Abstract

Για να ελεγχθεί η υπόθεση ότι η ταυτόχρονη στόχευση του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) και ο αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού-β (ΤΟΡ-β) μπορεί να προσφέρει μία νέα θεραπευτική προσέγγιση στον καρκίνο του παγκρέατος, σίγηση EGFR με παρεμβολή RNA (shEGFR) συνδυάστηκε με ΤΟΡ-β δέσμευση του με διαλυτό υποδοχέα ΤΟΡ-β II (sTβRII). Επιδράσεις στον σχηματισμό αποικίας σε 3-διαστάσεων καλλιέργεια, ο σχηματισμός όγκου σε γυμνούς ποντικούς, και κατάντη σηματοδότησης παρακολουθήθηκαν. Σε αμφότερες τις ASPC-1 και τα κύτταρα Τ3Μ4, είτε shEGFR ή sTβRII ανέστειλε σημαντικά το σχηματισμό αποικιών. Ωστόσο, σε ASPC-1 κύτταρα, που συνδυάζει shEGFR με sTβRII μειωμένο σχηματισμό αποικίας πιο αποτελεσματικά από ό, τι είτε μόνη προσέγγιση, ενώ στα κύτταρα Τ3Μ4, shEGFR μεσολάβηση αναστολή σχηματισμού αποικίας αντιστράφηκε με sTβRII. Παρομοίως,

in vivo

ανάπτυξη του ASPC-1 που προέρχεται από όγκους εξασθένισε είτε shEGFR ή sTβRII, και ήταν σημαντικά κατασταλεί από τα δύο διανύσματα. Αντίθετα, Τ3Μ4 που προέρχονται από όγκους είτε απέτυχαν να σχηματίσουν ή ήταν πολύ μικρό, όταν μόνο EGFR σίγησε, και αυτά τα αποτελέσματα αντιστράφηκαν από sTβRII λόγω της αυξημένης πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Ο συνδυασμός των shEGFR και sTβRII μειώθηκε φωσφο-HER2, φωσφο-HER3, τα επίπεδα φωσφο-src (Tyr416) ​​phoshpo-ΕΚΚ και στα κύτταρα ASPC-1, αλλά αυξημένα επίπεδα τους στα κύτταρα Τ3Μ4. Επιπλέον, η αναστολή των δύο EGFR και HER2 με λαπατινίμπη ή src από SSKI-606, ΡΡ2, ή dasatinib, μπλοκάρει το sTβRII μεσολάβηση ανταγωνισμό σχηματισμού αποικίας σε κύτταρα Τ3Μ4. Μαζί, αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι ταυτόχρονα στόχευση του EGFR, ΤΟΡ-β, και μπορεί να αποτελέσει src μία νέα θεραπευτική προσέγγιση στην PDAC που αποτρέπει δηλητηριώδεις cross-talk μεταξύ μελών της οικογένειας EGFR και ΤΟΡ-β-dependent pathways

Citation.: Deharvengt S, M Marmarelis, Korc Μ (2012) Η ταυτόχρονη στόχευση του υποδοχέα EGF, TGF-β και Src σημεία σε νέα θεραπευτική προσέγγιση στον καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 7 (6): e39684. doi: 10.1371 /journal.pone.0039684

Επιμέλεια: Hidayatullah Γ Munshi, του Πανεπιστημίου Northwestern, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24 του Απρ 2012? Αποδεκτές: 29 Μάη, 2012? Δημοσιεύθηκε: 27 του Ιούν 2012

Copyright: © 2012 Deharvengt et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (NCI) χορηγεί CA-R37-075059 (ΜΚ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παγκρέατος αδενοκαρκίνωμα του πόρου (PDAC) είναι η τέταρτη κύρια αιτία θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο στις Ηνωμένες Πολιτείες, με ποσοστό επιβίωσης 5 ετών 6% [1]. Αυτά μελαγχολική στατιστικές οφείλονται, εν μέρει, με το προχωρημένο στάδιο του καρκίνου σε παρουσίαση, ένα χαμηλό ποσοστό της τέλεσης οπισθοεκτομής, πολλαπλές μοριακές αλλαγές που προωθούν παγκρέατος ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και την επιβίωση, την ένδειξη χημειοαντίσταση, και έντονη desmoplasia που μετριάζει τη διείσδυση των ναρκωτικών [2] – [5]. PDAC συνδέεται με μια υψηλή συχνότητα μεταλλάξεων στο Κ-

ras ογκογονίδιο

(95%), και το ρ16 (85%), ρ53 (75%) και Smad4 (55%) ογκοκατασταλτικών γονιδίων [4 ]. Επιπλέον, όταν το γονίδιο p16 δεν είναι μεταλλαγμένο, είναι επιγενετικώς σιγήσει [6]. Υπάρχει επίσης αυξημένη έκφραση του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) (EGFR), άλλοι υποδοχείς κινάσης τυροσίνης και τους συνδέτες τους, και παράγοντας μετασχηματισμού ανάπτυξης βήτα (TGF-β) ισομορφών [7]. EGFR μεσολαβεί κύτταρο-αυτόνομες καταρράκτες μιτογόνου και μιτογονική σηματοδότηση ενεργοποιώντας ποικίλες οδούς, συμπεριλαμβανομένων ενεργοποιημένων από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ), ρ38 ΜΑΡΚ, και κινάση Jun (JNK), ενώ ο ΤΟΡ-β ενεργοποιεί Smad-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από σηματοδότηση και πιστεύεται ότι ασκούν παρακρινείς επιδράσεις στα κύτταρα εντός του mircroenvironment όγκου σε PDAC [8] – [10].

υπερβολική ενεργοποίηση του EGFR και δυσλειτουργική σηματοδότηση από τον υποδοχέα TGF-β (TβR) εξαρτώμενη από μονοπάτια, όπως παρατηρείται σε PDAC, δημιουργεί πολλαπλές παρεκκλίνουσα αυτοκρινείς και παρακρινείς αλληλεπιδράσεις μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και μικροπεριβάλλοντος του όγκου που συμβάλλουν στην desmoplasia όγκου και ότι μπορούν να τέμνονται με μία ή την άλλη από τις δεκάδες σηματοδότησης καταρράκτες που εμπλέκονται στην πλειονότητα των PDACs [5], [11]. Δυστυχώς, η στόχευση του EGFR παρατείνει ελαφρώς μόνο την επιβίωση των ασθενών με PDAC, και μόνο όταν χορηγείται σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη [12], ενώ η αντι-TGF-β θεραπείες για PDAC σήμερα αναπτύσσονται και δοκιμάζονται σε προ-κλινικές μελέτες [13] – [15].

