Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο υποδοχέας ανδρογόνων (AR) διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην εξάπλωση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη. Ωστόσο, ο μηχανισμός δράσης της στον πολλαπλασιασμό παραμένει άγνωστος. Η κατανόηση του μηχανισμού δράσης AR σε πολλαπλασιασμό μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη αποτελεσματικών στρατηγικών για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

Στη μελέτη αυτή αναφέρει ότι η θεραπεία παλμού συγχρονισμένα κύτταρα LNCaP με Casodex, ένα AR-ανταγωνιστής, για 4 ώρες στα μέσα G

1 φάση ήταν αρκετή για να αποτρέψει την είσοδο κυττάρων από S φάση. Από τη συναρμολόγηση του συμπλόκου προ-αντιγραφής (pre-RC) σε G

1 απαιτείται για την εξέλιξη των κυττάρων από το G

1 έως φάση S, η επίδραση του Casodex κατά τα μέσα-G

1 προταθεί ότι ο ρόλος του AR στον πολλαπλασιασμό θα μπορούσε να είναι να ρυθμίζει την συναρμολόγηση των προ-RC. Για να ελεγχθεί αυτή η πιθανότητα, μελετήθηκε η αλληλεπίδραση μεταξύ των AR και Cdc6, ένα βασικό συστατικό της προ-RC στα κύτταρα LNCaP. AR συν-εντοπισμένη και συν-ανοσοκαταβυθίζεται με Cdc6, και θεραπεία Casodex διαταράσσεται αυτή την αλληλεπίδραση. AR-ανοσοκαθιζάνουν (AR-ΙΡ) περιείχε επίσης κυκλίνη Ε και κυκλίνη Α, το οποίο παίζει ένα κρίσιμο ρόλο στην προ-RC συναρμολόγηση και του κυτταρικού κύκλου εισόδου στην S φάση, και DNA πολυμεράση-α, PCNA, και ριβονουκλεοτιδική ρεδουκτάση, οι οποίες είναι απαραίτητες για την την έναρξη της σύνθεσης του DNA. Επιπλέον, σε κύτταρα σε φάση S, AR συν-καθιζάνουν με συστατικά του μηχανισμού αντιγραφής του DNA των κυττάρων που εισήλθε στη φάση S.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Μαζί, αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ένα νέο ρόλο του AR ως συστατικό της προ-RC να ασκήσει έλεγχο επί της εξέλιξης των κυττάρων LNCaP από το G

1 έως S φάση μέσω ενός μηχανισμού ο οποίος είναι ανεξάρτητος από το ρόλο της ως παράγοντας μεταγραφής

Παράθεση:. Murthy S, M Wu, Bai VU, Χου Ζ, Menon Μ, Μπαράκ ER, et al. (2013) Ο ρόλος των ανδρογόνων υποδοχέων στην εξέλιξη των κυττάρων LNCaP καρκίνου του προστάτη από το G

1 έως S φάση. PLoS ONE 8 (2): e56692. doi: 10.1371 /journal.pone.0056692

Επιμέλεια: Antimo Migliaccio, ΙΙ Università di Napoli, Ιταλία

Ελήφθη: 16 Αυγούστου, 2012? Αποδεκτές: 14η Ιανουαρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 20 Φεβρουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Murthy et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από επιχορήγηση W81XWH-05-1-0071 από το Υπουργείο άμυνας για να GPR. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται καρκίνος του μη-δέρματος και δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις αμερικανικές άνδρες [1]. Ανδρογόνων, ενεργοποιώντας τον υποδοχέα ανδρογόνων (AR), παίζει σημαντικό ρόλο τόσο στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Ως εκ τούτου, ανδρογόνων με φαρμακολογικά ή χειρουργικό ευνουχισμό [2] παραμένει πρώτης γραμμής θεραπεία για την αντιμετώπιση του τοπικά προχωρημένου ή διαδίδονται καρκίνο του προστάτη. Ωστόσο, αν και η ασθένεια υποχωρεί αρχικά σε απόκριση ανδρογόνων κατάλυσης, το υποτροπές τελικά να γίνει ευνουχισμό ανθεκτικά [3], [4]. Είναι αξιοσημείωτο ωστόσο, παρά τη συνέχιση της χρήσης αυτής της στρατηγικής θεραπείας για πάνω από 70 χρόνια, πολύ λίγα είναι γνωστά για το μηχανισμό με τον οποίο τα Ar ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη. Η κατανόηση του μηχανισμού δράσης AR σε πολλαπλασιασμό μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών στρατηγικών για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη.

Ο ευνουχισμός ανθεκτική ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη συχνά συνδέεται με αυξημένη έκφραση του AR [5] , [6], [7]. AR παραμένει απαραίτητη για τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του προστάτη που έχουν καταστεί ανθεκτικά ευνουχισμού? AR-ειδικό shRNA ή siRNA μπλοκάρει τον πολλαπλασιασμό των ανδρογόνων ευαίσθητη, καθώς ο ευνουχισμός ανθεκτικά AR-θετικά κύτταρα καρκίνου του προστάτη [8], [9], [10], [11], [12]. Επιπλέον, μικροέγχυση αντισώματος AR-ειδικό στον πυρήνα ή κατεργασία των κυττάρων με AR mRNA hammerhead ριβοένζυμο αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των AR-θετικό, αλλά όχι AR-αρνητικό, καρκινικά κύτταρα του προστάτη [13], υποδηλώνοντας έναν κρίσιμο ρόλο του AR στον πολλαπλασιασμό του AR-εκφράζουν κύτταρα καρκίνου προστάτη. Είναι ενδιαφέρον ότι, ο ρόλος του AR στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του προστάτη φαίνεται να είναι ανεξάρτητη από τη λειτουργία του ως παράγοντα μεταγραφής, τουλάχιστον σε ανθεκτικά ευνουχισμού καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου προστάτη CWR22R3 (που προέρχονται από τα ξενομοσχεύματα CWR22), στην οποία AR-εξαρτώμενο πολλαπλασιασμό είναι συνδέτης ανεξάρτητη αλλά AR μεταγραφική δραστηριότητα παραμένει εξαρτώμενη από συνδετήρα [11]. Συλλογικά, οι παρατηρήσεις αυτές να επικαλεστεί την πιθανότητα ότι, εκτός από το ρόλο της ως παράγοντας μεταγραφής, AR μπορεί να παίζει άμεσο ρόλο στην κυτταρικό κύκλο ρυθμιστικών γεγονότων που απαιτούνται για τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Ένα άμεσο ρόλο του AR στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού έρχεται σε αντίθεση με την έννοια της έμμεσης ρόλο στον οποίο το Ar μεταγραφική δραστηριότητα ρυθμίζει την έκφραση των παραγόντων που απαιτούνται για την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου.

εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου από το G

1 έως φάση S είναι θεμελιώδους σημασίας για τον πολλαπλασιασμό. Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι Casodex (βικαλουταμίδη), ένας ειδικός αναστολέας του AR, αναστέλλει την ικανότητα του G

1 φάση AR-θετικού καρκίνου LNCaP κύτταρα του προστάτη να εισέλθουν στην S φάση [14], [15], υποδεικνύοντας ένα ρόλο AR σε πρόοδο του κυτταρικού κύκλου από το G

1 έως S φάση. Πρόοδος των κυττάρων από G

1 έως S φάση απαιτεί έναν καταρράκτη διαδοχικών γεγονότων στην G

1 φάση που συμβάλλουν στην συναρμολόγηση του μηχανισμού της αντιγραφής του DNA σε κύτταρα που εισέρχονται στην S φάση. Αυτά τα γεγονότα περιλαμβάνουν α) τη φόρτωση του Cdc6, αντιγραφής παράγοντα αδειοδότησης RLF-B /Cdt1 και συντήρηση μίνι-χρωμόσωμα (Mcm) πρωτεΐνες πάνω στο συγκρότημα αναγνώριση προέλευσης (ORC) για να σχηματίσει σύμπλοκο προ-αντιγραφής (pre-RC), και β) ξετύλιγμα του DNA από ελικάση (Cdc45) που σχετίζονται με προ-RC, και η συναρμολόγηση των ενζύμων της σύνθεσης του DNA για να σχηματίσουν μέγα-συγκροτημάτων που απαιτούνται για την έναρξη της σύνθεσης του DNA στις αφετηρίες αντιγραφής του DNA (βλέπε Reddy et al [16] για την επανεξέταση ).

Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε αν AR αλληλεπιδρά με τα συστατικά του προ-RC και μηχανήματα αντιγραφής του DNA. Οι μελέτες μας δείχνουν, για πρώτη φορά ότι απαιτείται AR στα μέσα G

1 φάση, κατά τον χρόνο της συναρμολόγησης προ-RC είναι γνωστή για να ξεκινήσει, προκειμένου για τα κύτταρα LNCaP να εισέλθουν στην S φάση, και ότι AR σχετίζεται με ρυθμιστικές πρωτεΐνες του κυτταρικού κύκλου και ένζυμα της σύνθεσης του DNA σε ένα πολύπλοκο πολυενζυμικά απομονώνεται από κύτταρα φάσης S. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν εμπλοκή AR στον πολλαπλασιασμό μέσω της αλληλεπίδρασής της με ρυθμιστικές πρωτεΐνες του κυτταρικού κύκλου και ένζυμα της σύνθεσης του DNA που απαιτείται για την έναρξη της σύνθεσης του DNA και την εξέλιξη των κυττάρων LNCaP από το G

1 έως S φάση.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

LNCaP κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI (Gibco BRL, Rockville, MD) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS), 2.5 mM γλουταμίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη , και 100 U /ml πενικιλίνη (πλήρες μέσο) σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2 και 95% αέρα στους 37 ° C.

Απομόνωση RNA, RT-PCR, και σε πραγματικό χρόνο RT -PCR (qRT-PCR)

RNA απομονώθηκε από τον έλεγχο και την Casodex κατεργασμένα κύτταρα και υποβλήθηκε σε RT-PCR για να προσδιοριστεί η έκφραση του PSA και GAPDH όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14]. Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιούνται για την PSA είναι: 5′-gcacccggagagctgtgt (προς τα εμπρός) και 5-gatcacgcttttgttcctgat (reverse) εκκινητών, καθώς και για GAPDH είναι 5′-gagatccctccaaaatcaagtg (προς τα εμπρός) και 5′-ccttccacgataccaaagttgt (αντίστροφη). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Η πυκνομετρία των RT-PCR ζώνες διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14]. qRT-PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα Applied Biosystems 7500 Fast PCR Πραγματικού χρόνου System (Applied Biosystems, Foster City, CA) χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς γονιδιακής έκφρασης Taqman για PSA (Id Δοκιμασία: Hs02576345_m1) και 18S RNA (Δοκιμασία Id: Hs03928985_g1) όπως περιγράφεται προηγουμένως [17]. Το σχετικό επίπεδο της έκφρασης PSA μετρήθηκε ποσοτικά με τη χρήση συγκριτικών ΔΔC

t με 18S RNA ως εσωτερικού ελέγχου.

Συγχρονισμός των LNCaP κύτταρα από ισολευκίνη στέρηση

ισολευκίνη στέρηση πραγματοποιήθηκε από προηγουμένως μας δημοσιευμένη μέθοδο [15]. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 60% έως 70% συρροή, και στη συνέχεια το μέσο αντικαταστάθηκε με ισολευκίνη ελεύθερο RPMI 1640 (Life Technologies, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 6% διαπιδυμένο FCS (Life Technologies, Carlsbad, CA), 2.5 mM γλουταμίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, και 100 μονάδες /ml πενικιλίνη. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε ισολευκίνη μέσο ελεύθερο για 36 ώρες σε μια συσκευή επώασης όπως παραπάνω. Κύτταρα απελευθερώθηκαν από ισολευκίνη-μπλοκ με αντικατάσταση του μέσου με το πλήρες μέσο που περιέχει 10% FCS και έλαβαν θεραπεία με Casodex (βικαλουταμίδη, δώρο από Astra Zeneca, Αγγλία, Ηνωμένο Βασίλειο), όπως υποδεικνύεται.

