Αφηρημένο

Ιστορικό

Μοναδική χαρακτηριστικά μικροπεριβάλλοντα όγκου μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως στόχοι της θεραπείας του καρκίνου. Η πυρηνική μεταθέτη υποδοχέα αρυλ υδρογονάνθρακα (ARNT) είναι ένας σημαντικός μεσολαβητής της εξέλιξης του όγκου. Ωστόσο, ο λειτουργικός ρόλος των ARNT στο χημειοθεραπευτικό φάρμακο για τον καρκίνο που έλαβαν παραμένει ασαφής.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Εδώ, βρήκαμε ότι το νοκ ντάουν της ARNT στα καρκινικά κύτταρα μείωσε το ρυθμό πολλαπλασιασμού και το μετασχηματισμό ικανότητα αυτών των κυττάρων. Επιπλέον, η σισπλατίνη επαγόμενη απόπτωση κυττάρων ενισχύθηκε σε ARNT ανεπάρκεια κυττάρων. Έκφραση ARNT μειώθηκε επίσης με την παρουσία της cisplatin μέσω οδός αποδόμησης του πρωτεασώματος. Ωστόσο, το επίπεδο ARNT διατηρήθηκε σε ανθεκτικά σε φάρμακο κύτταρα σισπλατίνη-αγωγή, η οποία εμπόδισε κυττάρων από απόπτωση. Είναι ενδιαφέρον, αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) αυξήθηκε δραματικά όταν ARNT χτυπήθηκε κάτω σε καρκινικά κύτταρα, ενισχύοντας σισπλατίνη απόπτωση. ROS προωθείται κυτταρικό θάνατο παρεμποδίστηκε σε κύτταρα κατεργασμένα με τον καθαριστή ROS, Ν-ακετυλο-κυστεΐνη (NAC).

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι η αντικαρκινική δράση της σισπλατίνης αποδίδεται στην επαγωγή της παραγωγής των ROS από την υποβάθμιση ARNT. Στόχευση ARNT θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός στρατηγική για την εξάλειψη της αντίστασης στα φάρμακα σε καρκινικά κύτταρα

Παράθεση:. Shieh J-M, Shen C-J, Chang W-C, Cheng Η-C, Chan Υ-Υ, Huang W-C, et al. (2014) Η αύξηση δραστικών μορφών οξυγόνου από την απορρύθμιση των ARNT Ενισχύει χημειοθεραπευτικού φαρμάκου-Induced Cancer Cell Death. PLoS ONE 9 (6): e99242. doi: 10.1371 /journal.pone.0099242

Επιμέλεια: Yu-Jia Chang, Ταϊπέι Ιατρικής του Πανεπιστημίου, την Ταϊβάν

Ελήφθη: 17 Φεβρουαρίου 2014? Αποδεκτές: 13 του Μαΐου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 12 Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 Shieh et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορήγηση NSC 102-2628-B-006-011-my3 από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο της Δημοκρατίας της Κίνας. Η έρευνα αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το Αρχηγείο του Πανεπιστημίου Πρόοδο στο Εθνικό Πανεπιστήμιο Cheng Kung. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο πυρηνικός μεταθέτης υποδοχέα αρυλ υδρογονάνθρακα (ARNT), επίσης γνωστή ως υποξία παράγοντα (HIF) -1β, είναι ένας παράγοντας μεταγραφής που ανήκει στη βασική έλικα-βρόχος-έλικα Per-ARNT-Sim (bHLH -PAS) της οικογένειας, όπως η πρωτεΐνη ενδοθηλιακής ΠΑΣ τομέα 1 (EPAS1), HIF-1α και του υποδοχέα αρυλο υδρογονανθράκων (AhR) [1] – [3]. Η ARNT σχηματίζει ένα ετεροδιμερές με HIF-1α σε απόκριση προς κυμαινόμενα επίπεδα οξυγόνου μικροπεριβάλλοντα, και περαιτέρω προωθεί την επιβίωση των κυττάρων και την αγγειογένεση [4] – [6]. Επιπλέον, η διατάραξη της ARNT σε εμβρυονικά βλαστικά κύτταρα ποντικού προκαλεί υπογλυκαιμία, μια ανεπάρκεια αγγειογένεση και την αποτυχία να ανταποκριθεί σε υποξία [7]. Επιπλέον, ARNT είναι ένας μεσολαβητής σε νορμοξικά συνθήκες όταν τα κύτταρα αντιμετωπίζουν βλαπτικών παραγόντων στο μικροπεριβάλλον, όπως 2,3,7,8-τετρα-χλωροδιβενζο [b, e] [1], [4] διοξιν (TCDD) ή αντι -cancer τα ναρκωτικά [8], [9]. Η ARNT διμερίζεται με τον υποδοχέα αρυλ υδρογονάνθρακα (AhR) και ρυθμίζει δραστικότητα μεταγραφής Sp1, μετά προς τα πάνω ρύθμιση του υποκινητή του κυτοχρώματος Ρ450 υποοικογένειας πολυπεπτίδιο 1 (CYP1A1) για να αντισταθεί ξενοβιοτικών καταπονήσεις, π.χ., TCDD [3]. Όταν για τη ρύθμιση της ARNT στα κύτταρα, μπορεί να σταθεροποιηθεί μέσω της αλληλεπίδρασης με την πρωτεΐνη BRCA 1 κατά τη διάρκεια της TCDD στρες [10]. Από την άλλη πλευρά, δραστική κασπάση-3 διασπά το ARNT κατά την διάρκεια της απόπτωσης για τη μείωση των κυτταρικών σημάτων επιβίωσης [11]. Απώλεια του HIF-1α και ARNT οδηγεί επίσης σε μια αυξημένη απόκριση σε ακτινοθεραπεία, μείωση της ανάπτυξης του όγκου, και μείωση της αγγειογένεσης σε όγκους μεταμοσχεύτηκαν σε ανοσο-ανεπαρκή ποντίκια [12]. Σε προηγούμενες μελέτες μας, βρήκαμε ότι ARNT αλληλεπίδρασε με c-Jun να σχηματίσουν c-Jun /ARNT και c-Jun /ARNT /Sp1 σύμπλοκα τα οποία προάγουν εκφράσεις της κυκλοοξυγενάσης (COX) -2, 12 (S) -lipoxygenase, και p21

WAF1 /Cip1

, σε επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) κατεργασμένους του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα σε ένα ορθοξικές κατάσταση [1], [13]. Οι μελέτες αυτές έδειξαν ότι ARNT αλληλεπιδρά με HIF-1α σε απόκριση σε συνθήκες υποξίας και συνδέεται επίσης με ειδικούς παράγοντες μεταγραφής οι οποίοι έχουν την ικανότητα να ενεργοποιούν την σηματοδότηση της ογκογένεσης σε νορμοξικά κατάσταση.