Δημιουργήσαμε πρόσφατα ένα 3-διαστάσεων σύστημα καλλιέργειας στο οποίο τα κύτταρα ενσωματωμένα σε Matrigel που αποτελείται από 3% του κολλαγόνου IV /λαμινίνης εμπλουτισμένο ζελατινώδη μέσο και τοποθετήθηκε επί ενός στερεοποιημένο στρώμα από μαλακό άγαρ [16] . Έχουμε διαπιστώσει ότι η ταυτόχρονη θεραπεία με ΤΟΡ-β1 και EGF ενισχυμένη ανάπτυξη σε αυτό το σύστημα μοντέλο 3-D σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι είτε αυξητικό παράγοντα μόνο του, και παρέχει αυξημένη χημειοαντίσταση σε κυτταροτοξικές ενώσεις [16]. Επιπλέον, η φαρμακολογική αναστολή της TβRI με SB431542 ή EGFR με erlotinib ενίσχυσε την αποτελεσματικότητα της gemcitabine και σισπλατίνη σε ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα και σε πρωτογενείς κυτταρικές καλλιέργειες καθιερώθηκαν από παγκρέατα της γενετικής μηχανικής μοντέλα ποντικών του PDAC [16], υπογραμμίζοντας την χρησιμότητα αυτής της 3 -D σύστημα καλλιέργειας για τη δοκιμή της αποτελεσματικότητας των θεραπευτικών παραγόντων.

Λόγω της σημασίας του EGFR και ΤΟΡ-β σε PDAC, επιδιώξαμε να ελεγχθεί η υπόθεση ότι η στόχευση και τις δύο οδούς μπορεί να ασκήσει ευεργετική αύξηση κατασταλτική επιδράσεις που είναι μεγαλύτερες από την καταστολή είτε οδού μόνο. Επειδή μικρού μορίου αναστολείς που στοχεύουν EGFR και TβRI μπορεί να ασκήσει μη ειδικές επιδράσεις και /ή μπορούν να στοχεύουν συνδέονται στενά με κινάσες, χρησιμοποιήσαμε μια πιο συγκεκριμένη προσέγγιση που αποτελείται από μια στρατηγική σιγαστήρα για να καταστείλει την έκφραση EGFR και ένα διαλυτό στρατηγική TβRII να απομονώνουν ΤΟΡ-β συνδέτες . Εμείς τώρα αναφέρουν ότι η ταυτόχρονη καταστολή των δύο οδών εξασθενημένο σχηματισμό αποικίας του ASPC-1 ανθρώπινου παγκρεατικού καρκίνου κύτταρα που αναπτύσσονται σε καλλιέργεια και ανάπτυξης όγκου 3-D

in vivo

, αλλά στοχεύουν ΤΟΡ-β αντέστρεψε τις ανασταλτικές της ανάπτυξης επιδράσεις που ασκούνται με σίγηση EGFR σε Τ3Μ4 ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, και αυτή η αντιστροφή συνέβη σε συνδυασμό με την ενεργοποίηση src όπως αντικατοπτρίζεται από αυξημένη φωσφορυλίωση τυροσίνης src επί 419.

Αποτελέσματα

Επιδράσεις της EGFR Knockdown και sTβRII Έκφραση σε σχηματισμού αποικίας

Ανθρώπινο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές εκφράζουν παράγοντα μετασχηματισμού άλφα ανάπτυξης (ΤΟΡ-α) και άλλους παράγοντες ανάπτυξης που ενεργοποιούν τον EGFR [17] – [19], καθώς και οι τρεις ΤΟΡ-β [20]. Για να καθοριστεί εάν κατάργηση EGFR και ΤΟΡ-β σηματοδότηση διαμορφωμένου την ανάπτυξη τέτοιων κυτταρικών σειρών, ASPC-1 και τα κύτταρα Τ3Μ4 συν-μολύνθηκαν σε m.o.i. 10 για κάθε ιό με shRNA-φακοϊό στόχευση της λουσιφεράσης (shLuc-LV με pWPT-GFP), EGFR (shEGFR-LV με pWPT-GFP), sTβRII (hLuc-LV με pWPT-sTβRII), ή και τα δύο EGFR και sTβRII (shEGFR -lv με pWPT-sTβRII). shEGFR-LV καταστέλλεται αποτελεσματικά επίπεδα EGFR, ενώ η έκφραση pWPT-sTβRII συνδέθηκε με την παρουσία άφθονα επίπεδα του sTβRII πρωτεΐνης στο μέσο και στις τέσσερις κυτταρικές σειρές (Εικ. 1Α).

(Α) ASPC-1 και Τ3Μ4 ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα μολύνθηκαν με shLuc-LV (shLuc), shEGFR-LV (shEGFR), WPT-sTβRII (sTβRII), ή και τα δύο shEGFR και sTβRII. Τα κυτταρολύματα και ρυθμισμένα μέσα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση με αντι-EGFR και αντισωμάτων αντι-ΗΑ-tag, αντίστοιχα, τα τελευταία χρησιμεύει για να επιβεβαιώσει την απελευθέρωση sTβRII από τα καρκινικά κύτταρα. Ένα αντίσωμα αντι-ΕΚΚ χρησίμευσε για την αξιολόγηση φόρτωση λωρίδα. (Β) Οι συνέπειες του EGFR φίμωση με shEGFR και ΤΟΡ-β παγίδευσης με sTβRII αξιολογήθηκαν με παρακολούθηση σχηματισμού αποικιών σε καλλιέργεια 3-D (Β). Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SE τριπλών καθορισμών από τρία ανεξάρτητα πειράματα. * Ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01, σε σύγκριση με τις αντίστοιχες ελέγχους