Από την έναρξη των κυττάρων σε S φάση χαρακτηρίζεται από την έναρξη της σύνθεσης του DNA, την εξέλιξη των συγχρονισμένων κυττάρων από G

1 έως S φάση παρακολουθήθηκε με προσδιορισμό της ικανότητας των κυττάρων να ενσωματώνουν

3Η-θυμιδίνης σε DNA όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14], [ ,,,0],15]. Σε τακτά χρονικά διαστήματα μετά την απελευθέρωση από ισολευκίνη-block, τα κύτταρα επισημάνθηκαν παλμικά με 2 μCi /ml

3Η-θυμιδίνης (ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, CA) για 30 λεπτά στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή. Η ραδιενέργεια που ενσωματώθηκε κατακρημνιζόμενο με οξύ υλικό προσδιορίστηκε στη συνέχεια όπως περιγράφεται [15].

Παρασκευή των κυτταρικών εκχυλισμάτων και Ανοσοκαταβύθιση

Εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα LNCaP συλλέχθηκαν με απόξεση σε αλατούχο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στους 4 ° C στα 2000 rpm σε φυγόκεντρο Sorvall RT7 και επαναιωρήθηκαν σε ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) ρυθμιστικό διάλυμα (50 mM Tris-HCl, ρΗ 7,4, 0,1% Triton Χ-100, 5 mM EDTA, 250 mM NaCl, 2 mM ΟαΟ

2, 50 mM NaF, και 0,1 mM Να

3νο

4) συμπληρωμένο με κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Ρ-8340, Sigma Chemical Co., St Louis, ΜΟ) σε μια πυκνότητα από περίπου 1 × 10

7 κύτταρα /ml. Το κυτταρικό εναιώρημα στη συνέχεια υποβλήθηκε δύο φορές σε 30 παλμούς υπερήχων χρησιμοποιώντας ένα Branson Sonifier 250 (Branson Sonic Power Co, Danbury, CT), ορίζεται σε ένα στοιχείο ελέγχου εξόδου 2 και ένα κύκλο λειτουργίας 20, με διακοπτόμενη ψύξη σε πάγο. Η επεξεργασία με υπερήχους κυτταρικό εκχύλισμα διαυγάστηκε με φυγοκέντρηση σε ένα Eppendorf Centrifuge 5415R στις 6.000 rpm για 5 λεπτά στους 4 ° C. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης σε εκχυλίσματα εκκαθαρίζονται αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας BioRad αντιδραστήριο Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

Για ανοσοκαταβύθιση, κυτταρικά εκχυλίσματα αραιώθηκαν 5 φορές σε ρυθμιστικό διάλυμα ΙΡ συμπληρωμένο με αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ και επωάζεται στους 4 ° C όλη τη νύκτα με 4 μg /ml αντισώματα anti-AR (AR-N20 ή AR-441) ή αντι-Cdc6 αντισώματα (H-304) (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA). Τα ανοσοσύμπλοκα στη συνέχεια προσροφήθηκαν σε Pierce Πρωτεΐνης Α /G αγαρόζης (Thermo Scientific, Philadelphia, ΡΑ) για 2 ώρες στους 4 ° C με ήπια ανάδευση. Τα σύμπλοκα προσροφημένα πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό IP με φυγοκέντρηση σε ένα Eppendorf Centrifuge 5415R στις 6.000 rpm για 5 λεπτά στους 4 ° C, και στη συνέχεια εκλούεται με ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης PAGE (Bio-Rad, Richmond, CA). ανοσοϊζήματα μάρτυρες παρασκευάζονται με χρήση 4 μg /ml καθαρισμένου ποντικού ή IgG κουνελιού (Αντισώματα Incorporated, Davis, CA) στη θέση του αντι-AR ή αντι-Cdc6 αντισώματα.

Απομόνωση DNA Replication Complex κλάσμα από Nuclear Κυτταρολύματος

Συγχρονισμένη LNCaP κύτταρα σε G

1 φάση (1 ώρα μετά την απελευθέρωση από ισολευκίνη-block) ή στη φάση S (24 ώρες μετά την απελευθέρωση από ισολευκίνη-μπλοκ) συλλέχθηκαν και η πυρηνική λύμα παρασκευάζεται από ένα ελαφρά τροποποίηση της μεθόδου των Subramanyam et al [18]. Τα συλλεγμένα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στους 4 ° C στα 2000 rpm σε φυγόκεντρο Sorvall RT7 και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα Α [0,16 Μ σακχαρόζης, 50 mM Tris-HCl (ρΗ 7,6), 25 mM KCl, 10 mM MgCl

2, 70 mM HEPES (ρΗ 7,6), 0,025 mM ΟαΟ

2, 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο (PMSF), 2 mM DTT, 1 mM EDTA] σε πυκνότητα 2 × 10

