Αφηρημένο

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι ένας από τους πιο κοινούς τύπους καρκίνου και προκαλεί 1.380.000 θανάτους ετησίως, από το 2008 σε όλο τον κόσμο. Ο εντοπισμός των φυσικών παραγόντων κατά του καρκίνου του πνεύμονα έχει γίνει πολύ σημαντικό. Gambogenic οξύ (GNA) είναι μία από τις δραστικές ενώσεις του Gamboge, ένα παραδοσιακό φάρμακο που χρησιμοποιήθηκε ως δραστική καθαρτικό, εμετικό, ή ανθελμινθικό για τη θεραπεία της ταινίας. Πρόσφατα, όλο και περισσότερα στοιχεία έδειξε ότι GNA ασκεί ελπιδοφόρα αποτελέσματα κατά του όγκου? Ωστόσο, ο υποκείμενος μηχανισμός παραμένει ασαφής. Στην παρούσα εργασία, βρήκαμε ότι GNA θα μπορούσε να προκαλέσει το σχηματισμό κενοτοπίων, το οποίο συνδέεται με την αυτοφαγία σε Α549 και κύτταρα HeLa. Περαιτέρω μελέτες αποκάλυψαν ότι GNA προκαλεί την έναρξη της αυτοφαγία με βάση τα αποτελέσματα της χρώσης MDC, χρώση AO, συσσώρευση LC3 II, ενεργοποίηση Beclin 1 και φωσφορυλίωση p70S6K. Ωστόσο, η υποβάθμιση της ρ62 διαταράχθηκε και δωρεάν GFP δεν μπορούσε να κυκλοφορήσει σε κύτταρα επεξεργασμένα GNA, η οποία έδειξε ένα μπλοκ στη ροή αυτοφαγία. Περαιτέρω μελέτες έδειξαν ότι η GNA εμποδίζει τη συγχώνευση μεταξύ αυτοφαγοσώματα και λυσοσώματα αναστέλλοντας την οξίνιση σε λυσοσώματα. Αυτή η δυσλειτουργική autophagy παίζει ένα ρόλο προ-θανάτου σε GNA-κατεργασμένα κύτταρα με την ενεργοποίηση της ρ53, Βαχ και διασπασμένη κασπάση 3, ενώ μειώνεται Bcl-2. Beclin 1 knockdown μειώθηκαν σημαντικά GNA-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο και τις επιπτώσεις στην ρ53, Bax, διασπασμένη κασπάση 3 και Bcl-2. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος. Τα ευρήματά μας δείχνουν, για πρώτη φορά, ότι η GNA μπορεί να προκαλέσει παρεκκλίνουσα αυτοφαγία να προκαλεί κυτταρικό θάνατο και μπορεί να υποδηλώνουν την πιθανή εφαρμογή της GNA ως εργαλείο ή βιώσιμη ναρκωτικών στην αντικαρκινικών θεραπειών

Παράθεση:. Mei W, Dong C , Hui C, Bin L, Fenggen Υ, Jingjing S, et al. (2014) Τα κύτταρα Gambogenic οξύ σκοτώνει τον καρκίνο του πνεύμονα μέσω Aberrant Autophagy. PLoS ONE 9 (1): e83604. doi: 10.1371 /journal.pone.0083604

Συντάκτης: Eric Asselin, Πανεπιστήμιο του Κεμπέκ στο Trois-Rivieres, Καναδάς

Ελήφθη: 18 Ιούνη, 2013? Αποδεκτές: 5 Νοέμ 2013? Δημοσιεύθηκε: 10 Ιανουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Mei et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας, Νο 81173600 (Q.-L. Li)? το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Anhui, Κίνα, Νο 11040606M190 (Q.-L. Li) και το κλειδί του έργου στο Εθνικό Επιστημονικό & amp? Τεχνολογίας Πρόγραμμα πυλώνα 2009ZX09103-399 (Q.-L. Li, Co-PI). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα ήταν ένας από τους πιο κοινούς τύπους καρκίνου για αρκετές δεκαετίες και τους λογαριασμούς για το 15-20% όλων των θανάτων από καρκίνο σχετίζονται παγκοσμίως [1] – [2]. Έως το 2008, εκτιμάται ότι περίπου 1.610.000 νέες περιπτώσεις ανά έτος έχουν αναφερθεί σε όλο τον κόσμο. Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι μια σημαντική αιτία θανάτου στον ανεπτυγμένο κόσμο και η πιο κοινή μορφή καρκίνου στην Κίνα [3]. Η χειρουργική εκτομή είναι η κύρια μέθοδος θεραπείας για τον καρκίνο του πνεύμονα. Ωστόσο, η χημειοθεραπεία /ακτινοβολία εξακολουθεί να είναι η αποτελεσματική θεραπεία για ασθενείς με προχωρημένο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) ή μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [4]. Κατά συνέπεια, τα νέα θεραπευτικές στρατηγικές και φάρμακα απαιτούνται επειγόντως για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα.