Η

Οι συνέπειες της αποσιώπησης EGFR και ΤΟΡ-β παγίδευσης αξιολογήθηκαν επόμενο με παρακολούθηση σχηματισμού αποικιών σε μια δοκιμασία καλλιέργειας 3-D. στην οποία Matrigel παρέχει ένα ακυτταρικό ικρίωμα και μαλακό άγαρ υποστηρίζει ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη [16]. Επιλέξαμε να χρησιμοποιήσει αυτό το πρότυπο σύστημα 3-D αφού έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι η ταυτόχρονη θεραπεία με TGF-β1 και του ΕΤΠ σε αυτό το ενισχυμένο μοντέλο ανάπτυξης σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι είτε παράγοντα ανάπτυξης και μόνο [16], επαναλαμβάνοντας έτσι όγκο ΤΟΡ-β αποτελέσματα προαγωγής καταδειχθεί προηγουμένως στο ξενομόσχευμα και ορθοτοπική ποντίκι μοντέλα PDAC [13] – [14]. σχηματισμός αποικίας με ASPC-1 κύτταρα μολυσμένα με pWPT-sTβRII ή shEGFR-LV μειώθηκε κατά 21% (ρ & lt? 0,05) και 33% (ρ & lt? 0,01), αντίστοιχα, ενώ μόλυνση με τόσο shEGFR-LV και pWPT-sTβRII κατέληξε σε ένα 56% (ρ & lt? 0,01) μείωση στον αριθμό των αποικιών σε σύγκριση με shLuc εκφράζουν ASPC-1 κύτταρα (Σχήμα 1 Β).. Αντίθετα, μετά από μόλυνση με shEGFR-LV, τον σχηματισμό αποικίας από κύτταρα Τ3Μ4 μειώθηκε κατά 45% (ρ & lt? 0,05), ενώ pWPT-sTβRII εξασθενημένο σχηματισμό αποικίας σε κύτταρα Τ3Μ4 κατά 27% (ρ & lt? 0,05). Ωστόσο, pWPT-sTβRII αντέστρεψε πλήρως τις ανασταλτικές δράσεις του shEGFR-LV επί του σχηματισμού αποικιών (Σχ. 1Β). Έτσι, ASPC-1 κύτταρα παρουσίασαν συνεργιστική ανασταλτική δράση επί του σχηματισμού αποικιών όταν μολύνονται τόσο με shEGFR-LV και pWPT-sTβRII, ενώ στα κύτταρα Τ3Μ4 υπήρχε παράδοξη αντιστροφή από pWPT-sTβRII των ανασταλτικών δράσεων της shEGFR-LV.

Για να προσδιοριστεί κατά πόσον άλλοι καρκίνο του παγκρέατος κυττάρων επένδυση που συμπεριφέρεται σαν κύτταρα Τ3Μ4, είμαστε δίπλα πραγματοποίησε την δοκιμασία σχηματισμού αποικιών λεπτομερώς στο COLO-357 και PANC-1 παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (Εικ. S1). COLO-357 κύτταρα ήταν μόνο ανάπτυξη αναστέλλεται σε απάντηση ταυτόχρονη νοκ ντάουν EGFR και έκφραση sTβRII. Αντίθετα κύτταρα PANC-1 ανάπτυξη αναστέλλεται από knockdown EGFR, αλλά παρουσίασαν αντιστροφή αυτού του ανασταλτικού αποτελέσματος ανάπτυξης παρουσία του sTβRII (Εικ. S1).

Σε βιολογικό περιβάλλον αποτελέσματα των EGFR Knockdown και sTβRII Έκφραση

στη συνέχεια εξετάσαμε τις συνέπειες της αποσιώπησης EGFR και έκφραση sTβRII σε ένα υποδόριο μοντέλο όγκου γυμνού ποντικού, για να καθοριστεί αν η παράδοξη αντιστροφή του EGFR σίγασης που παρατηρείται στο 3-D

in vitro

μοντέλο εμφανίστηκε επίσης

in vivo

. Σε σύγκριση με τους όγκους που δημιουργούνται από ASPC-1 κύτταρα μολυσμένα με shLuc-LV, οι όγκοι του όγκου κατά την ημέρα 24 μειώθηκαν κατά 36% (p & lt? 0,05) με shEGFR-LV, 38% (p & lt? 0,05) με pWPT-sTβRII, και 85% (ρ & lt? 0,01) με δύο φορείς (Σχήμα 2Α).. Επιπλέον, 2 από 8 ποντικούς που έλαβαν ένεση με pWPT-sTβRII εκφράζουν ASPC-1 κύτταρα ήταν χωρίς όγκο. Δραματικά, 4 από 8 ποντικούς που έλαβαν ένεση με κύτταρα ASPC-1 που εκφράζουν τόσο pWPT-sTβRII και shEGFR-LV ήταν χωρίς όγκο την ημέρα 24, και τα υπόλοιπα 4 όγκοι έγιναν ορατές μόνο 21 ημέρες μετά την ένεση των καρκινικών κυττάρων. Στην περίπτωση των Τ3Μ4 προερχόμενων όγκους, τερματίστηκαν πειράματα την ημέρα 16 λόγω της ταχείας ανάπτυξης του όγκου σε δύο από τις τέσσερις ομάδες. Σε αυτό το χρονικό σημείο, ο όγκος του όγκου μειώθηκε κατά 37% (ρ & lt? 0,05) για κύτταρα μολυσμένα με pWPT-sTβRII και κατά 97% (ρ & lt? 0,01) για shEGFR-LV-μολυσμένα κύτταρα (Εικ. 2Β). Αντίθετα, τα κύτταρα που έχουν μολυνθεί με Τ3Μ4 τόσο pWPT-sTβRII και shEGFR-LV σχηματίζονται μεγάλους όγκους, καθένα από τα οποία εμφάνισε περιοχές νέκρωσης (Εικ. 2Β).

ASPC-1 (Α) και Τ3Μ4 κύτταρα (Β) μολύνθηκαν με shLuc-LV (shLuc), shEGFR-LV (shEGFR), sTβRII, ή και τα δύο EGFR-LV και sTβRII, και ενίεται υποδορίως (μία ένεση ανά ποντικό) στην περιοχή του πλευρού γυμνών ποντικών. Οι όγκοι των όγκων παρακολουθήθηκαν για την ενδεικνυόμενη αριθμό ημερών. Οι τιμές είναι ο μέσο ± SEM 8 ποντικών ανά ομάδα, που αναφέρεται στον παρονομαστή στα δεξιά του κάθε καμπύλη. Ο αριθμός των όγκων που σχηματίζονται σε κάθε ομάδα υποδεικνύεται στον αριθμητή. * P & lt? 0,05 και ** p & lt?. 0.01, σε σύγκριση με τους αντίστοιχους ελέγχους