7 κύτταρα /ml. Το εναιώρημα κυττάρου στη συνέχεια ομογενοποιήθηκε σε έναν κινητήρα που Wheaton ομογενοποιητή (Wheaton Co., Wheaton, IL) μέχρι -90% των κυττάρων χρωματίστηκαν με trypan μπλε χρωστική ουσία (συνήθως τρία εγκεφαλικά επεισόδια σε μια ρύθμιση περιστροφής του 3). Το κυτοσολικό υπερκείμενο στη συνέχεια διαχωρίζεται από το πυρηνικό σφαιρίδιο με φυγοκέντρηση σε ένα Eppendorf Centrifuge 5415R στις 6.000 rpm για 5 λεπτά στους 4 ° C. Το πυρηνικό σφαιρίδιο αιωρήθηκε σε ένα όγκο ρυθμιστικού Α ίση με εκείνη που χρησιμοποιείται για την ομογενοποίηση και υποβλήθηκε δύο φορές σε 30 παλμούς υπερήχων με ένα Branson Sonifier 250 (Branson Co., Danbury, CT) ορίζεται σε ένα στοιχείο ελέγχου εξόδου του 2 και έναν κύκλο λειτουργίας 20, με διακοπτόμενη ψύξη σε πάγο. Η επεξεργασία με υπερήχους πυρηνικό εκχύλισμα διαυγάστηκε με φυγοκέντρηση σε ένα Eppendorf Centrifuge 5415R στις 6.000 rpm για 5 λεπτά στους 4 ° C. Το συγκρότημα αντιγραφή του DNA κλάσμα στη συνέχεια απομονώθηκε με υποβολή του πυρηνικό λύμα σε φυγοκέντρηση σε κλίση πυκνότητας σουκρόζης ουσιαστικά όπως περιγράφεται από Reddy και Pardee [19]. Πυρηνική λύμα (0.5 ml) απλώθηκε πάνω από ένα 4,8 ml γραμμική διαβάθμιση 20-40% (β /ο) σακχαρόζης σε ρυθμιστικό διάλυμα Α, το οποίο με τη σειρά του επιστρώθηκε πάνω από ένα μαξιλάρι σακχαρόζης 66% (0,5 ml) και φυγοκεντρήθηκε σε μία Beckman SW 50,1 στροφείο στους 4 ° C για 16 ώρες σε 35.000 rpm. Η βαθμίδα στη συνέχεια διαχωρίζονται στα κλάσματα των 0,5 ml και το ταχέως καθιζάνον κλάσμα που περιείχε δραστικότητα πολυμεράσης DNA αναφέρεται ως η replitase συγκρότημα κλάσμα όπως περιγράφεται από Murthy και Reddy [20]. Το συγκρότημα κλάσμα από το G

1 ή κύτταρα φάσης S στη συνέχεια υποβλήθηκε σε ανάλυση κηλίδος Western για να εκτιμηθεί η παρουσία ενζύμων ρυθμιστικών πρωτεϊνών σύνθεσης του DNA και του κυτταρικού κύκλου.

Ανάλυση Western Blot

δείγματα διαλύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης PAGE (Bio-Rad, Richmond, CA) και υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση σε αποδιατακτικό πήκτωμα 10% πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και μετά μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Μεμονωμένα μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με αντισώματα έναντι AR (AR-N20 ή AR-441), Cdc6 (Η-304), ειδικό αντιγόνο προστάτη (PSA, C-19), Lamin B, DNA πολυμεράση-α (STK1), PCNA (PC10 ), αναγωγάσης ριβονουκλεοτιδίου (R2, Ε-16), κυκλίνη Α (Η-432), κυκλίνη Ε (C-19) (όλα από την Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), p27

Kip-1, κυκλίνη Β (BD Transduction Lab, San Jose, CA), κασπάσης 3 (Cell σηματοδότηση Danvers, ΜΑ), ή GAPDH (Chemicon, Temecula, CA). Ανοσοαντιδραστικές ζώνες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας συζευγμένο με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα χρένο και SuperSignal WestPico χημειοφωταυγές υπόστρωμα (Pierce, Rockfold, IL) και εμφανίσθηκε με τη χρήση φιλμ ακτινών Χ.

χρώση ανοσοφθορισμού και συνεστιακό μικροσκόπιο

LNCaP κύτταρα αναπτύχθηκαν σε γυάλινες πλάκες πλύθηκαν μία φορά με PBS, ακολουθούμενη από σταθεροποίηση σε 3,7% (ο /ο) φορμαλδεΰδη για 20 λεπτά στους 22 ° C. Τα κύτταρα διαπερατά σε 0.5% (ο /ο) Triton Χ-100 για 15 λεπτά και αποκλείστηκαν για 1 ώρα σε 2% (β /ο) BSA σε 22 ° C. Τα πλακίδια στη συνέχεια επωάστηκαν για 1 ώρα στους 22 ° C με αντισώματα έναντι AR (AR-N20 ή AR-441) και Cdc6 ή DNA πολυμεράση-α που ακολουθείται από δύο κατσίκας-αντι-ποντικού-ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) – και κατσίκα-αντι Κουνέλι-τετραμεθυλοροδαμίνη Β ισοθειοκυανική (TRITC) -σημασμένου δευτερογενή αντισώματα (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ). Μετά από τέσσερις πλύσεις με PBS, τα πλακίδια τοποθετούνται με Aqua-Poly /Όρος (Polysciences Inc., Warrington, ΡΑ). Ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ διεξήχθη με Zeiss LSM 410 όρθια συνεστιακό μικροσκόπιο. Οι εικόνες επεξεργάστηκαν και ανάλυση colocalization (το οποίο είναι χρωματισμένο κίτρινο) πραγματοποιήθηκε με ένα σύστημα Meta Διέγερση Zeiss LSM 410 με συλλογή στα 488 και 543 nm. Ένταση Συσχέτιση Quotient (ICQ) ανάλυση για την ποσοτικοποίηση AR colocalization με Cdc6 ή DNA πολυμεράση α διεξήχθη με τη χρήση λογισμικού ImageJ (ΝΙΗ, Bethesda, MD).

ανοσοφθορισμού Ανίχνευση βρωμοδεοξυουριδίνης (BrdU) ενσωματώθηκε στο DNA

LNCaP κύτταρα αναπτύχθηκαν σε γυάλινες πλάκες σημάνθηκαν με 10 μΜ BrdU (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) για 30 λεπτά, πλύθηκαν μία φορά με PBS και μονιμοποιήθηκαν σε 3.7% φορμαλδεΰδη για 20 λεπτά στους 22 ° C. Τα κύτταρα διαπερατά σε 0.5% (ν /ν) Triton Χ-100 για 15 λεπτά και αποκλείστηκαν για 1 ώρα σε 2% (w /v) λευκωματίνη βόειου ορού στους 22 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με μονοκλωνικά αντισώματα ποντικού έναντι BrdU (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ), που ακολουθείται από κατσίκα αντι-ποντικού-ΡΙΤΟ-επισημασμένο δευτερογενές αντίσωμα. Διαφάνειες τοποθετήθηκαν με Vectashield Τοποθέτηση Μέσο που περιέχει DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) και φωτομι- έγινε με ένα μικροσκόπιο Zeiss Axiofot εξοπλισμένο για επιφθορισμό.

