Αφηρημένο

μορφολογία των κυττάρων καθορίζει τη συμπεριφορά των κυττάρων, μεταγωγή σήματος, πρωτεϊνών αλληλεπίδραση, και την ανταπόκριση σε εξωτερικά ερεθίσματα. Στον καρκίνο, οι λειτουργίες αυτές συμβάλλουν βαθιά στους μηχανισμούς αντίστασης σε ράδιο- και χημειοθεραπεία. Όσον αφορά αυτό το θέμα, η μελέτη αυτή συνέκρινε την γονιδίωμα ευρεία γονιδιακή έκφραση σε εκθετικά αναπτυσσόμενες κυτταρικές σειρές από διαφορετικές οντότητες όγκου, καρκίνωμα του πνεύμονα και πλακώδες καρκίνωμα, υπό περισσοτέρων φυσιολογικών τρισδιάστατη (3D) έναντι συνθήκες μονοστιβάδα κυτταρικής καλλιέργειας. Ολόκληρο ανάλυση μικροσυστοιχιών cDNA γονιδιώματος επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας το γονίδιο 2.0 τσιπ Affymetrix HG U133 Plus. ανάλυση Σημασία των μικροσυστοιχιών (SAM) και ανάλυση t-test αποκάλυψε σημαντικές αλλαγές στο προφίλ γονιδιακής έκφρασης του 3D σε σχέση με τις συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων 2D. Αυτές οι αλλαγές επηρέασαν την εξωκυτταρική μήτρα και είχαν κυρίως σχετίζονται με βιολογικές διαδικασίες όπως η ανάπτυξη των ιστών, προσκόλληση κυττάρου, το ανοσοποιητικό σύστημα και η απόκριση της άμυνας σε αντίθεση με όρους που σχετίζονται με την επιδιόρθωση του DNA, η οποία δεν είχε σημαντικές μεταβολές. Επιλεγμένα γονίδια επαληθεύτηκαν με ημι-ποσοτική RT-PCR και κηλίδωση Western. Επιπλέον, δείχνουμε ότι η 3D ανάπτυξη μεσολαβεί μια σημαντική αύξηση των καρκινικών κυττάρων ράδιο- και χημειοαντίσταση σχέση με 2D. Τα ευρήματά μας δείχνουν σημαντικές διαφορές έκφρασης γονιδίου μεταξύ των συστημάτων κυτταρικής καλλιέργειας 3D και 2D και υποδεικνύουν ότι η κυτταρική αποκρισιμότητα σε εξωτερικούς στρες όπως ιονίζουσα ακτινοβολία και χημειοθεραπευτικά επηρεάζεται ουσιαστικά από διαφορική έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στη ρύθμιση της σηματοδότησης ιντεγκρίνης, το σχήμα κυττάρου και κυττάρου-κυττάρου επαφή

Παράθεση:. Zschenker O, Streichert Τ, Hehlgans S, Κορδόνια Ν (2012) Genome-Wide Ανάλυση γονιδιακής έκφρασης στα κύτταρα του καρκίνου αποκαλύπτει 3D Ανάπτυξης να επηρεάσει ECM και διαδικασίες που συνδέονται με κινητό πρόσφυση αλλά όχι επισκευής DNA. PLoS ONE 7 (4): e34279. doi: 10.1371 /journal.pone.0034279

Επιμέλεια: Kerstin Borgmann, Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου του Αμβούργου-Eppendorf, Γερμανία

Ελήφθη: 21 του Ιούνη 2010? Αποδεκτές: 27 Φεβ 2012? Δημοσιεύθηκε: 11 Απριλίου 2012 |

Copyright: © 2012 Zschenker et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα και οι συγγραφείς ήταν εν μέρει υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση από το Ομοσπονδιακό Υπουργείο Παιδείας και Έρευνας της Γερμανίας (BMBF Συμβόλαιο 03ZIK041 σε NC) και από το EFRE (Ευρωπαϊκό Ταμείο Περιφερειακής Ανάπτυξης) Europäische Fonds für regionale Entwicklung, Europa fördert Sachsen (100.066.308). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Το μικροπεριβάλλον είναι θεμελιώδης ρυθμιστής της κυτταρικής συμπεριφοράς [1], [2], [3]. Ένα μεγάλο σώμα της εργασίας έχει δείξει πως οι αλληλεπιδράσεις των κυττάρων με την εξωκυτταρική μήτρα (ECM), ως ένα από τα βασικά συστατικά του μικροπεριβάλλοντος, συμβάλλουν στη ρύθμιση της κρίσιμης κυτταρικών λειτουργιών, όπως κύτταρο σχήμα /αρχιτεκτονική, την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση [2], [4], [5], [6], [7], [8], [9]. αλληλεπιδράσεις κυττάρου-ECM ελέγχει επίσης την έκφραση του γονιδίου και την οργάνωση της χρωματίνης σε ανάπτυξη και ECM-εξαρτώμενο τρόπο [10], [11]. Πρόσφατα αναδυόμενες ευρήματα δείχνουν ότι ειδικά οι συνθήκες ανάπτυξης διαδραματίζουν ουσιαστικό ρόλο για την κυτταρική ανταπόκριση σε εξωτερικά ερεθίσματα. Αυτό έγινε εμφανές στην τρισδιάστατη (3D) ex vivo κυτταρικές καλλιέργειες που αναπτύσσονται σε ECM και σε σφαιροειδείς μοντέλα [4], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [ ,,,0],17]. Είναι σημαντικό, αυτά τα 3D μοντέλα κυτταρικής καλλιέργειας καλύτερα μιμούνται ένα φυσιολογικό μικροπεριβάλλον από τα συμβατικά επικαλυμμένα ή ECM-προεπικαλυμμένα πλαστικά καλλιέργειας κυττάρων [15], [18].

Εκτός από τη χρήση των μοντέλων της κυτταρικής καλλιέργειας 3D στη μηχανική ιστών [ ,,,0],19], [20], [21] και μελέτες για την εμβρυϊκή ανάπτυξη και τη φυσιολογία [18], οι καλλιέργειες 3D κυττάρων είναι όλο και περισσότερο χρησιμοποιούνται στην έρευνα του καρκίνου [7], [8], [9], [12], [16], [22]. Στη συντριπτική πλειοψηφία των περιπτώσεων, κυτταρικές σειρές όγκων διαφορετικής προέλευσης εμφανίζουν μια βελτιωμένη αντίσταση σε ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία σε ένα 3D περιβάλλον ενδεικτική από αυξημένη κλωνογονικότητας και μειωμένη απόπτωση [12], [13], [14], [16], [ ,,,0],17], [23], [24], [25], [26], [27]. Εκτός από μια σημαντική επίδραση της ιντεγκρίνης με τη μεσολάβηση των αλληλεπιδράσεων κυττάρου-ECM [28], μια σύνθετη αλληλεπίδραση των βιοχημικών οδών σηματοδότησης και βιοφυσικών /παράγοντες mechanotransduction σχετίζονται πιστεύεται ότι προσδίδουν αυτή την αυξημένη αντίσταση των καρκινικών κυττάρων των οποίων οι υποκείμενοι μηχανισμοί παραμένουν να προσδιορίζεται τόσο για το γονιδίων και στο επίπεδο της πρωτεΐνης [2].

