Abstract

Σε αυτή τη μελέτη επικεντρώθηκε σε βαρύτητα-ευαίσθητων πρωτεϊνών από δύο γραμμές ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του θυρεοειδούς (ML-1? RO82-W-1), που εκτέθηκαν σε 2D clinostat (CLINO), ένα τυχαίο μηχάνημα τοποθέτησης (RPM) και στην κανονική 1

g

-οι όροι. Μετά από μια τριών (3δ) – ή επτά ημερών καλλιέργειας (7δ) επί των δύο συσκευών, βρήκαμε και οι δύο τύποι κυττάρων αυξάνεται τρισδιάστατα εντός πολυκύτταρους σφαιροειδή (MCS) και, επίσης, τα κύτταρα που παραμένουν προσκολλημένα (AD) προς την φιάλη καλλιέργειας, ενώ 1

g

-Έλεγχος καλλιέργειες σχηματίζεται μόνο προσκολλημένων μονοστιβάδες, εκτός εάν το κάτω μέρος του δίσκου καλλιέργειας καλύφθηκε με αγαρόζη. Στην περίπτωση αυτή, οι κυτοκίνες IL-6 και IL-8 διευκόλυνε το σχηματισμό MCS σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας την τεχνική υγρού-επικάλυψης σε 1

g

. ML-1 κύτταρα καλλιεργούνται στο RPM ή τα CLINO απελευθερώνονται ποσότητες IL-6 και MCP-1 στο υπερκείμενο, το οποίο ήταν σημαντικά αυξημένα σε σύγκριση με 1

g

-controls. Απελευθέρωση της IL-4, IL-7, IL-8, IL-17, ηωταξίνη-1 και VEGF αυξημένο χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο, αλλά δεν επηρεάστηκε σημαντικά από τις συνθήκες βαρύτητας. Μετά 3d στο RPM ή στο CLINO, μια συσσώρευση F-ακτίνης γύρω από την κυτταρική μεμβράνη ήταν ανιχνεύσιμη σε AD κύτταρα και των δύο κυτταρικών σειρών. IL-6 και IL-8 διέγερση των κυττάρων ML-1 για 3d και 7δ επηρεάσει τα περιεχόμενα πρωτεΐνης των β

1-ιντεγκρίνης, ταλίνη-1, Ki-67, και β-ακτίνη δοσοεξαρτώμενο σε προσκολλημένα κύτταρα. Το SS

1-ιντεγκρίνης περιεχόμενο μειώθηκε σημαντικά σε AD και δείγματα MCS σε σύγκριση με 1

g

, ενώ ταλίνη-1 ήταν υψηλότερη εκφράζεται σε MCS από πληθυσμούς AD. Ο δείκτης πολλαπλασιασμού Ki-67 ήταν αυξημένα σε δείγματα AD σε σύγκριση με 1

g

και δείγματα MCS. Η β-ακτίνη περιεχόμενο των κυττάρων R082-W-1 παρέμεινε αμετάβλητη. κύτταρα ML-1 παρουσίασαν καμία μεταβολή σε β-ακτίνης σε καλλιέργειες RPM, αλλά μία μείωση στα δείγματα CLINO. Έτσι, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι προσομοίωση μικροβαρύτητας επηρεάζει την απελευθέρωση των κυτοκινών στο οζώδες καρκίνου του θυρεοειδούς κύτταρα, καθώς και την παραγωγή των β

1-ιντεγκρίνης και Ταλίν-1 και προβλέπει ένα πανομοιότυπο αποτέλεσμα σε πραγματικές συνθήκες μικροβαρύτητας.

Παράθεση : Svejgaard Β, Wehland Μ, Ma Χ, Kopp S, Sahana J, Warnke E, et al. (2015) Κοινή Επιδράσεις σε καρκινικά κύτταρα που ασκείται από ένα τυχαίο θέσης μηχανών και ένα 2D Clinostat. PLoS ONE 10 (8): e0135157. doi: 10.1371 /journal.pone.0135157

Επιμέλεια: Yoshiaki Taniyama, Osaka University Graduate School of Medicine, Ιαπωνία

Ελήφθη: 31ης Ιανουαρίου του 2015? Αποδεκτές: 19 Ιουλίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 14 Αυγούστου 2015

