Αφηρημένο

Ιστορικό

καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι ένα από τα πιο κοινές κακοήθειες, αλλά οι τρέχουσες θεραπευτικές προσεγγίσεις για την προηγμένη CRC είναι λιγότερο αποτελεσματική. Έτσι, νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις είναι απολύτως αναγκαία. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να διερευνηθεί η συμμετοχή των CK2 πυρηνική πρωτεϊνική κινάση α υπομονάδα (CK2α) στην πρόοδο του όγκου, και στην πρόγνωση της ανθρώπινης CRC.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Τα επίπεδα έκφρασης πυρηνικών CK2α αναλύθηκαν σε 245 παχέος ιστούς από ασθενείς με CRC με ανοσοϊστοχημεία, ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR και κηλίδος Western. Εμείς συσχετίζονται τα επίπεδα έκφρασης με κλινικοπαθολογική παραμέτρους και την πρόγνωση σε ασθενείς ανθρώπινο CRC. Η υπερέκφραση των πυρηνικών CK2α συσχετίστηκε σημαντικά με το βάθος της εισβολής, κομβική θέση, αμερικανική μεικτής επιτροπής για τον Καρκίνο (AJCC) σταδιοποίηση, τον βαθμό διαφοροποίησης, και περινευρικό εισβολή. Οι ασθενείς με υψηλά επίπεδα έκφρασης του πυρηνικού CK2α είχαν σημαντικά φτωχότερη συνολικό ποσοστό επιβίωσης σε σύγκριση με τους ασθενείς με χαμηλά επίπεδα έκφρασης του πυρηνικού CK2α. Σε multi-περιγραφικές ανάλυση παλινδρόμησης Cox, η υπερέκφραση της πυρηνικής CK2α έχει αποδειχθεί ότι είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης για CRC. Επιπλέον, DLD-1 ανθρώπινου κόλου καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως ένα κυτταρικό μοντέλο για τη μελέτη του ρόλου των CK2α στην κυτταρική ανάπτυξη, και την έκφραση της σε κύτταρα CK2α DLD-1 αναστέλλεται από τη χρήση της τεχνολογίας siRNA. Τα δεδομένα έδειξαν ότι CK2α ειδική επεξεργασία siRNA οδήγησε σε αναστολή της ανάπτυξης.

Συμπεράσματα /Σημασία

Στο σύνολό τους, η υπερέκφραση της πυρηνικής CK2α μπορεί να είναι ένας χρήσιμος δείκτης για την πρόβλεψη της έκβασης των ασθενών με CRC.

Παράθεση: Lin KY, Tai C, Hsu JC, Li CF, Fang CL, Lai HC, et al. (2011) Η υπερέκφραση της πυρηνικής πρωτεΐνης κινάσης CK2 α καταλυτική υπομονάδα (CK2α) ως Κακή μάντης στην Ανθρώπινη ορθοκολικού καρκίνου. PLoS ONE 6 (2): e17193. doi: 10.1371 /journal.pone.0017193

Επιμέλεια: Terence Lee, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 11, Αυγ 2010? Αποδεκτές: 25 Ιανουαρίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 17 Φεβ 2011