Όσον αφορά την έκφραση των γονιδίων, μεγάλες προσπάθειες έχουν αναληφθεί για τον εντοπισμό συγκεκριμένων διαγνωστικών, προγνωστικών και η θεραπεία παρακολούθησης πρότυπα γονιδιακής έκφρασης σε βιοψίες των διαφόρων ανθρώπινων [2] κακοήθειες, [5], [6], [29], [30], [31]. Περιέργως, ορισμένες από αυτές τις μελέτες έδειξαν ισχυρή επικάλυψη μεταξύ in vivo και 3D αλλά συνόλων δεδομένων δεν 2D κυτταρικής καλλιέργειας, η οποία επέτρεψε τελικά την ταυτοποίηση των υπογραφών γονιδίων πρόβλεψης για τη συνολική επιβίωση των ασθενών με καρκίνο. Απομένει να διευκρινιστεί εάν οι αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση κάτω από 3D σε σχέση με τις συνθήκες ανάπτυξης 2D μπορεί να εξηγήσει ή να παρέχουν συμβουλές σε συγκεκριμένες οδούς στρες ή επιδιόρθωσης του DNA που συμμετέχουν στην ενισχυμένη ράδιο- ή χημειοαντίσταση ενήλικων καρκινικών κυττάρων 3D. Αν ναι, στοχευμένες θεραπευτικές προσεγγίσεις κατά κλειδί προαγωγούς όγκου θα μπορούσε να βελτιστοποιηθεί.

Για να απαντηθεί αυτό το ερώτημα, η μελέτη αυτή σε σύγκριση βασικής γονιδιακής έκφρασης δύο ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές γραμμές διαφορετικής προέλευσης και με διάφορες γενετικό υπόβαθρο σε ένα ικρίωμα 3D ECM ή κάτω από συνηθισμένες συνθήκες 2D μονοστοιβάδα όσον αφορά τη συμπεριφορά τους κατά την ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές, συνθήκες καλλιέργειας και κυττάρων διπλασιασμό φορές

καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα γραμμή Α549 ελήφθη από την ATCC (Manassas, USA). Η πλακωδών κυττάρων γραμμή καρκίνωμα UT-SCC15 ήταν ένα είδος δώρο από τον R. Grenman (Turku University Κεντρικό Νοσοκομείο, Φινλανδία). Για τους συμβατικούς καλλιέργεια 2D κυττάρων, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Μέσο Eagle Τροποποιημένο Μέσο (DMEM? ΡΑΑ, Cölbe, Γερμανία) που περιέχει glutamax-I (L-αλανυλ-L-γλουταμίνη) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS? ΡΑΑ) και 1 % μη-βασικά αμινοξέα (ΝΕΑΑ? ΡΑΑ) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 7% CO

2. Για καλλιέργεια 3D κυττάρων, τα κύτταρα απλώθηκαν σε ένα μίγμα 0,5 mg /ml λαμινίνης πλούσια εξωκυτταρική μήτρα (Matrigel? BD, Heidelberg, Germany) και πλήρες μέσο ϋΜΕΜ σε μια στρώση αγαρόζης (Sigma, Taufkirchen, Γερμανία) σε μια 24- καλά κυτταρικής καλλιέργειας πιάτο (BD) όπως δημοσιεύθηκε [12], [13], [14], [16].

ώρα κύτταρα που αναπτύσσονται ως μονοστιβάδες σε φιάλες κυτταροκαλλιέργειας μετρήθηκαν σύμφωνα με πρότυπα πρωτόκολλα διπλασιασμού. Εν συντομία, και μόνο τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 2D ή 3D και επεξεργασία με θρυψίνη και μεταφέρθηκαν σε 10 ml μέσου που περιέχει FCS. Μετά ήπια ανάμιξη σε μέσο, ​​10 μΙ του διαλύματος των κυττάρων μεταφέρθηκε με πιπέττα σε ένα θάλαμο καταμέτρησης Neubauer χρησιμοποιώντας μια κατάλληλη αραίωση. Κύτταρα σε 4 τετράγωνα μετρήθηκαν μικροσκοπικώς (Zeiss, Jena, Germany) και ο αριθμός των κυττάρων υπολογίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Για κύτταρα που αναπτύσσονται σε περιβάλλον 3D Matrigel, κύτταρα απομονώθηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [23], [33] χρησιμοποιώντας ένα θάλαμο καταμέτρησης Neubauer.

3D και 2D προσδιορισμούς σχηματισμού αποικιών

κλωνογονιδιακή επιβίωση υπό 3D συνθήκες δοκιμάστηκε όπως προηγουμένως δημοσιευθεί [15], [16], [17], [34]. Εν συντομία, και μόνο τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 0,5 mg /ml Matrigel συμπληρωμένου με ϋΜΕΜ /10% FCS /1% ΝΕΑΑ. Μετά από 24 ώρες, και μόνο τα κύτταρα ακτινοβολούνται (0-6 Gy), ή σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις Cisplatin (0,1, 1, 5, 10 μΜ? Για 24 ώρες? Neocorp). Η σισπλατίνη απομακρύνθηκε με 3- (2D) ή 15-φορές (3D) πλύση με DMEM /10% FCS /1% ΝΕΑΑ. Στη συνέχεια, τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε αποικίες /κύτταρο συστάδες. Στο 8 (Α549) ή 11 ημέρες (UT-SCC15) μετά την επίστρωση, που καλλιεργούνται αποικίες /συστάδες κυττάρων (& gt? 50 κύτταρα) έχουν μικροσκοπικά μετρήθηκαν. επιβίωση των κυττάρων 2D επιτεύχθηκε όπως δημοσιεύθηκε [23]. Μετά από 8 ημέρες (Α549) ή 11 ημέρες (UT-SCC15), κύτταρα βάφτηκαν με Coomassie blue (Merck, Darmstadt, Γερμανία) και οι αποικίες (& gt? 50 κύτταρα) μετρήθηκαν. Οι ικανότητες επίστρωσης υπολογίστηκαν ως εξής: Οι αριθμοί των αποικιών που σχηματίστηκαν /αριθμούς κυττάρων απλώνονται. Επιβίωση κλάσματα υπολογίζονται ως εξής: Οι αριθμοί των αποικιών που σχηματίστηκαν /(αριθμοί κυττάρων επιστρώθηκαν (ακτινοβολημένα /Σισπλατίνη) × ικανότητα επίστρωσης (μη-εκπέμπον /μη επεξεργασμένα)). Κάθε σημείο επί καμπύλες επιβίωσης αντιπροσωπεύει το μέσο κλάσμα επιβίωσης από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η ακτινοβόληση των κυτταρικών καλλιεργειών