Η

Οι όγκοι που προκύπτουν είτε από ASPC-1 ή Τ3Μ4 κύτταρα παρουσίασαν άφθονα Ki-67 ανοσοδραστικότητα και εστίες CD-31- θετικά ενδοθηλιακά κύτταρα (Σχ. 3Α). Σε ASPC-1 που προέρχεται από όγκους, η έκφραση της pWPT-sTβRII δεν μετέβαλε τον πολλαπλασιασμό, ενώ η έκφραση του shEGFR-LV συσχετίστηκε με 60% (ρ & lt? 0,05) μείωση τόσο Ki-67 και CD31 ανοσοαντιδραστικότητα, και η έκφραση και των δύο φορέων προκάλεσε περαιτέρω μείωση της Ki-67 (72%, ρ & lt? 0,01) και CD31 (76%, ρ & lt? 0,01) ανοσοαντιδραστικότητα (Εικ. 3Α). Σε κύτταρα Τ3Μ4, η έκφραση του pWPT-sTβRII συσχετίστηκε με μείωση του πολλαπλασιασμού (40%, ρ & lt? 0,01) και την αγγειογένεση (77%, ρ & lt? 0,01), η έκφραση του shEGFR-LV δεν μετέβαλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό αλλά εμφανώς μειωμένη CD31 ανοσοαντιδραστικότητα (71 %, p & lt? 0.01), ενώ η έκφραση των δύο φορέων σημαντικά αυξημένο πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων (196%, p & lt? 0,01) παρά την επίμονη μείωση (85%, p & lt?.. 0.01) σε CD31 ανοσοαντιδραστικότητα (Σχήμα 3Α)

Α. Οι ASPC-1- και Τ3Μ4 προερχόμενο όγκους που περιγράφονται στο σχήμα 2 ανοσοχρωματίστηκαν για Κί67 να εκτιμήσει τον πολλαπλασιασμό και CD31 για την αξιολόγηση της αγγειογένεσης. B. Οι ίδιες οι όγκοι βαθμολογήθηκαν για TUNEL-poisitive κύτταρα και διασπασμένη PARP ανοσοαντιδραστικότητα για την αξιολόγηση της απόπτωσης. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SEM των τριπλών προσδιορισμών από τρία ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt? 0,05 και ** p & lt? 0,01, σε σύγκριση με τους αντίστοιχους ελέγχους

Η

Λόγω της παρουσίας των περιφερειών της νέκρωσης σε όγκους Τ3Μ4 εκφράζουν τόσο pWPT-sTβRII και shEGFR-LV, αυτό. ήταν σημαντικό να αποφευχθούν ψευδή αποτελέσματα που μπορεί να προκύψουν σε περιοχές που πρόκειται να υποβληθούν νέκρωση. Ως εκ τούτου, τόσο η δοκιμασία TUNEL και διασπάται ανοσοχρώση PARP πραγματοποιήθηκαν δίπλα σε αξιολόγηση απόπτωσης, και οι δύο μέθοδοι αποδίδοντας γενικά συγκλίνουσες αποτελέσματα (Σχ. 3Β). Έτσι, pWPT-sTβRII δεν μετέβαλε σημαντικά το ποσοστό κυττάρων που υφίστανται απόπτωση είτε ASPC-1 ή Τ3Μ4-drived όγκους, ενώ η έκφραση shEGFR-LV συσχετίστηκε με μια σημαντική αύξηση στην απόπτωση σε κύτταρα ASPC-1 (ρ & lt? 0,01), αλλά όχι σε κύτταρα Τ3Μ4. Επιπλέον, σε ASPC-1 που προέρχεται από όγκους, pWPT-sTβRII δεν μετέβαλε shEGFR-LV-σχετίζεται απόπτωση, αλλά σε Τ3Μ4 προερχόμενα όγκους συνδέθηκε με αυξημένη απόπτωση (Σχ. 3Β).

Επίδραση του EGFR νοκ ντάουν και sTβRII Έκφραση σε φωσφορυλίωση μέλος του EGFR Μέλη της οικογένειας

EGFR, HER2 και HER3 όλα έχουν ενοχοποιηθεί για την παθολογία των PDAC [7], [21] – [23]. Από EGFR σχηματίζει ετεροδιμερή με HER2 και HER3, ήταν σημαντικό να προσδιοριστεί αν σίγηση του θα μπορούσε να διαμορφώνει σηματοδότηση από αυτά τα μέλη της οικογένειας του EGFR. Ως εκ τούτου, κυτταρολύματα ASPC-1 και Τ3Μ4 υποβλήθηκαν σε ανοσοστύπωση για την αξιολόγηση των επιπέδων της φωσφο-HER2, και φωσφο-HER3 (Σχ. 4Α). Η πυκνομετρική ανάλυση των δεδομένων από τρία πειράματα έδειξαν ότι η έκφραση pWPT-sTβRII σε ASPC-1 κύτταρα προκάλεσε μια 17% και 20% μείωση στα επίπεδα, αντίστοιχα φωσφο-HER2 και φωσφο-HER3 (ρ & lt? 0,05), ενώ EGFR knockdown προκάλεσε μια 61% μειώνονται σε επίπεδα φωσφο-HER2 (ρ & lt? 0,01) και μία μείωση κατά 30% σε φωσφο-HER3 (ρ & lt? 0,01) επίπεδα. ASPC-1 κύτταρα που εκφράζουν τόσο shEGFR-LV και pWPT-sTβRII παρουσίασαν παρόμοια μείωση στα επίπεδα φωσφο-HER2 (52%, p & lt? 0.01), αλλά μια πιο έντονη μείωση στα επίπεδα φωσφο-HER3 (56%, p & lt? 0,01). Αντίθετα, στα κύτταρα Τ3Μ4, pWPT-sTβRII δεν μεταβάλλουν τα επίπεδα φωσφο-HER2 ή φωσφο-HER3, ενώ EGFR knockdown συσχετίστηκε με αυξημένα επίπεδα και των δύο φωσφο-υποδοχέων (Σχ. 4Α). Σε τρία πειράματα, υπήρξε μια αύξηση 60% σε φωσφο-HER2 και τα επίπεδα φωσφο-HER3 σε κύτταρα Τ3Μ4 εξής knockdown EGFR, και 100% και 80% αυξήσεις στη φωσφο-HER2 και τα επίπεδα φωσφο-HER3, αντίστοιχα, σε κύτταρα που εκφράζουν και τις δύο διανύσματα .