Αποτελέσματα

Χρήση του Casodex να προσδιοριστεί ο ρόλος του AR στον κύκλο κυττάρων συγχρονισμένων LNCaP κύτταρα

στρατηγικές AR knockdown έχουν χρησιμοποιηθεί για να αποδείξει ότι η AR είναι απαραίτητη για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του προστάτη [8], [9], [10], [11], [12]. Ωστόσο, AR knockdown με siRNA ή shRNA απαιτεί θεραπεία του καρκίνου του προστάτη κύτταρα σε περίοδο αρκετών ημερών. Έτσι, αυτή η προσέγγιση δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό όταν στον κυτταρικό κύκλο (δηλαδή, G

1, S, ή G

2 /M φάσεις) AR απαιτείται για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων LNCaP, καθώς κάθε φάση της κυτταρικού κύκλου δεν διαρκεί περισσότερο από μερικές ώρες. Συνεπώς, χρησιμοποιήσαμε την μη-στεροειδή αντι-ανδρογόνα Casodex (βικαλουταμίδη) για την επιλεκτική και οξεία αναστέλλουν AR, προκειμένου να προσδιοριστεί ο ρόλος του AR στην πρόοδο των συγχρονισμένων κυττάρων LNCaP μέσα G

1 και S φάσεις.

Casodex χρησιμοποιείται συνήθως στους 10 έως 20 μΜ για την αναστολή της δραστηριότητας AR μεταγραφική ανδρογόνου επαγόμενη? αλλά σε αυτά τα πειράματα, τα κύτταρα είναι σε απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό (CSS) μέσο [21], [22] που περιέχει. Ωστόσο, συγχρονισμένα κύτταρα απελευθερώνονται στο μέσο που περιέχει CSS-δεν θα προχωρήσει διαμέσου του κυτταρικού κύκλου. Συγκρίναμε την αποτελεσματικότητα του Casodex για την έκφραση του ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA), μια ειδική γονίδιο AR-στόχου [23], σε κύτταρα LNCaP σε FCS- εναντίον CSS- μέσο. Στέρηση ανδρογόνου των κυττάρων σε CSS-μέσου μειωμένη έκφραση του PSA σε περίπου 50% αυτής που στα κύτταρα ελέγχου FCS-μεσαίες και Casodex προκάλεσε περαιτέρω μείωση (Σχ. 1Α και 1Β). Casodex σε 75-100 μΜ σε FCS-μέσο είχε την ίδια επίδραση στην έκφραση του PSA ως 25-50 μΜ Casodex σε CSS-μέσου (Σχ. 1Α και 1Β). Αξίζει να σημειωθεί ότι, όταν η εξαρτώμενη από τη δόση απόκριση προς Casodex χαράσσεται σε σχέση με τον δικό του έλεγχο (σε FCS vs. CSS), οι καμπύλες επικαλύπτονται, υποδεικνύοντας ότι το IC

50 για την αναστολή της δραστηριότητας AR είναι ≈50 μΜ Casodex είτε σε FCS ή CSS (Εικ. 1 C). Κύτταρα κατεργασμένα με 100 μΜ Casodex σε FCS-μέσου ήταν μορφολογικώς παρόμοια με αυτά που έλαβαν θεραπεία με 20 μΜ Casodex σε CSS-μέσο, ​​και 100 μΜ Casodex σε FCS-μέσο δεν προκάλεσε αξιοσημείωτη κυτταρικό θάνατο, όπως προσδιορίζεται με τη μέθοδο αποκλεισμού Trypan Blue (τα δεδομένα δεν απεικονίζεται). Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε 100 μΜ Casodex, ένα μέγιστη αποτελεσματική συγκέντρωση για την αναστολή της δραστηριότητας AR, να καθοριστεί ο ρόλος του AR σε πολλαπλασιασμό των κυττάρων LNCaP σε FCS-μέσο. Αυτή η συγκέντρωση είναι παρόμοια με αυτή που χρησιμοποιείται για να αναστείλει την έκφραση του PSA ή ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP με την παρουσία FCS [24], [25], [26].

Εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα LNCaP πλύθηκαν δύο φορές με ελεύθερο ορού και ορμόνες μέσο ελεύθερο και μεταφέρθηκαν σε μέσο RPMI που περιείχε 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) ή 6% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό (CSS). Μετά από 24 ώρες, Casodex προστέθηκε και τα κύτταρα επωάστηκαν για επιπλέον 24 ώρες. RNA που απομονώνεται από τον έλεγχο και την Casodex επεξεργασμένα κύτταρα υποβλήθηκε σε RT-PCR και ανάλυση qRT-PCR του PSA όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. προϊόντα (Α) RT-PCR του PSA και GAPDH διαχωρίστηκαν σε πήκτωμα 1% αγαρόζης. Η αναλογία του PSA πυκνότητα ταινίας /GAPDH (Ρ αναλογία /G) κυττάρων σε FCS χωρίς Casodex ορίστηκε στο 1,0 και το G /Ρ από άλλες συνθήκες θεραπείας εκφράζεται σε σχέση με αυτό το στοιχείο ελέγχου. (Β) Σχετικά επίπεδα PSA, όπως προσδιορίζεται με qRT-PCR, σχεδιάζονται ως συνάρτηση της συγκέντρωσης Casodex. Και (Γ) Σχετικά επίπεδα PSA στο Σχ. 1Β απεικονίζονται ως ποσοστό του μάρτυρα χωρίς Casodex υπολογίζεται χωριστά για FCS- και CSS- μέσο. Κλειστό κύκλο, FCS-μεσαίων? και ανοικτοί κύκλοι, CSS-μέσο. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

LNCaP Έναρξη κυττάρων σε S φάση απαιτεί λειτουργικά AR κατά τη διάρκεια Mid-G

1 Φάση

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι η ισολευκίνη αιτίες στέρησης LNCaP κύτταρα να συλλάβει το G