Η ακτινοβόληση παραδόθηκε σε θερμοκρασία δωματίου χρησιμοποιώντας μονές δόσεις (0-6 Gy) 200 kV X -rays (YXLON Y.TU 320? YXLON, Κοπεγχάγη, Δανία) φιλτράρεται με 0,5 χιλιοστά του χαλκού. Η δόση-ρυθμός ήταν περίπου 1,3 Gy /min σε 20 mA. Η απορροφούμενη δόση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα δοσίμετρο Duplex (ΜΔ, Freiburg, Γερμανία).

cDNA μικροσυστοιχιών

Το προφίλ γονιδιακής έκφρασης μετρήθηκε με RNA που εξάγεται από 5 × 10

6 κύτταρα που αναπτύσσονται σε 3D ή 2D. Ολικό RNA παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ NucleoSpin RNA II σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Macherey-Nagel, Düren, Germany). Διαδικασίες για την σύνθεση cDNA, την επισήμανση και υβριδισμός διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Affymetrix) και όπως δημοσιεύθηκε [35]. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Affymetrix ανθρώπινο γονίδιο γονιδίωμα τσιπ HG U133 Plus 2.0. Σύνθεση DNA πρώτου κλώνου με 90 ng του συνολικού RNA, σύνθεση του επισημασμένου με βιοτίνη cRNA και καθαρίσει διεξήχθη με τη χρήση του 3 ‘IVT Express Kit (Affymetrix). Για την υβριδοποίηση, 15 μg cRNA κατακερματισμένων επωάστηκαν με το τσιπ σε 200 μΐ διαλύματος υβριδισμού σε Hybridization Φούρνος 640 (Affymetrix) στους 45 ° C για 16 ώρες. GeneChips στη συνέχεια πλύθηκαν και χρωματίστηκαν με το ρευστών Station Affymetrix 450 σύμφωνα με την GeneChip Expression Wash, Stain και σάρωση Εγχειρίδιο χρησιμοποιώντας το GeneChip Hybridization, Wash και Stain Kit (Affymetrix). Μικροσυστοιχίες σαρώθηκαν με την Affymetrix GeneChip Scanner 7G, και τα σήματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας GCOS (V.1.4? Affymetrix). Για τη σύγκριση δειγμάτων και τα πειράματα χρησιμοποιήθηκε το RMA αλγόριθμος (Εκφραση κονσόλας, V.1.1), περαιτέρω ανάλυση διεξήχθη με TIGR MeV (v.4.6.2). Τρεις επαναλήψεις χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση μικροσυστοιχιών και στατιστικές. Για την ανάλυση SAM, ένας λόγος σήματος Log 0,8 (-0,8) χρησιμοποιήθηκε ως κατώφλι το οποίο ισούται με μία πτυχή αλλαγή του 1,6 και -1,6, αντίστοιχα. δεδομένα γονιδιακής έκφρασης είναι διαθέσιμες στο GEO προσχώρησης Νο GSE17347. Για τη λίστα γονίδιο, λειτουργικά εμπλουτισμός χρησιμοποιήσαμε το ToppGeneSuite [36]. Πορείες και άλλες λειτουργικές ομάδες γονιδίων αξιολογήθηκαν για διαφορική ρύθμιση χρησιμοποιώντας το εργαλείο οπτικοποίησης GenMAPP (Ver. 2.1) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [37].

SAM απαιτεί την εισαγωγή μιας τιμής «δέλτα». Η τιμή «Δέλτα» ορίζει το όριο για τον αριθμό των ψευδώς θετικών γονιδίων στο επικυρωμένη σύνολο δεδομένων. Να καταρτίσει έναν κατάλογο των δυνητικά σημαντικών γονιδίων, υπολογίσαμε το ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR). Η εκτιμώμενη FDR (ο μέσος αριθμός των ψευδώς σημαντικά γονίδια) για κάθε δεδομένη «δέλτα» ( «Δέλτα» αξία) προσδιορίστηκε σύμφωνα με Tusher et al. [38].

Ημι-ποσοτική RT-PCR

Για την επικύρωση των δεδομένων μικροσυστοιχιών με PCR, χρησιμοποιήθηκε

ολικού RNA που απομονώθηκε για προφίλ γονιδιακής έκφρασης. cDNA παρασκευάστηκε με κιτ SuperScript ™ III αντίστροφης μεταγραφάσης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen, Karslruhe, Germany). Σε συντομία, συντέθηκε cDNA σε έναν όγκο 20 μΐ που περιείχε 1 μg DNase επεξεργασμένου ολικού RNA, 1 μΙ ολιγο (dt)

20 (50 μΜ), και 1 μΙ 10 mM dNTP Mix, 4 μΐ 5 χ Πρώτη ρυθμιστικό Strand, 1 μΐ 0,1 Μ DTT, 1 μΐ RNase OUT, και 1 μΙ SuperScript III (200 U /μl). RNA, dNTPs και ολιγο (άΤ) αναμίχθηκαν πρώτα, θερμαίνεται στους 65 ° C για 5 λεπτά και τοποθετήθηκε σε πάγο μέχρι την προσθήκη των υπόλοιπων συστατικών της αντίδρασης. Στη συνέχεια, το μίγμα της αντίδρασης επωάστηκε στους 55 ° C για 45 λεπτά και τερματίστηκαν με θερμο-απενεργοποίηση στους 70 ° C για 15 λεπτά. Ένα πανομοιότυπο αντίδραση χωρίς αντίστροφη μεταγραφάση διεξήχθη για να επιβεβαιωθεί η απουσία γενωμικού DNA. Ημι-ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε για τα γονίδια TXNIP, DUSP6, λειτουργίας του CEACAM1, NPC1 και BCL2A1 χρησιμοποιώντας εκκινητές που παρατίθενται στον Πίνακα 1 (Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Γερμανία), 2 μΐ cDNA και HotStar Taq πολυμεράση (Qiagen, Hilden, Γερμανία ) σύμφωνα με πρότυπα πρωτόκολλα PCR. Εμπρόσθια εναύσματα για όλα τα γονίδια επιλέχθηκαν από την αναζήτηση του αρχικού ολιγονουκλεοτιδίων ακολουθία του αντίστοιχου αριθμού αναγνώρισης γονίδιο του γονιδίου τσιπ Affymetrix στην ιστοσελίδα του Affymetrix (https://www.affymetrix.com/analysis/index.affx). Οι αντίστροφοι εκκινητές σχεδιάστηκαν με βάση την αλληλουχία του γονιδίου που παρέχονται στην ιστοσελίδα Affymetrix. Θερμοκρασίες ανόπτησης 50 ° C χρησιμοποιήθηκαν για TXNIP, DUSP6 και BCL2A1 ή 55 ° C για λειτουργίας του CEACAM1 και NPC1. Για κανονικοποίηση, ένας β-ακτίνης θραύσμα 540 bp ενισχύθηκε ταυτόχρονα χρησιμοποιώντας εκκινητές παρατίθενται στον Πίνακα 1 [39]. Τα αποτελέσματα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας 1% αγαρόζη (Carl Roth, Karlsruhe, Germany) τζελ και πυκνομετρική ανάλυση με λογισμικό J® εικόνας (National Institutes of Health, Bethesda, USA) μετά από χρώση πηκτωμάτων με βρωμιούχο αιθίδιο (Carl Roth).

η

εκχυλίσματα ολικής πρωτεΐνης και κηλίδωση Western

εκχυλίσματα ολικής πρωτεΐνης από 4-ημερών 3D και κυτταρικές καλλιέργειες 2D απομονώθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13]. Εν συντομία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τροποποιημένο ρυθμιστικό RIPA (50 mM Tris-HCl (Carl Roth), ρΗ = 7,4), 1% Nonidet-Ρ40 (Sigma), 0,25% δεοξυχολικό νάτριο (Applichem, Darmstadt, Γερμανία), 150 mM NaCl (VWR International, Darmstadt, Γερμανία), 1 mM αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (Merck), πλήρης κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche, Mannheim, Germany), 1 mM NaVO

4 (Applichem), 2 mM NaF (Applichem)). Τα δείγματα αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Συνολικό ποσό πρωτεΐνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία δικιγχονικού οξύ (Pierce, Βόννη, Γερμανία). Μετά την ηλεκτροφόρηση νάτριο δωδεκυλο θειικού πολυακρυλαμιδίου πηκτή και μεταφορά των πρωτεϊνών σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Schleicher & amp? Schüll, Dassel, Γερμανία), οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με τα ακόλουθα αντισώματα: anti-Ινονεκτίνης (BD, Χαϊδελβέργη, Γερμανία), αντι-CTGF, αντι- ErbB3 (Santa Cruz, Χαϊδελβέργη, Γερμανία), αντι-BCL2A1 (διάρκεια ζωής των Βιοεπιστημών, Σιάτλ, ΗΠΑ) και αντι-β-ακτίνης (Sigma)? υπεροξειδάση αρμορακίας συζευγμένη με γαϊδάρου αντι-κουνελιού, γαϊδάρου αντι-κατσίκας και προβάτου αντι-ποντικού (Amersham, Freiburg, Germany) δευτερεύοντα αντισώματα. Supersignal® West Dura Extended Διάρκεια υπόστρωμα (Pierce, Βόννη, Γερμανία) και Amersham Hyperfilm ECL (GE, Μόναχο, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση. Πυκνομετρία διεξήχθη χρησιμοποιώντας λογισμικό Image J®. Τρία ανεξάρτητα πειράματα έχουν πραγματοποιηθεί.

Αποτελέσματα

3D και την ανάπτυξη των κυττάρων 2D χαρακτηριστικά και την επιβίωση των κυττάρων μετά από ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία

το σχήμα των κυττάρων και η μορφολογία ήταν διαφορετικά μεταξύ 3D και 2D συνθήκες της κυτταρικής ανάπτυξης (Εικ. 1Α). Τέσσερις ημέρες μετά την επίστρωση, τα κύτταρα εκθετικά αυξανόμενη με παρόμοιους χρόνους διπλασιασμού (Εικ. 1Β). Αυτή η ομοιότητα στο κελί χρόνους διπλασιασμού παρέχεται συγκρίσιμες πειραματικές συνθήκες για ολόκληρη την ανάλυση γονιδιακής έκφρασης γονιδιώματος. Σημαντικά, προηγούμενα πειράματα αξιολόγηση της επιβίωσης ακτινοβολίας Α549 και κύτταρα UT-SCC15 επαναλήφθηκαν σχηματίζοντας έτσι το σκεπτικό για την υποβληθείσα μελέτη για σύνδεση της ανάπτυξης που εξαρτάται από ράδιο- και χημειοαντίσταση με τροποποίηση γονιδιακής έκφρασης ανάπτυξη που εξαρτάται [11]. Υπό 3D συνθήκες, και οι δύο κυτταρικές σειρές παρουσίασαν σημαντικά υψηλότερο κλωνογονική επιβίωση μετά την έκθεση σε αυξανόμενες απλές δόσεις των ακτίνων Χ ή αυξανόμενων συγκεντρώσεων Cisplatin σε σύγκριση με 2D (Εικ. 1 C και D). Αυτά τα στοιχεία δείχνουν μια σύνδεση μεταξύ των συνθηκών ανάπτυξης και τη μορφολογία των κυττάρων και των κυτταρικών ραδιοφωνικών και χημειοαντίσταση.

(Α) Εκπρόσωπος εικόνες και σχηματική του 2D (

i

,

iii

) και 3D (

II, IV

) την ανάπτυξη των κυττάρων, όπως διαπιστώθηκε κατά την ημέρα 4 αμέσως πριν από την απομόνωση του RNA. Μπαρ, 50 μm. (Β) φορές από κυτταρικές καλλιέργειες 2D και 3D κατά την ημέρα 4 διπλασιασμός μετά την επίστρωση. Τα αποτελέσματα δείχνουν μέση τιμή ± SD (η = 3). N.S., δεν είναι σημαντική. Κλωνογονική επιβίωση του 2D ή 3D καλλιεργούνται κύτταρα που εκτέθηκαν σε αυξανόμενες δόσεις ακτίνων Χ (2, 4 ή 6 Gy) (C) ή συγκεντρώσεις Cisplatin (0,1, 1, 5, 10 μΜ) (D), που εφαρμόζεται 24 ώρες μετά την επίστρωση. Η σισπλατίνη απομακρύνθηκε μετά από 24 ώρες από 3- (2D) ή 15-φορές (3D) πλύση με DMEM /10% FCS /1% ΝΕΑΑ. Τα αποτελέσματα δείχνουν μέση τιμή ± SD (η = 3? T-test). * P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01. CDDP, σισπλατίνη. Bar, 200 μm.

Η

Όλη η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης του γονιδιώματος του Α549 και UT-SCC15 καλλιεργήθηκαν σε 3D ή 2D

Αυτή η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης του γονιδιώματος μεγάλη διεξήχθη κάτω από ανεπεξέργαστα συνθήκες και προορίζονται να προσδιορίζουν συγκεκριμένα μοτίβα γονιδιακής έκφρασης απλών γονιδίων ή λειτουργικώς συνδέεται ομάδες γονιδίων που μπορούν να συνδεθούν με κύτταρο όγκου ράδιο- και χημειοαντίσταση. Από το γονίδιο προφίλ, ιεραρχική ομαδοποίηση και στατιστική ανάλυση με τη χρήση του SAM, ήταν προφανές ότι οι συνθήκες ανάπτυξης επηρεάζουν τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης (Εικ. 2Α και Β). Το εκτιμώμενο ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR) ήταν 0 μέχρι το σύνολο «δέλτα» ( «Δέλτα» = 2.873 σε Α549? «Δέλτα» = 2.445 σε UTSCC15). Ένας μεγαλύτερος αριθμός γονιδίων διαφορικά εκφραζόμενων σε Α549 (376 μεταγραφές) από ό, τι στα κύτταρα UT-SCC15 (178 μεταγραφές) (Σχ 2Α, Πίνακας 2?. Πίνακα S1 και S2). Σε 3D, Α549 και UT-SCC15 κύτταρα έδειξαν περισσότερα γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω από κάτω-ρυθμίζονται σε σύγκριση με 2D (Σχ. 2Α και Β).

(Α) Ιεραρχική συστάδες γονιδίων των κυτταρικών καλλιεργειών 2D και 3D κατά την ημέρα 4 μετά την επίστρωση. Κόκκινο δείχνει γονιδίων που εκφράζονται άνω του μέσου όρου? πράσινο υποδεικνύει τα γονίδια που εκφράζονται κάτω του μέσου όρου και το μαύρο υποδηλώνει μέσο έκφρασης μετά Σημασία ανάλυση των μικροσυστοιχιών (SAM). «Θετική» δείχνει γονιδίων απορυθμίζεται σε 3D σε σχέση με 2D. «Αρνητικό» δείχνει γονίδια προς τα κάτω σε 3D σε σχέση με 2D. (Β) Οικόπεδο αριθμό των αντιγράφων κατά αναλογίες καταγραφής σήματος από 3D σε σχέση με κυτταρικές καλλιέργειες 2D των Α549 και κύτταρα UT-SCC15. (Γ) Γονιδιακή Οντολογία-εξαρτώμενη αποτύπωση των απόλυτους αριθμούς και ποσοστά σημαντικά τροποποιημένων γονιδίων σε 3D σε σχέση με κυτταρικές καλλιέργειες 2D σύμφωνα με την ανάλυση SAM.

Η

Σύμφωνα με το SAM, κύτταρα Α549 είχε 242 μεταγραφές μέχρι – και 134 κάτω-ρυθμίζονται, ενώ κύτταρα UT-SCC15 είχε 125 μεταγραφές επάνω και 53 μεταγραφές κάτω-ρυθμιζόμενη (Σχήμα 2Α και Β, Πίνακας S1 και S2.). Περιέργως, αυτοί οι δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές έδειξε επικάλυψη των κυτταρικών συστατικών και των βιολογικών λειτουργιών που πρόκειται να επηρεαστούν κάτω από συνθήκες ανάπτυξης 3D σε σχέση με το γονίδιο της οντολογίας (Σχ. 2C, πίνακες S3 και S4). κύτταρα UT-SCC15, σε γενικές γραμμές, έδειξε ότι υπάρχει λιγότερη γονίδια τροποποιούνται με 3D ανάπτυξη σε σύγκριση με κύτταρα Α549 (Σχ. 2Α, Πίνακας S2). Από μια σύγκριση της έκφρασης γονιδίου ένα-προς-ένα, έγινε φανερό ότι οι τροποποιήσεις που συμβαίνουν σε διαφορετικά γονίδια εντός των ίδιων ομάδων κυτταρικών συστατικών ή βιολογικών λειτουργιών σε μια κυτταρική γραμμή-εξαρτώμενο τρόπο. Στην κορυφή του SAM, η ανάλυση t-test διεξήχθη στην οποία 856 γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω και 721 ρυθμισμένα προς τα κάτω σε 3D Α549 κυτταρικής καλλιέργειας σε σχέση με 2D (να σημειωθεί: κατώφλι SLR +/- 0,8). Σε κύτταρα UT-SCC15, 429 γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω και 277 ρυθμισμένα προς τα κάτω σε 3D, σε σύγκριση με 2D. Η επικάλυψη των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων κατά SAM και t-test για τη σύγκριση 3D-to-2D αποκάλυψε 238 μεταγραφές επάνω ρυθμισμένη και 128 μεταγραφές ρυθμισμένα προς τα κάτω σε κύτταρα Α549 και 119 μεταγραφές επάνω ρυθμισμένη και 52 μεταγραφές ρυθμισμένα προς τα κάτω σε UT- κυττάρων SCC15 (Πίνακας S5 και S6) .Οι ευρήματα δείχνουν ότι οι διαδικασίες που συνδέονται με την κυτταρική προσκόλληση, τη βιολογική πρόσφυση, ανοσολογικές αποκρίσεις του συστήματος, την άμυνα απαντήσεις, την ανάπτυξη των ιστών και την αντιμετώπιση της οργανικής ουσίας είναι κατά κύριο λόγο ρυθμίζεται μέσω διαφορικής έκφρασης γονιδίων όταν τα κύτταρα μεταφέρονται από ένα 2D σε ένα 3D μικροπεριβάλλον μήτρα που βασίζεται. Χωρίς έντονες μεταβολές έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην επιδιόρθωση του DNA, μπορεί να σκεφτεί ότι ράδιο- και χημειοαντίσταση του 3D κύτταρα που αναπτύχθηκαν αποτελέσματα από συγκεκριμένες, ακόμη αγνώστων, οι αλλαγές της αρχιτεκτονικής των κυττάρων και δια του παρόντος επαγόμενες τροποποιήσεις της κυτταρικής interactome από την άποψη της μεταγωγής σήματος και πρωτεΐνη -πρωτεΐνη αλληλεπιδράσεις.