Copyright: © 2011 Lin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση (DOH98-TD-Ι-111-TM006) από το Υπουργείο Υγείας, την Ταϊβάν. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) αντιστοιχούσαν σε περίπου 1 εκατομμύριο νέες περιπτώσεις το 2002 (9,4% του παγκόσμιου συνόλου), και σε αντίθεση με τις περισσότερες περιοχές, οι αριθμοί δεν ήταν τόσο διαφορετική στους άνδρες και τις γυναίκες (αναλογία, 1.2:1) [1]. Από την άποψη της συχνότητας εμφάνισης, CRC κατατάσσεται τέταρτη σε συχνότητα στους άνδρες και τρίτη στις γυναίκες. Υπάρχει τουλάχιστον μια παραλλαγή 25-φορές σε εμφάνιση CRC σε όλο τον κόσμο. Τα υψηλότερα ποσοστά εμφάνισης είναι στη Βόρεια Αμερική, Δυτική Ευρώπη, και, στους άνδρες κυρίως, την Ιαπωνία. Συχνότητα τείνει να είναι χαμηλό στην Αφρική και ενδιάμεσα στις νότιες περιοχές της Νότιας Αμερικής. Στην Ταϊβάν, CRC κατατάσσεται ως η δεύτερη πιο συχνά διαγιγνώσκεται κακοήθεια και προκαλεί περισσότερους από 10.000 θανάτους ετησίως (https://www.doh.gov.tw/statistic/index.htm? Προσεγγιστεί το Δεκέμβριο του 2008). Παρά τις τρέχουσες χειρουργικές τεχνικές και η χημειοθεραπεία που έχουν κάνει σημαντικές βελτιώσεις, το ποσοστό θεραπείας για προχωρημένους CRC παραμένει σε χαμηλά επίπεδα και η νοσηρότητα παραμένει σε υψηλά επίπεδα [2]. Έτσι, οι πρόοδοι στην θεραπεία της ασθένειας αυτής είναι πιθανό να προέρχονται από μια πληρέστερη κατανόηση της παθογένεσης της και βιολογικά χαρακτηριστικά.

Η πρόγνωση των νεοδιαγνωσθέντων CRC στηρίζεται κυρίως στην κοινή επιτροπή Αμερικής για τον Καρκίνο (AJCC) στάδιο καθορίζεται από το το βάθος της εισβολής, η συμμετοχή των λεμφαδένων, και μακρινή μετάσταση [3], [4]. Ωστόσο, στην πραγματικότητα, είναι καλά γνωστό ότι οι ασθενείς με το ίδιο στάδιο CRC ετερογένεια AJCC επιβίωση οθόνη, με μερικούς ασθενείς που εμφανίζουν σχετικώς βραχείς χρόνους επιβίωσης. Κατά συνέπεια, ο προσδιορισμός των πιο ελπιδοφόρα προγνωστικούς παράγοντες που είναι πράγματι άκρως προγνωστική των ασθενών που υποβάλλονται σε CRC χειρουργική θεραπεία είναι υποχρεωτική. Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι το ρόλο γενετικές αλλοιώσεις μπορεί να έχει στην ανάπτυξη και εξέλιξη της CRC [5], [6]. Μοριακή παθολογία μπορεί να είναι χρήσιμη όχι μόνο για την κατανόηση της παθογένεσης της νόσου, αλλά επίσης για να δώσει χρήσιμο προγνωστικό μοριακών δεικτών. Ορισμένες προτεινόμενες βιολογικούς προγνωστικούς παράγοντες περιλαμβάνουν υπερέκφραση του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF), ενισχυτής του Zeste ομολόγου 2 και τρανσγλουταμινάση 2 [7] – [9].

CK2 πρωτεΐνης κινάσης (παλαιότερα γνωστό ως κινάσης καζεΐνης 2) μια εξαιρετικά διατηρημένη κινάσης σερίνης /θρεονίνης. Διανέμεται πανταχού σε ευκαρυωτικούς οργανισμούς, όπου τις περισσότερες φορές φαίνεται να υπάρχουν σε τετραμερή συμπλέγματα που αποτελούνται από δύο καταλυτικές υπομονάδες (αα, α ‘α’ ή αα ») και δύο ρυθμιστικές υπομονάδες β [10], [11]. CK2 είναι μια εξαιρετικά πολυλειτουργική πρωτεΐνη κινάσης με μια μεγάλη σειρά από περισσότερα από 300 υποστρώματα, πολλά από τα οποία κριτικά εμπλέκονται στη διαδικασία της κυτταρικής ανάπτυξης, πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης [12], [13]. Η διακοπή του