(Α) Επιπτώσεις στην φωσφορυλίωση των υποδοχέων. ASPC-1 και Τ3Μ4 κύτταρα μολύνθηκαν όπως δεικνύεται με shLuc-LV (shLuc), shEGFR-LV (shEGFR), WPT-sTβRII (sTβRII), ή και των δύο shEGFR και sTβRII. Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση με αντισώματα που κατευθύνονται εναντίον των υποδεικνύονται υποδοχείς και φωσφο-υποδοχείς. (Β) Τα κύτταρα μολύνθηκαν όπως αναφέρεται στο Α, και προϊόντα λύσης κυττάρου υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση με αντισώματα που κατευθύνονται εναντίον των αναφερομένων πρωτεϊνών και φωσφο-πρωτεϊνών. Κάθε πίνακας δείχνει τα δεδομένα από έναν εκπρόσωπο από τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα. Και στις δύο πίνακες Α και Β, immnoblotting με ένα αντίσωμα αντι-ΕΚΚ επιβεβαίωσε ισοδύναμη φόρτιση λωρίδας, αλλά δεν είναι όλοι οι κηλίδες ERK δείξει.

Η

Για να προσδιορίσετε αν HER2 και HER3 φωσφορυλίωση επίσης διαμορφωμένο

στο vivo

σε κύτταρα Τ3Μ4, όγκους που προέρχονται από τα κύτταρα αυτά αξιολογήθηκαν από immunohistochemsitry (Εικ. S2). Μέτρια φωσφο-HER2 ανοσοαντιδραστικότητα ήταν εμφανής σε όγκους από κύτταρα μολυσμένα με shLuc, και shEGFR-LV, η οποία μειώθηκε σε όγκους που έχουν μολυνθεί με pWPT-sTβRII, αλλά αυξήθηκε σε όγκους που εκφράζουν και τις δύο διανύσματα. Αντίθετα, φωσφο-HER3 ανοσοαντιδραστικότητα ήταν χαμηλή σε όγκους από shLuc-μολυσμένα κύτταρα Τ3Μ4, αυξήθηκε ελαφρά σε pWPT-sTβRII εκφράζουν όγκων, μέτρια αύξηση shEGFR-LV που εκφράζουν όγκους, και σημαντικά αυξημένη σε όγκους που εκφράζουν και τις δύο φορείς (Εικ. S2 ). Έτσι, τόσο HER2 και HER3 ενεργοποιούνται ανωμάλως

in vivo

στα κύτταρα Τ3Μ4 όταν και οι δύο EGFR και TGF-β μονοπάτια έχουν μπει στο στόχαστρο.

Επιπτώσεις του EGFR Νοκ ντάουν και sTβRII Έκφραση σε μεταγενέστερους Σηματοδοσίας

ΕΚΚ, src, και AKT είναι μιτογόνο και προ-επιβίωσης ενότητες που είναι μεταγενέστερος των μελών της οικογένειας του EGFR και ότι συμβάλλουν στην PDAC εξέλιξη [12] σηματοδότησης, [24]. Ως εκ τούτου, ASPC-1 και λύματα κυττάρων Τ3Μ4 υποβλήθηκαν σε ανοσοστύπωση για την αξιολόγηση των επιπτώσεων των knockdown EGFR και έκφραση sTβRII σε αυτά τα μονοπάτια (Εικ. 4Β). Σε κύτταρα ASPC-1, shEGFR-LV, pWPT-sTβRII, και ο συνδυασμός τους συνδέθηκε με εξασθενημένο επίπεδα φωσφο-ΕΚΚ, αλλά μόνο ο συνδυασμός μείωσε φωσφο-ΑΚΤ επίπεδα, ενώ καμία από αυτές τις συνθήκες διαμολύνσεως επήγαγε την de-φωσφορυλίωση της Src (Tyr527 ), το οποίο θα είναι ανακλαστικό της ενεργοποίησης src (Εικ. 4Β). Αντίθετα, στα κύτταρα Τ3Μ4, shEGFR-LV μόνο του ή σε συνδυασμό με pWPT-sTβRII οδήγησε σε αυξημένη φωσφο-ΕΚΚ και μειωμένη φωσφο-src (Tyr527) επίπεδα, χωρίς μεταβολή της φωσφο-ΑΚΤ επίπεδα (Σχ. 4Β).

για να επιβεβαιώσετε ότι ο συνδυασμός των shEGFR-LV και pWPT-sTβRII ενεργοποιηθεί src στα κύτταρα Τ3Μ4, λύματα υποβλήθηκαν επίσης σε μια συστοιχία αντισωμάτων φωσφο-κινάσης. EGFR σιγαστήρα οδήγησε σε αναστολή της φωσφορυλίωσης του src (Tyr419), Fyn, Hck, Lyn, ναι και Fgr, η οποία ήταν ιδιαίτερα έντονη σε σχέση με το src (Εικ. 5). Αντιθέτως, η έκφραση του sTβRII ανέστειλε την φωσφορυλίωση της Lyn Ναι, και Fgr, χωρίς να μεταβάλλεται src, Fyn ή Hck φωσφορυλίωσης (Εικ. 5). Ωστόσο, τα ανασταλτικά αποτελέσματα του shEGFR-LV σε όλα τα 6 κινάσες πλήρως αντιστραφεί από sTβRII (Εικ. 5), υποδεικνύοντας ότι η έκφραση του sTβRII επανενεργοποιηθεί src οικογένεια κινασών.

κύτταρα Τ3Μ4 μολύνθηκαν με shLuc-LV (shLuc ), shEGFR-LV (shEGFR), και /ή WPT-sTβRII (sTβRII) όπως υποδεικνύεται. Τα κυτταρολύματα στη συνέχεια αναλύθηκαν με ένα φωσφο-κινάση συστοιχία αντισωμάτων για την αξιολόγηση της κατάστασης φωσφορυλίωσης των υποδεικνυόμενων μέλη της οικογένειας src. Τα αποτελέσματα προσδιορίστηκαν ποσοτικά όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SEM των τριπλών προσδιορισμών από τρία ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01 και *** ρ & lt? 0.001, σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Επιπτώσεις της HER2 κατασιγάσει και src Αναστολή για Σχηματισμού Αποικίας σε Τ3Μ4 κύτταρα