επικύρωση των δεδομένων μικροσυστοιχιών με PCR και κηλίδωση Western

Για την επικύρωση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών, επιλεγμένα γονίδια και πρωτεΐνες εξετάστηκαν με τη χρήση ημι-ποσοτική RT-PCR (θειορεδοξίνης πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης (TXNIP) , διπλής ειδικότητας φωσφατάση 6 (DUSP6), καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο που σχετίζονται με μορίου προσκόλλησης κυττάρου 1 (λειτουργίας του CEACAM1), νόσο Niemann-Pick, τύπου C1 (NPC1) και πρωτεΐνη BCL2 σχετίζονται Α1 (BCL2A1)) και κηλίδωση Western (Ινονεκτίνης (FN1), αυξητικού παράγοντα του συνδετικού (CTGF), v-erb-B2 ερυθροβλαστική λευχαιμία ιικού ογκογονιδίου ομόλογο 3 (ErbB3) και BCL2A1), αντίστοιχα.

Οι αναλογίες καταγραφής σημάτων επιλεγμένων γονιδίων από κυτταρικές καλλιέργειες 3D ή 2D εμφανίζονται σε Σχήμα 3. TXNIP και DUSP6 παρούσα γονίδια όλο που εκφράζονται στις δύο κυτταρικές σειρές όταν καλλιεργούνται σε 3D σε σχέση με 2D (Σχ. 3). επαγωγή λειτουργίας του CEACAM1 και NCP1 και BCL2A1 καταστολής παρατηρήθηκαν μόνο σε καλλιέργειες κυττάρων Α549 3D (Εικ. 3). Ημι-ποσοτική RT-PCR σε δείγματα RNA που χρησιμοποιείται για την ανάλυση μικροσυστοιχιών επιβεβαίωσε επαγόμενη έκφραση TXNIP σε 3D, ενώ αυξημένη έκφραση DUSP6 μπορούσε να επιβεβαιωθεί μόνο σε κύτταρα UT-SCC15 (Εικ. 4Α και Β). Ενισχυμένη επίπεδα λειτουργίας του CEACAM1 mRNA ήταν ανιχνεύσιμα τόσο 3D Α549 και πολιτισμών 3D UT-SCC15 κυττάρων, η οποία ήταν επιβεβαιωτική για Α549 και οριακά για τα κύτταρα UT-SCC15 όσον αφορά τα δεδομένα μικροσυστοιχιών DNA (Εικ. 4Α και Β). Τα γονίδια NPC1 και BCL2A1 έδειξαν μειωμένη ή σταθερά επίπεδα στο ευρύ ανάλυση του γονιδιώματος σε Α549 ή κύτταρα UT-SCC15, αντίστοιχα? αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν πλήρως από ημι-ποσοτική RT-PCR (Εικ. 4Α και Β).

Η έκφραση των γονιδίων TXNIP1, DUSP6, λειτουργίας του CEACAM1, NPC1 και BCL2A1 οριοθετείται συγκριτικά από 3D σε σχέση με κυτταρικές καλλιέργειες 2D των Α549 και UT -SCC15 κυττάρων.

η

(Α) Ημι-ποσοτική RT-PCR διεξήχθη όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Δεικνύονται 1 πήγματα% αγαρόζη με θραύσματα RT-PCR του TXNIP, DUSP6, λειτουργίας του CEACAM1, NPC1 και mRNAs BCL2A1 απομονώνεται από Α549 ή κύτταρα UT-SCC15. Τα δείγματα ενισχύθηκαν από cDNA που παράγεται με αντίστροφη μεταγραφή του συνολικού RNA των 4 ημερών 3D και κυτταρικές καλλιέργειες 2D. Όλα τα πειράματα (V1, V2, V3) παρουσίασαν. β-ακτίνης έκφραση υπηρέτησε ως έλεγχος φόρτωσης (540 bp). οθόνη (Β) Γραφήματα αποτελέσματα από πυκνομετρική ανάλυση της έκφρασης mRNA ενδεικνυόμενης μετά από κανονικοποίηση σε β-ακτίνη. Τα αποτελέσματα δείχνουν μέση τιμή ± SD (n = 3).

Η

Στη συνέχεια, ένα διαφορετικό σύνολο των γονιδίων (FN1, CTGF, ErbB3, BCL2A1) ελέγχθηκε σε επίπεδο πρωτεΐνης με κηλίδωση Western. Οι αναλογίες καταγραφής του σήματος από αυτά τα γονίδια που παράγονται από το μικροσυστοιχιών DNA ήταν: FN1 = 1.6 /n.c. (Α549 /UT-SCC15)? CTGF = 1.2 /-3.8 (Α549 /UT-SCC15)? ErbB3 = 2.2 /n.c. (Α549 /UT-SCC15)? BCL2A1 = -3.8 /n.c. (Α549 /UT-SCC15) (Σχ. 5Α, ο Πίνακας S1 και S2). Σε καλλιέργειες κυττάρων Α549 3D, ανάλυση έκφρασης πρωτεΐνης επιβεβαίωσε το DNA που βασίζεται σε μικροδιάταξη πάνω ρύθμιση της φιμπρονεκτίνης, CTGF και ErbB3, καθώς και την προς τα κάτω ρύθμιση BCL2A1 (Σχ. 5Β και C). 3D UT-SCC 15 κυτταρικές καλλιέργειες δεν έδειξε μεταβολές των εξεταζόμενων πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένης CTGF, η οποία κατέδειξε ισχυρή καταστολή, σύμφωνα με βάσει μικροδιάταξης ανάλυσής μας (σχ. 5Β και C). Στις περισσότερες περιπτώσεις, αυτά τα δεδομένα έδειξαν παρόμοια αποτελέσματα μεταξύ ανάλυση γονιδιακής έκφρασης ευρύ ολόκληρο το γονιδίωμα χρησιμοποιώντας τη μορφή μικροσυστοιχίας και RT-PCR ή στύπωμα Western.