Saccharomyces cerevisiae

γονίδια που κωδικοποιούν τις δύο καταλυτικές υπομονάδες CK2 οδηγεί σε μια αποτυχία στην ανάπτυξη, και η επίδειξη ότι knockout του γονιδίου που κωδικοποιεί την ρυθμιστική CK2 β υπομονάδα σε ποντικούς είναι επίσης θανατηφόρος ενισχύει τη σημασία της CK2 στη συντήρηση της κυτταρικής βιωσιμότητας της κανονικής διάρκειας ζωής των κυττάρων και κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης [14], [15]. Στην υπομονάδα β, ορισμένα υπολείμματα κυστεΐνης μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην αγκύρωση του κινάσης σε πυρηνικές δομές. δραστηριότητα CK2 μπορεί να έχει ένα ρόλο στην κυτταρική ανάπτυξη μέσω της σήμανσης του σε θέσεις-κλειδιά στην πυρηνική μήτρα και χρωματίνης δομές [16]. Αρκετές ερεθίσματα ανάπτυξης μπορεί να ενισχύσει CK2 πυρηνική παλινδρόμηση, έτσι ώστε υψηλότερα πυρηνικού εντοπισμού παρατηρείται σε καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα [17], [18].

Επιπλέον, CK2 απορρύθμισης σε καρκινικά κύτταρα μπορεί να επηρεάσει την αποπτωτική δραστικότητα και για την ενίσχυση της κυτταρικής επιβίωσης [19]. CK2 μπορεί να ασκήσει αντιαποπτωτικού αποτελέσματα μέσω διαφόρων μηχανισμών. Για παράδειγμα, CK2 εξουδετέρωση απόπτωση προστατεύοντας Bid από νέκρωσης όγκου συνδέτη που επάγει απόπτωση παράγοντα που σχετίζονται με (TRAIL) προκληθείσα κασπάσης-8 μεσολαβούμενη αποικοδόμηση [20]. CK2 εμπλέκεται επίσης στη φωσφορυλίωση αρκετών πρωτεϊνών που σχετίζονται με την απόπτωση, συμπεριλαμβανομένων p53and πυρηνικός παράγοντας-κΒ [21], [22]. Επιπλέον, ο κυτταρικός θάνατος μεσολάβηση υποδοχέα Fas ρυθμίζεται από την έκφραση CK2 [23].

Το επίπεδο CK2 φαίνεται να ρυθμίζεται σφικτά σε φυσιολογικά κύτταρα, αντιστέκονται μια αλλαγή στην εγγενή τους επίπεδο CK2 [24]. Αύξηση στοιχεία δείχνουν ότι CK2 ένζυμο είναι ένα συστατικό των ρυθμιστικών δικτύων πρωτεϊνικής κινάσης που εμπλέκονται σε πολλές πτυχές του κυτταρικού μετασχηματισμού και του καρκίνου [25]. Αυξήσεις στο επίπεδο και τη δραστηριότητα CK2 συστηματικά έχουν παρατηρηθεί σε μία ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του μαστικού αδένα, το κεφάλι και το λαιμό, και τον καρκίνο του νεφρού [26] – [28]. Η υπερέκφραση και προγνωστική σημασία του α υπομονάδας CK2 παρατηρήθηκαν μόνο στον καρκίνο του πνεύμονα, καρκίνο του προστάτη και λευχαιμία [29] – [31]. Για τις γνώσεις μας, η έκφραση και η προγνωστική σημασία της πυρηνικής CK2α στο ανθρώπινο CRC είναι ακόμα άγνωστη. Οι στόχοι αυτής της μελέτης ήταν να διερευνηθεί η σχέση μεταξύ της έκφρασης των πυρηνικών CK2α και κλινικοπαθολογική παραμέτρους και την πρόγνωση σε ασθενείς με ανθρώπινο CRC. Αξιολογήσαμε επίσης τα αποτελέσματα της έκφρασης CK2α siRNA-ανέστειλε επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου.