Cisplatin είναι ένας σημαντικός χημειοθεραπευτικό φάρμακο που χρησιμοποιείται με πολλά είδη καρκίνων, ειδικά των όρχεων, των ωοθηκών, του οισοφάγου, του τραχήλου της μήτρας, του στομάχου, του προστάτη και καρκίνους μη μικροκυτταρικό πνεύμονα [14]. Μετά εισροή μέσα σε ένα κύτταρο, η σισπλατίνη υδρολύεται και γίνεται ενεργό μορφή του. Σταυρωτής σύνδεσης των κλώνων του DNA λαμβάνει χώρα μέσω δέσμευσης σε DNA σε θέση 7 της γουανίνης δραστικών σισπλατίνης που προκαλεί θάνατο των καρκινικών κυττάρων [15], [16]. Εκτός από την πρόκληση απόπτωσης προκαλώντας απελευθέρωση κυτοχρώματος c σε απόκριση DNA στρες, σισπλατίνη επάγει επίσης την απόπτωση κυττάρων που προκαλείται από αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) μέσω ενός ρ53-διαμεσολαβούμενη ρ38α που ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) πορείας HCT1116 καρκινικά κύτταρα κόλου [ ,,,0],17]. ROS παράγονται συνεχώς και να εξαλειφθούν κατά την κανονική φυσιολογική και βιολογική λειτουργία [18]. Κατά τη διάρκεια του οξειδωτικού στρες, όπως υποξία ή ξενοβιοτικών διέγερση, ROS μπορεί να εξαλειφθεί με σαρώσεως πρωτεΐνες, όπως δισμουτάσες υπεροξειδίου (sods) και υπεροξειδάση της γλουταθειόνης. Τα καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν μεγαλύτερη ανοχή των ROS από ό, τι τα φυσιολογικά κύτταρα. Ένα χαμηλό επίπεδο ROS διευκολύνει καρκινικών κυττάρων οδηγώντας γονίδια ανάπτυξης που σχετίζεται με κύτταρο, αλλά μια υψηλότερη παραγωγή των ROS προκαλεί επίσης κύτταρα να υποστούν απόπτωση [19]. Ωστόσο, τα καρκινικά κύτταρα να προσαρμοστούν στις βλάβες από τη σισπλατίνη με προς τα πάνω ρύθμιση μεταφορείς εκροής, όπως το μεταφορέα σύνδεσης ΑΤΡ κασέτας (ABC). Η πολυφαρμακευτική αντίσταση 1 (MDR1) είναι ένα μέλος της εκροής φαρμάκου ABC μεταφορείς που αντλούν αντικαρκινικά φάρμακα εκτός της μεμβράνης [20]. Επιπλέον, η υπερέκφραση του MDR1 επιτρέπει στα κύτταρα του ανθρώπου καρκινώματος ΚΒ να αντισταθεί αποτελεσματικά κολχικίνη, βινβλαστίνη, και δοξορουβικίνη [21]. Αντικαρκινικά φάρμακα προκαλούν τα καρκινικά κύτταρα να αποκτήσουν αντίσταση μέσω υπερέκφρασης γονιδίων ανθεκτικών στα φάρμακα. Ως εκ τούτου, η κατανόηση του μοριακού μηχανισμού που εμπλέκονται στη ρύθμιση της εξαγοράς της αντίστασης σε καρκινικά κύτταρα θα ήταν επωφελής για την αποτελεσματική θεραπεία.

Σε προηγούμενη μελέτη μας, διαπιστώσαμε ότι ARNT αλληλεπιδρά με SP1 για να ρυθμίζουν την έκφραση MDR1 και να προστατεύονται τα κύτταρα από σισπλατίνη επαγόμενη απόπτωση [9]. Η ARNT-ρυθμιζόμενη εκροή των φαρμάκων παρατηρήθηκε επίσης σε MDR1-αυξητικά καρκινικά κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ARNT είναι μία από τις ρυθμιστικές αρχές να διατηρήσουν τα καρκινικά κύτταρα επιβίωση υπό θεραπεία με σισπλατίνη. Για να συνεχίσει περαιτέρω ο πιθανός ρόλος του ARNT στη διατήρηση της επιβίωσης των κυττάρων, το αποτέλεσμα του επιπέδου ARNT επί χημειοθεραπευτικών αποτελεσματικότητα μελετήθηκε σε διάφορους τύπους καρκίνου. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι η απορρύθμιση των ARNT όχι μόνο μείωσε την κυτταρική βιωσιμότητα, αλλά προωθείται σισπλατίνη κυτταρικό θάνατο που επάγεται με την ενίσχυση της παραγωγής των ROS. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ARNT θα μπορούσε ταυτόχρονα να ρυθμίζουν την έκφραση MDR1 και να μειώσει το επίπεδο ROS να προστατεύουν τα καρκινικά κύτταρα από τα ναρκωτικά που προκαλείται απόπτωση.

Αποτελέσματα

Η ARNT ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων

για να διευκρινιστεί ότι ARNT είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου υπό νορμοξικές συνθήκες, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με μία δοκιμασία ενσωμάτωσης BrdU υπό ARNT-knockdown κατάσταση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των κυττάρων ήταν σημαντικά μειωμένη σε siARNT κύτταρα. Τα αποτελέσματα από παλμό-επισήμανση BrdU (20 λεπτά) και το συγχρονισμό των κυττάρων από το μπλοκ θυμιδίνης έδειξε ότι siARNT μειωμένη σύνθεση DNA (σχ. 1Β) και συγκρατείται κυττάρων σε εξέλιξη S-φάση του κυτταρικού κύκλου (σχ. S1), αντίστοιχα. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι ARNT ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων πιθανώς μέσω του ελέγχου της εξέλιξης της φάσης S σε νορμοξία.