Εμείς επόμενο επιδίωξε να αξιολογηθεί ο ρόλος των HER2 στη διαμεσολάβηση τα δηλητηριώδη αποτελέσματα της ταυτόχρονης EGFR στόχευσης και ΤΟΡ-β. Όπως ήταν αναμενόμενο, shEGFR-LV αξιοσημείωτα κατέστειλε τα επίπεδα EGFR σε κύτταρα Τ3Μ4, shHER2-LV αξιοσημείωτα κατέστειλε τα επίπεδα HER2, ενώ μόλυνση με τους δύο φορείς σιγήσει την έκφραση και των δύο EGFR και HER2 (Εικ. S3). Επιπλέον, τα κύτταρα που εκφράζουν είτε Τ3Μ4 shEGFR-LV ή shHER2-LV παρουσίασαν σημαντική μείωση του αριθμού των αποικιών στη δοκιμασία 3-D (Σχ. 6Α). Στην περίπτωση των shEGFR-LV, αλλά όχι shHER2-LV ή shEGFR-LV μαζί με shHER2-LV, αυτή η επίδραση αντιστράφηκε από pWPT-sTβRII (Σχ. 6Α). Έτσι, η ταυτόχρονη μόλυνση με shEGFR-LV και shHER2-LV σημαντικά ανέστειλε την ανάπτυξη των αποικιών (66%, p & lt? 0,01). Παρομοίως, λαπατινίμπη (1 μΜ), ένας αναστολέας κινάσης διπλής τυροσίνης που διακόπτει HER2 και EGFR μονοπάτια σηματοδότησης, μειωμένος αριθμός αποικιών κατά 47% (ρ & lt? 0,01) και απέτρεψε την αντιστροφή παρατηρήθηκε μετά από συν-μόλυνση με shEGFR-LV και pWPT-sTβRII ( Εικ. 6).

Α. HER2 σιγαστήρα και αναστολή. κύτταρα Τ3Μ4 μολύνθηκαν με shLuc-LV (shLuc), shEGFR-LV (shEGFR), shHER2-LV (shHER2), ή και τα δύο shEGFR και shHER2, εν τη απουσία ή παρουσία WPT-sTβRII (sTβRII) ή 1 μΜ lapatinip. σχηματισμός αποικίας παρακολουθήθηκε σε 3-D καλλιέργειας. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SEM των τριπλών προσδιορισμών από τρία ανεξάρτητα πειράματα. * Ρ & lt? 0,05, και ** ρ & lt? 0,01, σε σύγκριση με τον έλεγχο. B. Επιπτώσεις της αναστολής c-Src. κύτταρα Τ3Μ4 επωάστηκαν απουσία ή παρουσία των αναστολέων της κινάσης src SKI-606 (1 μΜ), ΡΡ2 (1 μΜ) και dasatinib (100 ηΜ), και προσδιορίστηκαν τα αποτελέσματα επί του σχηματισμού αποικιών σε 3-D καλλιέργειας. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SE τριπλών καθορισμών από τρία ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, σε σύγκριση με τους αντίστοιχους ελέγχους

Η

Κατά την άποψη του up-ρύθμιση του φωσφο-src (Tyr419) και την αποφωσφορυλίωση Src (Tyr527) από το. συνδυασμός shEGFR-LV και pWPT-sTβRII στο Τ3Μ4 κύτταρα, επιδιώξαμε να προσδιορίσει αν οι καταστροφικές επιπτώσεις αυτού του συνδυασμού μπορεί να διαμεσολαβείται από ενεργοποιείται src. Ως εκ τούτου, εξετάστηκαν οι επιπτώσεις των τριών διακριτών αναστολέων src στον σχηματισμό αποικίας σε 3-D πολιτισμό επόμενο. Μόνο dasatinib (100 ηΜ) ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων Τ3Μ4 μολυνθεί με shLuc-LV (Εικ. 6Β). Ωστόσο, SKI-606 (1 μΜ), ΡΡ2 (1 μΜ), και dasatinib (100 ηΜ) μπλοκάρει πλήρως την pWPT-sTβRII μεσολάβηση αναστροφή της shEGFR-LV-επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης (Εικ. 6Β), υποδεικνύοντας ότι αυτή η επίδραση ήταν εξαρτάται από την δραστηριότητα src κινάση.

Συζήτηση

τα μέλη της οικογένειας EGF, συμπεριλαμβανομένων των TGF-α, που δεσμεύει την ηπαρίνη EGF αυξητικό παράγοντα (ΗΒ-EGF), betacellulin, και αμφιρεγουλίνη, είναι εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε PDAC και δρουν επί των καρκινικών κυττάρων σε PDAC και σχετικά με τα παρακείμενα στοιχεία στρωματικά [7]. ενεργοποίηση του EGFR από αυτούς τους συνδετήρες ξεκινά πολλαπλές καταρράκτες σηματοδότησης, όπως Ras /Raf /MAPK και Rac /JNK /ΜΑΡΚ-p38 [24]. EGFR ετεροδιμερισμό με άλλα μέλη της οικογένειας EGFR οδηγεί στην ενεργοποίηση των άλλων οδών σηματοδότησης που περιλαμβάνουν Src, Raf1, Β-Raf, Crk, και Nck, οι οποίες προωθούν περαιτέρω την εξέλιξη του όγκου και της βιολογικής επιθετικότητα [25]. EGFR δια-συνομιλία με πολλαπλές οδούς ενισχύεται από την υψηλή συχνότητα των Kras και Smad4 μεταλλάξεις, και από την αφθονία του ΤΟΡ-β η οποία μεταβάλλει την εξωκυττάρια μήτρα κατά τρόπο που προάγει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, επάγει παρεκκλίνουσα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά αλληλεπιδράσεις, ενισχύει την αγγειογένεση, και προωθεί μετάσταση [4] – [7], [10], [13] – [14], [26] – [27]. Επιπλέον, ΤΟΡ-β συνεργεί με EGF στην προώθηση του πολλαπλασιασμού σε καλλιέργεια 3-D [16]. Μαζί, αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι μονοπάτια σηματοδότησης παρεκκλίνουσα EGFR και ΤΟΡ-β-εξαρτώμενη είναι κομβικής σημασίας για την προώθηση του παγκρέατος εξέλιξη του καρκίνου και μπορεί να αντιπροσωπεύει κρίσιμο θεραπευτικοί στόχοι σε PDAC.

