Abstract

C-C υποδοχέα χημειοκινών 7 (CCR7) συμβάλλει στην επιβίωση ορισμένων κυτταρικών γραμμών καρκίνου, αλλά ο ρόλος του στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ανθρώπινου μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC) παραμένει ασαφής. δοκιμασίες πολλαπλασιασμού πραγματοποιήθηκαν σε κύτταρα Α549 και Η460 NSCLC χρησιμοποιώντας Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8 έδειξε ότι η ενεργοποίηση των CCR7 με ειδικό συνδετήρα του, εξωγενή συνδέτη χημειοκίνης 21 (CCL21), συνδέθηκε με σημαντική γραμμική αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων με διάρκεια της έκθεσης σε CCL21. Η αλληλεπίδραση CCL21 /CCR7 αύξησε σημαντικά το κλάσμα των κυττάρων του G

2 /M φάση του κυτταρικού κύκλου, όπως μετριέται με κυτταρομετρία ροής. Σε αντίθεση, CCL21 /CCR7 δεν είχε σημαντική επίδραση στην G

0 /G

1 και S φάσεις. κηλίδα Western και σε πραγματικό χρόνο PCR έδειξε ότι CCL21 /CCR7 απορυθμίζεται σημαντικά έκφραση της κυκλίνης Α, κυκλίνη Β1, και κυκλίνη εξαρτώμενη κινάση 1 (CDK1), τα οποία σχετίζονται με την G

2 /M μετάπτωσης φάσης. Η έκφραση της κυκλίνης D1 και κυκλίνη Ε, οι οποίες σχετίζονται με την G

0 /G

1 και G

1 /S μεταβάσεις, δεν μεταβλήθηκε. Η αλληλεπίδραση CCL21 /CCR7 ενισχύεται σημαντικά φωσφορυλίωση της εξωκυτταρικής κινάσης σήματος ρυθμίζεται (Ρ-ΕΚΚ), αλλά όχι Akt, όπως μετράται με κηλίδα Western. LY294002, ένας εκλεκτικός αναστολέας της ΡΙ3Κ που εμποδίζει την ενεργοποίηση του Akt κατάντη, δεν εξασθενήσει τη δράση των CCL21 /CCR7 επί P-ΕΚΚ. Συνανοσοκατακρήμνιση επιβεβαιώθηκε περαιτέρω ότι υπήρχε μια αλληλεπίδραση μεταξύ Ρ-ERK και κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1, ή CDK1, ιδιαίτερα παρουσία του CCL21. CCR7 μικρό παρεμβαλλόμενο RNA ή PD98059, ένας εκλεκτικός αναστολέας της ΜΕΚ που διαταράσσει την ενεργοποίηση των κατάντη ERK, κατάργησε σημαντικά τις επιδράσεις των εξωγενών CCL21. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι CCL21 /CCR7 συμβάλλει στην εξαρτώμενη από τον χρόνο τον πολλαπλασιασμό ανθρώπινων κυττάρων NSCLC με προς τα πάνω ρύθμιση κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1, και CDK1 ενδεχομένως μέσω της οδού ERK

Παράθεση:. Xu Y, Liu L, Qiu X , Jiang L, Huang Β, Li H, et al. (2011) CCL21 /CCR7 Προωθεί G

2 /M φάση Πρόοδος μέσω της ERK Διαδρομή στην Ανθρώπινη μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα. PLoS ONE 6 (6): e21119. doi: 10.1371 /journal.pone.0021119

Επιμέλεια: Λιν Ζανγκ, University of Pennsylvania, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7η Μαΐου του 2011? Αποδεκτές: 19η Μάη 2011? Δημοσιεύθηκε: 16, Ιουν, 2011

Copyright: © 2011 Xu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 30972967) και Ταμείο Έρευνας για τον Διδακτορικό Πρόγραμμα της Τριτοβάθμιας Εκπαίδευσης της Κίνας (Αρ 20092104110018). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

υποδοχέα CC χημειοκίνης 7 (CCR7) εκφράζεται σε όλα τα αφελή Τ-κύτταρα και σε ορισμένες μνήμη Τ-κύτταρα, Β-κύτταρα, και ώριμα δενδριτικά κύτταρα [1]. Κατά την αλληλεπίδραση με τους συνδέτες του, συνδέτη χημειοκίνης 19 (CCL19) ή χημειοκίνη συνδέτη 21 (CCL21) [2], CCR7 συμβάλλει στην κυκλοφορία λεμφοκυττάρων και επανακάμπτοντας σε λεμφαδένες κατά τη διάρκεια ανοσολογικές και φλεγμονώδεις αντιδράσεις [3] – [5]. CCR7 εκφράζεται υψηλά σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), καρκίνου του μαστού, και πλακώδες καρκίνωμα της κεφαλής και του λαιμού και είναι υπεύθυνη για διαμεσολάβηση μετάσταση σε ορισμένες γραμμές καρκινικών κυττάρων [6] – [15]. Μέχρι σήμερα, ο ρόλος του CCR7 στον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων κυττάρων NSCLC δεν έχει διευκρινισθεί.

Η ενεργοποίηση του CCR7 μπορεί να αυξήσει φωσφορυλίωση εξωκυτταρικό σήμα κινάση ρυθμιζόμενη (Ρ-ΕΚΚ) ή Akt (Ρ-Akt) μέσω Gi πρωτεΐνες για να ενισχύσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ή της επιβίωσης [16] – [20]. ERK ανήκει στην οικογένεια που ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ), η οποία περιλαμβάνει επίσης c-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK) και ρ38. Ο καταρράκτης ERK, ενεργοποιούνται από μιτογόνα ερεθίσματα, είναι κρίσιμη για την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό [21], [22] και απαιτείται για την κανονική πρόοδο στη μίτωση [23], [24]. Οι οδοί JNK και ρ38 ενεργοποιείται σε απόκριση σε χημικές ουσίες και το περιβαλλοντικό στρες [25] – [27]. Akt (επίσης γνωστή ως Akt1), ένας μεσολαβητής της ανάπτυξης επιβίωσης παράγοντα που επάγεται κυττάρου [28] – [30]., Μπορεί να προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω φωσφορυλίωσης [31]

Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να εξεταστεί η αποτέλεσμα και ρυθμιστικού μηχανισμού της αλληλεπίδρασης CCL21 /CCR7 στον πολλαπλασιασμό των Α549 και ΝΟΙ-Η460 (Η460) ανθρώπινα κύτταρα NSCLC. Εδώ, αποδείξαμε ότι CCL21 /CCR7 συνέβαλαν στην εξαρτώμενη από τον χρόνο τον πολλαπλασιασμό ανθρώπινων κυττάρων NSCLC με προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης της κυκλίνης Α, κυκλίνη Β1, και CDK1 μέσω της οδού ERK. Πληροφορίες συγκέντρωσε από αυτή τη μελέτη δανείζει διορατικότητα στους μηχανισμούς επιβίωσης των CCR7 μεσολάβηση καρκινικά κύτταρα και έχει επιπτώσεις για τους στόχους της θεραπείας με NSCLC.

Αποτελέσματα

CCL21 /CCR7 προάγει τον πολλαπλασιασμό των Α549 και Η460 κύτταρα . Σε προηγούμενη μελέτη, αναγνωρίσαμε ένα υψηλότερο επίπεδο έκφρασης CCR7 σε Α549 και ανθρώπινες κυτταρικές σειρές NSCLC Η460 σε σύγκριση με άλλες κυτταρικές γραμμές [32]. Για να ερευνηθεί ο ρόλος του CCR7 στη λειτουργία των Α549 και Η460 κύτταρα, η ενεργοποίηση και αναστολή CCR7 προκλήθηκαν με εξωγενή CCL21 και με CCR7 μικρά RNA παρεμβολής (siRNA), αντίστοιχα. Μετά την επιμόλυνση με CCR7 siRNA (siCCR7) ή ελέγχου siRNA, η έκφραση του CCR7 αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας Western blot και ανάστροφης μεταγραφάσης (RT) -PCR. Βρήκαμε ότι siCCR7 μειωτικά σημαντικά τα επίπεδα της πρωτεΐνης και του mRNA του CCR7, σε σύγκριση με τον έλεγχο siRNA (Σχήμα 1).

Α549 (Α) και Η460 κύτταρα (Β) επιμολύνθηκαν με έλεγχο siRNA ή CCR7 siRNA (siCCR7) . Μετά την επιμόλυνση, η έκφραση της πρωτεΐνης CCR7 (α) και mRNA (β) αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας στύπωμα Western (α) και RT-PCR (β) και συγκριτικά με μη διαμολυσμένους Α549 ή Η460 κύτταρα. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. * Ρ & lt?. 0,05, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου

Η

Για να προσδιοριστεί η επίδραση της CCL21 /CCR7 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, η δοκιμασία CCK-8 εκτελέστηκε σε Α549 και Η460 κύτταρα. Σύμφωνα με τα δημοσιευμένα στοιχεία [33], [34] και τα αποτελέσματα της προκαταρκτικό πείραμα μας, στα 100 ng /συγκεντρώσεις mL CCL21 προωθηθεί σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, σε σύγκριση με συγκεντρώσεις 50 ng /mL, ενώ δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ 100 ng /mL και 200 ​​ng /mL συγκεντρώσεις (Σχήμα 2). Ως εκ τούτου, στα 100 ng /mL συγκεντρώσεις CCL21 χρησιμοποιήθηκε στο ακόλουθο πείραμα. Η αλληλεπίδραση CCL21 /CCR7 προωθηθεί σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ενώ siCCR7 κατήργησε σημαντικά την δράση του CCL21 (Σχήμα 3). siCCR7 μόνη δεν είχε καμία σημαντική επίδραση επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ όλων χρονικό σημείο που εξετάστηκε (όλα τα P & lt? 0.01), υποδεικνύοντας μια γραμμική αύξηση του πολλαπλασιασμού με αυξανόμενους χρόνους έκθεσης σε CCL21 (όλα τα P & lt? 0,01).

Α549 (Α) και Η460 (Β) κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CCL21 (50, 100 ή 200 ng /mL) για 24, 48, ή 72 ώρες, και η ζωτικότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό CCK-8. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. ** Ρ & lt?. 0,01, σε σύγκριση με τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με CCL21 (50 ng /mL)

Η

Α549 (Α) και τα κύτταρα Η460 (Β) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CCL21 (100 ng /mL) για 24 , 48, ή 72 ώρες, και η ζωτικότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό CCK-8. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. ** P & lt?. 0.01, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου

Η

CCL21 /CCR7 αυξάνει το ποσοστό των κυττάρων σε G

2 /M. Για να επαληθευθεί αν η δράση του CCL21 /CCR7 στον πολλαπλασιασμό των Α549 και Η460 κύτταρα συνδέεται με μια αλλαγή στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου, την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου διεξήχθη χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Η αλληλεπίδραση CCL21 /CCR7 ενίσχυσε σημαντικά την αναλογία των κυττάρων στο G

2 /M φάση, ενώ δεν υπήρξε σημαντική επίδραση αυτής της αλληλεπίδρασης από την αναλογία των κυττάρων σε G

0 /G

1 ή την S φάση, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Πίνακας 1). siCCR7 καταργηθεί σημαντικά αυτό το αποτέλεσμα της CCL21, ενώ μόνος siCCR7 δεν είχε σημαντική επίδραση στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου.

Η

CCL21 /CCR7 απορυθμίζει την έκφραση της κυκλίνης Α, κυκλίνη Β1, και CDK1. Για τον προσδιορισμό της πιθανός μηχανισμός με τον οποίο CCL21 /CCR7 επηρεάζει το G

2 /M διανομή φάσης σε Α549 και Η460 κύτταρα, την έκφραση της κυκλίνες και εξαρτώμενη κινάση 1 (CDK1) αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας στύπωμα Western και σε πραγματικό χρόνο PCR . Σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου, η αλληλεπίδραση CCL21 /CCR7 ρυθμίζεται αυξητικά σημαντικά την πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA του κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1, και CDK1, οι οποίες σχετίζονται με G

2 /M εξέλιξη φάσεως (Σχήμα 4). siCCR7 καταργηθεί σημαντικά τις επιπτώσεις της CCL21, ενώ μόνος siCCR7 δεν είχε σημαντική επίδραση στην κυκλίνη ή CDK1 έκφρασης. CCL21 δεν είχε σημαντική επίδραση στα επίπεδα της κυκλίνης D1 ή την κυκλίνη Ε, οι οποίες σχετίζονται με G

0 /G

1 και το G

1 /S μετάβαση.

Α549 (Α ) και κύτταρα Η460 (β) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CCL21 (100 ng /mL) για 24 ώρες, και η πρωτεΐνη (α) και mRNA (β) τα επίπεδα των κυκλινών α, Β1, D1, και Ε και των CDK1 εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας Western blot (α) και πραγματικού χρόνου PCR (β). Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. * P & lt? 0,05 ή ** p & lt?. 0.01, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου

Η

CCL21 /CCR7 απορυθμίζει την έκφραση της Ρ-ΕΚΚ, αλλά δεν P-Akt. Άλλοι έχουν αναφέρει ότι CCR7 μπορεί να αυξήσει τη φωσφορυλίωση της ERK, JNK, ή Akt, οι οποίες σχετίζονται με την κυτταρική επιβίωση [16] – [20], [33], [35] – [42]. Για να επαληθευθεί αν η αλληλεπίδραση CCL21 /CCR7 μπορεί επίσης να ενισχύσει την έκφραση των μελών της οικογένειας ΜΑΡΚ και Akt σε Α549 και Η460 κύτταρα, η έκφραση αυτών των συστατικών αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας κηλίδα Western. Η αλληλεπίδραση CCL21 /CCR7 ρυθμίζεται αυξητικά σημαντικά την έκφραση της Ρ-ERK σε 24 ώρες και 48 ώρες, ενώ δεν υπήρξε σημαντική επίδραση επί της έκφρασης της ERK (Εικόνα 5). CCL21 /CCR7 δεν είχε σημαντική επίδραση στην έκφραση ή φωσφορυλίωση της JNK, ρ38, ή Akt. Επειδή Akt είναι πιθανόν ανάντη της ERK [43], Α549 και Η460 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CCL21 για 24 ώρες μετά από την έκθεση 1 ώρας σε LY294002, ένας εκλεκτικός αναστολέας της ΡΙ3Κ που αναστέλλει την ενεργοποίηση του κατάντη Akt μονοπάτι. Μετά από αυτή τη θεραπεία, CCL21 /CCR7 ακόμη ρυθμίζεται αυξητικά σημαντικά την έκφραση του Ρ-ΕΚΚ (Εικόνα 6).

Α549 (Α) και τα κύτταρα Η460 (Β) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CCL21 (100 ng /mL) για 12, 24, ή 48 ώρες, και φυσιολογικά και φωσφορυλιωμένη επίπεδα έκφρασης (Α-) εκτιμήθηκαν με στύπωμα Western. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. * Ρ & lt? 0,05 ή ** ρ & lt?. 0,01, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου

Η

Α549 (Α) και τα κύτταρα Η460 (Β) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CCL21 (100 ng /mL) για 24 ώρες μετά LY294002 , ένας εκλεκτικός αναστολέας της ΡΙ3Κ που κατά συνέπεια εμποδίζει την ενεργοποίηση του κατάντη Akt, εφαρμόσθηκε για 1 ώρα. Η έκφραση της Ρ-ERK εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας Western blot. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. ** P & lt?. 0.01, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου

Η

Η αναστολή των P-ΕΚΚ καταργεί τις ωστική επιπτώσεις της CCL21 /CCR7 στον πολλαπλασιασμό και G

2 /M εξέλιξη φάση. Για να επαληθευθεί αν PD98059, ένας εκλεκτικός αναστολέας της ΜΕΚ που διαταράσσει την ενεργοποίηση του κατάντη ERK, μπορεί να καταργήσει τις επιδράσεις της CCL21 /CCR7 επί του πολλαπλασιασμού και G

2 /M φάση εξέλιξης της Α549 και Η460 κύτταρα, η βιωσιμότητα των κυττάρων και την κατανομή του κυτταρικού κύκλου δοκιμασίες διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας CCK-8 και κυτταρομετρία ροής, αντίστοιχα. PD98059 κατήργησε σημαντικά τις επιπτώσεις της CCL21 /CCR7 επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και η

2 /M φάση εξέλιξης G (Σχήμα 7 και Πίνακα 2, αντίστοιχα). PD98059 κατάργησε επίσης την επίδραση της CCL21 /CCR7 στην έκφραση της Ρ-ΕΚΚ, κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1, και CDK1 (Σχήμα 8). Επιπλέον, PD98059 μόνος είχε σημαντική ανασταλτική δράση επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, ο G

2 /M εξέλιξη φάση και η έκφραση της Ρ-ΕΚΚ, κυκλίνη Α και κυκλίνη Β1 (Σχήμα 7, Πίνακας 2 και το Σχήμα 8, αντίστοιχα).

Α549 (α) και τα κύτταρα Η460 (Β) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CCL21 (100 ng /mL) για 24, 48, ή 72 ώρες μετά PD98059, ένας εκλεκτικός αναστολέας της ΜΕΚ που διαταράσσει την ενεργοποίηση του κατάντη ERK, εφαρμόσθηκε για 1 ώρα. ζωτικότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό CCK-8. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. * Ρ & lt? 0,05 ή ** ρ & lt?. 0,01, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου

Η

Α549 (Α) και τα κύτταρα Η460 (Β) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CCL21 (100 ng /mL) για 24 ώρες μετά PD98059 , ένας εκλεκτικός αναστολέας της ΜΕΚ που διαταράσσει την ενεργοποίηση του κατάντη ERK, εφαρμόσθηκε για 1 ώρα. Τα επίπεδα έκφρασης αυτών των συστατικών εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας Western blot. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. * P & lt? 0,05 ή ** p & lt?. 0.01, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου

Η

P-ΕΚΚ, που προκαλείται από CCL21 /CCR7, αλληλεπιδρά με κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1, και CDK1. Να προσδιορίσει περαιτέρω εάν υπάρχει μια αλληλεπίδραση μεταξύ P-ΕΚΚ και κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1, ή CDK1, Συνανοσοκατακρήμνιση εκτελέστηκε. Α549 και Η460 κυττάρων απουσία ή παρουσία CCL21 για 24 ώρες υποβλήθηκαν σε ανοσοκαταβύθιση με αντισώματα έναντι Ρ-ERK ή IgG, ακολουθούμενη από κηλίδωση Western για κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1, και CDK1. Μία έντονη, ειδική αλληλεπίδραση μεταξύ Ρ-ERK και κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1, ή CDK1 παρατηρήθηκε, ειδικά όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CCL21 για 24 ώρες (Σχήμα 9α). Η αμοιβαία ανοσοκαθίζηση με αντισώματα έναντι κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1, CDK1, ή IgG εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western για Ρ-ERK, και πάλι, η αλληλεπίδραση μεταξύ Ρ-ERK και κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1, ή CDK1 ήταν εμφανή, ειδικά με την παρουσία του CCL21 (Σχήμα 9b). Α549 και Η460 κυττάρων απουσία ή παρουσία PD98059 επί 1 ώρα υποβλήθηκαν σε ανοσοκαθίζηση με αντισώματα έναντι Ρ-ERK ή IgG, ακολουθούμενη από κηλίδωση Western για κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1, και CDK1. Η αλληλεπίδραση μεταξύ Ρ-ERK και κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1, ή CDK1 αποδυναμώθηκε σε απόκριση σε έκθεση PD98059 (Σχήμα 9c).

Α549 (Α) και Η460 (Β) κυττάρων απουσία ή παρουσία CCL21 (100 ng /mL) για 24 ώρες υποβλήθηκαν σε ανοσοκαταβύθιση με αντισώματα έναντι Ρ-ERK ή IgG, ακολουθούμενη από κηλίδωση Western για κυκλίνη α, κυκλίνη Β1, και CDK1 (α). Η αμοιβαία ανοσοκαθίζηση με αντισώματα έναντι κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1, CDK1, ή IgG αναλύθηκαν με κηλίδωση Western για την P-ΕΚΚ (β). Α549 και Η460 κυττάρων απουσία ή παρουσία PD98059 επί 1 ώρα υποβλήθηκαν σε ανοσοκαθίζηση με Ρ-ERK ή IgG αντισώματα ακολουθούμενη από Western blotting για κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1, και CDK1 (γ).

Η

Συζήτηση

Αρκετές μελέτες έχουν τεκμηριώσει ότι η ενεργοποίηση του CCR7 είναι υπεύθυνη για διαμεσολάβηση επιβίωση ορισμένων κυτταρικών γραμμών καρκίνου μέσω της προώθησης μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό ή με αναστολή απόπτωσης [33], [35] – [42]. Ωστόσο, ο ρόλος του CCR7 στον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων κυττάρων NSCLC δεν έχει τεκμηριωθεί καλά. Στην παρούσα μελέτη, επιβεβαιώσαμε ότι η αλληλεπίδραση CCL21 /CCR7 μπορεί να ενισχύσει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό ανθρώπινων NSCLC κυττάρου σε έναν χρονο-εξαρτώμενο τρόπο, που περιλαμβάνει την προς τα πάνω ρύθμιση του κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1, και CDK1, ενδεχομένως μέσω της ERK, αλλά όχι το Akt, μονοπάτι.

Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες που χρησιμοποιούν διαφορετικά μοντέλα κυττάρου [16], [37], [40], η ενεργοποίηση του CCR7 με CCL21 προωθείται πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Σε αντίθεση με τα τρέχοντα ευρήματα μας, μια προηγούμενη μελέτη προτείνει ότι μυϊκό CCL21 δεν είχε σημαντική δράση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Α549 [44]. Μια πιθανή εξήγηση για την ασυμφωνία είναι ότι CCL21 ποντίκι μπορεί να αλληλεπιδράσει με CXCR3 αλλά όχι CCR7, ενώ το ανθρώπινο CCL21 μπορεί να δεσμεύσει CCR7 αλλά όχι CXCR3 [45]. Αυτό υποδηλώνει ότι η ενεργοποίηση του CXCR3 δεν επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Α549

Παραδοσιακά, ο κυτταρικός κύκλος είναι χωρισμένη σε τέσσερις φάσεις:. Η αντιγραφή του DNA λαμβάνει χώρα κατά τη διάρκεια της φάσης S, και το χρωμόσωμα διαχωρισμός λαμβάνει χώρα κατά τη διάρκεια της φάσης Μ. Οι φάσεις S και Μ διαχωρίστηκαν με τις λεγόμενες φάσεις κενό, G1 (πριν από την αντιγραφή του DNA) και G2 (πριν μίτωση). Έχουμε αποδείξει ότι CCL21 /CCR7 σημαντικά μεταβληθεί κατανομή του κυτταρικού κύκλου, έτσι ώστε περισσότερα κύτταρα που κατοικείται το G

2 /M φάση. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές όσον αφορά την κατανομή των κυττάρων στο G

0 /G

1 και φάσεις S.

Το κυτταρικό κύκλο ρυθμίζεται από κυκλίνες και CDKs. Οι κυκλίνες τύπου D θεωρούνται ως βασικοί ρυθμιστές του G

1 εξέλιξη [46]. Κυκλίνης E απαιτείται για την G

1 /S μετάβαση [47], [48] και κυκλίνη Α είναι απαραίτητη για την εξέλιξη μέσω της S φάσης [49], [50]. Τόσο η κυκλίνη Α και οι κυκλίνες Β-τύπου συνδέουν με CDK1 για την προώθηση της έναρξης μίτωσης [51], [52]. Σε αυτή τη μελέτη, και οι δύο πρωτεΐνες και τα επίπεδα του mRNA της κυκλίνης Α, κυκλίνη Β1, και CDK1 έγιναν αυξητικά σημαντικά όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CCL21 για 24 ώρες. Αυτό δείχνει ότι CCL21 /CCR7 επιταχύνει την G εξέλιξη

2 /M φάση για την προώθηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στην κυκλίνη D1 ή τα επίπεδα έκφρασης της κυκλίνης Ε μετρήθηκαν, υποδεικνύοντας ότι CCL21 /CCR7 δεν έχει σημαντική επίδραση στην G

0 /G

1 φάση ή το G μετάβαση

1 /S. Αυτό το εύρημα καταδεικνύει για πρώτη φορά ότι CCL21 /CCR7 έχει ωθητική επίδραση στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου που αφορούν την G

2 /M φάση.

Αρκετές μελέτες χρησιμοποιώντας άλλους τύπους κυττάρων έχουν δείξει ότι η ενεργοποίηση των CCR7 σχετίζεται με ενισχυμένη κυτταρική επιβίωση μέσω της αυξημένης φωσφορυλίωσης της ERK, JNK, ή Akt [16] – [20], [33], [35] – [42]. Εξετάσαμε αν CCL21 /CCR7 μπορεί να ενισχύσει την έκφραση των συστατικών ΜΑΡΚ και Akt σε Α549 και Η460 κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας πρότεινε ότι CCL21 /CCR7 ενισχυμένη τη φωσφορυλίωση της ERK αλλά όχι JNK, ρ38, ή Akt. Τα ευρήματα αυτά έρχονται σε αντίθεση με παλαιότερα δημοσιευμένες εκθέσεις που πρότεινε μια διευκολυντική επίδραση της CCR7 στο Akt, αλλά δεν ΕΚΚ, οδός [16], [19]. Μια ξεχωριστή μελέτη έδειξε ότι Akt είναι πιθανόν ανάντη της ERK [43]. Βρήκαμε ότι CCL21 /CCR7 ακόμη θα μπορούσε να ρυθμίζει προς τα πάνω σημαντικά την έκφραση του Ρ-ERK μετά τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με LY294002 για 1 ώρα. Επειδή LY294002 αναστέλλει εκλεκτικά ΡΙ3Κ για την πρόληψη κατάντη ενεργοποίηση της Akt, τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν έντονα ότι Akt δεν παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην αλληλεπίδραση μεταξύ CCL21 /CCR7 και ERK. Αυτό είναι σε συμφωνία με μια προηγούμενη αναφορά [53]. Ο λόγος για αυτές τις διαφορές παραμένει ασαφής.

Από CCL21 /CCR7 ήταν ικανή να αυξήσει την έκφραση της Ρ-ΕΚΚ, επιδιώξαμε να προσδιοριστεί εάν υπάρχει μια αλληλεπίδραση μεταξύ Ρ-ERK και κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1, ή CDK1. Συνανοσοκατακρήμνιση και αμοιβαία αποτελέσματα ανοσοκαθίζησης υποδηλώνουν έντονα μία αλληλεπίδραση μεταξύ P-ΕΚΚ και κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1, ή CDK1, ειδικά με την παρουσία του CCL21. Αυτή η αλληλεπίδραση θα μπορούσε να αποδυναμωθεί με την αναστολή της ERK με PD98059. Επιπλέον, PD98059 κατάργησε την επίδραση του CCL21 /CCR7 επί Α549 και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Η460 και G

2 /M φάση εξέλιξης, καθώς και προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης της Ρ-ΕΚΚ, κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1, και CDK1. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι η επίδραση της CCL21 /CCR7 επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και αυξορρύθμιση του κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1, και CDK1 μπορεί να συμβεί μέσω της οδού ERK σε ανθρώπινα κύτταρα NSCLC.

Αυτή η μελέτη προτείνει ότι η ενεργοποίηση του CCR7 με CCL21 μπορεί να προωθήσει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NSCLC σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο περιλαμβάνουν κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1, και CDK1, ενδεχομένως μέσω της ERK, αλλά όχι το Akt, μονοπάτι. Αυτή η πληροφορία μπορεί να βοηθήσει στην αποσαφήνιση των μηχανισμών της επιβίωσης των κυττάρων του καρκίνου και τον εντοπισμό πιθανών στόχων για τη θεραπεία του NSCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικής καλλιέργειας και αντιδραστηρίων

Α549 και Η460 κυτταρικές σειρές από την προηγούμενη δημοσιευμένη εργασία μας [32] καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 ή DMEM-F12 συμπληρωμένου με 10% ορό HyClone εμβρύου βοός (FBS) (ThermoFisher Scientific, Fremont, CA, USA) σε μια ατμόσφαιρα 5% CO

2 στους 37 ° C. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 75 cm

2 φιάλες καλλιέργειας και συλλέχθηκαν σε ένα διάλυμα τρυψίνης-ΕϋΤΑ στη λογαριθμική φάση ανάπτυξης.

Η κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1, κυκλίνη D1, κυκλίνη Ε, CDK1, Ρ-ΕΚΚ , ΕΚΚ, Ρ-ΙΝΚ, JNK, Ρ-ρ38, ρ38, P-Ακί, Akt, IgG, και μονοκλωνικά αντισώματα ποντικού ή κουνελιού β-ακτίνης αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Ανασυνδυασμένη ανθρώπινη CCL21 αγοράστηκε από ΡβρίΌ Tech (Rocky Hill, NJ, USA). siCCR7 και Lipofectamine 2000 αγοράσθηκαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Κυττάρων Μετρώντας Kit-8 (CCK-8) αγοράστηκε από Dojindo Laboratories (Πεκίνο, Κίνα). PD98059 και LY294002 ελήφθησαν από τη Sigma (St. Louis, ΜΟ, USA) και χρησιμοποιήθηκε σε 50 μΜ ή 100 μΜ (τελικές συγκεντρώσεις), αντίστοιχα, σύμφωνα με τις προηγούμενες αναφορές [40], [54]. Πρωτεΐνης /G χάντρες Ένα ελήφθησαν από Beyotime (Haimen, Κίνα).

θεραπεία siRNA των κυττάρων

Α549 και Η460 κύτταρα τοποθετήθηκαν πάνω σε 6 εκατοστά

2 πιάτα κυτταρικής καλλιέργειας και αναπτύχθηκαν σε 30-50% συρροή πριν από την επιμόλυνση με Λιποφεκταμίνη 2000, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [55]. Η αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Η βελτίωση της αποτελεσματικότητας των siCCR7 και μη φίμωση siRNA έλεγχο εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας Western blot και RT-PCR. Οι αλληλουχίες των siCCR7 και ελέγχου siRNA ήταν: CCR7, 5′-GCGUCAACCCUUUCUUGUATT-3 ‘και 3′-UACAAGAAAGGGUUGACGCAG-5′? ελέγχου, 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘και 3′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-5’.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Οι κυτταρικές πολλαπλασιαστικές δραστηριότητες εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας CCK-8. Α549 και Η460 κύτταρα σπάρθηκαν επί πλακών 96 φρεατίων (1000 κύτταρα /φρεάτιο) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με CCL21 για 0, 24, 48, ή 72 ώρες. Μετά τη θεραπεία, CCK-8 προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και επωάστηκαν για 4 ώρες στους 37 ° C. Η τιμή οπτικής πυκνότητας (OD) του κάθε φρεάτιο μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών (Spectra Θέρμο, Männedorf, Ελβετία) με ένα τεστ μήκος κύματος 450 nm.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Μετά την κατεργασία με CCL21 για 24 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό ισοτονικό ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού (PBS) και σταθεροποιήθηκαν σε 75% αιθανόλη για 2 ώρες στους 4 ° C. Τα σταθεροποιημένα κύτταρα εκπλύθηκαν δύο φορές με 500 μι ψυχρού PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια βάφτηκαν με 500 μι διαλύματος χρώση με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) (50 μg /mL ΡΙ, 0.1% Triton Χ-100, 200 μg /mL άνευ ϋΝάσης RNase σε PBS) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Δέκα χιλιάδες γεγονότα ανά δείγμα αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας FACS-scan κυτταρόμετρο ροής (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA), και το ποσοστό των κυττάρων σε G

0 /G

1, S και G

2 /M φάσεις του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ΜΟϋΡΙΤ LT 3.0 (Becton-Dickinson).

Western ανάλυση κηλίδος

Μετά την επεξεργασία με CCL21 για 24 ώρες, τα κύτταρα εκχυλίζονται με λύσης ρυθμιστικού (150 mM NaCl, 1% ΝΡ-40, 0.1% SDS, 2 μg /mL απροτινίνη και 1 mM PMSF) για 30 λεπτά στους 4 ° C. Τα εκχυλίσματα φυγοκεντρήθηκαν στις 12,000 χ

g

για 15 λεπτά στους 4 ° C. Υπερκείμενα που περιέχουν ολική πρωτεΐνη στη συνέχεια συλλέχθηκαν. Κλάσματα, που το καθένα περιέχει πρωτεΐνη 50 μg, διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF στα 55 V (κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1, P-Ακί, Akt) ή 40 V (οι άλλοι) για 2.5 ώρες σε χαμηλή θερμοκρασία . Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα για 2 ώρες, και οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων κατά 1:1000 (Ρ-ΙΝΚ, JNK, Ρ-ρ38, ρ38 και β-ακτίνη) ή 1:200 (οι άλλοι) αραίωση όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Οι πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού IgG συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας (HRP) σε αραίωση 1:6000 ή 1:8000 για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, αντίστοιχα. Συγκροτήματα απεικονίστηκαν με ένα σύστημα EC3 Imaging (UVP LLC, ορεινές, CA, USA), και η OD μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ImageJ (ΝΙΗ, Bethesda, MD, USA). Η διαφορά μεταξύ OD δοκιμαστεί πρωτεϊνών και β-ακτίνης του ίδιου δείγματος υπολογίστηκε ως σχετική περιεκτικότητα και εκφράζεται γραφικά.