Autophagy είναι ένα φυσιολογικό αυτό-πεπτική διεργασία που αποικοδομείται κυτταροπλασματικά συστατικά για τη διατήρηση του κυτταρικού μεταβολισμού κατά την διάρκεια θρεπτικό στέρηση ή /και μεταβολικό στρες. Κατά τη διάρκεια της αυτοφαγία, μακρομόρια, τα μακρόβια πρωτεΐνες και κατεστραμμένα οργανίδια (όπως το ενδοπλασματικό δίκτυο και τα μιτοχόνδρια) που περιβάλλεται από αυτοφαγοσώματα. Οι αυτοφαγοσώματα στη συνέχεια συντήκονται με λυσοσώματα, όπου ο απομονωμένος περιεχόμενο υφίστανται υποβάθμιση και την ανακύκλωση από υδρολάσες κάτοικο. Autophagy είναι σημαντική σε όλα τα κύτταρα για την απομάκρυνση των μακρόβιων πρωτεϊνών ή κατεστραμμένα οργανίδια. Αυτή η ικανότητα προκαλεί αυτοφαγία να είναι μια πολλά υποσχόμενη υποψήφια για ένα μηχανισμό επιβίωσης ως απάντηση σε διάφορες καταπονήσεις [5]. Ωστόσο, αρκετές πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι autophagy λειτουργεί επίσης ως ένας μηχανισμός προ-θάνατος που προκαλείται από αντικαρκινική θεραπεία [6] – [9]. Πράγματι, αυτοφαγικά κυτταρικός θάνατος θεωρείται ότι προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο τύπου ΙΙ, ενώ η απόπτωση είναι προγραμματισμένος κυτταρικός τύπος θανάτου Ι [10]. Αυτοί οι δύο τύποι θανάτου κυττάρου έχουν περιγραφεί ως διακριτές μορφές κυτταρικού θανάτου? Ωστόσο, πολλές μελέτες δείχνουν cross-talk μεταξύ των δύο τύπων. Για παράδειγμα, ρ53, η οποία είναι ένας ισχυρός επαγωγέας της απόπτωσης, μπορεί επίσης να προκαλέσει την αυτοφαγία μέσω της αύξησης της έκφρασης του

DRAM

, ένα γονίδιο άμεσο στόχο p53 [11]. Beclin 1 /Atg 6 είναι τμήμα ενός τύπου συμπλόκου κινάσης ΡΙ3 III που απαιτείται για τον σχηματισμό των αυτοφαγικά κυστιδίων. Παρεμβολή με Beclin 1 μπορεί να αποτρέψει την επαγωγή της αυτοφαγία. Η διακοπή της αλληλεπίδρασης μεταξύ της περιοχής ΒΗ3 του Beclin 1 και Bcl-2 οδηγεί σε αυξημένη autophagy [12] – [13].

Gambogenic οξύ (GNA, C38H46O8, MW 631.32) (Σχήμα 1Α) είναι ένα από τα κύρια ενεργά συστατικά του Gamboge, μία ρητίνη εξιδρώνεται από το hanburyi δέντρο Garcinia [14]. Gamboge είναι ένα παραδοσιακό φάρμακο που χρησιμοποιήθηκε ως δραστική καθαρτικό, εμετικό, και ανθελμινθικό για τη θεραπεία της ταινίας. Gamboge έχει χρησιμοποιηθεί στη θεραπεία του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού, ο καρκίνος του πνεύμονα, λεμφικό σάρκωμα και καρκίνωμα cutaneum [15], σε μια κλινική στην Κίνα και έχει δείξει συναρπαστικά αποτελέσματα [16]. Πρόσφατα, συσσωρεύοντας στοιχεία έχουν καταδείξει ότι το κύριο δραστικό συστατικό GNA έχει ένα ευρύτερο φάσμα των αποτελεσμάτων αντι-όγκου και μικρότερη τοξικότητα [17] – [19]. Τα μοριακά και βιοχημικά αποτελέσματα της GNA περιλαμβάνουν την επαγωγή της απόπτωσης σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές και ζωικά μοντέλα της καρκινογένεσης [20] – [24]. Υυ et al. έχουν διαπιστώσει ότι GNA μπορούν να προκαλέσουν GSK3b-εξαρτώμενη G1 σύλληψη στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα και πρότεινε ότι GNA μπορεί να προκαλέσει κυτταρικό θάνατο μέσω αυτοφαγία παρά απόπτωση [25]. Ωστόσο, οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν τις επιδράσεις της GNA παραμένουν ασαφείς. Οι παρούσες μελέτες αποκαλύπτουν το μοριακό μηχανισμό και το ρόλο των αυτοφαγία στην GNA επαγόμενη κυττάρου όγκου θάνατο.

Α, η χημική δομή του GNA. Β, GNA αναστέλλει την ανάπτυξη και αναστέλλει τον κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα. Α549 και HeLa κύτταρα κατεργάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις GNA για τις υποδεικνυόμενες χρονικές περιόδους, και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων αναλύθηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ. C, τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (έλεγχος) ή κύτταρα επεξεργασμένα με 3 μΜ GNA για 24 ώρες ήταν άμεσα παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (αριστερά) και κυττάρων κενοτοπίων ποσοτικοποιήθηκε (δεξιά)? παρατηρήθηκαν τουλάχιστον 600 κύτταρα. Μέσα ± SEM, η = 3.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Οι ποντικοί διατηρήθηκαν σε ένα συγκεκριμένο παθογόνο-ελεύθερο περιβάλλον. Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από τη συμβουλευτική επιτροπή καλής μεταχείρισης των ζώων του Πανεπιστημίου Επιστήμης και Τεχνολογίας της Κίνας (Αριθμός Άδειας: 2010-11). ελήφθησαν επαρκή μέτρα για την ελαχιστοποίηση του πόνου και της δυσφορίας σε συμμόρφωση με τους εθνικούς κανονισμούς.

1. Αντιδραστήρια και αντισώματα

Gambogenic οξύ (ΠΕΑ) (Εικόνα 1Α), που απομονώθηκε από Gamboge, δόθηκε από το εργαστήριο καθ Xiaoshan του Wang. Η καθαρότητα GNA ήταν 99%, το οποίο προσδιορίστηκε με HPLC-DAD. ΜΤΤ, monodansylcadaverine (MDC), ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ), Annexin V, ακριδίνη πορτοκαλί και Hoechst 33342 αγοράστηκαν από την Sigma. Η ραπαμυκίνη και τρεαλόζη ήταν ευγενικό δώρα από τον καθηγητή Guanghui Wang. Mitotracker Red, LysoTracker Κόκκινο και LysoSensor Πράσινο DND-189 ελήφθησαν από την Invitrogen. αντισώματα LC3 αγοράστηκαν από Novus (NB100-2220), αντισώματα ρ62 ήταν από την Biomol (PW9860), p70S6K (1494-1), ρ-p70S6K (3204-1) και ρ-p38 (1229-1) αντισώματα ήταν από Epitomics. αντισώματος GAPDH αγοράστηκε από την Chemicon (MAB374). GFP (sc-9996), κασπάσης-3 (sc-7148), ρ53 (sc-6243), Bax (sc-7480), Beclin 1 αντισώματα (SC-11427), και Bcl-2 (sc-7382) αγοράστηκαν από Santa Cruz Biotechnology. Τα αντιδραστήρια διαλύθηκαν σε φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (PBS), εκτός από GNA και ραπαμυκίνη, τα οποία παρασκευάστηκαν σε DMSO.