Στην παρούσα μελέτη αποδείξαμε ότι λεντοϊού που βασίζεται σίγηση του EGFR εξασθενημένος αποτελεσματικά προ-μιτογόνες δράσεις του σε 3 από 4 παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, και ότι λεντοϊού που βασίζονται παγίδευση του ΤΟΡ-β εξασθενημένη επίσης πολλαπλασιασμό σε 3-D καλλιέργεια στις ίδιες τρεις κυτταρικές γραμμές. Ωστόσο, σε ASPC-1 και COLO-357 κύτταρα, ταυτόχρονα φίμωση EGFR και απομόνωσης ΤΟΡ-β είχε ως αποτέλεσμα αυξημένη καταστολή της ανάπτυξης, ενώ σε κύτταρα Τ3Μ4 και PANC-1 δεν υπήρχε σχεδόν πλήρης αντιστροφή των αυξητικών-κατασταλτικά αποτελέσματα του EGFR μειορύθμιση . Κάτω από πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας ιστού, ASPC-1 και Τ3Μ4 κύτταρα είναι ανθεκτικά σε ΤΟΡ-β-διαμεσολαβούμενη αναστολή της ανάπτυξης, ενώ COLO-357 και τα κύτταρα PANC-1 είναι αυξητικοί-παρεμποδίζεται από ΤΟΡ-β [19], [28]. Ετσι, η παρατηρούμενη παράδοξη αντιστροφή δεν μπορούν να αποδοθούν σε διαφορές στην ανασταλτική της ανάπτυξης απόκριση των καρκινικών κυττάρων. Αντ ‘αυτού, σε κύτταρα Τ3Μ4, αυτό αντιστροφή οφείλεται, εν μέρει, στην πάνω ρύθμιση φωσφο-HER2 και φωσφο-HER3 προκαλείται από EGFR μειορύθμιση και ενισχύεται παρουσία του sTβRII. Σε συμφωνία με αυτό το συμπέρασμα, οι αυξητικοί-ανασταλτικές επιδράσεις που προκαλούνται από φίμωση HER2 ή και τα δύο EGFR και HER2 δεν είχαν αντιστραφεί από sTβRII. Ομοίως, η λαπατινίμπη, η οποία αναστέλλει και τις δύο EGFR και HER2 κινάσης δραστηριότητες, επίσης ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων Τ3Μ4 και αυτό το αποτέλεσμα ήταν ανθεκτική σε sTβRII μεσολάβηση αντιστροφή. ERK μπορεί να ενεργοποιηθεί με πολλαπλούς ανάντη σήματα, και αυξημένη HER2 /3 φωσφορυλίωση σε κύτταρα Τ3Μ4 συνδέθηκε στην παρούσα μελέτη με αυξημένη φωσφορυλίωση ERK, υποδεικνύοντας ότι HER2 /3 κατάντη σηματοδότησης επίσης να ενεργοποιηθεί.

Αρκετές γραμμές του στοιχεία δείχνουν ότι η ενεργοποίηση src διαμεσολαβείται από TGF-β παγίδευση είναι επίσης ζωτικής σημασίας για το φαινόμενο αναστροφής. Πρώτον, η αναστολή src με σίγηση EGFR αντιστράφηκε πλήρως με ΤΟΡ-β δέσμευση. Δεύτερον, EGFR Σηματοδότησης είναι γνωστό ότι ενεργοποιεί src [29], και η ενεργοποίηση src είναι γνωστό ότι επάγει την απελευθέρωση των προδρόμων συνδετήρων τύπου EGF [6] και εξασθενούν EGF εσωτερίκευση [29], [30]. Οι μηχανισμοί αυτοί μπορεί να προωθήσει ετεροδιμερισμός EGFR με HER2 και HER3, ενισχύοντας έτσι περαιτέρω μιτογονικής σηματοδότησης. Τρίτον, sTβRII αύξησε τα επίπεδα της φωσφορυλίωσης src στο κατάλοιπο τυροσίνης 419 στον Τ3Μ4, και φωσφορυλίωση σε αυτό το site συσχετίζεται με αυξημένη δραστηριότητα src. Επιπλέον, sTβRII δεν μετέβαλλε την φωσφορυλίωση της Src (Tyr527) σε κύτταρα ASPC-1, αλλά μειώθηκε η φωσφορυλίωση της στα κύτταρα Τ3Μ4 εν απουσία και παρουσία shEGFR, επιβεβαιώνοντας ότι src είχε ενεργοποιηθεί σε κύτταρα Τ3Μ4 με sTβRII. Τέταρτον, τρεις αναστολείς κινάσης src, SKI-606, ΡΡ2 και dasatinib, μπλοκάρει το TβRII μεσολάβηση αντιστροφή της αναστολής της ανάπτυξης.

Έχουμε προσδιορίσει προηγουμένως ότι η προσθήκη καθαρής πρωτεΐνης sTβRII στο μέσο αυτών των κυττάρων, επίσης, διαχωρίζει ΤΟΡ-β και αποκλείει τις δράσεις του ΤΟΡ-β

in vitro

(αδημοσίευτες παρατηρήσεις). ΤΟΡ-β συνδέεται II υποδοχέα (TβRII) ομοδιμερές ΤΟΡ-β, η οποία στη συνέχεια σχηματίζει ένα σύμπλεγμα με ετεροτετραμερείς ομοδιμερούς TβRI, που οδηγεί στην ενεργοποίηση της δραστικότητας κινάσης σερίνης-θρεονίνης TβRI προς τον τύπο [9]. Αυτή η ενεργοποίηση ενεργοποιεί έναν καταρράκτη σηματοδότησης που περιλαμβάνει τη φωσφορυλίωση Smads υποδοχέα ρυθμιζόμενη (R-Smads), Smad2 και Smad3, στο C-τερματικό SSXS μοτίβο τους, μετέπειτα ολιγομερισμού τους με την κοινή μεσολαβητή Smad4, και μετατόπιση του συγκροτήματος προς τον πυρήνα όπου η ρύθμιση της μεταγραφής του γονιδίου στη συνέχεια πραγματοποιείται [9], [31]. TβRII μπορούν επίσης να φωσφορυλιωθούν σε υπόλειμμα τυροσίνης 284 που οδηγεί στην ενεργοποίηση εναλλακτικές οδούς όπως ρ38 ΜΑΡΚ [32]. Ενώ η ενεργοποίηση src συχνά εμφανίζεται στα κατάντη των υποδοχέων κινάσης τυροσίνης, ΤΟΡ-β μπορεί επίσης να αυξήσει τη δραστηριότητα src, αλλά σε ένα παροδικό τρόπο [33]. Ωστόσο, ο ΤΟΡ-β δρα επίσης για την επαγωγή src αποικοδόμηση [34]. Είναι δυνατόν, ως εκ τούτου, ότι παγίδευση ΤΟΡ-β σε κύτταρα Τ3Μ4 μπορεί να εμποδίσει τον καρκίνο που προέρχεται από κύτταρα ΤΟΡ-β από την επαγωγή αποικοδόμησης src και /ή αδρανοποίηση.