(Α) κύτταρα HeLa διαμολύνθηκαν με 30 ηΜ siRNA ARNT ολιγονουκλεοτίδια και σκαρφάλωμα ολιγονουκλεοτίδια (SC) με λιπομόλυνση. δοκιμασία ενσωμάτωσης BrdU διεξήχθη όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Οι ράβδοι σφάλματος σημαίνουν μέσες + SD (η = 3). Η στατιστική σημαντικότητα (*** P & lt? 0,001? ** P & lt? 0,01) μεταξύ ελέγχου και siARNT oligonucleatides-επεξεργασμένα κύτταρα αναλύθηκε με

t

test του Student. κύτταρα (Β) HeLa διαμολύνθηκαν με 30 ηΜ siRNA ARNT ολιγονουκλεοτίδια και σκαρφάλωμα ολιγονουκλεοτίδια (SC) με λιπομόλυνση και επισημάνθηκαν με 20 ηΜ BrdU για 20 λεπτά ή 24 ώρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με αντισώματα αντι-BrdU που ακολουθείται από αντι-ποντικού FITC και DAPI. Το ποσοστό των καρκινικών κυττάρων με θετική χρώση πυρηνικά και BrdU υπολογίστηκε μετρώντας ανοσοθετικών κυττάρων σε τέσσερις επιλέγονται τυχαία. Οι ράβδοι σφάλματος σημαίνουν μέσες + SD (η = 4). Η στατιστική σημαντικότητα (*** P & lt? 0,001? ** P & lt? 0,01) μεταξύ ελέγχου και siARNT oligonucleatides-επεξεργασμένα κύτταρα αναλύθηκε με

t

test του Student

Η

Νοκ ντάουν της ARNT αναστέλλει. μετασχηματισμό κυττάρων

με βάση τα ευρήματα που Arnt έκφραση ενισχύει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, η επίδραση της ARNT στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων επιβεβαιώθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας δοκιμασία σχηματισμού αποικίας. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, αν και το μέγεθος δεν ήταν σύμφωνη με τα γονικά κύτταρα, οι αριθμοί των αποικιών μειώθηκε περισσότερο προφανώς ARNT ανεπάρκεια κύτταρα. Ο μειωμένος συντελεστής πολλαπλασιασμού παρατηρήθηκε επίσης σε κύτταρα με ανεπαρκές ARNT (Εικ. S2). Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι η ανάπτυξη των κυττάρων shARNT ανεστάλη υπό συνθήκη 3D-καλλιέργειας (Σχ. 2Β), αλλά όχι σε συνθήκες 2D-καλλιέργειας (Σχ. 2Α). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η εξάντληση των ARNT μείωσε την ικανότητα του κυτταρικού μετασχηματισμού από τα καρκινικά κύτταρα.

(Α) Υπό ορθοξικές κατάσταση, Α375 γονικά κύτταρα (Ρ), κύτταρα shLacZ (Ζ), και ARNT-σιγήσει κύτταρα ( shARNT # 1 και 2 #) επωάστηκαν σε φρέσκο ​​μέσο καλλιέργειας σε νορμοξικά κατάσταση. Μετά από 7 ημέρες, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και βάφτηκαν με χρώση Giemsa. Το πείραμα εκτελέστηκε με δοκιμασία σχηματισμού αποικίας. (Β) Η εξάντληση των ARNT αναστέλλει κυτταρικό μετασχηματισμό σε καρκινικά κύτταρα. Τα κύτταρα σπάρθηκαν στο άνω στρώμα του μέσου άγαρ. Μετά από επώαση για 3 εβδομάδες με συμπληρωμένο μέσον, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με Giemsa. Το πείραμα εκτελέστηκε με δοκιμασία μαλακού άγαρ. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

ARNT-knockdown οδηγεί κύτταρα ανθεκτικά σε φάρμακο για να είναι πιο ευαίσθητα στην σισπλατίνη

Μεταξύ χημειοθεραπευτικά φάρμακα, σισπλατίνη επάγει κυτταρικό θάνατο μέσω σχηματισμού σισπλατίνη προσαγωγές DNA που οδηγούν σε βλάβη του DNA και μειώνει την πρόοδο της S-φάσης. Η δυνατότητα που ARNT ελέγχει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω της ρύθμισης της εξέλιξης της φάσης S μας ώθησε να εξετάσει κατά πόσον παράγεται καμία επίδραση στην σισπλατίνη που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο. Προκειμένου να αποσαφηνιστεί η σημασία των ARNT στη ρύθμιση αντίστασης σισπλατίνη, χρησιμοποιήσαμε ένα ζευγάρι των κυττάρων, ακονίσετε-1 και να ακονίσετε-1-C15 (ακονίσετε-1 σισπλατίνη-ανθεκτικά κύτταρα). Σταθερό ARNT νοκ ντάουν κυτταρικές σειρές παρήχθησαν από σταθερά την επιμόλυνση ακονίσετε-1 και να ακονίσετε-1-C15 κυτταρικές σειρές με το φορέα shARNT (Εικ. S3). Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, σισπλατίνη απόπτωση ήταν πιο σημαντική στα κύτταρα shARNT από ό, τι σε γονικά κύτταρα ακονίσετε-1. Επιπλέον, η σισπλατίνη που προκαλείται λιγότερο κυτταρικό θάνατο σε ακονίσετε-1-C15 κύτταρα από ό, τι στα κύτταρα ακονίσετε-1, ακόμη και με θεραπεία υψηλής συγκέντρωσης. Ωστόσο, τα κύτταρα ακονίσετε-1-C15 χάσει την ικανότητα αντοχής τους σε μια ARNT-νοκ ντάουν κατάσταση (Εικ. 3). Κατά τη θεραπεία με σισπλατίνη, η ARNT ήταν επίσης υποβαθμισμένη σε γονική ακονίσετε-1 κύτταρα, αλλά όχι σε κύτταρα ανθεκτικά ακονίσετε-1-C15 (Εικ. 4). Σισπλατίνη προωθηθεί περισσότερο η ενεργοποίηση της κασπάσης-3 σε κύτταρα ακονίσετε-1, αλλά όχι σε ακονίσετε-1-C15 κυττάρων, ακόμα και όταν μια υψηλότερη συγκέντρωση σισπλατίνης εφαρμόστηκε για να ακονίσετε-1-C15 κύτταρα (Εικ. 4). Ωστόσο, και τα δύο κύτταρα ακονίσετε-1 και να ακονίσετε-1-C15 έγινε πιο ευαίσθητα στην σισπλατίνη όταν ARNT ήταν ελλιπής (Εικ. 4). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι η έκφραση της ARNT είναι ένας σημαντικός παράγοντας που ρυθμίζει την αντίσταση φαρμάκου από τα καρκινικά κύτταρα.