2. καλλιέργεια κυττάρων

Το ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα Α549 κυτταρική σειρά αγοράστηκε από την Τράπεζα Κυττάρων της Σαγκάης Ινστιτούτο Κυτταρικής Βιολογίας. Η ανθρώπινη επιθηλιακή κυτταρική σειρά καρκινώματος HeLa και καθιέρωσε GFP-LC3 κύτταρα /HeLa παρασχέθηκαν από τον καθηγητή Guanghui Wang [26]. Για τη δημιουργία μιας σταθερής κυτταρικής σειράς που εκφράζει EGFP-λιωμένο LC3, κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν με EGFP-LC3, και επιλέγονται μεμονωμένοι κλώνοι που εκφράζουν σταθερά GFP-LC3 χρησιμοποιούσαν 0,2 mg /mL G418. Μία μέτρια κλώνος έκφρασης ανθεκτικά στο G418 επιλέχθηκε για περαιτέρω πειράματα. SPC-Α-1, Η460, GIC-82 και 16-HBE παρασχέθηκαν από τον καθηγητή Guang-Μπιάο Zhou [25]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco Τροποποιημένο Eagle Medium (ϋΜΕΜ) (Sigma) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) (Invitrogen), 100 U /ml πενικιλίνη, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη στους 37 ° C υπό 5% CO

2.

3. Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασία

ΜΤΤ δοκιμασία.

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

4 κύτταρα σε 100 μΐ μέσου ανά φρεάτιο σε 24 ώρες πριν από την πείραμα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις της GNA στους 37 ° C για τον υποδεικνυόμενο διάρκεια του χρόνου. διάλυμα ΜΤΤ προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας (500 μg /ml τελική συγκέντρωση) σε 4 ώρες πριν από το τέλος της θεραπείας. Η αντίδραση σταμάτησε με την προσθήκη 10% οξινισμένου SDS (100 μΐ) σε κάθε φρεάτιο. Η τιμή απορρόφησης (Α) στα 490 nm μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα αυτοματοποιημένο Microplate Reader (800uv Bio-Tek ELX, Bio-Tek Instrument Inc, Winooski, VT, USA). Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκφράστηκε ως (Asample – Ablank) /(Acontrol – Ablank) × 100%, όπου Α είναι η απορρόφηση. Για τα κύτταρα σε επεξεργασία με αντιδραστήρια, τα κύτταρα υπό αγωγή με όχημα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. Το κενό που αντιπροσωπεύεται ΜΤΤ προστίθεται στο μέσο.

ΡΙ ή αννεξίνη V /PI κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις GNA για 24 ώρες, συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, μετά πλύθηκαν δύο φορές με PBS, επωάστηκαν με ΡΙ μόνο του ή μαζί με αννεξίνη V-ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη για 10 λεπτά μακριά από το φως και αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής (Becton & amp? Dickinson, USA). Το ποσοστό των νεκρών κυττάρων προσδιορίσθηκε με βάση την διαπερατότητα της μεμβράνης του πλάσματος σε PI.

Trypan blue δοκιμασία χρώσης.

Τα κύτταρα (2 χ 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο) σπάρθηκαν σε 24 -Καλά πλάκες με επίπεδο πυθμένα. Μετά από καλλιέργεια επί 24 ώρες, 3 μΜ GNA προστέθηκε για τις υποδεικνυόμενες χρονικές περιόδους. Τα κύτταρα στη συνέχεια αποκολλήθηκαν από το υπόστρωμα με θρυψινοποίηση και χρωματίστηκαν με διάλυμα κυανού Trypan (0,4% σε PBS). Ο αριθμός των νεκρών κυττάρων μετρήθηκε σε αιμοκυτταρόμετρο υπό μικροσκόπιο φωτός (Olympus, Japan). Τουλάχιστον 400 κύτταρα μετρήθηκαν για κάθε δείγμα, και το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές.

4. Αυτοφαγικά δείκτη χρώσης

GFP-LC3 /κύτταρα HeLa που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με 3 μΜ της GNA για τις υποδεικνυόμενες χρονικές περιόδους επωάστηκαν με 10 μΜ monodansylcadaverine ή 75 ηΜ LysoTracker Κόκκινο για 15 λεπτά. Μετά από πλύσιμο δύο φορές με PBS, τα κύτταρα εξετάστηκαν με μικροσκοπία φθορισμού (Olympus, Japan).

5. Ποσοτικοποίηση των όξινων φυσαλιδώδους οργανιδίων με πορτοκαλί της ακριδίνης

Μετά την κατεργασία με τις υποδεικνυόμενες αντιδραστήρια, τα κύτταρα βάφτηκαν με πορτοκαλί της ακριδίνης σε μια τελική συγκέντρωση 1 μg /ml για 15 λεπτά μακριά από το φως, τότε παρατηρείται κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού ή συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

6. μετάδοσης ηλεκτρονίου μικροσκοπία

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και καρκινικό ιστό εκτομήθηκε, μετά πλύθηκαν δύο φορές με PBS και σταθεροποιήθηκαν με 2% παραφορμαλδεΰδη /2% γλουταραλδεΰδη σε 0.1 Μ φωσφορικό ρυθμιστικό (ρΗ 7.4), που ακολουθείται από 1% ΟΣΟ

4. Μετά την αφυδάτωση, λεπτές τομές χρωματίστηκαν με οξικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο για παρατήρηση κάτω από ένα JEOL ΤΕΜ-100SX ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (JEOL, Japan).

