Αφηρημένο

Μια σημαντική πρόκληση στην αντιμετώπιση των ασθενών με καρκίνο του προστάτη εντοπισμό των ατόμων που κινδυνεύουν να αναπτύξουν μεταστατική νόσο, όπως στις περισσότερες περιπτώσεις, η ασθένεια θα παραμείνει νωχελικός. Αναλύσαμε ομαδοποιημένα δείγματα ορού από 4 ομάδες των ασθενών (n = 5 δείγματα /ομάδα), που συλλέγονται προοπτικά και ενεργά παρακολουθείται για τουλάχιστον 5 έτη. Οι ασθενείς ομάδες ήταν (i) ιστολογική διάγνωση της καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη χωρίς ενδείξεις καρκίνου »ΒΡΗ», (ii) εντοπισμένο καρκίνο χωρίς ενδείξεις εξέλιξης, «μη προχωρούν» (iii) εντοπισμένο καρκίνο με ενδείξεις των βιοχημικών εξέλιξης, «προχωρούν », και (iv) οστικών μεταστάσεων σε παρουσίαση« μεταστατικός ». Ομαδοποιημένα δείγματα ήταν ανοσο-εξαντλημένο από τα 14 πιο ιδιαίτερα άφθονες πρωτεΐνες και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα 4-plex προσέγγιση iTRAQ. Συνολικά 122 πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν και σχετικά ποσοτικά. Συγκρίσεις προχωρούν

έναντι

μη προχωρούν ομάδες αναγνωρίστηκε το σημαντικό διαφορική έκφραση των 25 πρωτεϊνών (p & lt? 0.001). Συγκρίσεις των μεταστατικών

έναντι

προχωρούν ομάδες αναγνωρίστηκε το σημαντικό διαφορική έκφραση των 23 πρωτεϊνών. Χαρτογράφηση των διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών επί της οδού εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη αποκάλυψε την απορυθμισμένη έκφραση των μεμονωμένων πρωτεϊνών, ζεύγη πρωτεϊνών και «πάνελ» των πρωτεϊνών που πρέπει να συνδέονται με συγκεκριμένα στάδια ανάπτυξης και εξέλιξης της νόσου. Η διάμεση ανοσοχρώσης ένταση του ευκαρυωτικού παράγοντα μετάφρασης επιμήκυνσης 1 άλφα 1 (eEF1A1), ένας από τους υποψηφίους που προσδιορίζονται, ήταν σημαντικά υψηλότερη σε οστεοβλάστες σε άμεση γειτνίαση με μεταστατικά κύτταρα όγκου σε σύγκριση με οστεοβλάστες σε οστό ελέγχου (ρ = 0,0353, Mann Whitney U). πρωτεομική προσέγγιση μας εντόπισε οδηγεί για δυνητικά χρήσιμα βιοδείκτες ορό που συνδέονται με τη μεταστατική εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Οι πίνακες εντοπίστηκαν, συμπεριλαμβανομένων ένταλμα eEF1A1 περαιτέρω έρευνα και επικύρωση

Παράθεση:. Rehman Ι, Evans CA, Glen Α, Cross SS, Eaton CL, Κάτω J, et al. (2012) iTRAQ Ταυτοποίηση των υποψηφίων ορού Biomarkers συνδεδεμένες με μεταστατική εξέλιξη του ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 7 (2): e30885. doi: 10.1371 /journal.pone.0030885

Επιμέλεια: Karl X. Chai, University of Central Florida, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26 Αύγ, 2011? Αποδεκτές: 27, Δεκεμβρίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 15 Φεβ 2012

Copyright: © 2012 Rehman et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από PROMET (σχέδιο αριθ. FP6-LSH-5-2004-018858), και P-MARK (σύμβαση αριθ. LSHC-CT-2004 – 503011), από το έκτο πρόγραμμα πλαίσιο της ΕΕ και η προτροπή NCRI (προστάτη καρκίνο Μηχανισμοί της εξέλιξης και θεραπεία) συνεργατική επιχορήγηση Δρ Hamdy και επιχορηγήσεις από Μηχανικών και Φυσικών Επιστημών Έρευνας (EPSRC) με τον Δρ Ράιτ: EP /E036252 /1 και GR /S84347 /01. Είμαστε ευγνώμονες στον Δρ Νίκολας Hoyle σε Roche Diagnostics, Penzberg, Γερμανία για την υποστήριξή του προς την αναλώσιμων και αντιδραστηρίων για το έργο. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Είμαστε ευγνώμονες στον Δρ Νίκολας Hoyle σε Roche Diagnostics, Penzberg, Γερμανία για την υποστήριξή του προς αναλώσιμων και αντιδραστηρίων για το έργο. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Στην Ευρώπη και τις ΗΠΑ, ο καρκίνος του προστάτη είναι η δεύτερη πιο κοινή διάγνωση του καρκίνου και η τρίτη συνηθέστερη αιτία θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με άνδρες [1], [2]. Επιπλέον, η συχνότητα έχει αυξηθεί, δεδομένου ότι η γενίκευση του ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA) [3]. Οι περισσότεροι ασθενείς με καρκίνο του προστάτη διαγιγνώσκονται σε πρώιμο στάδιο, αλλά ακόμη και με διαλογή πάνω από 7% των περιπτώσεων αναπτύσσουν μεταστατική νόσο [4]. Σε άνδρες με μακρινή μετάσταση η πρόγνωση είναι κακή, με μέσο όρο επιβίωσης των 24 έως 48 μηνών. Το οστό είναι η πλέον κοινή θέση για μετάσταση καρκίνου του προστάτη και σχετίζεται με τον πόνο των οστών, συμπίεση του νωτιαίου μυελού και βλάβη του μυελού [4]. Επί του παρόντος, οστό μεταστατικές αλλοιώσεις που καθορίζεται από απεικόνισης όπως η σάρωση των οστών ισότοπο, ωστόσο, η αναγνώριση ενός βασίζεται βιοδεικτών (ες) στον ορό για την πρόβλεψη της ευαισθησίας των ασθενών να αναπτύξουν μετάσταση στα οστά θα μπορούσε να επιτρέψει μια πιο ακριβή κλινική εκτίμηση του οδηγού νόσου και να βοηθήσει θεραπεία.

Η διάγνωση του καρκίνου του προστάτη είναι πιο συχνά από μια τριάδα ορού του ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA) μετρήσεων, δακτυλική εξέταση (DRE), και ιστολογική εκτίμηση του transrectal υπερήχων (TRUS) καθοδηγούμενη βιοψία υλικό [ ,,,0],5]. Παρά το γεγονός ότι το PSA είναι ένα FDA ενέκρινε βιοδείκτης για την ανίχνευση του καρκίνου του προστάτη, η χρησιμότητά του είναι αμφιλεγόμενη, όπως έχει αποδειχθεί να είναι αναξιόπιστη για τη διάγνωση της νόσου, και ιδίως για τη διάκριση βραδείας από επιθετικές μορφές της νόσου [6], [7]. Επιπλέον, η PSA συνδέεται με υψηλό βαθμό ψευδώς θετικών και ψευδώς αρνητική δοκιμασία, καθώς τα επίπεδα μπορεί να είναι αυξημένα σε μη καρκινικό συνθήκες του προστάτη, συμπεριλαμβανομένης καλοήθους προστατικής υπερπλασίας (ΒΡΗ). Έτσι, επιπλέον βιοδείκτες χρειάζονται επειγόντως η οποία θα μπορούσε να βελτιώσει την διαγνωστική ειδικότητα του PSA και να προβλέψει την πιθανότητα εξέλιξης της νόσου.

Το αίμα και τα προϊόντα της, όπως το πλάσμα και ο ορός είναι ιδανικά ρευστά για την ταυτοποίηση των βιοδεικτών του καρκίνου, δεδομένου ότι περιέχουν πρωτεΐνες τόσο εκκρινόμενες και αποβάλλεται από τα καρκινικά κύτταρα, σε συνδυασμό με την ευκολία της δειγματοληψίας. Ωστόσο, η μεταβλητή σύνθεση και μεγάλο δυναμικό εύρος των πρωτεϊνών που υπάρχουν στο πλάσμα (υπολογίζεται σε 10

10 τάξεις μεγέθους ή μεγαλύτερη), θέτουν τρομερές προκλήσεις για τον προσδιορισμό κλινικά σχετική βιοδείκτες ανάμεσα στο πλαίσιο της άφθονες πρωτεΐνες όπως αλβουμίνη, ανοσοσφαιρίνη και τρανσφερίνης [8]. Από τους 22 ή έτσι πιο άφθονες πρωτεΐνες στο πλάσμα, αυτά αποτελούν περισσότερο από το 99% της μάζας του συνόλου των πρωτεϊνών του πλάσματος, ενώ το υπόλοιπο 1% πιστεύεται ότι αποτελείται από τις πρωτεΐνες χαμηλής μέσης /αφθονία και περιλαμβάνουν την πισίνα βιοδείκτη [9 ]. Οι μεγάλες τάξεις μεγέθους σε συγκέντρωση πρωτεΐνης έχουν παρεμποδίσει τις προηγούμενες προσπάθειες βασίζονται φασματομετρία μάζας για τον εντοπισμό των κλινικά σχετικών βιοδεικτών, κυρίως λόγω της καταστολής του ιονισμού των χαμηλών πρωτεϊνών αφθονία από τα υψηλότερα πρωτεΐνες αφθονία [10]. Πάντως, πριν από την απομάκρυνση μερικών από τα πιο ιδιαίτερα άφθονες πρωτεΐνες έχει δειχθεί ότι βελτιώνουν την ανίχνευση του σχετικά χαμηλότερη άφθονες πρωτεΐνες [11], [12]. Αν και υπάρχουν πολλές διαφορετικές μεθοδολογίες κλασματοποίηση πρωτεϊνών με βάση τις διαφορές στο μοριακό βάρος, το σχήμα, το φορτίο, ρΐ, υδροφοβικότητα και συγγένεια μέσω ειδικών βιομοριακών αλληλεπιδράσεων, έχει αναφερθεί ότι ο διαχωρισμός πρωτεΐνης υψηλής αφθονία χρησιμοποιώντας το αντίσωμα που βασίζεται IgY-12 ανοσοεξάντληση σύστημα είναι ιδιαίτερα αναπαραγώγιμη [13].

Μεταξύ των πρωτεομικής τεχνολογίες που χρησιμοποιούνται για την ταυτοποίηση βιοδείκτη, «ισοβαρικών Ετικέτες για σχετική και η απόλυτη ποσοτικοποίηση» (iTRAQ) έχει τα πλεονεκτήματα του να είναι σχετικά υψηλή απόδοση, και μπορούν ταυτόχρονα να παρέχουν πληροφορίες σχετικά με πεπτίδιο ποσοτικοποίηση και ταυτοποίηση , όπως έχει ήδη αναφερθεί από εμάς και άλλους [14] – [16]. Εν συντομία, σε μια τυπική ροή εργασίας τα δείγματα μειώνονται, αλκυλιωμένα και πρωτεολυτικά πέψη για την παραγωγή πεπτιδίων. Τα πεπτίδια επισημαίνονται με ένα σύνολο αντιδραστηρίων iTRAQ (σε μορφή 4 ή 8-plex), συνενώθηκαν και κλασματοποιήθηκε με ισχυρή ανταλλαγή κατιόντων (SCX). Τα κλάσματα στη συνέχεια αναλύονται με υγρή χρωματογραφία διαδοχικής φασματομετρίας μάζας (LC-MS /MS), με τις προκύπτουσες φάσματα μάζας παροχή πληροφοριών ακολουθίας (από τα πεπτιδικά θραύσματα), και η σχετική ποσοτικοποίηση (από τα ιόντα ομάδα αναφοράς).