ακονίσετε-1 shLacZ κύτταρα (Ζ), να ακονίσετε-1 ARNT ανεπάρκεια κύτταρα (shARNT), ακονίσετε-1-C15 shLacZ κύτταρα (Ζ), και να αυξήσουν-1-C15 ARNT ανεπάρκεια κύτταρα (shARNT) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ή χωρίς σισπλατίνη (20 μΜ cisplatin για να ακονίσετε-1 κύτταρα shLacZ και να ακονίσετε-1 ARNT ανεπάρκεια κύτταρα? 80 και 100 μΜ cisplatin για να ακονίσετε -1-C15 shLacZ κύτταρα και να ακονίσετε-1-C15 ARNT ανεπάρκεια κυττάρων) για 24 ώρες. Τα αποπτωτικά κύτταρα εξετάστηκαν με χρώση με αννεξίνη V-FITC /ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ), και κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση κυτταρικής απόπτωσης. Η αποπτωτική δείκτης υπολογίσθηκε. * Αργά απόπτωση? # Πρώιμη απόπτωση. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Hone-1 κύτταρα επιμολύνθηκαν με 50 ηΜ siARNT ή 50 ηΜ stealth RNAi αρνητικό μάρτυρα (SC) για 24 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς σισπλατίνη (60 μΜ για να ακονίσετε-1 κύτταρα και 80 μΜ για να ακονίσετε-1-C15 κύτταρα) σε φρέσκα καλλιεργημένα μέσο για 24 ώρες. Η συνολική πρωτεΐνη (συμπεριλαμβανομένων των ζωντανών κυττάρων και τα νεκρά κύτταρα) εκχυλίστηκε, αναλύθηκε με κηλίδωση Western και ανιχνεύονται με ARNT, κασπάσης-3, και α-τουμπουλίνης αντισώματα. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Χημειοθεραπευτικά φάρμακα επάγουν ARNT υποβάθμιση και την κυτταρική απόπτωση

Για να αποσαφηνιστεί ο μηχανισμός που εμπλέκονται στην ρύθμιση προς τα κάτω του ARNT σε ευαίσθητα κύτταρα σισπλατίνη αγωγή, η έκφραση του ARNT εξετάστηκε περαιτέρω σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, σισπλατίνη παρήγαγε καμία επίδραση στο μεταγραφικό επίπεδο του αγγελιοφόρου ARNT (m) RNA. Ωστόσο, η σισπλατίνη που προκαλείται από ARNT απορρύθμιση αντιστράφηκε στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με έναν αναστολέα πρωτεασώματος (Εικ. 5Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η σισπλατίνη ενεργοποιούνται ARNT αποδόμησης μέσω πρωτεασώματος εξαρτώμενη οδών σε ευαίσθητα κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον ότι, η σισπλατίνη που προκαλείται από ARNT απορρύθμιση θα μπορούσε επίσης να αντιστραφεί όταν διαφορετικών τύπων καρκίνου κύτταρα προκατεργάστηκαν με τον σαρωτή ROS NAC (Εικ. S4). Αυτά τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η παραγωγή των ROS, τουλάχιστον είναι μία από τις αιτίες για την εξάλειψη ARNT σε σισπλατίνη αγωγή καρκινικών κυττάρων. Για να εξετασθεί περαιτέρω κατά πόσον απορρύθμιση των ARNT απαιτείται επίσης για άλλα χημειοθεραπευτικά φάρμακα όπως η ταξόλη και η doxorubicin να επάγει κυτταρικό θάνατο, τα κύτταρα HeLa και HeLa σισπλατίνη ανθεκτικά (HeLa R) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυτά τα φάρμακα, και τις εκφράσεις των ARNT και κατακερματισμένη DNA μελετήθηκαν . Η δοξορουβικίνη και η ταξόλη ανέστειλε ARNT έκφρασης και αυξήθηκε το κατακερματισμένο DNA σε κύτταρα HeLa (Σχ 5C & amp?. 5D). Ωστόσο, η έκφραση της ARNT δεν άλλαξε σε κύτταρα HeLa R μετά την αγωγή με ταξόλη ή δοξορουβικίνη (Σχ. 5C), και αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με την έλλειψη των κατακερματισμένων DNA που παρατηρούνται σε κύτταρα HeLa R (Σχ. 5D). Επιπλέον, κυτταρικές σειρές shARNT ήταν επίσης περισσότερο ευαίσθητα στη σισπλατίνη που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο (Σχ. 3). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι ARNT διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην αντίσταση από τα καρκινικά κύτταρα σε διάφορα χημειοθεραπευτικά φάρμακα. Βρήκαμε επίσης ότι ο αναστολέας κασπάσης, zVAD, μπλοκάρει την έκφραση της ρ53 και ενεργοποίηση της κασπάσης-3 σε κύτταρα σισπλατίνη αγωγή (Σχ. 5Ε). Είναι ενδιαφέρον, σισπλατίνη που προκαλείται από την απορρύθμιση των ARNT αποκαταστάθηκε το zVAD αντιμετωπίζονται ευαίσθητα κύτταρα HeLa (Σχ. 5Ε). Επιπλέον, η σισπλατίνη που προκαλείται από την ενεργοποίηση της κασπάσης-3, εξάντληση των ARNT, και μια αύξηση της ρ53 αντιστράφηκαν σε κύτταρα προ-αγωγή με NAC (Εικ. S4). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η σισπλατίνη-επαγόμενη ενεργοποίηση της κασπάσης-3 με τη μεσολάβηση της έκφρασης της ARNT και ρ53. ZVAD μπλοκάρει κασπάσης-3 και διασώζονται ARNT έκφραση σε ευαίσθητα κύτταρα σισπλατίνη θεραπεία, υποδηλώνοντας ότι η ενεργοποίηση της κασπάσης-3 είναι απαραίτητη για τη σισπλατίνη που προκαλείται από κυτταρικό θάνατο σε ευαίσθητα κύτταρα.