Copyright: © 2015 Svejgaard et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Οργανισμό Διαστήματος Γερμανικά (DLR? (ΓΔ) BMWi έργα 50WB1124 και 50WB1524), ο Ευρωπαϊκός Οργανισμός Διαστήματος (ESA? ESA-CORA-GBF-2011 -005 Συσκευή έργο Σύγκριση? ESA-CORA-GBF- 2013-001 έργο ΘΥΡΕΟΕΙΔΙΚΑ 3) (ΓΔ), το Πανεπιστήμιο Aarhus της Δανίας (ΓΔ), το Πανεπιστήμιο του Regensburg (JG), και DGLRM (Νέοι Πρόγραμμα Fellow για EW και GA) . Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η παρατεταμένη διαστημικές πτήσεις συχνά προκαλούν επιβλαβή προβλήματα υγείας στον άνθρωπο. Ένας αριθμός των διαστημικών πτήσεων αποτελέσματα έχουν μελετηθεί εκτενώς στο παρελθόν και αναθεωρούνται [1-4]. Μερικά αποτελέσματα μπορούν να εξηγηθούν από γνωστούς φυσιολογίας? π.χ. η έλλειψη βαρύτητας στρες στο πόδι μυϊκό σύστημα οδηγεί σε ταχεία απώλεια της οστικής μάζας και των μυών, και η έλλειψη της βαρυτικής φορέα προκαλεί προβλήματα που σχετίζονται με την ισορροπία και τις κινήσεις των ματιών [1]. Είχε αποδειχθεί ότι ακυρωτική της βαρύτητας επηρεάζει τους μοριακούς μηχανισμούς των κυττάρων κατευθείαν [3]. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε πραγματική ή προσομοιωμένη μικροβαρύτητας αλλάξει γονίδιο και πρωτεΐνη συμπεριφορά τους έκφραση [5-7], την αύξηση της απόπτωσης [8, 9], επιβραδύνουν την κυτταρική ανάπτυξη [10] και να μεταβάλλουν τον κυτταρικό σκελετό [11-13]. Επιπλέον, εντοπίστηκαν πολυκύτταρων αδρανών υλικών, που έμοιαζε με τα όργανα από τα οποία τα κύτταρά τους είχαν προέρχεται [14].

Τα τελευταία χρόνια έγινε φανερό ότι οι μελέτες για τη συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων στο χώρο θα μπορούσε να υποστηρίξει την έρευνα του καρκίνου στη Γη [15]. Τώρα είναι ενδιαφέρον να συγκρίνουμε τους ρόλους των διακριτών πρωτεϊνών στην κυτταρική προσαρμογή στις μεταβαλλόμενες περιβαλλοντικές συνθήκες (μικροβαρύτητας). Εμείς χαρακτηριζόμενη διάφορες γραμμές ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του θυρεοειδούς αναπτύσσονται κάτω από συνθήκες πραγματικού και προσομοιωμένου μικροβαρύτητα, με σκοπό να βρει δυνατότητες μείωσης του καρκινικού κυττάρου επιθετικότητα [16-18]. Από πειράματα σε πραγματικές μικροβαρύτητας δηλαδή δυνατότητες διαστημικές πτήσεις είναι σπάνια και ακριβά [16], ένα μεγάλο μέρος των μελετών πραγματοποιήθηκε με τη χρήση συσκευών με στόχο την προσομοίωση μικροβαρύτητας στη Γη [3, 19]. Ωστόσο, κάθε συσκευή επηρεάζει τα κύτταρα όχι μόνο με την πρόληψη καθίζηση, αλλά και από τα χαρακτηριστικά του τρόπου λειτουργίας της, οι οποίες περιλαμβάνουν παροδικό hypergravity ή δόνηση [20]. Επομένως, θεωρήθηκε ότι ορισμένες παρατηρήσεις που έγιναν σε κύτταρα καλλιεργημένα σε μια συσκευή που προσομοιώνει μικροβαρύτητα μπορεί να μην είναι αποκλειστικά και μόνο λόγω πρόληψη της καθίζησης των κυττάρων αλλά επίσης και λόγω συσκευή-ειδικές επιδράσεις [18]. Επιπλέον, παρατηρήσαμε επίσης ότι τα αποτελέσματα είναι ειδικές για συγκεκριμένα είδη των θυρεοειδικών κυτταρικές γραμμές [21]. Προκειμένου να διερευνηθεί η επίδραση της βαρύτητας αλλαγμένη σε κυτταρικό επίπεδο, μελετήσαμε διαφορετικά καρκινικά κύτταρα σε διαφορετικές συσκευές που προσομοιώνουν μικροβαρύτητα σύμφωνα με συγκρίσιμα πρωτόκολλα. Πριν από τον χαρακτηρισμό, την ανθρώπινη θυρεοειδικών κυττάρων FTC-133, ML-1, και HTU-5 καλλιεργήθηκαν στο Random Positioning Machine (RPM, Σχήμα 1Α) [17], αλλά μόνο τα κύτταρα FTC-133 στο RPM και γρήγορο περιστρεφόμενο 2D -Clinostat (CLINO, Σχήμα 1Β) [18], καθώς και στο διάστημα [16, 22, 23]. Τα πειράματα αποκάλυψαν διάφορες πτυχές και επεσήμανε κυτταροσκελετού πρωτεϊνών και κυτοκινών ως πρωταρχικούς στόχους των επιπτώσεων μικροβαρύτητας [3, 19, 22, 23]

Α:. Τυχαία θέσης Machine (RPM) και Β:. 2D-Clinostat

σε αυτή τη μελέτη διερευνήσαμε την επίδραση της προσομοιωμένης μικροβαρύτητα χρησιμοποιώντας το RPM και τις συσκευές CLINO επί δύο ανθρώπινες κυτταρικές σειρές θυλακιώδη καρκίνο του θυρεοειδούς (ML-1, RO82-W-1) κατά παράλληλο τρόπο, είτε για τρία (3D) ή επτά (7δ) ημέρες, αντίστοιχα, πριν επιλεγεί κυτοκίνες και οι πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού ποσοτικοποιήθηκαν. Για να αξιολογηθεί ο πιθανός ρόλος των κυτοκινών IL-6 και IL-8 για την έκφραση επιλεγμένων πρωτεϊνών σε κύτταρα καρκίνου του θυρεοειδούς, μελετήσαμε την επίδραση της IL-6 και IL-8 εφαρμογή επί Ki-67, SS

1- ιντεγκρίνη, ταλίνη-1, και β-ακτίνης πρωτεϊνών σε προσκολλημένα κύτταρα ML-1. Επιπλέον, επικεντρώθηκε στο ρόλο των κυτοκινών IL-6 και IL-8 σε ML-1 και σφαιροειδή σχηματισμός RO82-W-1 χρησιμοποιώντας την τεχνική υγρού-επικάλυψης υπό 1

g

-οι όροι [24]. Οι κυτοκίνες και οι πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού, του οποίου η θέση ή η έκφραση αλλοιώθηκε, αντίστοιχα, συζητήθηκε σε σχέση με συγκεκριμένους ρόλους τους στον καρκίνο του θυρεοειδούς.

Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

ML-1 κυτταρική σειρά.

Μονοστιβάδες ML-1 θυλακιώδη καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα [25] καλλιεργήθηκαν είτε στην RPM ή του clinostat. Η κυτταρική σειρά ML-1 που προέρχεται από ένα επαναλαμβανόμενο όγκο ενός κακώς διαφοροποιημένο θυλακιώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς (στάδιο pT4) ενός 50-year-old γυναίκα [25]. Η κυτταρική γραμμή έχει χρόνο διπλασιασμού 4 ημέρες. Τα κύτταρα καταλαμβάνουν γλυκόζη, εκκρίνουν θυρεοσφαιρίνη, θυροξίνη, τριιωδοθυρονίνη και και είναι ογκογόνα σε γυμνά ποντίκια.

UCLA RO82-W-1 κυτταρική γραμμή.

Η κυτταρική γραμμή RO82-W-1 ήταν θεσπίστηκε με Estour

et al

. το 1989 [26]. Η κυτταρική σειρά αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich Chemie (Μόναχο, Γερμανία). Αυτή η κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται από τις μεταστάσεις του θυλακιώδες καρκίνωμα σε ένα θηλυκό ασθενή. Αν και η πρωτογενής όγκος του RO82-W-1 που απελευθερώνεται θυρεοσφαιρίνη (Tg) στην κυκλοφορία, η πρόσληψη του I131 ήταν μικρότερη από 2% [26]. κύτταρα RO82-W-1 είναι Tg-θετικών και είναι επίσης ογκογόνα σε γυμνά ποντίκια [26].

δύο κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI-1640 στους 37 ° C και 5% CO

2. Το μέσο συμπληρώθηκε με 100 μg /mL στρεπτομυκίνη, 100 U /mL πενικιλλίνη και 10% FCS (όλα Biochrom, Βερολίνο, Γερμανία).

Επειδή και οι δύο κακοήθη ανθρώπινα θυρεοειδούς θυλακιώδη κυτταρικές γραμμές είχε διατηρήσει την ικανότητα να συνθέτουν Tg , αποτελούν πολύτιμα μοντέλα για τη μελέτη της ανθρώπινης θυλακιώδη καρκινώματα.

κυττάρων Διαδικασία Πολιτισμού

24 ώρες πριν από τα πειράματα, τα κύτταρα και των δύο τύπων σπάρθηκαν είτε σε φιάλες διαφανειών (Thermo Scientific, Roskilde, Δανία) με μια αναπτυσσόμενη περιοχή 9 cm

2 για την CLINO ή σε φιάλες Τ25 (Sarstedt, Nümbrecht, Γερμανία) με μια αναπτυσσόμενη περιοχή 25 cm

2 για το RPM. Τα κύτταρα για κάθε τύπο φιαλών καλλιέργειας τυχαιοποιήθηκαν να καλλιεργούνται ως στατική ελέγχου εδάφους (1

ζ

-condition) ή σε μία από τις συσκευές. εικόνες αντίθεσης φάσης συνελήφθησαν. Οι μορφολογικές εικόνες για RO82 W–1 κύτταρα δίδονται στο σχήμα 2. CLINO και τα πειράματα διεξήχθησαν RPM σε επιμέρους επωαστήρες στους 37 ° C, και αλέθεται έλεγχοι πάντοτε διατηρείται δίπλα στα πειράματα στην ίδια αντίστοιχη θερμοκοιτίδα, αναπαύεται υπό στατικές 1

g

-οι όροι. Τα κύτταρα και των δύο τύπων συλλέχθηκαν μετά 3d ημέρες και 7η

Α:. Θυλακιώδες καρκίνου του θυρεοειδούς κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 3d σε στατική 1

g

. Τα κύτταρα πολλαπλασιάστηκαν όπως 2D μονοστιβάδας. Β: RO82-1 W-κύτταρα επωάζονται για 3d για το RPM. Τα βέλη δείχνουν 3D αδρανών υλικών (πολυκύτταρων σφαιροειδή? MCS). Τα ένθετα δείχνουν κολύμπι 3D σφαιροειδή στο υπερκείμενο. C: MCS που σχηματίζεται στην CLINO μετά από 3 ημέρες. D: κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 7 ημέρες στο CLINO 1 RO82-W-. Τα βέλη δείχνουν 3D σφαιροειδή. Το ένθετο δείχνει ένα πλωτό σφαιροειδές στο υπερκείμενο. Ε: RO82-W-1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 7 ημέρες σε στατικό 1

g

-οι όροι αναπτύσσονται καθώς και μια συρρέουσα μονοστιβάδα. F: 7-ημερών MCS σχηματίζεται επί του RPM (βέλη) θα μπορούσε να ανιχνευθεί και προσκολλημένα RO82-W-1 κύτταρα

Η

Επίδραση της IL-6 και IL-8 σε προσκολλημένα ML-1. κύτταρα που αναπτύσσονται κάτω από 1

g

– συνθήκες

ML-1 κύτταρα από κατεψυγμένα αποθέματα καλλιεργήθηκαν σε φιάλες Τ75 σε μέσο RPMI 1640 έως ότου έφθασαν συρροής (3-5 ημέρες). Στη συνέχεια τα κύτταρα υποκαλλιεργήθηκαν σε 5 Τ175 και μόλις έφτασαν συρροής αυτοί υποκαλλιεργήθηκαν πάλι σε 20 Τ175 φιάλες. Μετά από να πάρει υποσυμβάλλουσες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με RPMI όχημα 1640 ή με 0,03 ng /mL, 1 ng /ml, 10 ng /mL, 100 ng /ml IL-6 ή 1 ng /ml, 10 ng /mL, 45 ng /mL ή 100 ng /ml IL-8 συγκεντρώσεις, αντίστοιχα [27-29]. Μπορούμε επίσης εφαρμόζονται για την IL-6 ομάδα 0,03 ng /mL και για IL-8 45 ng /mL, επειδή αυτές οι συγκεντρώσεις κυκλοφόρησαν στο υπερκείμενο από ML-1 κύτταρα μετά από 7 ημέρες.

