το ήπαρ, και 256 άτομα με σταδίου Ι ή σταδίου ΙΙ του παχέος εντέρου ή του ορθού, που ήταν όργανο περιορίζεται και χωρίς μεταστάσεις. Τα άτομα με αυτές τις μορφές καρκίνου πρώιμο στάδιο επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω ως υπόλοιπο μετάσταση δωρεάν κατά τη διάρκεια κλινική παρακολούθηση διάρκειας τουλάχιστον 3 ετών. Όλοι οι ασθενείς είχαν αυτο-αναφερόμενη Ασκενάζι εβραϊκής καταγωγής.

Κεντάκι Καυκάσου συνόλου δεδομένων.

Τα στοιχεία του πληθυσμού της μελέτης Κεντάκι έχουν περιγραφεί αλλού [8]. Εν συντομία, το σύνολο δεδομένων που χρησιμοποιούνται στην αξιολόγηση αυτή αποτελούνταν από 77 ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου σταδίου IV και 398 ασθενείς με σταδίου Ι /ΙΙ του καρκίνου του παχέος εντέρου. Όλοι οι ασθενείς σε αυτό το δείγμα ήταν Καυκάσιοι.

Απομόνωση DNA, Γονοτυπικές και Ποιοτικού Ελέγχου

Discovery συνόλου δεδομένων.

DNA από λεμφοκύτταρα πλήρες αίμα εξήχθη χρησιμοποιώντας το QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) και αποθηκεύθηκε στους -20 ° C μέχρι τη χρήση για προσδιορισμό του γονότυπου. Όλα τα δείγματα DNA υποβλήθηκαν σε ενίσχυση ολόκληρο το γονιδίωμα χρησιμοποιώντας το Illustra Genomiphi V2 DNA Amplification Kit (GE Healthcare, Waukesha, Wisconsin? Κατάλογος Νο 25660032). Τα δείγματα αποθηκεύονται στους -20 ° C.

Τα δείγματα γονότυπου στο 2,5 με 8 πλατφόρμα Illumina Omni. Τα δεδομένα καθαρίζονται χρησιμοποιώντας διαδικασίες ποιοτικού ελέγχου που συνιστώνται από την ομάδα εργασίας αναδύονται Genomics [9]. Οι διαδικασίες QC περιλαμβάνουν αξιολόγηση του δείγματος και το ποσοστό κλήσεων δείκτη, οι αναντιστοιχίες μεταξύ των φύλων (plink [10]? «-Έλεγχος Φύλου»), εις διπλούν, Hardy-Weinberg ισορροπία, δείγμα συγγένειας (plink [10]? «-genome»), Και διαστρωμάτωση του πληθυσμού. Συνολικά 1.491.783 SNPs συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση μετά την αφαίρεση των SNPs που είχε ελάσσονα συχνότητες αλληλόμορφου & lt? 0,01, δεδομένα που λείπουν σε μεγαλύτερη από 2% των δειγμάτων, ή Illumina GenTrain βαθμολογίες μικρότερη από 0,6. Συνολικά, 5 στάδιο IV ασθενείς, και 7 σταδίου Ι και ΙΙ οι ασθενείς, απομακρύνθηκαν από τις αναλύσεις για το γεγονός ότι τα ποσοστά κλήσης λιγότερο από 98%, για την αποτυχία του ελέγχου του φύλου ή για να είναι μια ακούσια διπλούν (βλ S1 αρχείου για περισσότερες λεπτομέρειες). Για τον έλεγχο για τη διαστρωμάτωση του πληθυσμού, οι δύο πρώτες κύριες συνιστώσες (PC) προήλθαν από πολυδιάστατη ανάλυση αποσύνθεσης χρησιμοποιώντας τη λειτουργία «cmdscale» στο R.

Επικύρωση Σύνολο δεδομένων # 1.

Η παχέος Διεπιστημονικές ( Corect) Μελέτη που διεξήχθη τον προσδιορισμό του γονοτύπου για την επικύρωση του συνόλου δεδομένων # 1. Γονοτυπική διεξήχθη χρησιμοποιώντας μια προσαρμοσμένη Affymetrix πλατφόρμα γονιδιώματος επίπεδο (το σύνολο Axiom® Corect) με περίπου 1,3 εκατομμύρια SNPs και indels? Ωστόσο, μόνο τα δεδομένα από SNPs αναγνωρίστηκε ως το Κορυφαία SNPs στο σύνολο δεδομένων ανακάλυψη εξήχθησαν από Corect για την ανάλυση αυτή (βλέπε Στατιστική ανάλυση). Τα δεδομένα καθαρίζονται χρησιμοποιώντας διαδικασίες ποιοτικού ελέγχου παρόμοιο με το σύνολο δεδομένων ανακάλυψη (βλ S2 αρχείου για λεπτομέρειες) [9].

Επικύρωση Σύνολο δεδομένων # 2.

Το DNA απομονώθηκε είτε από λεμφοκύτταρα ολικό αίμα ή από σταθεροποιημένα με φορμαλίνη ενσωματωμένα σε παραφίνη (FFPE) φυσιολογικό κολονικό ιστό χρησιμοποιώντας κιτ εκχύλισης Qiagen QIAamp DNA ή το DNA QIAamp Blood Kit Mini (Qiagen, Hilden, Germany) και αποθηκεύθηκε στους -20 ° C μέχρι τη χρήση για προσδιορισμό του γονότυπου. Όλα τα δείγματα DNA υπεβλήθησαν σε ενίσχυση ολόκληρο το γονιδίωμα χρησιμοποιώντας την Repli-g DNA Amplification Kit (Qiagen, CA). Για ένα υποσύνολο των δειγμάτων, τόσο FFPE και το αίμα που προέρχεται το DNA ήταν διαθέσιμα και χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο αντιστοιχίας των γονότυπων για τη διασφάλιση της ποιότητας. Προσδιορισμό του γονότυπου για rs60745952 έγινε χρησιμοποιώντας δοκιμασίες Sequenom iPlex και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας MassARRAY [11]. Γονότυπους κλήθηκαν χρησιμοποιώντας Typer 4.0.2 λογισμικού.

Κεντάκι Καυκάσου συνόλου δεδομένων.

Το DNA απομονώθηκε από όλα τα άτομα και χημεία ΑΒΙ TaqMan χρησιμοποιήθηκε για γονότυπο rs60745952. Αυτό που απαιτείται έθιμο σχεδιασμό των ανιχνευτών και εκκινητών από την ABI. PCR [40 Κύκλοι] πραγματοποιήθηκε σε ένα ΑΒΙ GeneAmp PCR System 9700 διπλή κεφαλή μέσου και του τελικού σημείου διαβάζει πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το ΑΒΙ 7900 Sequence Detection System.

Στατιστικές Αναλύσεις

λογιστικής παλινδρόμησης διεξήχθη σε αξιολογήσει την πιθανή συσχέτιση μεταξύ κάθε SNP και το στάδιο IV σε σχέση με τις φάσεις Ι και ΙΙ του παχέος εντέρου κάτω από ένα log-προσθετικό γενετικό μοντέλο. Παρότι οι αρχικές αναλύσεις που χρησιμοποιούνται plink [10], η τελική ανάλυση για rs60745952 στα τρία σύνολα δεδομένων της μελέτης χρησιμοποιήθηκαν SAS v9.2 (SAS Institute Inc., Cary, NC) για την κατάλληλη ένταξη των συμμεταβλητών θεωρώντας μόνο την ανεξαρτησία των ατόμων, όχι αλληλόμορφα [12 ], όπως εφαρμόζεται σε plink [10]. Όλες οι αναλύσεις παλινδρόμησης προσαρμόστηκαν για την ηλικία και το φύλο και, στην περίπτωση της ανακάλυψης και σύνολο δεδομένων επικύρωσης # 1, το οποίο ήταν GWAS, τα πρώτα 2 κύριες συνιστώσες. Επιπλέον, σε αυτά τα δύο σύνολα δεδομένων που εξετάστηκε κατά πόσον rs60745952 διεξήχθη σε ένα μεγαλύτερο απλότυπος στο στάδιο IV ασθενείς από ό, τι στο I /II ασθενείς σταδίου. Μετά τον εντοπισμό του κατάλληλου χρωμοσωμική περιοχή στο σύνολο δεδομένων ανακάλυψη χρησιμοποιώντας το πρότυπο LD παράγεται σε Haploview [13] (S3 File), υπολογίσαμε το D ‘μεταξύ κάθε SNP στο μπλοκ και rs60745952 και μετρήθηκε ο αριθμός των SNPs για τις οποίες D’ = 1. στην συνέχεια διεξάγεται δοκιμή μετάθεση για να ελεγχθεί αν ο αριθμός των SNPs με D ‘= 1 ήταν σημαντικά μεγαλύτερη στο στάδιο IV σε σχέση με το στάδιο I /II ασθενείς (S4 File).