7. Ανάλυση ανοσοκηλίδας

κύτταρα ή ιστό όγκου πλύθηκαν σε ψυχρό αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) στους 4 ° C, κατόπιν πρωτεΐνες παρασκευάστηκαν, διαχωρίστηκαν με 12% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Millipore) . Η μεμβράνη επωάστηκε για 1 ώρα σε PBS-Tween 20 (0,05%) που περιέχει 5% άπαχο γάλα. Πρωτογενή αντισώματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας αντι-ποντικού προβάτου IgG-HRP ή αντι-κουνελιού IgG-HRP δεύτερα αντισώματα (Amersham Pharmacia Biotech). Οι πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης ECL (Amersham Pharmacia Biotech). Ένα αντι-GAPDH αντίσωμα (αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης? Chemicon). Χρησιμοποιήθηκε για να εξασφαλιστεί η ίση φόρτωση πρωτεϊνών

Για την εκ νέου ανιχνευτή στη μεμβράνη με ένα άλλο πρωτεύον αντίσωμα, η μεμβράνη επωάστηκε πρώτα με απογύμνωσης Buffer (50 mM Tris-HCl, ρΗ 6,8, 0,1 mM β-μερκαπτοαιθανόλη, και 20 mM SDS) για 30 λεπτά στους 50 ° C, στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο.

8. RNA παρεμβολής

δίκλωνα ολιγονουκλεοτίδια που στοχεύουν 5′-CCACUCUGUGAGGAAUGCACAGAUA-3 ‘των Beclin 1 mRNA ανθρώπινου συντέθηκε από Σαγκάη GenePharma (Σαγκάη, Κίνα), και ένα άσχετο ολιγονουκλεοτίδιο χρησίμευε ως αρνητικός μάρτυρας. Η διαμόλυνση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, το siRNA και Lipofectamine 2000 (Invitrogen) αναμίχθηκαν σε μέσο Opti-ΜΕΜ (Invitrogen) και επωάστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για να επιτραπεί ο σχηματισμός συμπλόκου. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με μέσο Opti-ΜΕΜ (Invitrogen), και προστέθηκε το μείγμα. Σε 12 ώρες μετά την επιμόλυνση, το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​πλήρες μέσο. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση και αναλύθηκαν περαιτέρω.

9. μοντέλο ποντικού ξενομοσχεύματος

BALB /CA γυμνά ποντίκια (30-40 ημερών και βάρους 18-20 g) χωρίστηκαν σε ομάδες που περιέχουν έξι ποντικών ανά ομάδα. κύτταρα Α549 ενέθηκαν s.c. (2 × 10

6 κύτταρα ανά ποντικό) στο δεξί οπίσθιο πόδι των ποντικών. Μετά καθορίστηκαν οι όγκοι (-50 mm

3), οι ποντικοί ί.ν. ένεση με ή χωρίς 16 mg /kg GNA δύο φορές την εβδομάδα για τρεις εβδομάδες. Σε 24 ώρες μετά την τελευταία ί.ν. ένεση, οι όγκοι απομονώθηκαν για ηλεκτρονικό μικροσκόπιο και κηλίδωση western ανάλυση.

10. Αξιολόγηση της ρΗ σε λυσοσώματα

Μετά την κατεργασία των κυττάρων Α549 με 3 μΜ GNA για τις υποδεικνυόμενες χρονικές περιόδους, τα κύτταρα επωάστηκαν με 1 mM LysoSensor Πράσινο DND-189 για 15 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS, στη συνέχεια εξετάστηκαν με μικροσκοπία φθορισμού (Olympus, Japan).

Αποτελέσματα

1. GNA αναστέλλει την ανάπτυξη και επάγει κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα

Η επίδραση της GNA επί κυτταρικής ανάπτυξης ερευνήθηκε χρησιμοποιώντας μια ΜΤΤ δοκιμασία σε αρκετές καρκινικές κυτταρικές γραμμές του ανθρώπου. Εξετάσαμε πρώτα την επίδραση του GNA επί του κυττάρου βιωσιμότητα των Α549 και κύτταρα HeLa. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, GNA ανέστειλε την ανάπτυξη σε Α549 και κύτταρα HeLa από τη συγκέντρωση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 1Β). Για την επιβεβαίωση των επιδράσεων του GNA επί κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα, η δοκιμασία ΜΤΤ επαναλήφθηκε σε διάφορες άλλες καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές (Η460, SPA-C-1, Glc-82 και η κανονική βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων γραμμή 16-ΗΒΕ). Η460, SPA-C-1 και Glc-82 ήταν όλα ευαίσθητα σε GNA, ενώ 16-ΗΒΕ ήταν λιγότερο ευαίσθητη σε GNA (Σχήμα S1A). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι GNA μπορεί να σκοτώσει αποτελεσματικά τον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων με χαμηλή τοξικότητα.

Είναι ενδιαφέρον ότι, όταν πραγματοποιήσαμε ένα ελαφρύ πείραμα κινητικής μικροσκοπία, βρήκαμε ότι τα κύτταρα GNA αγωγή παρουσίασαν προοδευτική συσσώρευση ενδοκυτταροπλασματική κενοτόπια που ήταν παρόμοιες με αυτές που συχνά παρατηρούνται σε κύτταρα που υφίστανται αυτοφαγία (Σχήμα 1 C). Εν τω μεταξύ, ένα αυξημένο ποσοστό των κυττάρων με μεγάλο ορατό χυμοτόπια παρατηρήθηκε στα κύτταρα GNA αγωγή σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 1C), συνεπής με ένα μηχανισμό αυτοφαγία σχετίζονται.