(Α) αναλογίες log Σήμα επιλεγμένων γονιδίων (FN1, CTGF, ErbB3 και BCL2A1 ) από την ανάλυση που βασίζεται σε μικροδιάταξη DNA υποβλήθηκε σε ανάλυση κηλίδας Western. (Β) Ολόκληρα κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν από καλλιέργειες κυττάρων 3D και 2D την 4η ημέρα μετά την επίστρωση. SDS-PAGE και ανάλυση κηλίδος Western διεξήχθησαν όπως περιγράφεται υπό Υλικά και Μέθοδοι. Αντιπροσωπευτικές εικόνες δείχνουν έκφραση της φιμπρονεκτίνης (240 kDa), CTGF (38 kDa), ErbB3 (180 kDa) και BCL2A1 (20 kDa). β-ακτίνης χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. (Γ) Οι μονάδες πυκνομετρική των πρωτεϊνικών ζωνών που φαίνεται στο ‘Β’ απεικονίζονται κατόπιν ομαλοποίηση σε β-ακτίνη.

Η

Συζήτηση

απώλεια της λειτουργικής και φαινοτυπικών χαρακτηριστικών συμβαίνουν όταν τα κύτταρα καλλιεργούνται ex νίνο σε ένα 2D μικροπεριβάλλον [1], [4], [18], [20]. Αυτό μπορεί να προληφθεί με καλλιέργεια κυττάρων σε φυσιολογικό 3D ικριώματα ECM παρουσιάζεται για διάφορες παραμέτρους, όπως η πρωτεϊνική έκφραση, τη μορφολογία, και την πρόβλεψη των γονιδίων υπογραφών για την κλινική έκβαση [2], [5], [6], [29], [30] . Λαμβάνοντας υπόψη αυτά τα σημεία, εστιάσαμε στους μηχανισμούς ρύθμισης του όγκου ευαισθησία των κυττάρων στην ράδιο- και χημειοθεραπεία. Για να εκτιμηθεί η επίπτωση της βασικής προφίλ γονιδιακής έκφρασης για την πιο φυσιολογική 3D έναντι των τεχνητών μοντέλα 2D κυτταρικής καλλιέργειας, η μελέτη αυτή διεξήχθη επί ανθρώπινων επιθηλιακών καρκινικών κυτταρικών γραμμών που προέρχονται από δύο από τις πιο συχνές καρκίνους παγκοσμίως, δηλαδή πνεύμονα (Α549) και το κεφάλι και καρκίνωμα του λαιμού πλακωδών κυττάρων (UT-SCC15) [40]. Επιλέγονται από διάφορα μοντέλα κυτταρική σειρά δοκιμάζονται στο εργαστήριο μας, αυτές οι δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου διαφέρουν ως προς την προέλευσή τους και το γενετικό υπόβαθρο και αποτελούν χαρακτηριστικά παραδείγματα που δείχνουν τις prosurvival επιπτώσεις της ανάπτυξης σε ένα ικρίωμα 3D ECM σε σύγκριση με συμβατικά χρησιμοποιούνται πλαστικά πολιτισμού [11], [ ,,,0],12], [13], [14]. Δείχνουμε σημαντικές αλλαγές στο προφίλ γονιδιακής έκφρασης του 3D έναντι καλλιεργειών 2D κυττάρων. Ενώ τα γονίδια που εμπλέκονται στην επιδιόρθωση του DNA οδούς έμεινε αμετάβλητος, η πλειοψηφία των τροποποιημένα γονίδια σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές που συνδέονται με βιολογικές λειτουργίες, όπως ανάπτυξη ιστού, κυτταρική προσκόλληση, και απόκριση αμυντικούς. Επικύρωση των δεδομένων μικροσυστοιχιών εκτελέστηκε σε επιλεγμένα γονίδια για mRNA και το επίπεδο της πρωτεΐνης.

Καλλιέργειες

3D κυττάρων είναι όλο και περισσότερο χρησιμοποιούνται στην έρευνα του καρκίνου καθώς και της μηχανικής των ιστών, αναπτυξιακή και κυτταρικής βιολογίας. Για την ανάπτυξη θεραπείας, κυτταρικής απόκρισης είναι το βασικό ζήτημα και δραματικά διαφορετική σε 3D φυσιολογικό περιβάλλον σε σύγκριση με τις συνθήκες τρυβλίο Petri. Όσον αφορά την κλωνογόνο επιβίωση των κυττάρων μετά από έκθεση σε ακτίνες Χ ή το εφαρμοσθεί ευρέως χημειοθεραπευτικό φάρμακο σισπλατίνη, τόσο Α549 και κύτταρα UT-SCC15 εμφανίζουν αυξημένη ποσοστά επιβίωσης σε σχέση με το 3D 2D. Καθώς αυτά είναι μόνο δύο παραδείγματα από τα πολλά [12], [13], [14], [15], [23], [24], τα παραδείγματα «προσκόλληση κυττάρου που προκαλείται ραδιοαντοχή» και «προσκόλληση αντοχή φαρμάκου κύτταρο» κυρίως εξετάζονται σε συμβατικά πιάτα καλλιέργειας κυττάρων ECM-επικάλυψη πρέπει να επαναξιολογηθεί, λαμβάνοντας σοβαρά τροποποιήσεις π.χ. μεταγωγή σήματος, διεργασιών επιδιόρθωσης του DNA, κλπ υπόψη όταν κύτταρα αναπτύσσονται σε 3D. Είναι σημαντικό, οι διαφορές στις παραμέτρους όπως υποξία, πολλαπλασιασμό και τη δοσιμετρία της ακτινοβολίας που είναι καλά γνωστές ως σημαντικές παραμέτρους των κυτταρικών ραδιοευαισθησία μπορεί να αποκλειστεί σε προηγούμενη εις βάθος συγκριτική ανάλυση μεταξύ των συνθηκών 3D και 2D κυτταρικής καλλιέργειας [11]. Έτσι, η 3D ECM με βάση το μοντέλο καλλιέργειας κυττάρων που χρησιμοποιείται εδώ είναι μια λογική και εφικτή μέθοδο για τις έρευνες των καρκινικών κυττάρων ραδιοφωνικών και χημειοευαισθησία και των υποκείμενων μηχανισμών.