(Α) κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σισπλατίνη για 24 h. Ολικό RNA εκχυλίστηκε για αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ με εκκινητές ARNT και GAPDH. κύτταρα (Β) HeLa υποβλήθηκαν σε αγωγή με 10 μΜ MG132 ή 1 μΜ λακτακυστίνη για 4 ώρες ακολουθούμενο από σισπλατίνη για 36 ώρες. Έκφραση των ARNT και ακτίνης αναλύθηκαν με ανάλυση κηλίδωσης Western χρησιμοποιώντας αντι-ARNT και αντισώματα αντι-ακτίνης. (Γ) HeLa και HeLaR κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις ταξόλης και δοξορουβικίνης για 24 ώρες. Εκδήλωση ARNT και ακτίνη ανιχνεύθηκαν με ανάλυση Western αποτύπωση χρησιμοποιώντας αντι-ARNT και αντισώματα αντι-ακτίνης. (Δ) Μετά από 30 μΜ θεραπεία cisplatin κυττάρων HeLa και HeLa R, αποπτωτικά κατάτμηση του DNA προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στο «Υλικά και μέθοδοι». (Ε) Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με 30 ηΜ siRNA ARNT ολιγονουκλεοτίδια και κωδικοποιημένο ολιγονουκλεοτίδια (SC) με λιπομόλυνση. Μετά τη θεραπεία zVAD 30 μΜ για 30 λεπτά που ακολουθείται από 30 μΜ cisplatin επί 36 ώρες, τα προϊόντα λύσης των κυττάρων παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western με αντισώματα εναντίον ARNT, procaspase-3, κασπάσης-3, ρ53, και η ακτίνη . Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Η αύξηση των ROS σε ARNT-knockdown κυττάρων συμβάλλει στην σισπλατίνη απόπτωση που επάγεται

Εκτός από την απορύθμιση αντλίες εκροής, μία αύξηση στην επίπεδο ROS είναι ένας άλλος τρόπος για χημειοθεραπευτικά φάρμακα για να επάγει απόπτωση. Όπως φαίνεται στο Σχ. S4, η εξάντληση των ROS αναστέλλεται δραματικά σισπλατίνη που προκαλείται κυτταρική απόπτωση. Για να διευκρινιστεί περαιτέρω ο μηχανισμός που εμπλέκονται στην ARNT ρυθμιζόμενη αντίσταση σισπλατίνη, εξετάστηκε ο ρόλος των ROS σε σισπλατίνη που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο. Πρώτα, προσδιόρισε την ποσότητα των ROS σε γονικά (Ρ), shLacZ (Ζ), και τα κύτταρα shARNT. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι ROS ήταν προφανώς υψηλότερο σε ARNT ανεπάρκεια κύτταρα σε σχέση με τα γονικά κύτταρα υπό συνθήκες ορθοξικές (Εικ. 6 και Σχ. S5A). Η αύξηση των ROS μειώθηκε σε shARNT κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με NAC (Εικ. S5A). Επιπλέον, η σισπλατίνη-ενισχυμένη ROS ποσό απομακρύνθηκε στα κύτταρα κατεργασμένα με NAC (Εικ. S5B). Η σισπλατίνη επήγαγε επίσης υψηλότερη παραγωγή των ROS στα κύτταρα shARNT (Εικ. S5c), και η ποσότητα των ROS μειώθηκε σε κύτταρα κατεργασμένα με NAC. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι η έκφραση του ARNT ανέστειλε σισπλατίνη αυξημένη παραγωγή ROS. Για να διευκρινιστεί αν η αύξηση των ROS σε shARNT κύτταρα παίζει ρόλο στην σισπλατίνη απόπτωση, NAC χρησιμοποιήθηκε για να καταστρέφουν ROS, και η αναλογία απόπτωση αναλύθηκε. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7, NAC αναστέλλεται σημαντικά σισπλατίνη που προκαλείται από κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα shARNT (Εικ. 7). Αυτά τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι ARNT προστατεύονται τα καρκινικά κύτταρα από σισπλατίνη απόπτωση, τουλάχιστον μέσω της μείωσης της παραγωγής ROS στα κύτταρα.

Α375 γονικών και shARNT κύτταρα επωάστηκαν κάτω από νορμοξικές συνθήκες για όλη τη νύχτα και χρωματίστηκαν με καρβοξυ-DCFDA να παρακολουθεί ROS παραγωγή. FL1 φθορισμού έδειξε την τιμή φθορισμού του καρβοξυ-2 ‘, 7’-διοξική διχλωροφθορεσκεϊνης (καρβοξυ-DCFDA). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με 10-ακετυλοκυστεΐνη (NAC) για 1 ώρα πριν Α375 γονικά κύτταρα (Ρ), κύτταρα shLacZ (Ζ), και ARNT-σιγήσει κύτταρα (shARNT # 1 και # 2) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ cisplatin, και στη συνέχεια επωάστηκαν για 24 ώρες. Τα αποπτωτικά κύτταρα εξετάστηκαν με χρώση με αννεξίνη V-FITC /ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ), και κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση κυτταρικής απόπτωσης. Η αποπτωτική δείκτης υπολογίσθηκε. * Αργά απόπτωση? # Πρώιμη απόπτωση. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Συζήτηση