Αποτελέσματα

Βασικά δεδομένα

Δύο εκατοντάδες και σαράντα πέντε CRC ασθενείς, 139 αρσενικά και θηλυκά 106, εγγράφηκαν στη μελέτη αυτή. Ηλικία κυμαίνονταν από 21 έως 88 ετών παιδιά ηλικίας κατά την πρώτη διάγνωση (μέσος όρος 64 ετών). Με βάση την ταξινόμηση AJCC, υπήρχαν 36 ασθενείς σταδίου Ι, 98 στάδιο ασθενείς II, 110 σταδίου ΙΙΙ ασθενείς, και 1 σταδίου IV ασθενή. Συνέχεια για τους ασθενείς κυμαινόταν 2,93 έως 123,97 μηνών (μέση 68,3 μήνες). Κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης, 69 ασθενείς πέθαναν από CRC. Μετεγχειρητικές επιπλοκές δεν συμβαίνουν σε αυτούς τους ασθενείς.

έκφραση Πυρηνική CK2α ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω και συνδέεται με πολλές κλινικοπαθολογική παραμέτρους CRC

Μελετήσαμε την έκφραση της πυρηνικής CK2α σε 245 ασθενείς CRC με ανοσοϊστοχημεία, και τέσσερις ασθενείς με κηλίδα Western. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση της πυρηνικής CK2α ήταν υψηλότερη σε ιστούς όγκων σε σχέση με το μη καρκινικούς ιστούς (Εικόνα 1). Επιπλέον, η ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση έδειξε ότι η έκφραση του CK2α αυξήθηκε σημαντικά σε ιστούς όγκων σε σύγκριση με τα μη καρκινικούς ιστούς (Πίνακας 1). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, η έκφραση της πυρηνικής CK2α είχε στατιστικά σημαντική συσχέτιση με το βάθος της εισβολής (

P

= 0,008), κομβικό κατάσταση (

P

Μια μελέτη που πραγματοποιήθηκε από Scaglioni et al. απέδειξε ότι CK2 φωσφορυλιωμένη την προμυελοκυτταρική λευχαιμία πρωτεΐνη (PML, ένας καταστολέας όγκου) και στοχευμένες αυτό για αποικοδόμηση από το πρωτεάσωμα [34]. Απώλεια της κρίσιμης θέση φωσφορυλίωσης CK2 σε PML οδήγησε σε σταθεροποίηση αυτής της πρωτεΐνης, ενίσχυση της PML-επαγόμενη απόπτωση. Επιπλέον, σε ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, υπάρχει μια αντίστροφη σχέση μεταξύ της PML έκφραση και δραστικότητα CK2. Δεδομένου PML είναι μια πυρηνική μήτρα-σχετιζόμενη πρωτεΐνη, μία πυρηνική συσσώρευση του CK2 μπορεί να είναι λειτουργικά σχετικές με την αδρανοποίηση των όγκων-κατασταλτικός λειτουργίες της PML. Σε μια άλλη μελέτη, CK2 έχει πρόσφατα περιγραφεί ως βασικός ρυθμιστής του όγκου καταστολέα NKX3.1 σε LNCaP κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Όπως PML, διαπιστώθηκε ότι ο αποκλεισμός της δραστικότητας CK2 στα κύτταρα LNCaP με αναστολέα απιγενίνη οδήγησε σε ραγδαία μείωση της συσσώρευσης NKX3.1 που διασώθηκε από την αναστολή του πρωτεασώματος [35].

Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε για η πρώτη φορά που η υπερέκφραση της πυρηνικής CK2α σε ιστούς CRC έγινε συσχετίζεται στενά με διάφορες παραμέτρους κλινικοπαθολογική συμπεριλαμβανομένου του βάθους διείσδυσης του καρκίνου, λέμφο μετάσταση στους λεμφαδένες, και περινευρική εισβολή. Αν και οι μηχανισμοί που διέπουν αυτές τις ενώσεις είναι ακόμη ασαφείς, πολλά στοιχεία για αυτές τις συσχετίσεις θα συζητηθούν παρακάτω. Πρώτον, τα στοιχεία για τη συσχέτιση μεταξύ της υπερέκφρασης της πυρηνικής CK2 και το βάθος της εισβολής προέρχεται από μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs), οι οποίες έχουν από καιρό συσχετιστεί με τον καρκίνο κυττάρων εισβολή και μετάσταση [36]. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι PC-3 ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη κύτταρα που υπερεκφράζουν μεμβράνη τύπου-1 μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας (ΜΤ1-ΜΜΡ) αυξήθηκαν ταχύτερα από ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου [37]. Αυτό το αποτέλεσμα πρότεινε ότι εισβολή προαγωγής ΜΤ1-ΜΜΡ συνδέεται άμεσα με την επιθετικότητα του όγκου. Γονιδίωμα-ευρύ προφίλ έκφρασης του ΜΤ1-ΜΜΡ-υπερεκφράζουν έναντι ΜΤ1-ΜΜΡ-σιγήσει καρκινικά κύτταρα και περαιτέρω ανάλυση εξόρυξης δεδομένων του προϋπάρχοντος βάση δεδομένων έκφραση των 190 ανθρώπινων όγκων, της 14ης τύπων καρκίνου οδήγησε να εντοπίσει 11 γονίδια, συμπεριλαμβανομένων CK2, η έκφραση του η οποία συσχετίζεται σταθερά και καθολικά με εκείνη της ΜΤ1-ΜΜΡ [38]. Δεύτερον, με χρησιμοποίηση ανοσοϊστοχημείας, η συσχέτιση μεταξύ VEGF-C και την ανάπτυξη της μετάστασης λεμφαδένα έχει περιγραφεί από Yonemura Υ et al [39]. Σε απάντηση στην υποξία, συνέβη στους περισσότερους όγκους αναπτύχθηκαν μεγαλύτερο από 1 mm

3, η έκφραση του VEGF-C μπορεί να διεγερθεί από υποξία παράγοντα-1 (HIF-1) [40]. Αποδείχθηκε ότι οι αναστολείς της CK2 μπλοκάρει την ενεργοποίηση του HIF-1, και στη συνέχεια την έκφραση του VEGF-C [41]. Τέλος, το αυξημένο σχηματισμό νευριτών αποδεικνύεται κατά τα προηγούμενα

in vitro

μελέτες δείχνουν ότι αξονική μετανάστευση μπορεί να αποτελέσει βασικό στοιχείο της περινευρικό εισβολής. Αξονικής ανάπτυξης είναι μια πολύπλοκη διαδικασία που απαιτεί νευροτροφικών παραγόντων ανάπτυξης και νευρωνική μόρια καθοδήγηση [42], [43]. Μια μελέτη που πραγματοποιήθηκε από Arevalo et al. έδειξε ότι νευρικό αυξητικό παράγοντα, έναν από τους νευροτροφικούς παράγοντες ανάπτυξης, μπορεί να τονώσει την ανάπτυξη νευρίτη μέσω της ενεργοποίησης του CK2 [44].

Η μελέτη μας έδειξε ότι η υπερέκφραση της πυρηνικής CK2α μπορεί να είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης για CRC. Κλινικά δεδομένα που ασχολούνται με την προγνωστική αξία της CK2α είναι περιορισμένες. Χρησιμοποιώντας παγκόσμιο προφίλ γονιδιακής έκφρασης, το γονίδιο CK2α έχει ταυτοποιηθεί ως προγνωστικός δείκτης σε ασθενείς με καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων του πνεύμονα [29]. Laramas et al. προβλέπονται τα στοιχεία για μια ισχυρή συσχέτιση μεταξύ ενός πυρηνικό εντοπισμό του CK2α και φτωχών προγνωστικοί παράγοντες στον καρκίνο του προστάτη στον άνθρωπο [30]. Επιπλέον, μελέτες των Kim et al. έδειξε ότι η υπερέκφραση της πρωτεΐνης CK2α στη λευχαιμία συσχετίστηκε με κακή έκβαση των ασθενών [31]. Από όσο γνωρίζουμε, δεν υπάρχει καμία αναφορά αναφέροντας την προγνωστική σημασία της πυρηνικής CK2α στην ανθρώπινη CRC. Είναι αξιοσημείωτο να παρατηρήσουμε ότι, για πρώτη φορά, η υπερέκφραση της πυρηνικής CK2α μπορεί να είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης για CRC. Η υπερέκφραση των πυρηνικών CK2α είναι ως εκ τούτου ένας χρήσιμος δείκτης για την πρόβλεψη της έκβασης ασθενών με CRC που είχαν μια χειρουργική εκτομή του όγκου. Οι ασθενείς με CRC δείχνοντας υπερέκφραση των πυρηνικών CK2α θα πρέπει να παρακολουθούνται προσεκτικά.