Παρά τις γνώσεις μας σχετικά με σοβαρές αλλοιώσεις των προτύπων γονιδιακής έκφρασης, διαχωρίζοντας κύτταρα από ιστούς για καλλιέργειες ex vivo 2D κυττάρου [1], [41], [42], τα ευρήματα αυτά έχουν ευρέως παραμεληθεί. Σε 2D, τόσο ο αριθμός των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων και τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης σε κυτταρικές σειρές από όγκο και κανονικούς ιστούς ελαττώθηκαν έως και 70% και είχε ένα εύρος διακύμανσης από περίπου 1.5-φορές σε σύγκριση με τις καταγωγής ιστούς, αντίστοιχα [43 ], [44]. Συγκρίνοντας την ανάλυση μικροσυστοιχιών μας με την εργασία των άλλων, βρήκαμε παρόμοια προφίλ γονιδιακής έκφρασης. Για παράδειγμα, τόσο Α549 και UT-SCC15 έδειξε διακριτικά μοτίβα βασικοκυτταρικό των γονιδίων που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες με λειτουργίες στη ρύθμιση της ECM, όπως λαμινίνη, ινωδονεκτίνη κολλαγόνο, ένα εύρημα παρομοίως παρατηρηθεί σε μια βασική ανάλυση γονιδιακής έκφρασης των κυτταρικών γραμμών 60 καρκίνο και τους αντίστοιχους ιστούς του καρκίνου και σε μια μελέτη που έγινε για το μελάνωμα [30], [42]. Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν περαιτέρω αντίληψη μας ότι οι πολιτισμοί 3D κυττάρων είναι πιο φυσιολογικές και τους ιστούς, όπως από 2D. Παρά παρόμοιους ρυθμούς ανάπτυξης των δοκιμαζόμενων ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών μας, κυτταρικές διεργασίες διαφοροποίησης που σχετίζονται με τροποποιήσεις σε π.χ. πρωτεΐνες ECM θα μπορούσε η έντονα επιρροή η ανταπόκριση των καρκινικών κυττάρων σε διάφορες θεραπείες.

Από υψίστης σημασίας για εμάς ήταν η διαπίστωση ότι κυτταρικές καλλιέργειες 3D διαφορικά ρητή γονίδια που εμπλέκονται στην «εξωκυττάρια μήτρα» και «κυτταρική προσκόλληση», καθώς και «ανταπόκριση άμυνα», αλλά όχι στην «επιδιόρθωση του DNA». Ως διαμόρφωση των γονιδίων που εμπλέκονται στη ρύθμιση του μεγέθους των κυττάρων και της προσκόλλησης δεν είναι εκπληκτικό όταν τα κύτταρα μεταφέρονται από μονοστοιβάδα σε ένα 3D περιβάλλον, τα ευρήματα αυτά υποδεικνύουν έντονα ότι το επίπεδο της έκφρασης συγκεκριμένων γονιδίων που σχετίζονται με την επισκευή του DNA δεν συνδέεται αναγκαστικά με λειτουργικά με η παρατηρούμενη συμπεριφορά των κυττάρων. Στην περίπτωσή μας, ακτινοβοληθεί ή Cisplatin επεξεργασμένου Α549 και UT-SCC15 έδειξε ένα υψηλότερο κλωνογονική επιβίωση κάτω από συνθήκες ανάπτυξης 3D σε σύγκριση με 2D? Ωστόσο, μια αντίστοιχη αύξηση στην έκφραση του π.χ. γονίδια επιδιόρθωσης του DNA, όπως PRKDC (πρωτεϊνική κινάση, DNA-ενεργοποιηθεί, καταλυτική πολυπεπτίδιο), Μηχάνημα αυτόματης ανάληψης (αταξία τηλαγγειεκτασία μεταλλαγμένο) ή MDC1 (μεσολαβητής του οδοφράγματος βλάβη του DNA 1) ήταν απούσα. Συμπερασματικά και σε αντίθεση με τη μελέτη αξιολογεί την πρόβλεψη της ακτινοθεραπείας και χημειοθεραπείας ανταπόκριση, μπορεί να σκεφτεί ότι ο κυριότερος καθοριστικός παράγοντας αυτής της βελτιωμένης επιβίωσης είναι πιθανό να είναι η πρωτεΐνη interactome και όχι το μεταγραφικό. Όσον αφορά τη μεταφορά των δεδομένων από το πάγκο-to-κομοδίνο για θεραπεία, θα πρέπει να τονιστεί ότι τα δεδομένα που παράγονται σε δείγματα όγκων με συντηρημένες φαινοτύπους, συμπεριλαμβανομένων των προφίλ γονιδιακής έκφρασης, είναι πιθανό να είναι πιο επίκαιρη παρά 2D δεδομένων και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την αναγνώριση απαραίτητη κόμβους σηματοδότησης για τη θεραπεία του στόχου.

Εν ολίγοις, τα υποβληθέντα δεδομένα δείχνουν σαφώς ότι οι συνθήκες ανάπτυξης έχει βαθιά επίδραση στη γονιδιακή έκφραση. Από καλλιέργειες 3D κυττάρων αντανακλούν φυσιολογικές συνθήκες ανάπτυξης και προσδίδουν ανθεκτικότητα θεραπεία για να τα καρκινικά κύτταρα, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι, σε επίπεδο μεταγραφικό, το σχήμα των κυττάρων και την επαφή κυττάρου-κυττάρου είναι δύο από τους σημαντικότερους παράγοντες που καθορίζουν την κυτταρική ανταπόκριση σε εξωτερικές στρες. Αυτή η έννοια μπορεί να αναπαραχθεί σε μια πιο ρεαλιστική, μεγαλύτερη πολυπλοκότητα στην οποία δομικές και επικοινωνιακές αλλαγές στο proteome προσθέτουν σημαντική συνθήματα για τη ρύθμιση της κυτταρικής συμπεριφοράς, ιδίως αντοχής στη θεραπεία. Οι μελλοντικές μελέτες σε βελτιστοποιημένα μοντέλα κυτταρικής καλλιέργειας, όπως το 3D μοντέλο ECM δικαιολογημένη για την αντιμετώπιση των transcriptomic και πρωτεομική μηχανισμούς των κυττάρων του όγκου βιολογία, τη θεραπεία του καρκίνου ανταπόκριση και αξιολόγηση των νέων πιθανών στόχων του καρκίνου.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακας S1. ανάλυση της έκφρασης

Gene σε 3D σε σχέση με κυτταρικές καλλιέργειες 2D Α549.

doi: 10.1371 /journal.pone.0034279.s001

(DOC)

Πίνακας S2. ανάλυση της έκφρασης

Gene σε 3D σε σχέση με κυτταρικές καλλιέργειες 2D UT-SCC15.

doi: 10.1371 /journal.pone.0034279.s002

(DOC)

Πίνακα S3.

Gene Ontology Ανάλυση, κυτταρικό συστατικό. Η επικάλυψη σημειώνονται με πλάγια /έντονα γράμματα.

doi: 10.1371 /journal.pone.0034279.s003

(DOCX)

Πίνακας S4.