Καρκίνος θεραπευτικές εφαρμογές, όπως ρίζα θεραπεία σε συνδυασμό με χημειο-θεραπευτικά φάρμακα που διαμεσολαβείται από επαγωγή των ROS, αποτελούν σημαντικά τρόποι για την εξάλειψη καρκινικά κύτταρα [22]. Ωστόσο, τα καρκινικά κύτταρα είναι ικανά αντοχής στη ζημία που προκαλείται από ROS-επαγόμενη απόπτωση μέσω εναλλακτικών αντι-αποπτωτικά μονοπάτια, όπως το Akt, Kras, Braf και Myc [23], [24]. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι ARNT παρείχε ικανότητα αντι-απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα που κατεργάζονται με το αντικαρκινικό φάρμακο, σισπλατίνη. Επιπλέον, η σισπλατίνη παρήγαγε μεγαλύτερη παραγωγή ROS σε ARNT-knockdown κυττάρων, με αποτέλεσμα την ενίσχυση του κυτταρικού θανάτου. Παρόμοια με τα ευρήματά μας που Arnt προστατεύονται από τη φθορά των κυττάρων με τη μείωση των επιπέδων ROS, τα κύτταρα της λευχαιμίας ήταν ευαίσθητα σε τρογλιταζόνη που επάγει επίσης την απόπτωση μέσω ενδοκυτταρικών ROS [25]. Ανθεκτικά κύτταρα λευχαιμίας παρουσίασαν μια αφθονία ARNT και ακολούθησε επίσης ανοδική ρύθμιση των sods (SOD2), πυρηνικό παράγοντα ερυθροειδή 2 που σχετίζονται με συντελεστή 2 (Nrf2) μεταγραφή, και ενδοκυτταρική συγκέντρωση γλουταθειόνης [25]. SOD2 μειώνει αντιοξειδωτικά και Nrf2 αυξάνει τις αντιοξειδωτικές δράσεις ενζύμου [25]. Επιπλέον, Nrf2 ρυθμίζει τη μεταγραφή του mir125b να αναστέλλουν AhR καταστολέα (AhRR), η οποία προστατεύει το νεφρό από οξεία βλάβη [26]. Αυτό δείχνει ότι ο σχηματισμός του AhR /ARNT σύμπλοκα μπορεί να ρυθμίζεται από mir125b [8]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ARNT μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση SOD2 ή το σχηματισμό συμπλόκου ARNT /AhR να μειώσει τη ζημία των κυττάρων που προκαλείται από την αύξηση των ROS.

Ως προς ρύθμιση του ARNT, βρήκαμε ότι η σισπλατίνη μπορεί να αναστείλει την ARNT σε ορισμένες ανεξερεύνητο τρόπους. ARNT αποδομήθηκε με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε μη ανθεκτικά κύτταρα επεξεργασμένα με σισπλατίνη. ημίσειας ζωής ARNT έμοιαζε να είναι σημαντικός για την απόπτωση που προκαλείται από τη σισπλατίνη. Για παράδειγμα, οι αναστολείς πρωτεασώματος, όπως MG132 και λακτακυστίνη, μπλοκάρει την αποικοδόμηση ARNT προκαλείται από σισπλατίνη. Ωστόσο, η σισπλατίνη-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές καρκίνου έδειξαν ότι η σταθερότητα ARNT δεν άλλαξε κατά τη διάρκεια της θεραπείας με σισπλατίνη. Αυτά τα καρκινικά κύτταρα με συνεχή ARNT επίπεδα έδειξε επίσης μια καλή ικανότητα να αποτρέψει την ικανότητα της απόπτωσης. Αυτά τα αποτελέσματα αντιστοιχούσαν σε μια προηγούμενη μελέτη στην οποία διάσπαση ARNT συσχετίστηκε με την υποβάθμιση του πρωτεασώματος μέσω της διαδικασίας ουβικιτινίωση [27]. Σύμφωνα με τα ευρήματά μας, που ARNT είχε εξαντληθεί από αντικαρκινικά φάρμακα, ARNT επίσης αποικοδομούνται από κουρκουμίνη σε νορμοξικά και υποξικές συνθήκες σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων [27]. Επιπλέον, η έκφραση του ARNT μπορεί να αποκατασταθεί με κατεργασία με NAC, ένα καθαριστή ROS, παρουσία της κουρκουμίνης. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με τα ευρήματα μας ότι NAC διασώθηκε την έκφραση ARNT σε ευαίσθητα κύτταρα σισπλατίνη επεξεργασία. Το ARNT μπορεί επίσης να διακοπεί με τη χρήση H

2O

2 σε καρκινικά κύτταρα [27]. Εκτός από ROS και σύμφωνη με το γεγονός ότι κασπάσης-3 και κασπάσης-9 επίσης διασπούν ARNT στην θέση αμινοξέων Asp 151 in vitro [11], βρήκαμε ότι η σισπλατίνη που προκαλείται από αποικοδόμηση του ARNT είχε κατασταλεί μετά από θεραπεία με τον αναστολέα κασπάσης zVAD. Έτσι, η σισπλατίνη-ενεργοποιημένων κασπασών μπορεί να προκαλέσει απορρύθμιση της ARNT σε ευαίσθητα σε φάρμακο κύτταρα αλλά όχι σε κύτταρα ανθεκτικά. Χημειοθεραπευτικά φάρμακα όπως η ταξόλη και η δοξορουβικίνη μπορεί επίσης να επάγει αντίστοιχα των καρκινικών κυττάρων μέσω της απόπτωσης κασπάσης-10 και τα μονοπάτια p53 [28], [29]. Σε αυτή τη μελέτη, η ταξόλη και η δοξορουβικίνη ενισχυμένη επίσης αποικοδόμηση ARNT, με αποτέλεσμα την απόπτωση των ευαίσθητων κυττάρων. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι ARNT αποτελεί ουσιαστικό παράγοντα για την προστασία των καρκινικών κυττάρων από τη φθορά που προκαλείται από φάρμακα. Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε επίσης ότι η διάσπαση του ARNT ενισχύεται από προκαλούμενη υποξία δραστική κασπάση, και αυτό ρυθμίζεται προς τα κάτω μεταγραφική δραστηριότητα των γονιδίων επιβίωσης που επάγεται από το HIF [27]. Η παραγωγή των ROS είναι μια από τις επιδράσεις μέσω της οποίας cisplatin προκαλεί κυτταρικό θάνατο [17]. Αναφέρθηκε επίσης ότι mir-24 που προκαλείται από ROS προκαλεί την εξάντληση της ARNT σε πρωτεϊνικό επίπεδο σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές ηπατοκυτταρικού καρκινώματος [30]. Στο σύνολό τους, ROS μπορεί να επάγεται από εξάντληση του ARNT, και στη συνέχεια παράγει περαιτέρω αρνητική ρύθμιση ανάδρασης ARNT με επαγωγή του mirRNA. Για τον λόγο αυτό, η πρόληψη της υποβάθμισης ARNT στην αρχική θεραπεία των φαρμάκων είναι σημαντική για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων. Ωστόσο, αν η ROS προκαλούμενη Mir-24 είναι η αιτία της καταστολής των ARNT σε κύτταρα σισπλατίνη αγωγή θα διερευνηθεί σε περαιτέρω μελέτες μας. Παρά το γεγονός ότι, ο μηχανισμός που εμπλέκεται στην προς τα πάνω ρύθμιση του επιπέδου ROS που προκαλείται από την εξάντληση της ARNT δεν ήταν σαφής και θα ήταν επίσης να διερευνηθεί, θα εικάζουν ότι η καταστολή του ARNT θα μπορούσε να είναι ένας από μηχανισμών που ευθύνονται για την αλλαγή του επιπέδου των ROS σε σισπλατίνη που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο.