RT-PCR και PCR πραγματικού χρόνου

Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Για τον προσδιορισμό των αποδόσεων των siCCR7 και τον έλεγχο siRNA, ημι-ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα G-STORM θερμικό ανακυκλωτή (GRI Ltd, Byfleet, UK) χρησιμοποιώντας το TAKARA RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0 (Takara, Dalian, Κίνα). Εκκινητές PCR είχαν ως εξής: CCR7 F: 5′-GAGGCTATTGTCCCCTAAACC-3 ‘, R: 5′-TGGAGGACAGTGAAGAAAACG-3’. Το μήκος CCR7 amplicon ήταν 305 bp. β-ακτίνης F: 5′-AAATCGTGCGTGACATTAA-3 ‘, R: 5′-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3’. Η β-ακτίνης μήκους amplicon ήταν 513 bp. Οι συνθήκες των κύκλων θερμότητας ήταν ως ακολούθως: 30 κύκλοι των 40 s το καθένα, συμπεριλαμβανομένων μετουσίωση στους 95 ° C, ανόπτηση στους 53 ° C, και επέκταση στους 72 ° C

σε πραγματικό χρόνο PCR πραγματοποιήθηκε σε έναν ΑΒΙ. Prism 7900HT γρήγορο σύστημα (Applied Biosystems, Foster, CA, USA) χρησιμοποιώντας SYBR Προμίγματα Ex Taq ΙΙ (Takara). Πολλαπλασιασμοί διεξήχθηκαν σε ένα συνολικό όγκο 20 μL και ανακυκλώθηκε 40 φορές μετά την αρχική αποδιάταξη (95 ° C για 30 s) με τις ακόλουθες παραμέτρους: 95 ° C για 5 s και 60 ° C για 30 s. β-ακτίνης F: 5′-AGCACAGAGCCTCGCCTTTG-3 ‘, R: 5′-ACATGCCGGAGCCGTTGT-3’. Η β-ακτίνης μήκους amplicon ήταν 107 bp. Άλλες αλληλουχίες πράιμερ έχουν δημοσιευθεί σε μια άλλη μελέτη [56]. Η αξιοπιστία των αποτελεσμάτων PCR υποστηρίχθηκε από την ανάλυση της καμπύλης διαχωρισμού. Σε πραγματικό χρόνο τα δεδομένα PCR υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το 2

-ΔΔCT μέθοδο για το πακέτο λογισμικού SDS 2.4 (Applied Biosystems) [57].

Συνανοσοκατακρήμνιση

Μετά τη θεραπεία με CCL21 για 24 ώρες , τα κύτταρα εκχυλίστηκαν με ρυθμιστικό λύσης (10 mM KCl, 1.5 mM MgCl

2, 10 mM HEPES [ρΗ 7,9], 1 mM PMSF, 1 mM DTT) και ομογενοποιείται για 30 λεπτά στους 4 ° C. Τα εκχυλίσματα φυγοκεντρήθηκαν στις 12,000 χ

g

για 15 λεπτά στους 4 ° C, και τα υπερκείμενα που περιέχουν συνολικής πρωτεΐνης συλλέχθηκαν. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης εξετέθησαν σε αντισώματα έναντι Ρ-ΕΚΚ, IgG, κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1, ή CDK1, τα οποία ακινητοποιήθηκαν επί /G σφαιρίδια πρωτεΐνης Α. Μετά από 3 ώρες επώαση στους 4 ° C με ήπια περιστροφή, χάντρες πλύθηκαν εκτεταμένα πέντε φορές με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, βραστά, και μικροφυγοκεντρήθηκαν. Πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με αντισώματα έναντι Ρ-ΕΚΚ, κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1, ή CDK1 με κηλίδα Western.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας SPSS 16.0 λογισμικού. Η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει τις διαφορές μεταξύ των ομάδων με τις διάφορες αγωγές, και η ελάχιστη σημαντική διαφορά (LSD) test ή Dunnett Τ3 χρησιμοποιήθηκε για post hoc ανάλυση υποομάδας. Πολυώνυμο αντίθεση χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των τάσεων. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές για την P & lt? 0,05. Ν-πλάσια τιμές για την έκφραση του γονιδίου αλλάξουν μέχρι και 0,5 και κάτω από 2 ελήφθησαν ως μη σημαντική, σύμφωνα με τις τιμές που λαμβάνονται από αρνητικό γονίδια ελέγχου [57], [58].