σε μια προσπάθεια για την ταυτοποίηση νέων πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη μεταστατική εξέλιξη του ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη, έχουμε πραγματοποιήσει ένα 4-plex ανάλυση iTRAQ χρησιμοποιώντας ομαδοποιημένα δείγματα ορού που συλλέγονται μελλοντικά από 4 σαφώς καθορισμένες ομάδες ασθενών που παρακολουθήθηκαν ενεργά για τουλάχιστον 5 χρόνια, και επιλέγονται για να αντιπροσωπεύουν το φάσμα της προστατικής νόσου. Μετά την ανάλυση των δεδομένων, βρέθηκαν να είναι σημαντικά εκφράζονται διαφορικά σε δείγματα καρκίνου του σε σύγκριση με καλοήθη δείγματα ένας αριθμός υποψηφίων. Ένας από τους υποψηφίους που καθορίσθηκε ως σημαντικά επάνω ρυθμισμένη σε ομάδες καρκίνος ήταν ευκαριωτικού παράγοντα επιμήκυνσης μετάφρασης 1 άλφα 1 (eEF1A1) και ερευνήθηκε περαιτέρω με ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας δείγματα ιστού του προστάτη από εντοπισμένη και μεταστατικό περιπτώσεις. Η βιοδεικτών οδηγεί προσδιορίζονται στη μελέτη μας «ανακάλυψη» φάση, συμπεριλαμβανομένων eEF1A1 συζητούνται σε σχέση με τη σημασία τους για την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και ορό συλλογή

περιφερικού αίματος συλλέχθηκαν προοπτικά από ασθενείς στην κλινική Ουρολογίας στο βασιλικό Νοσοκομείο Hallamshire κατά το χρόνο της αρχικής τους επίσκεψη, μετά από έγγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση. συλλογή δειγμάτων αίματος εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου του Sheffield. Ορός συλλέχθηκε επιτρέποντας στο αίμα να πήξει για 30 λεπτά, φυγοκεντρήθηκε στα 1200 χ g για 10 λεπτά στους 4 ° C και στη συνέχεια αποθηκεύεται στους -80 ° C σε κλάσματα των 100 μΙ. Όλα τα δείγματα αίματος συλλέχθηκαν πριν από τη χορήγηση οποιασδήποτε θεραπείας. Είκοσι δείγματα ορού επιλέχθηκαν προσεκτικά για να αντιπροσωπεύουν τα διάφορα στάδια και βαθμούς της ασθένειας του προστάτη και συνενώθηκαν (n = 5 ασθενείς /ομάδα), για να σχηματίσει 4 ομάδες ασθενών. Όλοι οι ασθενείς παρακολουθήθηκαν ενεργά για τουλάχιστον 5 έτη από τη στιγμή της αρχικής δειγματοληψίας αίμα τους. Οι 4 ομάδες ασθενών ήταν: Ομάδα 1: ιστολογική διάγνωση της καλοήθους προστατικής υπερπλασίας »ΒΡΗ», χωρίς ενδείξεις καρκίνου με τουλάχιστον 2 ανεξάρτητα σύνολα προστάτη βιοψίες, και ένα επίπεδο PSA κάτω από 10 ng /ml (μέση ηλικία 61 ετών) . Ομάδα 2: ιστολογική διάγνωση του καρκίνου του προστάτη με επίπεδα PSA κάτω από 10 ng /ml, και χωρίς ενδείξεις αυξανόμενο PSA μετά από 5 έτη ενεργό παρακολούθηση – «μη προχωρούν» ομάδα, (μέση ηλικία 67 ετών)? Ομάδα 3: ιστολογική διάγνωση κλινικά εντοπισμένο καρκίνο με ένα αρχικό επίπεδο PSA κάτω από 13 ng /ml, ακολουθούμενα από 3 διαδοχικές αυξήσεις στα επίπεδα του PSA κατά τη διάρκεια 5 ετών της ενεργού παρακολούθησης -‘progressing «ομάδας, (μέση ηλικία 69 ετών)? Ομάδα 4: ασθενείς με PSA & gt? 19 ng /ml και τα αποδεικτικά στοιχεία των οστών μετάσταση από ένα θετικό σπινθηρογράφημα οστών ραδιονουκλεοτιδίου – ομάδα «μεταστατικός», (μέση ηλικία 73 ετών). Οι διαφορές στη διάμεση ηλικία των ασθενών διαπιστώθηκε ότι δεν ήταν στατιστικά σημαντική μεταξύ των 4 ομάδων (p = 0,146, Kruskal-Wallis test). Τα χαρακτηριστικά της νόσου από τους 20 ασθενείς που περιλαμβάνει τις 4 ομάδες που παρουσιάζονται στον Πίνακα S1.

υλικό του ασθενούς ιστού

μικροσυστοιχίες ιστών (TMAs), που αποτελείται από 56 περιπτώσεις αδενοκαρκινώματος του προστάτη που κυμαίνονται στο ενιαίο βαθμούς Gleason (δηλ βαθμός 2, n = 5? βαθμού 3, n = 32? βαθμού 4, n = 9? βαθμού 5, n = 10), και 40 περιπτώσεις των παρακείμενων μη κακοήθη ιστό, και κατασκευάστηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [17] , [18]. Ένα επιπλέον 23 περιπτώσεις βιοψιών των οστών από ασθενείς με και χωρίς καρκίνο του προστάτη σκελετική μετάσταση ελήφθησαν με βιοψία οστεοτρύπανο 8 mm γίνεται με γενική αναισθησία. Εν επιγνώσει συναίνεση του ασθενούς και από έγκριση της επιτροπής δεοντολογίας αποκτήθηκε πριν από τη μελέτη (Νότια Σέφιλντ Έρευνας Επιτροπή Ηθικής και Δεοντολογίας, SSREC /02/155 και 00/172).

Οι κυτταρικές σειρές

Ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη κυτταρικές σειρές LNCaP, PC-3, DU145 και vCap αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC), (https://www.lgcstandards-atcc.org/). κύτταρα DuCaP ελήφθησαν μέσω της κοινοπραξίας του έργου PRIMA (https://www.primaproject.org/participants.php). Η LNCaP-Ρτο5, LNCaP-Ln3, PC-3M και PC-3M-LN4 κύτταρα ήταν ένα είδος δώρο από τον Dr. Curtis Pettaway (Πανεπιστήμιο του Τέξας, M.D. Anderson Κέντρο Καρκίνου), [19]. Οι κυτταρικές σειρές LNCaP-C4-2 και LNCaP-C4-2B ελήφθησαν από τον καθηγητή Γιώργο Thalmann [20]. Τα κύτταρα οστεοσαρκώματος ΤΕ-85 ήταν ένα είδος δώρο από τον καθηγητή Ι.Α. Gallagher, Πανεπιστήμιο του Λίβερπουλ. Όλες οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως και επιβεβαιώθηκε ότι είναι απαλλαγμένα από Mycoplasma [15].

IgY-14 εξάντληση συγγένεια των δειγμάτων ορού

Τα συγκεντρωμένα δείγματα ορού είχαν εξαντληθεί από τα 14 πιο κοινών πρωτεϊνών του πλάσματος με τη χρήση της IgY-14 σύστημα εξάντληση Seppro [21]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η συγκέντρωση ορού που ακολουθείται από εξάντληση από τα πιο ιδιαίτερα άφθονες πρωτεΐνες είναι μια αποτελεσματική στρατηγική για τη μείωση του δυναμικού εύρους των πρωτεϊνών, και επομένως να βελτιωθεί η αναγνώριση των βιοδεικτών του ορού, όπως καταδεικνύεται χρησιμοποιώντας την ποσοτική πρωτεομική μέθοδο iTRAQ (R) [ ,,,0],22]. Δείγματα ορού από 5 ασθενείς που αντιπροσωπεύουν κάθε μία από τις 4 ομάδες ασθενών ομαδοποιήθηκαν σε ίσους όγκους για να δώσουν ένα συνολικό όγκο 200 μΐ για κάθε ομάδα (40 μΙ από κάθε δείγμα). Τα συγκεντρωμένα δείγματα ορού απεστάλησαν σε ξηρό πάγο για να Genway (Digilabs Biovision, Γερμανία), για ανοσο-εξάντληση χρησιμοποιώντας το σύστημα Seppro Ig-Y14. Το κλάσμα διερχόμενης ροής (απεμπλουτισμένου της αλβουμίνης, IgG ανοσοσφαιρίνη, ινωδογόνο, τρανσφερίνη, IgA, IgM, απτοσφαιρίνης, α2-macroglobin, α1-όξινη γλυκοπρωτεΐνη, α1-αντιτρυψίνη, Αρο ΑΙ HDL, Αρο Α-ΙΙ HDL, συμπλήρωμα C3 και LDL (ΑροΒ)), χρησιμοποιήθηκε για επακόλουθη ανάλυση iTRAQ.

επισήμανση δείγμα iTRAQ και SCX κλασματοποίηση

Πριν από την ανάλυση iTRAQ, τα δείγματα συμπυκνώθηκαν και το ρυθμιστικό διάλυμα ανταλλάσσεται με χρησιμοποίηση 5 kDa μοριακού βάρους αποκοπής σπιν συγκεντρωτές (Millipore). Τα δείγματα ήταν ρυθμιστικό ανταλλάσσεται τρεις φορές έναντι 500 μΙ 1 Μ triethylammoniumbicarbonate (ΤΕΑΒ) ρυθμιστικό και συμπυκνώθηκε σε όγκο περίπου 80 μΐ. Τα δείγματα σημάνθηκαν με τα αντιδραστήρια iTRAQ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, και όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14], [15]. Κάθε δείγμα σημάνθηκε με ένα από τα τέσσερα αντιδραστήρια iTRAQ (ιόντα ρεπόρτερ iTRAQ του λόγου 114.1, 115.1, 116.1, 117.1 μάζας /φορτίου). Η σειρά επισήμανση ετικέτα ήταν BPH- 117? εντοπισμένη μη προχωρούν καρκίνο-116? πρόοδο του καρκίνου-115? μεταστατική νόσο-114). Τα επισημασμένα δείγματα συνενώθηκαν και κλασματοποιήθηκαν με ισχυρή ανταλλαγή κατιόντων (SCX), χρησιμοποιώντας μία στήλη BioLC HPLC (Dionex, Surrey, UK), και αναλύθηκαν με LC-MS /MS όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14], [15].

φασματομετρία διαδοχική φασματομετρία μάζας ανάλυση

μάζας (MS) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματόμετρο μάζας εν σειρά QStar XL Hybrid ESI Quadrupole χρόνο-πτήσης, ESI-qQ-TOF-MS /MS (Applied Biosystems, Framingham, ΜΑ? MDS-Sciex, Concord, Ontario, Canada), σε συνδυασμό με ένα online τριχοειδές σύστημα υγρής χρωματογραφίας (Famos, Switchos και Ultimate από Dionex /LC Συσκευασίες, Άμστερνταμ, Ολλανδία). Τα αποξηραμένα δείγματα επαναιωρηματοποιήθηκαν σε 60 λίτρα 3% ακετονιτρίλιο και 0.1% μυρμηκικό οξύ έτοιμο προς τον MS, και 10-15 l (ανάλογα με τη συγκέντρωση του πεπτιδίου όπως φαίνεται στην ένταση κορυφής του χρωματογραφήματος SCX) εγχύθηκαν σε νανο- LC-ESI-MS /MS σύστημα για κάθε ανάλυση. Η αρχική διαχωρισμός έγινε σε ΡΕΡΜΑΡ C

18 RP τριχοειδής στήλη (LC Packings) με ένα σταθερό ρυθμό ροής 0,3 l /min. LC ρυθμιστικά Α και Β παρασκευάστηκαν ως 3% ακετονιτρίλιο, 0.1% μυρμηκικό οξύ και 97% ακετονιτρίλιο, 0.1% μυρμηκικό οξύ, αντίστοιχα. Η βαθμίδα ξεκίνησε ως 97% ρυθμιστικό διάλυμα Α και 3% ρυθμιστικό Β για 3 λεπτά, ακολουθούμενη από 3 έως 25% ρυθμιστικό Β επί 120 λεπτά, 90% ρυθμιστικό Β για 7 λεπτά και τέλος 97% ρυθμιστικό διάλυμα Α για 7 λεπτά. Η απόκτηση των δεδομένων στο φασματόμετρο μάζας ορίσθηκε σε τρόπο θετικού ιόντος, με ένα επιλεγμένο εύρος μάζας των 350-1800 m /z. διαδοχική φασματομετρία μάζας πραγματοποιήθηκε σε πεπτίδια με 2, 3, 4 καταστάσεων φόρτισης σε ένα ευρύ φάσμα από 65 έως 2.000 σάρωσης m /z.

Αναγνώριση των πρωτεϊνών και τη σχετική ποσοτικοποίηση

ταυτοποίηση πρωτεϊνών και σχετική ποσοτικοποίηση διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23], [24]. Ταυτοποίηση του πεπτιδίου προδρόμου και θραύσματα διεξήχθη από την αναζήτηση της βάσης δεδομένων έναντι του ελβετικού-Prot και TrEMBL

Homo sapiens

βάση δεδομένων πρωτεϊνών (41070, 71449 ΑΠΑ αντίστοιχα, κατεβάσει από UniProt, Μάιος 2010). Παραμέτρους για την αναζήτηση συστάθηκαν ως εξής: MS ανοχή ήταν 0,4 και MS /MS ανοχής τέθηκαν σε: πεπτίδιο ανοχή 0,4 Da, χρεώνουν 2, 3 και 4, min μήκος του πεπτιδίου, z-score, max p-value και βαθμολογία AC ήταν 6, 6, 10

-6 και 6 αντίστοιχα. Phenyx προεπιλογή βαθμολόγησης «τούρμπο» ενεργοποιήθηκε με μάζα περιορισμό ανοχή 0,1 Da για το MS και MS /MS και το ελάχιστο ποσοστό της κάλυψης πεπτιδική αλληλουχία από b

+ (β), β

2 + (β ++), y

+ (y) ή y

2 + (y ++) σειρά θραύσμα ορίστηκε στην προεπιλεγμένη τιμή των 20%. Στόχου χώρος αναζήτησης της βάσης δεδομένων περιορίστηκε σε τρυπτικά πεπτίδια με μέγιστη 1 miscleavage. Οι τροποποιήσεις τέθηκαν ως εξής: 4-Plex iTRAQ μετατοπίσεις μάζας (144 Da, Κ και Ν-όρος), μεθυλσουλ (+46 Da) και την οξείδωση της μεθειονίνης (16 Da). Ποσοστών εσφαλμένων ανακάλυψη (FDR) εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας συνεχόμενα βάση δεδομένων στόχο-δολωμάτων, όπως περιγράφεται από τον Ηλία και Gygi [25]. μεταβολές πρωτεϊνών χαρακτηριστεί χρησιμοποιώντας έναν αλγόριθμο t- τεστ που αναπτύχθηκε στο σπίτι [23].

Ανοσοϊστοχημεία για eEF1A1

Ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε ουσιαστικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Τμήματα των οστών και προστάτη ιστοί κόπηκαν (4 m) και τοποθετημένα σε SuperFrost πλακίδια (VWR International, Γερμανία). Τα πλακίδια επωάστηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-eEF1A1 αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology-, CA, USA Cat. Ν

o sc21758), στα 0.4 μg /ml σε 2% ορό αλόγου όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Οι τομές πλύθηκαν δύο φορές σε PBS-Tween 20 (PBST), και επωάστηκαν για 30 λεπτά με αντι-ποντικού IgG HRP ImmPRESS (Vector Laboratories, Cat. Ν

o MP-7402). Μετά από περαιτέρω πλύση σε PBST, εντοπισμός του συμπλόκου /αντιγόνου αντισώματος οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα ImmPACT DAB (Vector Laboratories, Cat. Ν

o SK-4105). τομές ελέγχου επωάστηκαν με αντι-ποντικού IgG ισότυπο αναφοράς (Vector Laboratories Ι-2000), αραιωμένο σε 0,4 μg /ml σε 2% κανονικό ορό αλόγου. eEF1A1 ανοσοχρώση εκτιμήθηκε τόσο για την ένταση και την κυτταρική εντόπιση από έναν έμπειρο ιστοπαθολόγο (Δρ Simon Cross), ο οποίος τυφλώθηκε με τη μελέτη. Κάθε υπόθεση ανατέθηκε ένταση χρώσης, που κυμαίνονται από 0-3, όπου 0 = απούσα? 1 = αδύναμη? 2 = μέτρια και 3 = έντονη χρώση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18].

κηλίδωση Western

κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε ουσιαστικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Αντι-EF-Tu κατσίκα πολυκλωνικό IgG πρωτογενές αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε σε συγκέντρωση 1:1000 (Santa Cruz, Cat. Ν

o. Sc12990). Δευτερογενής αντίσωμα ήταν συζευγμένο με HRP κουνελιού αντι-κατσίκας (Abcam), και χρησιμοποιήθηκε σε μια συγκέντρωση 1:1400 (Abcam). Διπλή χρώμα ακρίβεια συν μοριακού βάρους δείκτες χρησιμοποιήθηκαν για την εκτίμηση του μεγέθους (Bio-Rad, Hertfordshire, UK).

Αντίστροφη μεταγραφή PCR και προσδιορισμός αλληλουχίας

Ολικό RNA εκχυλίσθηκε από κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο TRI (Sigma-Aldrich, UK), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το RNA ποσοτικοποιήθηκε φασματοφωτομετρικά και 2 μg μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας το κιτ SuperScript III ανάστροφης μεταγραφάσης με 250 ng τυχαίων εκκινητών, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen, UK). PCR εκκινητές ειδικούς στην ισομορφή eEF1A1 σχεδιάστηκαν με το χέρι, χρησιμοποιώντας την ακολουθία cDNA Ensembl: ENST00000316292 (https://www.ensembl.org/index.html). Η eEF1A1-εμπρός αλληλουχία εκκινητής ήταν (5′-3 ‘): TCCTTCAAGTATGCCTGGGTCT (eEF1A1-F1), που αντιστοιχεί στο νουκλεοτίδιο θέσεις 157-178. Η αλληλουχία eEF1A1-αντίστροφος εκκινητής ήταν: TGGCACAAATGCTACTGTGTCG (eEF1A2-R1), που αντιστοιχεί σε θέσεις νουκλεοτιδίων 555-576, για να δώσει ένα αναμενόμενο μέγεθος του προϊόντος PCR 420 bp. Ομοίως PCR εκκινητές ειδικούς για την ισομορφή eEF1A2 σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας την αλληλουχία cDNA Ensembl: ENST00000298049. Η αλληλουχία του εκκινητή eEF1A2-προς τα εμπρός ήταν: AGGAGGCTGCTCAGTTCACCT (eEF1A2-F3), που αντιστοιχούν σε νουκλεοτιδικές θέσεις 1004-1024? και ο eEF1A2- αντίστροφο εκκινητή αλληλουχία ήταν: CCGCTCTTCTTCTCCACGTTC (eEF1A2-R3), που αντιστοιχεί στο νουκλεοτίδιο θέσεις 1317-1336, με ένα αναμενόμενο μέγεθος του προϊόντος PCR 334 bp. Οι εκκινητές συντέθηκαν χρησιμοποιώντας την εμπορική εγκατάσταση στο Eurofins MWG Operon (https://www.eurofinsdna.com/products-services/oligonucleotides0.html).

Η αντίστροφη μεταγραφή PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση 1 μΙ cDNA από κάθε από τις κυτταρικές σειρές, 10 pmol από κάθε προς τα εμπρός /αντίστροφου εκκινητή, και 0,5 μΙ Taq AccuPrime DNA πολυμεράση (Invitrogen, UK), σε 20 όγκους μΐ. Θερμοκυκλοποίηση εκτελέστηκε υπό τις ακόλουθες συνθήκες: αρχική μετουσίωση στους 94 ° C για 5 λεπτά? 30 κύκλοι PCR στους 94 ° C για 1 λεπτό, 58 ° C για 1 λεπτό, και 72 ° C για 1 λεπτό, και μια τελική επέκταση 72 ° C για 7 λεπτά. προϊόντα ενισχυμένα με PCR (10 μΐ) διαχωρίστηκαν σε γέλη αγαρόζης 2,5% που περιέχει βρωμιούχο αιθίδιο και απεικονίστηκε με τη χρήση του XR GelDoc

+ Molecular Imager (Bio-Rad). εντάσεις μπάντα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας τον Ποσότητα Ένα λογισμικό (Bio-Rad).

Τα προϊόντα PCR αλληλουχία στον πυρήνα εγκατάσταση Γενετικής, Πανεπιστήμιο του Sheffield (https://www.shef.ac.uk/medicine/research /corefacilities/genetics.html). αλληλουχίες DNA που απεικονίστηκαν με τη χρήση του χρωματισμών Lite έκδοση 2.01 του λογισμικού, ελεύθερα κατεβάσετε από https://www.technelysium.com.au/chromas_lite.html.

Αποτελέσματα

Ιεραρχική ανάλυση συστάδων του προφίλ πρωτεΐνης

Η ανάλυση των 4 συγκεντρωμένων ομάδες ασθενών εντοπίστηκαν 122 πρωτεΐνες μαζί με τις σχετικές πληροφορίες για τα σχετικά επίπεδα έκφρασης τους (Πίνακας S2). Το ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη ήταν 1,4%, το οποίο είναι εντός του αποδεκτού ορίου του 5% [25]. Για το σύνολο δεδομένων iTRAQ, 75 μοναδικές πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν και σχετικά ποσοτικά με ≥2 μοναδικά πεπτίδια, και αυτά τα δεδομένα χρησιμοποιήθηκαν για τη στατιστική ανάλυση για να προσδιοριστεί μεταβολές στα επίπεδα πρωτεΐνης μεταξύ των ομάδων. Ιεραρχική ομαδοποίηση έγινε για την ομαδοποίηση των δεδομένων με βάση τον βαθμό ομοιότητας μεταξύ των ομάδων καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη και του καρκίνου. Agglomerative ομαδοποίηση χρησιμοποιώντας το τετράγωνο Ευκλείδεια απόσταση μεταξύ log

10 αξία των αναλογιών iTRAQ και μικρότερο διαδικασία σύνδεσης intercluster ανομοιότητας εκτελέστηκε (Mathematica 7.0.0 για Mac), για να δημιουργηθεί το δενδρόγραμμα που φαίνεται στο Σχήμα 1. Ένα βασικό χαρακτηριστικό του δενδρόγραμμα είναι διαχωρισμό των ομάδων ασθενών ανάλογα με το στάδιο της νόσου τους. Οι ασθενείς με μετάσταση χώριζε το απώτατο και συνεπώς θεωρούνται ότι είναι η πιο διαφορετική από ασθενείς με καλοήθη υπερπλασία του προστάτη. Οι ασθενείς με καλοήθη υπερπλασία του προστάτη συγκεντρωμένα πιο στενά με τους ασθενείς στην ομάδα της μη προχωρούν σε σύγκριση με τους προχωρούν και μεταστατικό ομάδες.

Τα δείγματα συγκεντρωμένα με βάση την ομοιότητα του προφίλ έκφρασης τους σε πρωτεΐνες που παρατηρούνται στο ημερολόγιο

10 του αναλογίες iTRAQ και ένα δενδρόγραμμα που παράγεται για να δείξει την σχέση μεταξύ των δειγμάτων. Τετράγωνο Ευκλείδεια απόσταση μεταξύ συστάδων (μόνο σύνδεση) εμφανίζεται. Διαστήματα των σημείων διακλάδωσης δείχνουν το βαθμό ομοιότητας? όσο μικρότερη είναι ο κλάδος όσο υψηλότερος είναι ο βαθμός της ομοιότητας.

Η

Γονιδιακή οντολογία σχολιασμό

Για να εκτιμηθεί το εύρος των πρωτεϊνών που προσδιορίζονται, γονίδιο οντολογίας (GO) σχολιασμούς για τις βιολογικές διεργασίες είχαν ανατεθεί με τη χρήση του πρωτεΐνη ανάλυση μέσω εξελικτικές σχέσεις (PANTHER), το λογισμικό, το οποίο συνδέει τους κωδικούς ένταξη της πρωτεΐνης με τις αντίστοιχες καταχωρήσεις στη βάση δεδομένων γονιδιακής οντολογίας [14], [27]. Η ανάλυση PANTHER αποκάλυψε την παρουσία πολλών πρωτεϊνών κοινών πλάσματος όπως αυτές που σχετίζονται με το συμπλήρωμα ανοσία (14%), η ανοσία και την άμυνα (27%), πρωτεόλυση (21%), την πήξη του αίματος (7%), και το μεταβολισμό των πρωτεϊνών και της τροποποίησης (22%).