Σχεδιασμός για την αντιγραφή Μελέτες

Στατιστική μοντελοποίηση προτείνει ότι μια ομάδα αντιγραφή των περιπτώσεων καρκίνου του παχέος εντέρου παρόμοιου μεγέθους με την ομάδα ανακάλυψη θα παρέχουν περίπου το 80% της ισχύος για να ελέγξετε μέχρι και 9 από τις πιο σημαντικές υποψηφίου μας SNPs (κορυφή SNPs) σε Bonferroni διορθωθεί επίπεδο σημαντικότητας 0,04 /9 (= 0,0044), συν 8 επιπλέον SNPs σε Bonferroni διορθωθεί επίπεδο σημαντικότητας 0,01 /8? έτσι το συνολικό σφάλμα τύπου 1 ελέγχθηκε για να είναι 0,05 (Ένα παρόμοιο σχέδιο χρησιμοποιήθηκε για τη δοκιμή φάσης III έναντι φάση Ι /ΙΙ ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου, αλλά μόνο η σύγκριση με τη φάση IV ασθενείς έχει αναφερθεί εδώ). Ισχύς για αναπαραγωγή υπολογίστηκε για κάθε SNP με βάση το 50% κατώτερο όριο εμπιστοσύνης του αντίστοιχου λόγου πιθανοτήτων [14] και την επικράτηση του SNP (βλέπε S5 αρχείου). Τρία από τα κορυφαία 9 SNPs συνοδεύονταν από SNP σύντροφος που κατέδειξε πλήρη ανισορροπία σύνδεσης στην ανακάλυψή μας ομάδα (D ‘= 1.0), και αυτά τα 3 σύντροφος SNPs προστέθηκαν στο σύνολο μας των κορυφαίων SNPs που πρόκειται να ελεγχθεί για την αντιγραφή, χωρίς στατιστικά προσαρμογή, για ένα σύνολο 20 SNPs προ-καθορίζεται για ανάλυση στην κοόρτη επικύρωσης. Πριν από την έναρξη της μελέτης επικύρωσης, αυτό το σχέδιο ανάλυση και οι ταυτότητες των 20 προκαθορισμένα SNPs κατατέθηκαν με τον υπεύθυνο του προγράμματος NCI επίβλεψη της μελέτης για την τεκμηρίωση ρεκόρ του σχεδιασμού της μελέτης. Πρόσθετες SNPs που ήταν παρόντες στην επικύρωση του συνόλου δεδομένων # 1 σειρά του γονότυπου δεν εξετάζονται στην παρούσα αξιολόγηση της μελέτης.

Ανάλυση συνδυασμένων δεδομένων (μετα-ανάλυση)

Τα αποτελέσματα σύνδεσης για την rs60745952 SNP στο τρία σύνολα δεδομένων της μελέτης με Ασκενάζι εβραϊκής καταγωγής (Discovery συνόλου δεδομένων, Επικύρωση Σύνολο δεδομένων # 1, Επικύρωση Σύνολο δεδομένων # 2) ενώθηκαν χρησιμοποιώντας μια μετα-ανάλυση με την προσέγγιση μέγεθος σταθμισμένο αντίστροφο δείγμα εφαρμοστεί σε μέταλλο [15]. Αξιολογήσαμε ομοιογένεια μεταξύ των αποτελεσμάτων σύνδεσης με τη χρήση της Q-test και υπολόγισε την εκτίμηση περίληψη αποτέλεσμα χρησιμοποιώντας ένα τυχαίο μοντέλο επιδράσεις [15]. Υπολογίσαμε την εκτίμηση περίληψη αποτέλεσμα χρησιμοποιώντας τόσο τα μοντέλα σταθερής και τυχαία επίδραση, δεδομένου ότι η τιμή p για τη δοκιμή της ομοιογένειας ήταν οριακά σημαντική (Πίνακας 3? P & lt? 0.10), γεγονός που υποδηλώνει κάποια ετερογένεια μπορεί να είναι παρούσα και η διακύμανση μεταξύ των μελετών θα πρέπει να είναι ενσωματωθεί στις αναλύσεις για την απόκτηση των ορίων εμπιστοσύνης.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 αρχείου. Γονοτυπική QA /QC Λεπτομέρειες για το Discovery συνόλου δεδομένων

doi:. 10.1371 /journal.pone.0146435.s001

(PDF)

S2 αρχείου. Γονοτυπική QA /QC Λεπτομέρειες για την επικύρωση Σύνολο δεδομένων # 1

doi:. 10.1371 /journal.pone.0146435.s002

(PDF)

S3 αρχείου. LD Οικόπεδα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0146435.s003

(PDF)

S4 αρχείου. Αξιολόγηση LD μέσω μεταθέσεων στο Discovery και επικύρωση # 1 Σύνολα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0146435.s004

(PDF)

S5 αρχείου. Επιλογή SNPs για την επικύρωση

doi:. 10.1371 /journal.pone.0146435.s005

(PDF)

Ευχαριστίες

Το περιεχόμενο αυτού του χειρογράφου δεν αντανακλούν απαραίτητα τις απόψεις ή πολιτικές του Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου ή κάποιο από τα συνεργαζόμενα κέντρα στην κοινοπραξία Corect, ούτε αναφορά εμπορικών επωνυμιών, εμπορικών προϊόντων ή οργανισμών υποδηλώνει την έγκριση από την κυβέρνηση των ΗΠΑ ή την σωστή εισαγωγή κοινοπραξία.