Για να αξιολογηθεί η βιολογική σημασία αυτών των

in vitro

ευρήματα, χρησιμοποιήσαμε ένα υποδόριο μοντέλο γυμνού ποντικού το οποίο επιτρέπει την αναπαραγώγιμη εκτίμηση του

in vivo

βιολογική σημασία των οδών που έχουν αλλοιωθεί σηματοδότησης

in vitro

. Έτσι, σε σχέση με τα κύτταρα ASPC-1, είτε EGFR κάτω ρύθμιση ή ΤΟΡ-β παγίδευσης κατέληξε σε σημαντική (36 έως 38%) μειώνεται στον όγκο του όγκου, με περαιτέρω μείωση στο 85% όταν ενώθηκαν οι δύο προσεγγίσεις. Εντυπωσιακά, οι όγκοι απέτυχε να σχηματίσει σε 2 από 8 ποντικούς που έλαβαν ένεση με κύτταρα ASPC-1 που εκφράζει pWPT-sTβRII, και σε 4 από τα 8 ποντίκια που εκφράζουν τόσο pWPT-sTβRII και shEGFR-LV. Επιπλέον, υπήρξε μια σημαντική καθυστέρηση στην εμφάνιση των 4 όγκους που προέκυψαν από κύτταρα που εκφράζουν τόσο pWPT-sTβRII και shEGFR-LV, όλα εκ των οποίων παρουσίασαν σημαντικά μειωμένο πολλαπλασιασμό και την αγγειογένεση, και αυξημένη απόπτωση. Αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν στρατηγικές για τη στόχευση του ΤΟΡ-β σε PDAC [13], [14], [35], και είναι σύμφωνο με την παρατήρηση ότι υπάρχει μια ισχυρή EGFR

in situ

σήμα υβριδοποίησης στο αγγειακό σύστημα του όγκου σε PDAC σε ανθρώπους [36] και με την προτεινόμενη ρόλους του EGFR στην αγγειογένεση των όγκων. Ενώ στόχευση ΤΟΡ-β με παγίδευση συνδετήρα ή με TβRI αναστολής κινάσης εξασθενεί παγκρεατική ανάπτυξη όγκου και μετάσταση σε μοντέλα ποντικών [13] – [15], τα ευρήματά μας δείχνουν ότι, σε ορισμένες περιπτώσεις, με στόχο τόσο EGFR και ΤΟΡ-β-dependent pathways μπορεί εξασκούν συνεργιστική ανασταλτικές επιδράσεις επί του πολλαπλασιασμού και της αγγειογένεσης PDAC.

Τ3Μ4 προερχόμενο όγκους, ΤΟΡ-β παγίδευση οδήγησε σε μείωση κατά 37% στον όγκο του όγκου και μείωση του πολλαπλασιασμού και της αγγειογένεσης, ενώ EGFR ρύθμιση προς τα κάτω ως αποτέλεσμα είτε ο αποτυχία να σχηματίσουν όγκους ή στον σχηματισμό εξαιρετικά μικρών όγκων και αξιοσημείωτα εξασθενημένο αγγειογένεση. Έτσι, τα κύτταρα Τ3Μ4 εξαρτώνται ιδιαίτερα από τους EGFR για την έναρξη του όγκου, της εξέλιξης και της αγγειογένεσης

in vivo

, και αυτό το εξαιρετικό εξάρτηση από τις EGFR είναι σύμφωνη με EGFR μεσολάβηση μιτογένεση, καθώς και με το ρόλο της στην εξαρτώμενες από αγγειογένεση ογκογονίδιο εθισμός [37], [38]. Αυτές οι δραματικές επιπτώσεις αντιστράφηκαν με sTβRII που αποκατέστησε τον πολλαπλασιασμό αλλά δεν μετέβαλλε την αγγειογένεση ή απόπτωση, καταλήγοντας σε μεγάλους όγκους που εμφάνισαν εστίες νέκρωσης. Έτσι, ενώ η

in vitro

και

in vivo

ανασταλτικές δράσεις ανάπτυξης του σιγαστήρα EGFR αντιστράφηκαν από τον TGF-β παγίδευσης, οι παρακρινούς αντι-αγγειογονικά αποτελέσματα της αποσιώπησης EGFR και τις επιπτώσεις στην απόπτωση επέμενε, υπογραμμίζοντας τις φιλο-μιτογόνες επιδράσεις της ενεργοποίησης src. Επιπλέον, έχει αποδειχθεί πρόσφατα ότι η αγγειογένεση είναι σημαντική σε ένα Kras γνώμονα γενετικά μοντέλο ποντικού PDAC [39] και εν παραλλαγή 161r μορφή interlukin-17F (IL-17F), το οποίο είναι ένα φυσικό ανταγωνιστής του αντι-αγγειογενετική επιδράσεις των άγριου τύπου 161H IL-17F, συνδέεται με μια χειρότερη πρόγνωση σε PDAC [40], παρέχοντας έμμεση απόδειξη ότι η αγγειογένεση μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην μεταστατική εξάπλωση της. Ενόψει αυτών των παρατηρήσεων, οι τρέχουσες ευρήματα υποδεικνύουν ότι η στόχευση του EGFR και ΤΟΡ-β μπορεί να είναι σημαντική για την ομαλοποίηση αγγειογένεση όγκου στην πρωτογενή όγκο και την καταστολή της αγγειογένεσης σε μεταστατικές αλλοιώσεις στον PDAC.

ASPC-1 και Τ3Μ4 κύτταρα λιμάνι μεταλλαγμένο KRAS και p53 γονίδια, και εκφράζουν υψηλά επίπεδα EGFR [5], [41]. Αυτά τα κύτταρα παράγουν επίσης υψηλά επίπεδα του ΤΟΡ-β, ΤΟΡ-α και αμφιρεγουλίνη [19], [42], τα οποία είναι αυτο-επαγώγιμοι, ΤΟΡ-β-επαγώγιμο, και προ-αγγειογενετική. Επιπλέον, τα κύτταρα ASPC-1 φιλοξενούν ένα μεταλλαγμένο γονίδιο Smad4 [43], ενώ τα κύτταρα Τ3Μ4 είναι άγριου τύπου για Smad4 [44]. Ως τέτοια, ASPC-1 και Τ3Μ4 κύτταρα εμφανίζουν αλλοιώσεις που είναι ιδιαίτερα αντιπροσωπευτικά του φάσματος των τυπικών μοριακών μεταβολών φαίνεται στην PDAC.