σε γενικές γραμμές, ARNT μπορούν να αλληλεπιδράσουν με HIF-1α για τη ρύθμιση των γονιδίων που εμπλέκονται στην προαγωγή αγγειογένεσης, αλληλεπιδρούν με c-Jun και Sp1 για να ρυθμίζει έκφραση MDR1, ή ρυθμίζουν EGF-επαγόμενη έκφραση της COX-2, 12 (S ) -lipoxygenase, και p21

WAF1 /Cip1

, τα οποία αντιλαμβάνονται την αλλαγή του συστατικού μικροπεριβάλλον [1], [13]. ARNT παίζει επίσης ζωτικό ρόλο στη ρύθμιση της εξέλιξης του όγκου, την αποτοξίνωση, και εκροή φαρμάκων κατά του καρκίνου, η οποία αυξάνει την πιθανότητα επιβίωσης σε δυσμενείς συνθήκες [3], [8], [9], [24]. Σε χημειοθεραπευτική αγωγή του καρκίνου, η σισπλατίνη συσσωρεύεται στα καρκινικά κύτταρα που προκαλεί βλάβη στο DNA και επάγει την απόπτωση. Η αντλία εκροής φαρμάκου, MDR1, ρυθμίζεται προς τα πάνω με ARNT να αποτρέψει σισπλατίνη απόπτωση [9]. Εκτός από τη ρύθμιση αντοχή φαρμάκου σε προηγούμενη μελέτη, ARNT επίσης προστατεύει τα κύτταρα από τοξικότητα μικροπεριβάλλοντος. Για παράδειγμα, το σύμπλοκο AhR /ARNT ανιχνεύει περιβαλλοντικές τοξίνες και ρυθμίζει οδούς υπεύθυνες για αποτοξίνωση. Για παράδειγμα, TCDD επάγει πολλών γονιδίων που διαμεσολαβείται από το σύμπλοκο AhR /ARNT, όπως το κυτόχρωμα Ρ450 1Α1 (CYP1A1), η οποία μπορεί να αποτοξινώσει πολυκυκλικών αρωματικών ενώσεων [8], [31]. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι ARNT παίζει περαιτέρω ρόλο στη ρύθμιση προς τα κάτω των ROS να αποτρέψει τα καρκινικά κύτταρα να υποστεί βλάβη από τη θεραπεία με σισπλατίνη. Στο σύνολό τους, εμείς εικάζουν ότι η ARNT είναι ένας κεντρικός μεσολαβητής για την εξάλειψη κυτταροτοξικότητα διεγείρεται από περιβαλλοντικούς παράγοντες.

Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας αποκάλυψαν ότι η εξάντληση των ARNT προωθούνται στην επίδραση των φαρμάκων κατά του καρκίνου στον καρκίνο του κυτταρικού θανάτου. Στην κατανόηση μας, υπήρχαν τουλάχιστον δύο μηχανισμοί που εμπλέκονται στην ARNT-προκάλεσε αντίσταση φαρμάκου: MDR1 αυξορρύθμιση [9] και της πρόληψης της παραγωγής ROS. Αν και ο μηχανισμός που εμπλέκεται στην ρύθμιση της παραγωγής ROS από την έκφραση ARNT παραμένει άγνωστη, η ανάπτυξη των ανταγωνιστών που στοχεύουν στην ARNT μπορεί να παρέχει νέες στρατηγικές για την καταστροφή καρκινικών κυττάρων ανθεκτικών.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταροκαλλιέργειες

κυτταρικές γραμμές ανθρώπινης κακοήθους μελανώματος (Α375) και ανθρώπινου τραχηλικού καρκίνου (HeLa) αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection. Ανθρώπινα κύτταρα καρκίνωμα του ρινοφάρυγγα (HONE1 και να ακονίσετε-1-C15) παρασχέθηκαν ευγενώς από το Δρ Τζέιν-Yang Chang (Εθνικό Σύστημα Υγείας Ερευνητικά Ινστιτούτα, την Ταϊβάν) [32]. Α375 και HeLa κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (ϋΜΕΜ) με 1% γλυκόζη (Gibco). Ακονίσετε-1 κύτταρα και τα παράγωγα σισπλατίνη ανθεκτική παραλλαγή τους, ακονίζουν-1-C15, διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Gibco). Όλες οι κυτταρικές γραμμές που έχει συμπληρωθεί με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS, Hyclone), 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (Sigma-Aldrich), και 100 U /ml πενικιλλίνη (Sigma-Aldrich) σε μέσο καλλιέργειας και επωάστηκαν με 5% CO

2 στους 37 ° C για συντήρηση. Cisplatin-ανθεκτικά κύτταρα Hone-1-C15 διατηρήθηκαν σε μέσο που περιείχε 15 μΜ σισπλατίνη. Οι ARNT ανεπάρκεια κυτταρικές γραμμές Α375 ήταν ανεξάρτητες σταθερές κυτταρικές σειρές που έχουν μολυνθεί με τον φορέα λεντοϊού που προέρχεται ARNT μικρό φουρκέτα (sh) RNA [9]. Οι κυτταρικές σειρές ARNT ανεπάρκεια ακονίσετε-1 και να ακονίσετε-1-C15 ήταν σταθερές κυτταρικές σειρές που έχουν μολυνθεί με φορέα λεντοϊού που προέρχονται ARNT shRNA [9]. χρονοδιαγράμματα Drug-αντίσταση χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη των υποσειρές ανθεκτικές σε σισπλατίνη [9]. κύτταρα HeLa εκτέθηκαν σε σισπλατίνη για μία περίοδο 9 μηνών. Η υπογραμμή αντίσταση λαμβάνεται με τη διαδικασία αυτή συμβολίζεται ως HeLa R.