Υλικά και Μέθοδοι

Τα άτομα της μελέτης

Η ομάδα των ασθενών περιελάμβανε 245 συνεχόμενες CRC περιπτώσεις από το 1998 έως 2002 τεκμηριώνουν παθολογικών και κλινικών παραγόντων και της κλινικής έκβασης. Κανένας από αυτούς τους ασθενείς είχαν λάβει προεγχειρητική χημειοθεραπεία και /ή ακτινοθεραπεία. Το τμήμα μη-όγκου λήφθηκε από το χονδροειδώς κανονική ορθοκολικό βλεννογόνο μακριά από τον όγκο σε εκτομή δείγμα του παχέος. Κλινικοπαθολογικοί παράμετροι του ΚΕΣ προσδιορίστηκαν σύμφωνα με την ταξινόμηση AJCC. Η διάρκεια παρακολούθησης ορίστηκε ως το χρονικό διάστημα μεταξύ της ημερομηνίας λειτουργία και την ημέρα της τελευταίας επίσκεψης, σύμφωνα με το διάγραμμα του ασθενούς. Η επιτροπή δεοντολογίας στο Chi-Mei Ιατρικό Κέντρο ενέκρινε το πρωτόκολλο της απόκτησης ιστών για τη διεξαγωγή αυτής της μελέτης. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε συμμετέχοντα πριν την απόκτηση του ιστού. ζεύγη όγκου /μη όγκου του παχέος ιστών αναλύθηκαν για έκφραση της πυρηνικής CK2α.

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση

έκφραση

Πυρηνική CK2α αναλύθηκε με ανοσοϊστοχημεία. μπλοκ ιστού εγκλεισμένες σε παραφίνη τομές των 5 μm και μεταφέρθηκαν σε πλακίδια μικροσκοπίου (Muto Pure Chemicals, Tokyo, Japan). Ηπατώματος χρησιμοποιήθηκε θετικός έλεγχος για CK2α. Ο αρνητικός έλεγχος συνίστατο στην παράλειψη του πρωτογενούς αντισώματος και επώαση με φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα. Μετά rehyfration και αντιγόνο ανάκτηση, μπλοκάρισμα αντιγόνου διεξήχθη χρησιμοποιώντας Dako REAL υπεροξειδάση Ανασταλτικό Διάλυμα (Dako, Carpinteria, CA) για 5 λεπτά. Οι πλάκες στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα πρωτογενές αντίσωμα: πολύκλωνο αντι-CK2α (Stressgen Bioreagents, Βικτώρια, Καναδάς) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου σε αραίωση 1:50. Η ανίχνευση του ανοσοαντιδραστικού χρώση διεξήχθη με τη μέθοδο συμπλόκου αβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ένα ευαίσθητο Dako REAL EnVision Σύστημα Ανίχνευσης (Dako) χρησιμοποιήθηκε ως το σύστημα ανίχνευσης. Μετά την επώαση με διαμινοβενζιδίνη για 5-8 λεπτά, οι τομές βάφτηκαν αντίθετα και τοποθετημένα για μικροσκοπική ερμηνεία. Η ανοσοαντιδραστικότητα ανεξάρτητα σκόραρε από δύο παθολόγους (C-F Li και C-L Fang). Το ποσοστό των κυττάρων του όγκου με μέτρια ή ισχυρή πυρηνική ανοσοδραστικότητα καταγράφηκε, και τα σκορ από τον ίδιο ασθενή ήταν μέσες τιμές για να ληφθεί μέσο δείκτη σήμανσης πυρηνική CK2α. Η αποκοπή του δείκτη επισήμανσης μέσο για να καθορίσει την υπερέκφραση πυρηνική CK2α ήταν πυρηνική αντιδραστικότητα σε & gt? 40% των κυττάρων (διάμεση τιμή). Κλινικά συλλογή δεδομένων και ανοσοϊστοχημική ανάλυση διεξήχθησαν ανεξάρτητα το ένα από το άλλο, σε μια μελέτη ερευνητή τυφλή.

εκχύλιση RNA και σύνθεση cDNA

Σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, ολικό RNA από 10 όγκων και μη -tumor ζεύγη παχέος ιστών απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ εκχύλισης RNA (Sigma, St. Louis, ΜΟ). ποιότητα RNA αναλύθηκε με τη χρήση Agilant 2100 Bioanalyzer. Οι τιμές όλων των RIN 20 δείγματα ήταν πάνω από 7. σύνθεση cDNA εκτελέστηκε όπως περιγράφεται στο προηγούμενο μελέτη μας [45]. Συντίθεται cDNA αποθηκεύθηκε στους -20 ° C μέχρι τη χρήση.

εκκινητές και ανιχνευτές

Taqman Gene Expression Δοκιμασίες συμπεριλαμβανομένων εκκινητές και ανιχνευτές της CK2α και β-ακτίνη, ένας εσωτερικός έλεγχος, αγοράστηκαν από την Applied Biosystems. Οι αριθμοί Δοκιμασία CK2α και β-ακτίνη ήταν Hs00751002_s1, και Hs99999903_m1, αντίστοιχα.

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων στόχων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου σε ο Prism 7300 Σύστημα ανίχνευσης ΑΒΙ Sequence (Applied Biosystems) όπως περιγράφεται στο προηγούμενη μελέτη μας [45]. κύκλος κατωφλίου (

C

t

) είναι ο αριθμός κλασματική κύκλος στον οποίο ο φθορισμός που δημιουργείται με διάσπαση του ανιχνευτή υπερβαίνει ένα σταθερό επίπεδο πάνω από την αρχική τιμή. Για ένα επιλεγμένο κατώφλι, ο αριθμός αντιτύπου μικρότερα εκκίνησης οδηγεί σε μια υψηλότερη

C

t

αξία. Το ποσό των CK2α mRNA σε όγκο ή μη καρκινικών ιστών, τυποποιηθεί έναντι του ποσού του mRNA β-ακτίνης, εκφράστηκε ως Δ

C

όγκου

ή Δ

C

μη-όγκου

=

C

t

(CK2α) -.

C

t

(β-ακτίνη)

καλλιέργειας κυττάρων και siRNA θεραπεία

Ανθρώπινο παχύ έντερο κυτταρική σειρά καρκίνου (DLD-1) λήφθηκε από την Έρευνα και Ανάπτυξη Ινστιτούτο Βιομηχανίας Τροφίμων (Hsinchu, Ταϊβάν). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό (Moregate BioTech, Bulimba QLD, Australia), 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη G, 100 μg /ml θειική στρεπτομυκίνη, και 250 ng /ml αμφοτερικίνη Β (όλες από τη Sigma). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ° C σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2. Για τη θεραπεία siRNA, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 30 ηΜ CK2α-ειδικό ή ομελέτα siRNA (Applied Biosystems), χρησιμοποιώντας siPORT NeoFX Επιμόλυνση Agent. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, πυρηνικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν, και στη συνέχεια κηλίδωση Western διεξήχθη για να αξιολογηθεί η επίδραση της θεραπείας siRNA.

πρωτεΐνη παρασκευή Πυρηνική

Ολικό κυτταρικό ιστό και πυρηνικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν με NE -ΚΑΤΑ Πυρηνική και κυτταροπλασματικά Εκχύλιση Αντιδραστήρια (Pierce Biotechnology, Rockford, IL), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δείγματα αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι να χρησιμοποιηθούν. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα BCA Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology) με αλβουμίνη βόειου ορού ως πρότυπο.

ανοσοαποτύπωσης

μετουσιωμένα δείγματα πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε 10% SDS-PAGE. Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Αποκλεισμένα στυπώματα επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου όλη τη νύχτα με πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-CK2α (1:161 αραίωση). β-ακτίνης (Sigma, αραίωση 1:8000) χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος για την ίση φόρτωσης πρωτεΐνης. Τα στυπώματα επωάστηκαν περαιτέρω με δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση (Sigma) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Ενισχυμένη αντιδραστήρια χημειοφωταύγειας (Pierce Biotechnology) χρησιμοποιήθηκαν για να απεικονίσει τις στοχευμένες πρωτεΐνες, οι οποίες στη συνέχεια ημι-ποσοτικά μετρήθηκε με πυκνομετρία. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν τρεις φορές, ανεξάρτητα.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων

δοκιμασία

Μετά την επεξεργασία siRNA, τα επιμολυσμένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 37 ° C, 5% CO

2 επωαστήρα για 4 , 8 και 14 ημέρες. Μεμονωμένες αποικίες (& gt? 50 κύτταρα /αποικία) σταθεροποιήθηκαν, χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα διάλυμα 1% κρυσταλλικό ιώδες σε μεθανόλη για 30 λεπτά, και μετρήθηκαν. Η δοκιμασία διεξήχθη τρεις φορές, ανεξάρτητα. Για κάθε πείραμα, χρησιμοποιήθηκαν δύο φρεάτια ανά συνθήκη. Οι ράβδοι σφάλματος SD

Στατιστική ανάλυση

Οι διαφορές στην έκφραση της πυρηνικής CK2α μεταξύ όγκου και μη καρκινικών ιστών στον ίδιο ασθενή και στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων αναλύθηκαν με χρήση ενός αντίστοιχου

t

δοκιμή. Ορισμένες παράμετροι κλινικοπαθολογικοί εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη. Ήταν η ηλικία, το φύλο, το βάθος της εισβολής, κομβική θέση, σταδιοποίηση, τον βαθμό διαφοροποίησης, αγγειακών και περινευρικό εισβολή. Η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης των πυρηνικών CK2α και κλινικοπαθολογική παραμέτρων εξετάστηκε με χ

2 τεστ. Όλα τα τελικά σημεία time-to-event σύμφωνα με διάφορες κλινικοπαθολογική παράμετροι απεικονίζονται με τη μέθοδο Kaplan-Meier και η σημασία προσδιορίστηκε στη συνέχεια με μια δοκιμασία log-rank uni-περιγραφικές. Κατ ‘αρχήν, αυτές οι σημαντικές παραμέτρους στην ανάλυση uni-περιγραφικές (

P

≤0.05) έχουν τεθεί σε multi-περιγραφικές μοντέλο παλινδρόμησης Cox για να προσδιοριστεί η αναλογία κινδύνου και η ανεξαρτησία των προγνωστικών αντίκτυπο σε μια σταδιακή πίσω της μόδας. Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το SPSS έκδοση του λογισμικού 14 (SPSS, Chicago, IL). Ένα

P

αξία των & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς θα ήθελα να ευχαριστήσω Kuo-Σαν Wen για τη βοήθειά του με ανοσοϊστοχημεία.. Οι συγγραφείς θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω Wen-Chun Chen για τη βοήθειά της με τη συλλογή κλινικών δεδομένων.