2. GNA αυξήσει δείκτες αυτοφαγικά σε Α549 και κύτταρα HeLa

Μια σειρά από πειράματα για να προσδιοριστεί αν autophagy επάγεται από GNA. Πρώτον, χρησιμοποιήσαμε monodansylcadaverine (MDC), μια lysosomotropic ένωση που είναι γνωστή για την επισήμανση όξινα ενδοσώματα, λυσοσώματα, και αυτοφαγοσώματα [27]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, GNA-επεξεργασμένα κύτταρα Α549 έδειξε μία δραματική αύξηση του αριθμού των MDC-επισημασμένου κυστίδια, υποδεικνύοντας ότι GNA θα μπορούσε να προκαλέσει το σχηματισμό των όξινων φυσαλιδώδους οργανίδια (ΑνΟ), η οποία είναι ένα χαρακτηριστικό της αυτοφαγία. Για την ποσοτικοποίηση αυτών των Avós, πορτοκαλί ακριδίνης ζωτική χρώση διεξήχθη και αναλύθηκαν με FACS. Βρήκαμε ότι ακριδίνη πορτοκαλί-θετικά Avós αυξήθηκε σε GNA επεξεργασμένα Α549 κυττάρων σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 2Β, 2C)? ραπαμυκίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας θετικός έλεγχος.

Α, Αντιπροσωπευτικές εικόνες χρώσης MDC. Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3 μΜ GNA για 24 ώρες, στη συνέχεια χρωματίστηκαν με 10 μΜ monodansylcadaverine (MDC) και παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. Β και C, χρώση πορτοκαλί ακριδίνης. Τα κύτταρα εκτέθηκαν στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις GNA για 24 ώρες, στη συνέχεια βάφονται με 1 μg /ml του πορτοκαλί ακριδίνης (B, C) και παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (Β) ή αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (C). Τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 50 μg /ml ραπαμυκίνης χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον 2 ανεξάρτητα πειράματα. D, Εκπρόσωπος εικόνες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας της GNA επεξεργασμένα κύτταρα Α549. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3 GNA μΜ για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα και αναλύθηκαν με μικροσκοπία ηλεκτρονίων. Τα βέλη υποδεικνύουν τις κενοτόπια σε επαφή με κυστίδια που είχαν πυκνά γεμισμένο με πολυ-ελασματοειδείς δομές.

Η

Η παρουσία αυτοφαγοσώματα, που εμφανίζουν διπλή μεμβράνη δομές κυστιδίων, θεωρείται ότι είναι το σήμα κατατεθέν της αυτοφαγία. Εξετάσαμε αν αυτή η δομή που σχηματίζεται σε κύτταρα Α549 GNA επεξεργασμένα κάτω από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (ΕΜ). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Δ, κύτταρα GNA κατεργασμένα εμφάνισε αυξημένο σχηματισμό αυτοφαγοσώματα σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου.

3. ΓΝΑ προκαλεί το σχηματισμό αυτοφαγικά δεικτών σε Α549 και κύτταρα HeLa

Για να επιβεβαιώσετε την GNA μεσολάβηση επαγωγή της αυτοφαγία, εξετάσαμε την έκφραση των δεικτών αυτοφαγία, συμπεριλαμβανομένων LC3. Κατά τη διάρκεια της αυτοφαγία, LC3 μετατρέπεται από την ελεύθερη μορφή (LC3-1) σε μια πρωτεολυτική επεξεργασία μικρότερη μορφή (LC3-ΙΙ). GFP-LC3 /κύτταρα HeLa, τα οποία εκφράζουν σταθερά GFP-LC3, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις GNA για 24 ώρες? Αυτά τα κύτταρα GNA επεξεργασμένα επέδειξαν μια δραματική αύξηση στην κατανομή στικτή του GFP-LC3 σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο, ενώ τα μη επεξεργασμένα κύτταρα εμφάνισαν διάχυτη εμφάνιση GFP-LC3. Ποσοτικοποίηση έδειξε ότι ο αριθμός των κυττάρων που περιείχαν τουλάχιστον 5 GFP-LC3 στικτή τελείες αυξήθηκε επίσης σε μια συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 3Α). Western blotting ανάλυση του GNA επεξεργασμένου Α549 κύτταρα έδειξαν μια αξιοσημείωτη αύξηση στο επίπεδο της LC3-ΙΙ σε μια συγκέντρωση και το χρονοεξαρτώμενο τρόπο (Εικόνα 3Β). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε Η460, SPA-C-1 και Glc-82 καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές σειρές, ενώ η κανονική του πνεύμονα γραμμή 16-ΗΒΕ ήταν λιγότερο ευαίσθητη σε GNA (Σχήμα S1B).

Α, Επιδράσεις της GNA σχετικά με την κατανομή των punctuates GFP-LC3. GFP-LC3 /κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις του GNA ή 50 μg /ml ραπαμυκίνης για 24 ώρες, στη συνέχεια ανιχνεύεται με μικροσκοπία φθορισμού. Το ποσοστό των κυττάρων με τουλάχιστον 5 GFP-LC3 στικτή τελείες υπολογίστηκε? τουλάχιστον 600 κύτταρα παρατηρήθηκαν, Μέσα ± SEM, η = 3, ** σημαίνει ρ & lt? 0,01, μονόδρομη ANOVA. Β, Επιδράσεις της GNA στις πρωτεΐνες LC3. Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις του GNA για 24 ώρες ή 3 μΜ GNA για τις υποδεικνυόμενες χρονικές περιόδους, στη συνέχεια αναλύθηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντισώματα αντι-LC3. πρωτεΐνη GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Το ραβδόγραμμα δείχνει τις εντάσεις ζώνη LC3-II σε σχέση με εκείνες του GAPDH. Η μέση ± SEM, η = 3, * σημαίνει ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01, μονόδρομη ANOVA. C, Επιδράσεις της GNA στις Beclin1 πρωτεΐνη. Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3 μΜ GNA για τις υποδεικνυόμενες χρονικές περιόδους, στη συνέχεια αναλύθηκαν με western αποτύπωση χρησιμοποιώντας αντι-Beclin1 αντισώματα. πρωτεΐνη GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Το ραβδόγραμμα δείχνει τις εντάσεις ζώνη Beclin 1 σε σχέση με εκείνες του GAPDH. Η μέση ± SEM, η = 3, * σημαίνει ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01, μονόδρομη ANOVA. D, Επιδράσεις της GNA στις φωσφορυλίωσης p70S6K. Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3 μΜ GNA για τις υποδεικνυόμενες χρονικές περιόδους, στη συνέχεια αναλύθηκαν με western αποτύπωση χρησιμοποιώντας αντι-p70S6K και αντισώματα αντι-ρ-p70S6K. πρωτεΐνη GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Το ραβδόγραμμα δείχνει τις εντάσεις ζώνης του ρ-p70S6K σε σχέση με εκείνες του GAPDH. Η μέση ± SEM, η = 3, * σημαίνει ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01, μονόδρομη ANOVA

Η

Τα επίπεδα Beclin 1, ένα προϊόν του γονιδίου ATG που είναι απαραίτητη για autophagy [. ,,,0],28], η αυξημένη σαφώς την πάροδο του χρόνου στην GNA επεξεργασμένα κύτταρα Α549 (Εικόνα 3C). Η κινάση Ser /Thr mTOR δρα ως ένας φύλακα στη διαδικασία αυτοφαγία, και μειωμένη δραστικότητα του mTOR έχει συσχετισθεί με αυξημένα επίπεδα αυτοφαγία. P70S6K είναι ένα υπόστρωμα του mTOR και η φωσφορυλίωση της εξαρτάται από την δραστηριότητα του mTOR. Βρήκαμε ότι η φωσφορυλίωση p70S6K μειώθηκε σαφώς την πάροδο του χρόνου μετά τη θεραπεία ΓΝΑ (Εικόνα 3D), που δείχνει μειωμένη δραστηριότητα του mTOR. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι GNA πυροδοτεί την έναρξη αυτοφαγικά δεικτών σε Α549 και κύτταρα HeLa.

4. ΓΝΑ αναστέλλει τη συγχώνευση μεταξύ αυτοφαγοσώματα και autolysosomes

Επειδή ΓΝΑ προκάλεσε την έναρξη της αυτοφαγικά δεικτών, αναρωτηθήκαμε αν GNA θα μπορούσε να προκαλέσει αυτοφαγικά ροή. Για να απαντηθεί αυτό το ερώτημα, θα εκτιμηθεί κατά πόσον οι αλλαγές συνέβησαν στη GFP-LC3, η οποία έχει επίσης χρησιμοποιηθεί για την παρακολούθηση της ροής αυτοφαγικά. Όταν GFP-LC3 παραδίδεται σε έναν λυσόσωμα, το τμήμα LC3 της χίμαιρας είναι ευαίσθητη στην υποβάθμιση, ενώ η πρωτεΐνη GFP είναι σχετικά ανθεκτικό στην υδρόλυση. Ως εκ τούτου, η μέτρηση των επιπέδων διασπάται GFP με στύπωση Western μπορεί να παρακολουθεί τη ροή του αυτοφαγία. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, το επίπεδο των ελεύθερων GFP αλλάξει ελαφρώς κατά την κατεργασία GNA, ενώ GFP-LC3-ΙΙ σαφώς αυξημένη πάροδο του χρόνου. Πολύ διαφορετικά αποτελέσματα παρατηρήθηκαν κατά την επεξεργασία με τρεαλόζη (κανονικό επαγωγέα αυτοφαγία), το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Παρακολουθήσαμε περαιτέρω το επίπεδο της ενδογενούς ρ62 /SQSTM1, μια autophagy-λυσόσωμα υπόστρωμα που σχετίζεται με την αποδόμηση της πρωτεΐνης αυτοφαγία-λυσοσωμική. Η συσσώρευση του ρ62 θεωρείται ότι είναι ένας δείκτης για την αναστολή της autophagy ή διακοπής του αυτοφαγικά αποικοδόμησης. GNA μπλοκάρει την αποικοδόμηση ρ62 από τη συγκέντρωση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 4Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι GNA εξασθενίζει αποικοδόμηση αυτοφαγικά. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε Η460, SPA-C-1 και Glc-82 καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές, ενώ η κανονική του πνεύμονα γραμμή 16-ΗΒΕ ήταν λιγότερο ευαίσθητη σε GNA (Σχήμα S1B).

Α, Επίδραση της GNA για την ροή της αυτοφαγία. GFP-LC3 κύτταρα /HeLa καλλιεργήθηκαν απουσία (έλεγχος) ή παρουσία 3 μΜ του GNA για τις υποδεικνυόμενες χρονικές περιόδους, και το επίπεδο της διασπασμένης GFP αναλύθηκε με στύπωση western χρησιμοποιώντας ένα αντι-ΟΡΡ αντίσωμα? 100 mM τρεαλόζη χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. πρωτεΐνη GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Το ραβδόγραμμα δείχνει τις εντάσεις ζώνης του GFP-LC3-ΙΙ ή διασπώνται GFP σε σχέση με εκείνες του GAPDH. Η μέση ± SEM, η = 3, * σημαίνει ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01, μονόδρομη ANOVA. Β, δόση και το χρόνο που εξαρτάται επιπτώσεις της GNA για την υποβάθμιση ρ62. Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις του GNA για 24 ώρες ή 3 μΜ GNA για τις υποδεικνυόμενες χρονικές περιόδους, και τα επίπεδα πρωτεΐνης ρ62 αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. πρωτεΐνη GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Το ραβδόγραμμα δείχνει τις εντάσεις μπάντα του ρ62 σε σχέση με εκείνες του GAPDH. Η μέση ± SEM, η = 3, ** ρ & lt? 0,01, μονόδρομη ANOVA. C, η αναστολή της σύντηξης μεταξύ αυτοφαγοσώματα και λυσοσώματα κατά την κατεργασία με GNA. GFP-LC3 /κύτταρα Hela υποβλήθηκαν σε αγωγή με 3 μΜ GNA για τις υποδεικνυόμενες χρονικές περιόδους και στη συνέχεια βάφτηκαν με 75 ηΜ LysoTracker Red (LTR) για 15 λεπτά. Αντιπροσωπευτικές εικόνες μικροσκοπίας φθορισμού εμφανίζεται. D, Αναστολή λυσοσώματος οξίνιση κατά την κατεργασία με GNA. Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3 GNA μΜ για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα ή 500 μΜ βαφιλομυκίνη Α1 για 8 ώρες και στη συνέχεια βάφονται με 1 mM LysoSensor Πράσινο DND-189 για 15 λεπτά. Αντιπροσωπευτικές εικόνες μικροσκοπίας φθορισμού φαίνεται.