αποκλεισμό μπλε Τρυπάνης δοκιμασία

Τα κύτταρα απλώνονται σε 5 × 10

4 ανά φρεάτιο σε πλάκες 24 φρεατίων. Αφού τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα, το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο, ​​με ή χωρίς σισπλατίνη. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C κάτω από μια υγροποιημένη υποξική κατάσταση (1% O

2) για επιπλέον 24 ώρες και επεξεργασία με θρυψίνη για να τους επαναιώρηση σε μέσο που περιέχει ορό. Trypan μπλε χρωστικής σε 20 μΐ και 20 μΐ ενός εναιωρήματος κυττάρων αναμείχθηκαν για τη μέτρηση του αριθμού των ζωντανών κυττάρων (με συντελεστή αραίωσης του 2). Χρωματισμένα κύτταρα μετρήθηκαν και θεωρούνται ως νεκρά κύτταρα.

βρωμοδεοξυουριδίνη (BrdU) δοκιμασία ενσωμάτωσης

σύνθεσης του DNA σε πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα ανιχνεύθηκε με ενσωμάτωση BrdU (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ). Η γονική και ARNT κύτταρα knockdown απλώθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και επωάζονται για 24 ώρες. 5-βρωμοδεοξυουριδίνη (BrdU) αντιδραστήριο προστέθηκε σε μέσα καλλιέργειας για 0 ​​έως 48 ώρες, 100 μΙ Στερέωση διάλυμα προστέθηκε στα κύτταρα για 30 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης και επωάστηκαν για 1 ώρα με αντίσωμα BrdU 100 μΙ 1 χ. Μετά την προσθήκη 100 μΙ 1 χ διάλυμα HRP-συζεύγματος για 30 λεπτά, προστέθηκαν 100 μΙ διαλύματος υποστρώματος ΤΜΒ. Μετά από 30 λεπτά επώασης, προστέθηκε το διάλυμα τερματισμού. Η OD μετρήθηκε στα 450 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλακός. Για ανοσοφθορισμό, κύτταρα επιμολυσμένα με 30 ηΜ siRNA ARNT ολιγονουκλεοτίδια ήταν παλμό επισημάνθηκαν με 20 ηΜ BrdU για 20 λεπτά ή 24 ώρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με αντισώματα αντι-BrdU που ακολουθείται από αντι-ποντικού FITC και DAPI. Το ποσοστό των καρκινικών κυττάρων με χρώση θετικά πυρηνικά και BrdU υπολογίστηκε μετρώντας ανοσοθετικών κυττάρων σε τέσσερα τυχαία επιλεγμένη χρήση λογισμικού Image J.

Colony δοκιμασία σχηματισμού

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν ως ξεχωριστές μονά κύτταρα σε 6 -Καλά πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας. Αφού τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη την νύχτα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 1 μΜ σισπλατίνης για 8 ώρες και το μέσο αλλάχθηκε σε φρέσκο ​​μέσο καλλιέργειας. Το μέσο καλλιέργειας άλλαζε κάθε 2 ημέρες. Μετά από επώαση για 7 ημέρες, η αποικία κύτταρο πλύθηκε με PBS δύο φορές και σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη (PFA, Sigma-Aldrich). Μεθανόλη (JT Baker) χρησιμοποιήθηκε για να αυξηθεί η διείσδυση των κυττάρων, και χρώση Giemsa (Sigma-Aldrich) χρησιμοποιήθηκε για χρώση κυττάρων. Οι αριθμοί των αποικιών προσδιορίστηκαν με το λογισμικό Image J [33]. Ο σχηματισμός αποικίας επιβεβαιώθηκε τουλάχιστον τρεις φορές.

δοκιμασία μαλακού άγαρ

DMEM High-γλυκόζη που περιέχει 10% FBS με 0,5% αγαρόζη τοποθετήθηκε στον πυθμένα (1,5 ml /φρεάτιο) του πλάκες 6 φρεατίων. Αφού το άγαρ είχε βασικό πηγμένα, 5 × 10

3 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε υψηλής γλυκόζης ϋΜΕΜ που περιείχε 10% FBS με 0.25% αγαρόζη και επιστρώθηκε στην κορυφή (1.5 κ.εκ. /φρεάτιο) πλακών 6-φρεατίων. Τα κύτταρα επωάστηκαν με 0,5 ml συμπληρωμένου μέσου μετά το στρώμα άγαρ κορυφής είχε πήξει. Το μέσο καλλιέργειας άλλαζε κάθε 2 ημέρες. Μετά από επώαση για 2 εβδομάδες, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS δύο φορές και σταθεροποιήθηκαν με 4% PFA. Η μεθανόλη χρησιμοποιείται για να αυξήσει τη διείσδυση των κυττάρων και χρώση Giemsa χρησιμοποιήθηκε για χρώση κυττάρων. Ο σχηματισμός αποικίας επιβεβαιώθηκε, τουλάχιστον τρεις φορές.

Αντίστροφη μεταγραφή-PCR (RT-PCR)

κυττάρων RNA εξήχθη από ΤπζοΙ (Invriogen) αντιδραστήριο και ακολουθείται από το χειρόγραφο. Δύο μg RNA αντιστράφηκε από IMPROM-ΙΙ ™ ανάστροφης μεταγραφάσης (Promega) και χρησιμοποιήθηκε για το cDNA εκμαγείο του αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). 50 ng εκμαγείο cDNA χρησιμοποιήθηκε για PCR με 2.5U Tag DNA πολυμεράσης (MD Bio, Ταϊβάν) [34]. Τα σύνολα αρχικών τεμαχίων χρησιμοποιήθηκαν ως εξής: ARNT (F): 5′-TGGGTCCAGCCATTGCCTCT-3 ‘, ARNT (R): 5′-CGAGCCAGGGCACTACAGGT-3′, GAPDH (F): 5’-CCATCACCATCTTCCAGGAG-3 ‘, GAPDH (R ): 5’-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3 ‘. Οι αντιδράσεις PCR στη συνέχεια ηλεκτροφόρηση με 2% γέλη αγαρόζης SeaKem LE (Lonza, ΜΕ, USA).

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με 1χ CCLR ή ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (10 mM ρυθμιστικό Tris σε ρΗ 6.5, 150 mM NaCl, 50 mM EDTA, 1% DOC, και 1% ΝΡ-40 που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης).