Αφηρημένο

Παρά το γεγονός ότι τα τρέχοντα πρωτόκολλα αντι-καρκίνου είναι αρκετά αποτελεσματικό, η θεραπεία που σχετίζονται με μακροπρόθεσμες παρενέργειες, που προκαλείται από την έλλειψη εξειδίκευσης των διαδικασιών κατά του καρκίνου, παραμένει ένα δύσκολο πρόβλημα στην παιδιατρική ογκολογία. ΤΑΤ-RasGAP

317-326 είναι ένα RasGAP προερχόμενο κύτταρο διαπερατό πεπτίδιο που δρα ως ευαισθητοποιητής για διάφορες θεραπείες κατά του καρκίνου σε ενήλικα κύτταρα του όγκου. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε την επίδραση της ΤΑΤ-RasGAP

317-326 σε διάφορες κυτταρικές σειρές καρκίνου της παιδικής ηλικίας. Η RasGAP πεπτίδιο προερχόμενο-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο αναλύθηκε σε αρκετές νευροβλάστωμα, σάρκωμα Ewing και κυτταρικές σειρές λευχαιμίας (καθώς επίσης και σε φυσιολογικά λεμφοκύτταρα). Ο κυτταρικός θάνατος αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μεθόδους κυτταρομετρίας ροής με την απουσία ή παρουσία του πεπτιδίου σε συνδυασμό με διάφορα γενοτοξίνες χρησιμοποιούνται στις κλινικές (4-υδροπεροξυκυκλοφωσφαμίδιο, ετοποσίδη, βινκριστίνη και δοξορουβικίνη). Όλα δοκιμαστεί παιδιατρικό όγκων, απαντώντας σε τουλάχιστον ένα genotoxin, ευαισθητοποιήθηκαν από ΤΑΤ-RasGAP

317-326. Η RasGAP πεπτίδιο προερχόμενο δεν αυξάνει τον κυτταρικό θάνατο των κανονικών λεμφοκυττάρων, μόνη ή σε συνδυασμό με την πλειονότητα των δοκιμαζόμενων χημειοθεραπείες. Κατά συνέπεια, ΤΑΤ-RasGAP

317 – 326 μπορεί να ωφεληθούν παιδιά με όγκους με την αύξηση της αποτελεσματικότητας των αντικαρκινικών θεραπειών κυρίως επιτρέποντας μειώσεις αντικαρκινικό φάρμακο δοσολογίας και των σχετικών παρενεργειών που προκαλείται από φάρμακα.

Παράθεση: Chevalier Ν, Gross Ν, Widmann C (2015) Αξιολόγηση της χημειοευαισθητοποιητικών δραστηριότητα της ΤΑΤ-RasGAP

317-326 στην παιδικών καρκίνων. PLoS ONE 10 (3): e0120487. doi: 10.1371 /journal.pone.0120487

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Salvatore Παπά, Ινστιτούτο ηπατολογίας – Birkbeck, Πανεπιστήμιο του Λονδίνου, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 3 Οκτ 2014? Αποδεκτές: 23η Ιανουαρίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 31 Μαρ, 2015

Copyright: © 2015 Chevalier et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Τα δεδομένα σχετικά με τα προφίλ array CGH των παράγωγων-κυτταρικές σειρές NB1 νευροβλαστώματος ελήφθησαν από τρίτο πρόσωπο: Δρ Aurélie Coulon ([email protected]) από την Ερευνητική Μονάδα παιδιατρικής Ογκολογίας, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Κέντρο (CHUV), Λωζάνη, Ελβετία) όπου οι αναγνώστες μπορούν να στέλνουν αιτήματα για δεδομένα

Χρηματοδότηση:. η χρηματοδότηση παρέχεται από FORCE ίδρυμα – https://www.force-fondation.ch/(NC NG)? MD-PhD υποτροφία από το Ελβετικό Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών (n ° 158116) (NC). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος αποτελεί τη δεύτερη αιτία θανάτου σε παιδιά μετά τα ατυχήματα στις βιομηχανικές χώρες [1, 2]. Η κατανόησή μας των καρκίνων της παιδικής ηλικίας έχει ωφεληθεί από τη σημαντική πρόοδο που επιτεύχθηκε τα τελευταία τέσσερα χρόνια. Πρότυπο θεραπείες για τη θεραπεία παιδιατρικών όγκων περιλαμβάνουν χειρουργική επέμβαση, ακτινοθεραπεία και εντατική χημειοθεραπεία πολλαπλών παραγόντων, όπως η ετοποσίδη, βινκριστίνη, δοξορουβικίνη και κυκλοφωσφαμίδη [3].

Στις ανεπτυγμένες χώρες, ογδόντα τοις εκατό των παιδιών που διαγιγνώσκονται με καρκίνο αναμένεται να επιβιώσουν εντός 5 ετών μετά την αγωγή. Ωστόσο, οι περισσότεροι από αυτούς θα υποφέρουν από χρόνιες παθήσεις από 40 ετών [4]. Επέκταση επιτήρηση των παιδιατρικών επιζώντες του καρκίνου παρουσιάζει υψηλό κίνδυνο για απειλητικές για τη ζωή αργά επιπτώσεις από τη δεύτερη κακοήθειες, καρδιακές παθήσεις και πνευμονικών ασθενειών [5, 6]. Ο κίνδυνος της πρόωρης θνησιμότητας εξαρτάται κυρίως από παράγοντες θεραπεία συγκεκριμένων όπως η αθροιστική δόση της χημειοθεραπείας [7]. Επομένως, η θεραπεία σχετιζόμενη μακροπρόθεσμες παρενέργειες που επάγονται από βλάβη στα μη καρκινικά κύτταρα είναι ένα δύσκολο πρόβλημα και παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άλυτα. Καθώς τα παιδιά είναι εξ ορισμού μακροχρόνια επιζώντες, υπάρχει μια έντονη ανάγκη για την ανάπτυξη χαμηλής τοξικότητας, καλύτερα στοχευμένες και αποτελεσματικές νέες θεραπευτικές στρατηγικές για όλους τους τύπους καρκίνου της παιδικής ηλικίας [8]. Στρατηγικές για την παράκαμψη αυτών των εμποδίων περιλαμβάνει τη βελτίωση των αντικαρκινικών ευαισθησία φαρμάκου και ειδικότητα προς τα καρκινικά κύτταρα [9-11].

Σε αυτό το πλαίσιο, μπορούμε έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ότι ένα κύτταρο-διαπερατό πεπτίδιο που προέρχεται από την πρωτεΐνη ρ120 RasGAP , που ονομάζεται ΤΑΤ-RasGAP

317-326, είναι ένας όγκος-ευαισθητοποιητής σε διάφορα αντικαρκινικά φάρμακα. Πράγματι, αν και δεν δείχνουν καμία τοξικότητα έναντι κυττάρων από μόνη της, είναι αποτελεσματικά και ειδικά ευαισθητοποιεί καρκινικά κύτταρα ενηλίκων

in vitro

και

in vivo

σε διάφορες θεραπείες κατά του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένης της χημειοθεραπείας [ ,,,0],12,13] και φωτοδυναμική θεραπεία [14]. Σημαντικά, εμφανίζει εξειδίκευση σε καρκινικά κύτταρα, καθώς δεν ευαισθητοποιεί μη νεοπλασματικά κύτταρα να genotoxin επαγόμενη απόπτωση [12, 14]. ΤΑΤ-RasGAP

317-326 φαίνεται να έχει επιπρόσθετες δραστηριότητες κατά του καρκίνου από κύτταρο όγκου ευαισθητοποίησης όπως έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι αυτό το πεπτίδιο μπορεί να παρεμποδίσει τη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή

in vitro

[15, 16] και ότι αυτή η δραστηριότητα μπορεί να αναστείλει τη διαδικασία metastatization

in vivo

[17]. Αυτό υποδεικνύει ότι η RasGAP προερχόμενο πεπτίδιο έχει την ικανότητα να δρουν ως αντι-μεταστατική ένωση στην κορυφή των αποτελεσμάτων ευαισθητοποίηση όγκων του. Πρόσφατα, έχει δειχθεί ότι οι αντικαρκινικές ιδιότητες των ΤΑΤ-RasGAP

317 έως 326 εξαρτώνται από δύο υπολείμματα τρυπτοφάνης στη θέση 317 και 319 [16]. Ωστόσο, ο τρόπος δράσης του ΤΑΤ-RasGAP

317-326 δεν έχει χαρακτηριστεί πλήρως. Εχει προηγουμένως δειχθεί ότι το πεπτίδιο αυτό δεν ευνοεί τον θάνατο των καρκινικών κυττάρων μέσω διαμόρφωσης της δραστηριότητας Ras, ΜΑΡΚ μονοπάτια σηματοδότησης, μεταγραφική δραστικότητα ΝΡ-κΒ, τα επίπεδα πρωτεΐνης Akt και κατάσταση φωσφορυλίωσης [18, 19]. Επιπλέον, τα μέλη της οικογένειας Bcl-2, τα οποία ρυθμίζουν μιτοχονδριακές εξαρτώμενου κυτταρικού θανάτου, απεδείχθη ότι είναι μεμονωμένα επουσιώδεις για τη δραστηριότητα ευαισθητοποίησης του πεπτιδίου [20].

Η επίδραση αυτού του πεπτιδίου στον καρκίνο της παιδικής ηλικίας είναι ωστόσο άγνωστο. Η μοριακή βιολογία των παιδιατρικών όγκων είναι διακριτή από καρκίνους σε ενήλικες με πολλούς τρόπους. Καθώς η γένεση των περισσότερων καρκίνων της παιδικής ηλικίας φαίνεται να προέρχεται από διαταραχές της φυσιολογικής πρώιμης ανάπτυξης, που συσσωρεύουν λιγότερες μεταλλάξεις από ενήλικα όγκους. Από την άλλη πλευρά, φαίνεται ότι η ανάπτυξη των παιδιατρικών όγκων εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό επιγενετικές τροποποιήσεις [21-23]. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε ως εκ τούτου διερευνηθεί κατά πόσον ΤΑΤ-RasGAP

317-326 ήταν σε θέση να καταστήσει τους όγκους της παιδικής ηλικίας πιο ευαίσθητα σε κλινικά σχετικά φάρμακα κατά των όγκων.

Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και κύτταρα καλλιέργειας

το CCRF-CEM [24], ΤΗΡ-1 [25] και Α673 [26] κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC) (οι αναφορές CRL-8436, ΤΙΒ-202 , CRL-1598, αντίστοιχα). Η ΛΑΝ-1 [27] και M-07e [28] κυτταρικές σειρές ελήφθησαν από το Leibniz Ινστιτούτο DSMZ-Γερμανική Συλλογή Μικροοργανισμών και Κυτταρικών Καλλιεργειών (αναφορές ACC655, ACC104 αντίστοιχα). Το EW-11 [29], TC252 [30] και ΝΒ1 προερχόμενο [31] κυτταρικές γραμμές που περιγράφηκε προηγουμένως. Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε 5% CO

2 στους 37 ° C. Οι νευροβλαστώματος κυτταρικές γραμμές (LAN-1, ΝΒ1-FBS, ΝΒ1-FBS-Re) και ο Ewing κυτταρική γραμμή σαρκώματος EW-11 αναπτύχθηκαν σε Dulbecco τροποποιημένο Eagle Medium (DMEM) (Gibco, Paisley, UK) που περιέχει εμβρυϊκό βόειο 10% ορού (FBS) (Gibco). Τα καρκινικά κύτταρα νευροβλαστώματος πρωτογενή ΝΒ1-ΝΒΜ διατηρήθηκαν σε νευρωνικά βασικό μέσο που πραγματοποιούνται από DMEM /F12 (Gibco) συμπληρωμένο με 2% Β27 χωρίς ορό συμπλήρωμα (Invitrogen, Carlsbad, CA), 20 ng /ml ανθρώπινου ανασυνδυασμένου παράγοντα βασικής ανάπτυξης ινοβλάστης ( bFGF) (Peprotech), και 20 ng /ml ανθρώπινου ανασυνδυασμένου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) (Peprotech). κύτταρα σαρκώματος ΤΗΡ-1 οξείας λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας γραμμές CCRF-CEM και, και το Α673 και TC252 Ewing, καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Gibco) που περιέχει 10% FBS. M07e, μια οξεία μυελοειδή λευχαιμία κυτταρική γραμμή, διατηρήθηκε σε Minimum Essential Medium άλφα (ΜΕΜα) (Gibco) συμπληρωμένο με 10% FBS και 5 ng /ml ανασυνδυασμένου ανθρώπινου κοκκιοκυττάρων μακροφάγων παράγοντας διέγερσης αποικιών (GM-CSF) (Peprotech). ανθρώπινα λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος (ΡΒΙ_) απομονώθηκαν με φυγοκέντρηση πυκνότητας σε ένα Ficoll-Paque κλίση (Lymphoprep? StemCell Technologies) από φλεγμονώδεις πλακούντες από υγιείς δότες, που λαμβάνονται από το κράτος του Vaud υπηρεσία μετάγγισης αίματος. Οι χορηγοί έδωσαν γραπτή συγκατάθεση για την πιθανή χρήση του αίματος τους για την ιατρική έρευνα. PBLs καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Gibco) συμπληρωμένο με 8% των ομαδοποιημένο ανθρώπινο ορό και συμπληρωμένο με 100 U /ml ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ιντερλευκίνη-2 (Proleukin, Roche Pharma AG).