0 /G

1 φάση [15], [27]. Μετά την απελευθέρωση από ισολευκίνη-μπλοκ, δηλαδή, να μεταφέρει στο πλήρες μέσο που περιέχει FCS (FCS-μέτρια), αυτά τα κύτταρα πρόοδος μέσω G

1 και εισάγετε φάση S 12 ώρες μετά την απελευθέρωση, και κορυφώνονται της φάσης S 10-12 ώρες στη συνέχεια [15]. Έχουμε επίσης δείξει ότι η θεραπεία Casodex για 24 ώρες ξεκινώντας από τη στιγμή της απελευθέρωσης από ισολευκίνη-μπλοκ καταργεί την ικανότητα των κυττάρων να εισέλθουν στην S φάση [14], [15]. Ενώ αυτό πρότεινε έναν ρόλο του AR στον κυτταρικό κύκλο, ότι πειραματικό σχεδιασμό δεν μπορεί να διακρίνει μεταξύ ενός ρόλου των AR σε G φάση

1 έναντι S. Ως εκ τούτου, προκειμένου να γίνει διάκριση μεταξύ μιας ανασταλτική επίδραση του Casodex σε G

1 έναντι στη φάση S, υποβάλλαμε σε αγωγή συγχρονισμένα κύτταρα LNCaP με Casodex ξεκινούν από 0, 4, 8, 12, ή 16 ώρες μετά την απελευθέρωση από ισολευκίνη-block , και προσδιορίζεται η ικανότητα των κυττάρων να ενσωματώνουν

3Η-θυμιδίνης (

3H-TdR) σε 20 ώρες μετά από την απελευθέρωση, έναν χρόνο όταν τα κύτταρα ελέγχου είναι σε φάση S (βλέπε σχηματικό της Εικ. 2Α). Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, Casodex μέγιστη ανέστειλε

ενσωμάτωση 3Η-TdR αν προστεθούν οποιαδήποτε στιγμή κατά τη διάρκεια της G

1 φάση (δηλαδή, 0, 4, ή 8 ώρες μετά την απελευθέρωση), υποδεικνύοντας ένα ρόλο AR στο G

1. Αντίθετα, η επίδραση Casodex αμβλύνθηκε όταν η θεραπεία καθυστέρησε μέχρι 12-16 ώρες μετά την απελευθέρωση από ισολευκίνη-μπλοκ, μια εποχή όταν τα κύτταρα έχουν ήδη δεσμευτεί να εισέλθουν στην S φάση. θεραπεία Casodex των κυττάρων που είχαν ήδη εισέλθει στην S φάση (16 ώρες μετά την απελευθέρωση από ισολευκίνη-μπλοκ) είχε πολύ μικρή επίδραση στην

3Η-TdR ενσωμάτωσης (Εικ. 2Α). Έτσι, η ανασταλτική δράση του Casodex εμφανίζεται σε G

1 φάση, όταν τα κύτταρα ετοιμάζονται να εισέλθουν στην S φάση, και όχι στη φάση S. Ως εκ τούτου, AR απαιτείται G

1 για τα κύτταρα να εισέλθουν στην S φάση.

LNCaP κύτταρα συγχρονίστηκαν από ισολευκίνη-στέρηση και κυκλοφόρησε σε πλήρες μέσο. Α) Casodex προστέθηκε στον υποδεικνυόμενο χρόνο μετά την απελευθέρωση από ισολευκίνη-μπλοκ και διατηρείται σε μεσοπρόθεσμη έως ότου

3Η-TdR ενσωμάτωση προσδιορίστηκε σε 20 ώρες μετά την απελευθέρωση από ισολευκίνη-μπλοκ. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστό του

3H-TdR ενσωμάτωση σε κύτταρα ελέγχου που τέθηκαν σε πλήρες μέσο εν τη απουσία του Casodex. Α) Casodex προστέθηκε για μια περίοδο 4 ωρών, όπως φαίνεται στην κορυφή του πίνακα, και

3Η-θυμιδίνης (

3Η-TdR) ενσωμάτωση στο DNA προσδιορίστηκε κάθε 4 ώρες μετά την απελευθέρωση από ισολευκίνη-μπλοκ και μετά την αφαίρεση της Casodex. Κάθε σημείο δεδομένων είναι ο μέσος όρος των δειγμάτων εις τριπλούν με & lt? 10% παραλλαγή? δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά των δύο ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Στη συνέχεια προσδιορίζεται, όταν το G

1 φάση Casodex είναι πιο αποτελεσματική στην καταστολή της εισόδου των κυττάρων στη φάση S. Εμείς παλμών αντιμετωπίζονται συγχρονισμένη LNCaP κύτταρα με Casodex κατά το πρώτο, δεύτερο ή τρίτο 4 ωρών διάστημα μετά την απελευθέρωση από ισολευκίνη-μπλοκ, που αντιστοιχούν σε πρώιμο-G

1, μέσα G

1, ή αργά-G

1, αντίστοιχα, και προσδιορίζεται το ποσοστό του

3H-TdR ενσωμάτωση στο DNA κατά διαστήματα 4 ωρών για 24 ώρες (βλέπε σχηματικό του Σχ. 2Β). Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι το

3H-TdR ενσωμάτωση προσφέρει μια αξιόπιστη και αναπαραγώγιμη μέθοδος για την παρακολούθηση της εξέλιξης των συγχρονισμένων κυττάρων από G

1 έως φάση S και επιβεβαιώνεται από ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, καθώς και την έκφραση του S φάσης- ειδικές κυκλίνες και η ενεργοποίηση των εξαρτώμενων από κυκλίνη κινασών [14], [15]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β, η θεραπεία με Casodex κατά τα μέσα-G

1 (4-8 ώρες μετά την απελευθέρωση από ισολευκίνη-μπλοκ) ήταν πιο αποτελεσματική στο να εμποδίσουν την είσοδο στη φάση S από ό, τι ήταν η θεραπεία κατά τη διάρκεια της πρώιμης G

1 (0-4 ώρες μετά την απελευθέρωση από ισολευκίνη-μπλοκ) ή αργά-G

1 φάση (8-12 ώρες μετά την απελευθέρωση από ισολευκίνη-block). Αυτό υποδηλώνει συμμετοχή AR σε κυτταρικό κύκλο ρυθμιστικές εκδηλώσεις στα μέσα G

1 φάση που είναι ζωτικής σημασίας για τα κύτταρα LNCaP να προχωρήσουν από το G

1 έως Σ

AR αλληλεπιδρά με Cdc6, ένα κρίσιμο συστατικό του προ-RC απαιτείται για την συγκρότηση της αναπαραγωγής Μηχανήματα σε S φάση κύτταρα LNCaP

από την επεξεργασία Casodex στα μέσα G

1 μπλοκάρει την ικανότητα των συγχρονισμένων κυττάρων LNCaP να εισέλθουν στην S φάση (Εικ. 2), που ελεγχθεί αν AR αλληλεπιδρά με ρυθμιστικές πρωτεΐνες του κυτταρικού κύκλου που εμπλέκονται στη συναρμολόγηση προ-RC, όπως συναρμολόγηση προ-RC στα μέσα έως τα τέλη-G1 είναι απαραίτητη για τα κύτταρα να εισέλθουν στην S φάση και να ξεκινήσει τη σύνθεση του DNA. Cdc6 σύνδεση προς το συγκρότημα αναγνώριση προέλευσης (ORC) είναι το πρώτο βήμα στη διαδικασία του pre-RC συγκρότημα [16]. Παρατηρήσαμε ότι ένας ανοσοκατακρήμνισμα παρασκευάζονται χρησιμοποιώντας Cdc6-ειδικά αντισώματα (Cdc6-IP) περιείχαν AR, υποδηλώνοντας αλληλεπίδραση AR με Cdc6 (Εικ. 3Α). Αυτή η αλληλεπίδραση είναι ειδική καθώς μία από τις πιο άφθονα εκφρασμένες πρωτεΐνες, του ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA), σε κύτταρα LNCaP δεν συσχετίστηκε με Cdc6-IP (Σχ. 3Α). Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ των ρυθμιστικών πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου και ένζυμα της σύνθεσης του DNA σε μια ποικιλία κυττάρων οδηγεί στην συναρμολόγηση μιας σύνθετης πολυενζυμικά ονομάζεται replitase ή DNA μηχανήματα αντιγραφής [28], [29], [30]. Αυτά τα σύμπλοκα είναι εύκολα ανιχνεύσιμα σε κύτταρα που βρίσκονται σε φάση S, αλλά όχι οποιαδήποτε στιγμή κατά τη διάρκεια φάσης G1 [29], [30]. Ως εκ τούτου, ελέγξαμε κατά πόσο η αλληλεπίδραση AR-Cdc6 είναι ένας κύκλος που εξαρτάται από κύτταρο φαινόμενο. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Β, αν και Cdc6 ήταν παρούσα σε χαμηλό επίπεδο σε G

κύτταρα 1 φάση, η σύνδεσή της με το AR-IP παρατηρήθηκε σε συγχρονισμένα κύτταρα LNCaP που ήταν στη φάση S, αλλά όχι σε εκείνους που ήταν στο G

1 φάση. Συγκριτικά, λαμίνη Β, μια πυρηνική πρωτεΐνη, έδειξε πολύ μικρή διαφορά σε σχέση με AR-IP από το G

1 έναντι κυττάρων φάσης S (Σχ. 3Β). Έτσι, AR παρουσιάζει έναν κύκλο εξαρτώμενη αλληλεπίδραση κυττάρου με Cdc6.

Α) Cdc6-IP παρασκευάστηκε από εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα LNCaP και υποβλήθηκε σε ανάλυση κηλίδας Western. Β) AR-IPs παρασκευάστηκαν από συγχρονισμένες G

1 φάση (1 ώρα μετά την απελευθέρωση από ισολευκίνη-block) ή S φάση (20 ώρες μετά την απελευθέρωση από ισολευκίνη-block) κύτταρα LNCaP, και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western. IgG βαριά αλυσίδα στο AR-IP και IgG-IP υποδεικνύεται από το βέλος.

Η

Casodex Διαταράσσει AR-Cdc6 Αλληλεπίδραση

Από AR εμπλέκεται για να παίξει ένα ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης Cdc6 [14], [31], ελέγξαμε αν Casodex επαγόμενη αποκλεισμό της εισόδου των κυττάρων LNCaP σε φάση S οφείλεται σε μείωση επιπέδων πρωτεΐνης Cdc6. Στην πραγματικότητα, κάτω από τις πειραματικές συνθήκες που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη, Casodex δεν είχε καμία αξιοσημείωτη επίδραση ούτε Cdc6 ή επίπεδα πρωτεΐνης AR στους εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα LNCaP (Σχ. 4Α, εισόδου). Παρ ‘όλα αυτά, Casodex διαταράσσεται αλληλεπίδραση AR με Cdc6 όπως υποδεικνύεται από την παρουσία του Cdc6 σε AR-IP των κυττάρων ελέγχου, αλλά όχι σε εκείνη των Casodex κατεργασμένων κυττάρων (Σχ. 4Α, AR-ΙΡ). Αυτό Casodex που προκαλείται από διαταραχή της AR σύνδεσης με Cdc6 υποστηρίχθηκε περαιτέρω από συνεστιακή μικροσκοπία (Σχήμα 4Β.)? παρατηρήσαμε μια αισθητή μείωση της colocalization του AR με Cdc6 στους πυρήνες των Casodex κατεργασμένων κυττάρων (ICQ = 0,059 ± 0,022 SD) σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (ICQ = 0,152 ± 0,047 SD). Έτσι, Casodex επαγόμενη καταστολή της εισόδου των κυττάρων LNCaP σε φάση S συνδέεται με την διάρρηξη του AR-Cdc6 αλληλεπίδραση.

Α) Εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα LNCaP υπέστησαν επεξεργασία με Casodex ή φορέα (έλεγχος) επί 24 ώρες και AR-IP παρασκευασμένα από επεξεργασμένα και κύτταρα ελέγχου υποβλήθηκε σε ανάλυση κηλίδας Western για την ανίχνευση AR και Cdc6. Β) LNCaP κύτταρα αναπτυγμένα σε καλυπτρίδες συγχρονίζεται από ισολευκίνη-στέρηση και απελευθερώνονται σε πλήρες μέσο παρουσία του οχήματος (έλεγχος) ή Casodex. Στις 24 ώρες μετά την απελευθέρωση από ισολευκίνη-μπλοκ (όταν τα κύτταρα ελέγχου αναμένεται να εισέλθουν φάση S), τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και επεξεργασία για χρώση immunoflourescent χρησιμοποιώντας αντι-AR (AR-441) μονοκλωνικό ποντικού και αντι-Cdc6 (H-304) κουνέλι πολύκλωνα αντισώματα.

η

AR αλληλεπιδρά με S Phase κυκλίνες

Εκτός Cdc6, μερικές από τις ρυθμιστικές πρωτεΐνες του κυτταρικού κύκλου, όπως κυκλίνες Ε και Α, παίζουν επίσης ένα σημαντικό ρόλο στην συγκρότηση προ-RC σε G

1 [16]. Ως εκ τούτου, ελέγξαμε κατά πόσο AR αλληλεπιδρά με οποιοδήποτε από τα κυκλινών που είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στην εξέλιξη των κυττάρων από G

1 έως φάση S (δηλ., Οι κυκλίνες Ε και Α) και G

2 /Μ ( δηλ., η κυκλίνη Β) φάσεις σε κύτταρα LNCaP. Παρατηρήσαμε ότι η κυκλίνη Ε και κυκλίνη Α, αλλά όχι μια μιτωτική κυκλίνη, κυκλίνη Β, συνδέθηκαν με AR-IP παρασκευασμένα από εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα LNCaP (Εικ. 5). Συγκριτικά, GAPDH, ένα κυτοσολικό δείκτη, δεν συσχετίστηκε με AR-ΠΕ. Έτσι, AR επιδεικνύει μία ειδική αλληλεπίδραση με ρυθμιστικές πρωτεΐνες του κυτταρικού κύκλου που εμπλέκονται στην ρύθμιση της εισόδου των κυττάρων στη φάση S.

AR-IP παρασκευασμένα από εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα LNCaP υποβλήθηκε σε ανάλυση κηλίδας Western.

AR αλληλεπιδρά με τα ένζυμα της σύνθεσης του DNA

από το CDC-6-εξαρτώμενη συναρμολόγηση προ-RC οδηγεί στην πρόσληψη των ενζύμων της σύνθεσης του DNA στους χώρους της αντιγραφής του DNA [16], και δεδομένου ότι AR αλληλεπιδρά με Cdc6 (Εικ. 3), ελέγξαμε αν AR-IP περιέχει επίσης ένζυμα της σύνθεσης του DNA. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6, παρατηρήσαμε ότι AR-IP παρασκευάζονται χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικά AR αντισώματα (AR-N20 και AR-441) περιείχαν DNA πολυμεράση-α, ένα ένζυμο κλειδί που εμπλέκονται στην εκκίνηση της σύνθεσης του DNA (Σχ. 6Α). αλληλεπίδραση AR με DNA πολυμεράση-α περαιτέρω ενισχύεται από immunoflourescent συνεστιακή μικροσκοπία (Σχήμα 6Β.)? παρατηρήσαμε μια ισχυρή colocalization του AR με DNA πολυμεράση-α (ICQ = 0.45 ± 0.016 SD) στους πυρήνες των κυττάρων LNCaP. Εκτός από την DNA πολυμεράση-α, AR-IP παρασκευάζονται χρησιμοποιώντας AR-441 και AR-N20 αντισώματα που περιέχονται πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (PCNA), μία βοηθητική πρωτεΐνη της πολυμεράσης DNA, και την καταλυτική υπομονάδα της ριβονουκλεοτιδικής αναγωγάσης (RNR2), η οποία μετατρέπει ριβονουκλεοτίδια σε δεοξυριβονουκλεοτίδια απαιτείται για τη σύνθεση DNA (Σχ. 6C). Εκτός από το ρόλο της στον πολλαπλασιασμό [8], [9], [10], [11], [12], AR αναφέρεται επίσης ότι παίζει ένα κρίσιμο ρόλο στην επιβίωση των κυττάρων LNCaP, όπως AR knockdown οδηγεί σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο [32]. Ως εκ τούτου, ελέγξαμε κατά πόσο ο ρόλος του AR σε ρύθμιση της απόπτωσης περιλαμβάνει επίσης την αλληλεπίδρασή της με αποπτωτικών πρωτεϊνών. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α, κασπάσης-3, ένα αποπτωτικό ένζυμο, δεν ανιχνεύθηκε σε AR-ΠΕ. Έτσι, AR παρουσιάζει μία επιλεκτική αλληλεπίδραση με τα ένζυμα της σύνθεσης του DNA που απαιτείται για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων LNCaP.

AR-IP περιέχει DNA πολυμεράση-α. AR-IP παρασκευασμένα από εκθετικά αυξανόμενα κύτταρα LNCaP χρησιμοποιώντας αντι-AR μονοκλωνικό ποντικού (441) ή πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (Ν-20) αντισωμάτων υποβλήθηκε σε ανάλυση κηλίδας Western. Β) AR είναι colocalized με DNA πολυμεράση-α σε κύτταρα LNCaP. Εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα LNCaP σε πλάκες μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με αντι-AR (Ν-20) πολυκλωνικό κουνελιού και αντι-DNA πολυμεράση-α (STK1) μονοκλωνικά αντισώματα ποντικού και συνεστιακή μικροσκοπία διεξήχθη. Γ) AR-IP περιέχει PCNA και ριβονουκλεοτιδικής αναγωγάσης.