Η

Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά υποδεικνύουν έντονα ότι GNA μπορεί να διαταράξει την υποβάθμιση της αυτοφαγία σε μεταγενέστερο στάδιο.

επόμενο αμφισβήτηση η οποία διαδικασία επηρεάζεται από ΓΝΑ. Εξετάσαμε την επίδραση της GNA στο συνεντόπισης της αυτοφαγοσώματα και λυσοσώματα. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4C, πολυάριθμες μικρές, έντονα χρωματισμένο τελείες GFP-LC3 (αυτοφαγοσώματα) και LysoTracker Red (LTR) -stained τελείες (λυσοσώματα) έχουν colocalized εντός 6 ωρών μετά τη θεραπεία GNA. Ωστόσο, αυτή η colocalization διαταράχθηκε στις 12 και 24 ώρες μετά τη θεραπεία GNA? τα μικρά, έντονα χρωματισμένο τελείες GPF-LC3 φάνηκε να συσσωρεύονται και έγινε μεγάλο, έντονα χρωματισμένο περιοχές, που πρότεινε ότι η συγχώνευση μεταξύ αυτοφαγοσώματα και λυσοσώματα έχει αποκλειστεί. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι ορισμένα φάρμακα, όπως CQ και βαφιλομυκίνη Α1, μπορεί να ανυψώσει το ρΗ του λυσοσώματα για την αναστολή σύντηξης με αυτοφαγοσώματα. Εμείς το ερώτημα κατά πόσον ΓΝΑ έχει παρόμοια αποτελέσματα. Εκτιμήσαμε την επίδραση της GNA στο λυσόσωμα οξίνιση με χρώση με LysoSensor Πράσινο DND-189, ένα acidotropic φθορίζοντα ανιχνευτή που μπορεί να παγιδευτεί σε όξινα οργανίδια. Βαφιλομυκίνη Α1 χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4D, λυσόσωμα επισήμανση διαταράχθηκε μέσα σε 12 ώρες μετά τη θεραπεία GNA και ήταν πολύ πιο επηρεάζονται προφανώς στις 24 και 36 ώρες (παρόμοια με τα αποτελέσματα του βαφιλομυκίνη Α1), υποδεικνύοντας αναστολή της λυσοσώματος οξίνισης. Αυτή η παρατήρηση μπορεί να εξηγήσει την GNA μεσολάβηση αναστολή της σύντηξης μεταξύ αυτοφαγοσώματα και λυσοσώματα. Ως εκ τούτου, αν και GNA προκαλούν το σχηματισμό αυτοφαγοσώματα, GNA αποκλείει επίσης την πρόοδο της διαδικασίας αυτοφαγικά καταστέλλοντας σύντηξη μεταξύ των αυτοφαγοσώματα και λυσοσώματα, αναστέλλοντας έτσι την αποικοδόμηση των περιεχομένων.

5. Το νοκ ντάουν της Beclin 1 μειώνεται ΓΝΑ που προκαλείται θάνατο των καρκινικών κυττάρων

Τα προηγούμενα δεδομένα δείχνουν ότι GNA μπορεί να προκαλέσει κυτταρικό θάνατο μέσω απόπτωσης. Για να προσδιορίσετε αν ο θάνατος των κυττάρων που προκαλείται από την GNA συσχετίζεται με δυσλειτουργική αυτοφαγία, έχουμε περαιτέρω μισθωτούς μικρή παρεμβολή RNA (siRNA) για να γκρεμίσουμε την έκφραση της Beclin 1, ένα βασικό γονίδιο για αυτοφαγία. Η επιμόλυνση του RNA ολιγονουκλεοτιδίων έναντι Beclin1 (Beclin 1 siRNA) σε κύτταρα Α549 κατέστειλε με επιτυχία το επίπεδο πρωτεΐνης των ενδογενών Beclin 1 σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με έλεγχο siRNA, υποδηλώνοντας ότι η Beclin 1 siRNA είναι αποτελεσματική (Σχήμα 5Α). Μετά από 24 και από 36 ώρες αγωγή με 3 μΜ GNA, κύτταρα Beclin 1 knockdown εμφανίζονται σημαντικά λιγότερο κυτταρικό θάνατο σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 5Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι GNA-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο σχετίζεται με δυσλειτουργικό αυτοφαγία.

Α, RNA ολιγονουκλεοτίδια κατά Beclin 1 (Beclin 1 siRNA) καταστέλλουν αποτελεσματικά Beclin 1 έκφρασης. Α549 κύτταρα επιμολυσμένα με τα siRNA κατά Beclin 1 ή αρνητικό μάρτυρα, και το επίπεδο πρωτεΐνης Beclin1 αναλύθηκε με κηλίδωση Western. πρωτεΐνη GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Το ραβδόγραμμα δείχνει τις εντάσεις ζώνη Beclin1 σε σχέση με εκείνες του GAPDH. Η μέση ± SEM, η = 3, ** ρ & lt? 0,01, μονόδρομη ANOVA. Β, κύτταρα Α549 επιμολύνονται με τα siRNA κατά Beclin 1 ή αρνητικό μάρτυρα. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 3 μΜ GNA για τις υποδεικνυόμενες χρονικές περιόδους, χρωματίστηκαν με 2 μΜ Hoechst 33342 και παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού? το ποσοστό των νεκρών κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε με κυανή χρώση Trypan. Η μέση ± SEM, η = 3, * σημαίνει ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01, μονόδρομη ANOVA

Η

6.. GNA προκαλεί αλλαγές στα επίπεδα των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την απόπτωση

Στη συνέχεια, διερευνήσαμε την οδό με την οποία δυσλειτουργικό επάγεται autophagy κυτταρικό θάνατος επέρχεται κατά την κατεργασία GNA. Αύξηση απόδειξη έδειξε ότι η cross-talk μεταξύ αυτοφαγία και απόπτωση ειδικά περιπλέκεται από το γεγονός ότι αυτές οι διαδικασίες έχουν πολλά κοινά ρυθμιστικά μόρια, όπως ρ53 και Bcl-2 μελών της οικογένειας [29] – [30]. GNA προκάλεσε αύξηση στα επίπεδα της πρωτεΐνης του Βαχ και διασπασμένη κασπάση-3 και μια μείωση στα επίπεδα του Bcl-2 και LC3-ΙΙ πάροδο του χρόνου, γεγονός που υποδηλώνει ότι η θεραπεία με GNA ενεργοποιεί Βαχ. Επειδή Bax είναι ένα από τα πιο γνωστά κατάντη στόχοι της ρ53, εκτιμήσαμε την επίδραση της GNA επί ρ53. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α, GNA προκάλεσε μια αξιοσημείωτη αύξηση στο επίπεδο του ρ53. Επειδή p38 ΜΑΡΚ συμβάλλει στην ενεργοποίηση των ρ53, παρακολουθήσαμε επίσης τα επίπεδα του ρ38. GNA προκάλεσε μια αξιοσημείωτη αύξηση στο επίπεδο της φωσφορυλιωμένης ρ38 (Σχήμα 6Α). Επιπλέον, ανάλυση κυτταρομετρίας ροής χρησιμοποιώντας χρώση με ιωδιούχο αννεξίνη V /προπιδίου έδειξε ότι η θεραπεία GNA αυξήθηκε σαφώς το κλάσμα των νεκρών κυττάρων και αργά αποπτωτικών κυττάρων σε σύγκριση με το NC. Έτσι, συμπεραίνουμε ότι GNA μπορούν να επάγουν απόπτωση σε κύτταρα Α549 τουλάχιστον εν μέρει μέσω αυτής της οδού.

Α, κύτταρα Α549 επιμολύνονται με τα siRNA κατά Beclin 1 ή αρνητικό μάρτυρα. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 3 μΜ GNA για τις υποδεικνυόμενες χρονικές περιόδους. Το σχετικό επίπεδο της πρωτεΐνης αναλύθηκε με κηλίδωση Western. πρωτεΐνη GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Το ραβδόγραμμα δείχνει τις εντάσεις ζώνη της αναγραφόμενης πρωτεΐνης σε σχέση με εκείνες του GAPDH. Η μέση ± SEM, η = 3, * σημαίνει ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01, μονόδρομη ANOVA. Β, κύτταρα Α549 επιμολύνονται με τα siRNA κατά Beclin 1 ή αρνητικό μάρτυρα. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 3 μΜ GNA για τις υποδεικνυόμενες χρονικές περιόδους, και τα κύτταρα βάφτηκαν με ιωδιούχο αννεξίνη V /προπίδιο και υποβλήθηκε σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Το ποσοστό στο άνω αριστερό τεταρτημόριο δείχνει το ποσοστό των κυττάρων που σημάνθηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (νεκρά κύτταρα), ενώ το ποσοστό στο άνω δεξιό τεταρτημόριο δείχνει τον πληθυσμό των κυττάρων επισημασμένου τόσο αννεξίνη V και ιωδιούχο προπίδιο (αργά αποπτωτικών και νεκρά κύτταρα).

Η

7. GNA αναστέλλει αυτοφαγία in vivo

GNA επέδειξε αποτελεσματικότητα σε όγκους που αναπτύσσονται σε γυμνά ποντίκια. εργαστήριο μας έχει δείξει στο παρελθόν ότι οι σχετικοί όγκοι των όγκων (RTV) σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με 16 και 32 mg /kg GNA ήταν 12,16 ± 7,39 και 7,65 ± 2,84, αντίστοιχα, ενώ ο RTV σε αρνητικούς ελέγχους υπό αγωγή με όχημα ήταν 26,36 ± 14,10? οι σχετικές αναλογίες ανάπτυξης του όγκου (T /C,%) ήταν 46,1% και 29,0%. Να καθορίζει τον μηχανισμό με τον οποίο GNA μειώνει την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

, έχουμε δημιουργήσει ένα μοντέλο πνεύμονα όγκου ξενομοσχεύματος ποντικού. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7, GNA επήγαγε την συσσώρευση αυτοφαγικά κυστίδια (Εικόνα 7Α), αύξησε τα επίπεδα της LC3-ΙΙ (Εικόνα 7Β) και αποκλείστηκαν αποδόμησης ρ62 (Σχήμα 7Β) σε όγκους. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι ο μηχανισμός με τον οποίο GNA ενεργεί

in vivo

επίσης αυτοφαγία σχετίζονται.

κύτταρα Α549 ενέθηκαν υποδορίως (2 × 10

6 /ποντικό) σε 30-40-ημερών BALB /CA γυμνά ποντίκια αρσενικό. Μετά εγκατεστημένων όγκων είχε σχηματιστεί (-50 mm

3), οι ποντικοί ί.ν. ένεση με ή χωρίς 16 mg /kg GNA δύο φορές την εβδομάδα για τρεις εβδομάδες. Σε 24 ώρες μετά την τελευταία ί.ν.