Για την ανάλυση βιολογικών δίκτυο, πλατφόρμα Metacore (GeneGo, Inc., St. Joseph, ΜΙ), χρησιμοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14], η οποία αποκάλυψε ότι πολλά από τα διαφορικά εκφραζόμενου πρωτεΐνες, όπως C4, C4a, C5, C5b, C9 και C6 αντιστοιχίζεται με την κλασική ανοσολογική απόκριση οδού (Σχήμα S1).

Διαγνωστική βιοδείκτη οδηγεί

οι διαφορές στα επίπεδα της πρωτεΐνης αναφερθεί μετά από ένα t -test ανάλυση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Οι τιμές ρ υπολογίστηκαν με βάση τον αριθμό των πεπτιδίων που χρησιμοποιούνται για τον ποσοτικό προσδιορισμό και τη διακύμανση των δεικτών αναφοράς iTRAQ προέρχονται από αυτά τα πεπτίδια. Μια ρ-value≤0.01 χρησιμοποιήθηκε για να εκχωρήσει σημαντικές αλλαγές στα επίπεδα της πρωτεΐνης μεταξύ των σετ δειγμάτων. Είναι σημαντικό ότι, οι αλλαγές πρωτεΐνη αναφέρεται ως σημαντική διαφορική έκφραση επιλέχθηκαν με βάση την στατιστική σημασία όχι φορές αλλαγή [28]. Ορισμένες από αυτές τις διαφορές αναμένεται να είναι δυνητικά μεγαλύτερο λόγω του γνωστού υπό εκτίμηση που σχετίζεται με iTRAQ ποσοτικοποίηση βάσει του [24].

Κατά τη διάρκεια της ανάλυσης μας, μας ενδιαφέρει σε πρωτεΐνες που δείχνει τόσο αυξάνεται και μειωμένα επίπεδα έκφρασης, όπως προηγούμενες μελέτες ανέφεραν ότι και οι δύο προηγούμενους σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται πρωτεΐνες μπορεί να είναι κλινικής σημασίας [15], [29].

η ταυτοποίηση των πρωτεϊνών που εκφράζονται διαφορικά σε μη προχωρούν, προχωρούν και μεταστατικό ομάδες ασθενών σε σχέση με το ομάδα BPH ήταν ενδιαφέροντος όπως αυτά θα μπορούσε να παρέχει οδηγεί για δυνητικά χρήσιμο διαγνωστικό και προγνωστικό βιοδείκτες (Πίνακας S3). Έτσι, μια σύγκριση μεταξύ της μη προχωρούν ομάδα του καρκίνου έναντι της ομάδας ΒΡΗ έδειξε σημαντική διαφορική έκφραση πρωτεϊνών 22? 7 εκ των οποίων τα επάνω ρυθμισμένη και 15 ρυθμισμένα προς τα κάτω (Πίνακας S3a). Ομοίως, η σύγκριση μεταξύ της προόδου ομάδα ασθενών έναντι της ομάδας ΚΥΠ προσδιόρισε την διαφορική έκφραση των πρωτεϊνών 19? 11 από τα οποία έδειξαν σημαντική υπερ-έκφραση και 8 έδειξαν ρύθμιση προς τα κάτω (Πίνακας S3b). Συγκρίσεις της μεταστατικής ομάδα ασθενών έναντι της ομάδας ΚΥΠ προσδιόρισε την διαφορική έκφραση των πρωτεϊνών 35, με 19 πρωτεΐνες που δείχνει σημαντική υπερ-έκφραση και 16 παρουσιάζουν σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω (Πίνακας S3C). Επιπροσθέτως, η C-αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP) βρέθηκε να είναι αυξημένα 41,1 φορές σε ορό ασθενών με μεταστατική νόσο σε σύγκριση με ασθενείς με καλοήθη υπερπλασία του προστάτη (Πίνακας S2).

Πρόγνωσης βιοδείκτη οδηγεί

Μόλις μια διάγνωση του καρκίνου έχει γίνει τα επόμενα βήματα είναι να αποδείξουν την έκταση (στάδιο) της νόσου, σε μια προσπάθεια να προβλέψουμε αυτούς τους ασθενείς στους οποίους η νόσος είναι πιθανό να εξελιχθεί από τους ασθενείς στους οποίους η νόσος είναι πιθανό να παραμείνει εντοπισμένη, και για την απόκτηση προγνωστικές πληροφορίες. Επί του παρόντος, τα επίπεδα του PSA προ-επεξεργασία, βιοψία Gleason βαθμό και κλινική σταδιοποίηση χρησιμοποιούνται για να παρέχουν προγνωστικές πληροφορίες? Ωστόσο, αυτές οι παράμετροι που σχετίζονται με έναν αριθμό περιορισμών. Έτσι, η σύγκριση των ασθενών με προχωρούν έναντι μη εξελισσόμενη νόσος αναγνωρίστηκε το σημαντικό διαφορική έκφραση πρωτεϊνών 25? 13 επάνω ρυθμισμένη και 12 ρυθμισμένα προς τα κάτω (Πίνακας S4).

επιπέδων πρωτεΐνης Differential συνδέονται με την εξέλιξη της νόσου

Εκτός από τις παραπάνω συγκρίσεις, οι διαφορές πρωτεΐνη χαρτογραφήθηκαν ανάλογα με το στάδιο του προστάτη ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου, δηλαδή ως η καρκίνος αναπτύχθηκε από μη κακοήθεις επιθήλιο και προχώρησε σε τοπικά προχωρημένο και μεταστατική νόσο (Σχήμα 2). Οι κατάλογοι των διαφορών που βασίζεται σε συγκρίσεις μεταξύ των μη προχωρούν σε σχέση με την ομάδα καλοήθη υπερπλασία του προστάτη? προχωρούν έναντι μη προχωρούν ομάδα? και μεταστατικό έναντι προχωρούν ομάδες του καρκίνου. Από το Σχήμα 2, είναι προφανές ότι η ατομική πρωτεΐνες, «ζεύγη» των πρωτεϊνών και των «πάνελ» των πρωτεϊνών (που ορίζονται ως ≥3 πρωτεΐνες), παρατηρήθηκαν να εκφράζονται διαφορικά σε ορισμένα στάδια της ανάπτυξης και της εξέλιξης της νόσου. Για παράδειγμα, οι μεμονωμένες πρωτεΐνες όπως α-2-μακροσφαιρίνη, λουμικάνη και αμυλοειδές ορού P-συστατικό παρατηρήθηκαν να εκφράζονται διαφορικά μεταξύ των μη προχωρούν έναντι της ομάδας ΚΥΠ. Άλλες πρωτεΐνες, όπως η βήτα-2-γλυκοπρωτεΐνη 1 και σωματομηδίνη-B (μπλε γραμματοσειρά), και οι δύο φαίνεται να είναι σχετικά μειωμένη ως «ζευγάρι» στην πρόοδο έναντι μη προχωρούν δείγματα, ενώ τόσο απολιποπρωτεΐνη Α-1V και συμπληρωματικό συστατικό 4Β ήταν φαίνεται να είναι σχετικά αυξημένη έκφραση σε μεταστατικό δείγματα σε σχέση με την πρόοδο δείγματα (πορτοκαλί γραμματοσειρά). Επιπλέον, δύο «πάνελ», φάνηκαν να τροποποιηθεί όπως αναπτύχθηκε η ασθένεια και προχώρησε. Το πρώτο πάνελ που αποτελείται από 3 πρωτεΐνες: afamin, άλφα-2-HS-γλυκοπρωτεΐνη Β αλυσίδα και φιμπρονεκτίνη 1 (φαίνεται στο κόκκινο γραμματοσειρά), και παρατηρήθηκε να είναι σχετικά αυξημένη σε έκφραση στο μη προχωρούν έναντι της ομάδας ΒΡΗ, αλλά μειώθηκε όπως ο καρκίνος προχωρήσει και παρέμεινε σχετικά χαμηλή, όπως ο καρκίνος κάνει μετάσταση. Το δεύτερο πάνελ που αποτελείται από 7 πρωτεΐνες: α-1-αντιχυμοθρυψίνη? cDNA FLJ55673, πολύ παρόμοια με τη συμπλήρωση του παράγοντα Β? cDNA FLJ54228, πολύ παρόμοια με πλούσιες σε λευκίνη α-2-γλυκοπρωτεΐνη? cDNA FLJ58564, πολύ παρόμοια με αναστολέα της πρωτεάσης του πλάσματος C1? Η σερουλοπλασμίνη, C5 του συμπληρώματος και συμπληρωματικό συστατικό C9b (πράσινο γραμματοσειρά), και παρατηρήθηκαν να είναι σχετικά μειωμένη σε έκφραση στο μη προχωρούν ομάδα σε σύγκριση με την ομάδα ΒΡΗ, και σχετικά αυξημένο σε έκφραση, όπως ο καρκίνος εξελιχθεί δηλαδή ήταν σχετικά αυξημένο κατά την πρόοδο ομάδα και παρέμεινε αυξημένη στο μεταστατικό ομάδα

Ο κατάλογος των διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών που παρουσιάζονται βασίζονται σε συγκρίσεις μεταξύ μη προχωρούν σε σχέση με καλοήθη υπερπλασία του προστάτη.? προχωρούν έναντι μη προχωρούν και μεταστατικά σε σχέση με την πρόοδο των ομάδων. Σημειώστε τη διαφορική έκφραση των πρωτεϊνών είτε μεμονωμένα (μαύρη γραμματοσειρά), ως ζεύγη (μπλε, πορτοκαλί και μοβ γραμματοσειρές), είτε ως πίνακα (≥3 πρωτεΐνες, πράσινο και κόκκινο γραμματοσειρές). (*) = Προσδιορίζονται ως ενιαίο πεπτίδιο υψηλή εμπιστοσύνη.

Η

Είναι ενδιαφέρον, ευκαρυωτικό μεταφραστικό παράγοντα επιμήκυνσης 1 άλφα 1 (eEF1A1), (γνωστός και ως EF-Tu), θεωρήθηκε για να δείξει σημαντική αύξηση της έκφρασης σε μη -progressing καρκίνος σε σχέση με καλοήθη υπερπλασία του προστάτη, και η έκφρασή της αυξήθηκε περαιτέρω με την εξέλιξη της νόσου, και διατηρήθηκε κατά τη διάρκεια της μετάστασης (Πίνακας S2 και Σχήμα 2). eEF1A1 ήταν το κορυφαίο χτύπημα μετά την BLASTP αναζήτηση του πεπτιδίου VETGVLKPGMVVTFAPVNVTTEVK προσδιορίζονται στα δείγματα ορού. Σύγκριση της αλληλουχίας αμινοξέων πλήρους μήκους eEF1A1 με ισομορφής του eEF1A2, έδειξε ότι η πεπτιδική αλληλουχία ήταν μοναδική για eEF1A1. Το αντίστοιχο πεπτίδιο σε eEF1A2 διαφέρει από ένα μόνο αμινοξύ όπου η βαλίνη υποκαθίσταται από ισολευκίνη. Δεδομένου ότι αυτά τα αμινοξέα έχουν 14 Da διαφορά στη μοριακή μάζα θα μπορούσε με βεβαιότητα να εκχωρήσετε το εντοπίστηκαν πεπτίδιο να αντιστοιχεί στην ισομορφή eEF1A1.

Επιβεβαίωση των υποψηφίων που προσδιορίζονται από iTRAQ

Για να επιβεβαιωθεί η διαφορική έκφραση της υποψήφιες πρωτεΐνες που προσδιορίζονται από iTRAQ, μπορούμε στη συνέχεια πραγματοποίησε ηλεκτροφόρηση 1D-gel που χρησιμοποιούν κοινές πηγές ορού από τις 4 ομάδες ασθενών. Μετά κηλίδωση με Coomassie blue, μία αμυδρή ζώνη οπτικά φαίνεται να είναι παρόν σε μία ελαφρώς υψηλότερη ένταση στα δείγματα από ασθενείς με μεταστατική νόσο σε σχέση με τις άλλες 3 ομάδες ασθενών (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτή η ζώνη αποκόπηκε από την πηκτή, υποβλήθηκε σε πέψη με θρυψίνη και τα προκύπτοντα πεπτίδια αναλύθηκαν με LC-MS /MS. Τα δεδομένα φασματομετρία μάζας προσδιορίζονται 7 πεπτίδια που ταιριάζουν σε CRP με κάλυψη ακολουθία 27,6%, και επιβεβαίωσε τα στοιχεία iTRAQ.