Χημεία

Τα φάρμακα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν βινκριστίνη (Sigma-Aldrich, St Louis, USA), ετοποσίδη (Sigma-Aldrich), 4-υδροπεροξυκυκλοφωσφαμίδιο (4-HC) (Niomech, Bielefeld, Germany) και δοξορουβικίνη (Pfizer AG, Zurich, Switzerland). Η χρώση χρησιμοποιείται για την εκτέλεση κυτταρομετρία ροής ήταν 7-αμινοακτινομυκίνης D (7-AAD) και Annexin V-FITC (κιτ Αννεξίνη V-FITC /7-AAD, Beckman Coulter, Miami, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής).

Σύνθεση πεπτιδίων

ΤΑΤ-RasGAP

317-326 (GRKKRRQRRRGGWMWVTNLRTD), TAT

48-57 (από τώρα και στο εξής αναφέρεται ως ΤΑΤ) (GRKKRRQRRR), ΤΑΤ-Κωδικοποιημένα (GRKKRRQRRRGGWLDMTTVNRW) και ΤΑΤ-μεταλλαγμένα (GRKKRRQRRRGGAMWVTNLRTD ) συντέθηκαν στο Τμήμα Βιοχημείας του Πανεπιστημίου της Λωζάνης, Ελβετία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12].

Κυτταροτοξική δοκιμασία

Για κύτταρα που αναπτύσσονται σε εναιώρημα (ΤΗΡ-1, M07e, CCRF-CEM , και λεμφοκύτταρα), τριακόσιες χιλιάδες κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και απευθείας σε κατεργασία με τις υποδεικνυόμενες δόσεις 4-HC, ετοποσίδη, βινκριστίνη, ή δοξορουμπικίνη παρουσία ή απουσία 10 μΜ ΤΑΤ-RasGAP

317 – 326, ΤΑΤ, ΤΑΤ-Κωδικοποιημένα ή ΤΑΤ-μεταλλαγμένα. Για προσκολλητικά κυτταρικές γραμμές (ΝΒ1-ΝΒΜ, ΝΒ1-FBS, ΝΒ1-FBS-Re, LAN-1, Α-Δ-11, TC252, και Α673), διακόσιες χιλιάδες κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν για 48 ώρες σε πλάκες των 6-φρεατίων και υποβλήθηκαν τότε σε επεξεργασία όπως τα κύτταρα που αναπτύσσονται σε εναιώρημα. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επώαση του φαρμάκου, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε κυτταρομετρία ροής για την αξιολόγηση του κυτταρικού θανάτου. Εν συντομία, προσκολλημένα κυτταρικές γραμμές αποκολλήθηκαν με θρυψίνη-EDTA (Gibco) και εναιωρήματα μονού κυττάρου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και βάφονται με 1 μg /ml 7-AAD και 50 ng /ml αννεξίνης V-FITC σε 500 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης. Ένα ελάχιστο δέκα χιλιάδες κύτταρα αναλύθηκαν. Το σήμα χρωστικής που προέρχεται 7-AAD δεν θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δοξορουβικίνη επειδή 7-AAD και δοξορουβικίνη έχουν παρόμοιες ιδιότητες φθορισμού (7-AAD μήκος κύματος εκπομπής: 525 nm? Doxorubicin μήκος κύματος εκπομπής: 530 nm [32]).

Στατιστική ανάλυση

Εκτός αν αναφέρεται, όλα τα πειράματα προήλθαν από τρία ή περισσότερα ανεξάρτητα πειράματα. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± διαστήματα εμπιστοσύνης 95%. Σημασία αξιολογήθηκε με τη χρήση t-δοκιμές που πραγματοποιούνται με το Microsoft Excel 2010 που ακολουθείται από Bonferroni διορθώσεων (δηλαδή διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές όταν οι τιμές ρ Μια πιθανότητα είναι ότι το μέσο στο οποίο αυτά αναπτύσσονται ρυθμίζουν το μεταβολισμό τους διαφορικά. Αυτό μπορεί με τη σειρά του επηρεάζει την ευαισθησία τους σε θεραπείες κατά του καρκίνου. Υπάρχουν πράγματι συσσώρευση αποδείξεις ότι η μεταβολική κατάσταση των καρκινικών κυττάρων παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στον τρόπο που ανταποκρίνονται σε αντικαρκινικά φάρμακα [41]. Μια άλλη υπόθεση είναι ότι οι διαφορετικοί πληθυσμοί κυττάρων επιλέγονται κατά χωρία διαφορετικό μέσο.