10 Τ175 φιάλες ( 2 Τ175 χωρίς IL-6 ή IL-8 και 8 Τ175 με διαφορετικές συγκεντρώσεις IL-6 ή IL-8) καλλιεργήθηκαν σε επωαστή (1

ζ

) για 3d, και ένα άλλο σύνολο των 10 Τ175 για 7δ.

Μετά 3d ή 7D το μέσο στις φιάλες καλλιέργειας έχει απορρίφθηκε, τα κύτταρα αποξέστηκαν σε 10 ml DPBS και φυγοκεντρήθηκε με 6000 στροφές ανά λεπτό για 15 λεπτά. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε, ο σβώλος διαλύθηκε σε 1 ml DPBS και φυγοκεντράται και πάλι από 6000 rpm για 15 λεπτά. Τα σφαιρίδια χρησιμοποιήθηκαν αμέσως για την εκχύλιση πρωτεϊνών, ανάλυση κηλίδος Western των β-ακτίνης, SS

1-ιντεγκρίνης, ταλίνη-1 και Ki-67 και εξής πυκνομετρία [17,19]. Τα αποτελέσματα δίνονται στο Σχήμα 3.

κηλίδος Western αναλύσεις και πυκνομετρική στοιχεία που δίνονται. A, C: βήτα-ακτίνη, 3d και 7δ? Β, D: ss

1-ιντεγκρίνης, 3d και 7δ? Ε, G: Ki-67, 3 και 7 ημέρες? F, Η: Talin-1, 3 και 7 ημέρες. IL-6 δόσεις: 0,03 ng /mL? 1 ng /mL? 10 ng /mL και 100 ng /mL. Η δόση 0,03 ng /mL είναι η μέγιστη ποσότητα της IL-6 που απελευθερώνεται από τα κύτταρα ML-1 στο υπερκείμενο και μετρήθηκε με ΜΑΡ (σκούρο γκρι στήλες). IL-8 δόσεις: 1 ng /mL? 10 ng /mL? 45 ng /mL και 100 ng /mL. Η δόση 45 ng /mL είναι η μέγιστη ποσότητα της IL-8 που απελευθερώνεται από ML-1 κύτταρα στο υπερκείμενο και μετρήθηκε με ΜΑΡ (σκούρο γκρι στήλες).

Η

Liquid-επικάλυψης τεχνική

Πολυκύτταροι σφαιροειδή όγκου παρήχθησαν με τη βοήθεια του υγρού επικάλυψης τεχνική [24]. καρκίνος του θυρεοειδούς κύτταρα της κυτταρικής γραμμής ML-1 και την κυτταρική γραμμή UCLA RO82-W-1 συλλέχθηκαν από μεγαλώνουν προσκολλημένα συρρέουσες μονοστοιβάδες επιστρώθηκαν σε 96-πλάκες με πολλές εκβαθύνσεις δοκιμή αγαρόζης-επικαλυμμένα (Nunc GmbH, Wiesbaden, Γερμανία) σε μια συγκέντρωση 4000 κύτταρα /200 μL RPMI 1640 και επωάστηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2. Τα κύτταρα διεγείρονται με όχημα, IL-6 (1 ng /ml, 10 ng /mL και 100 ng /mL) και IL-8 (1 ng /ml, 10 ng /mL και 45 ng /mL). Μετά ελήφθησαν 3d και 7η εικόνες και τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στο Σχήμα 4.

A1-A7: αντίθεσης φάσης μικροσκοπικές εικόνες που λαμβάνονται μετά 3d. ML-1 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε φρεάτια αγαρόζης επικαλυμμένα, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα ή διάφορες δόσεις της IL-6 ή IL-8, αντιστοίχως. A8: 3-ημερών σφαιροειδές και προσκολλημένα κύτταρα ML-1 στο CLINO. Β1-Β7: Φωτογραφίες που ελήφθησαν μετά από 3d. RO82-W-1 καρκίνου του θυρεοειδούς κύτταρα αναπτύσσονται σε φρεάτια αγαρόζης επικαλυμμένα, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα ή διάφορες δόσεις της IL-6 ή IL-8, αντιστοίχως. Β8: 3-ημερών σφαιροειδές και προσκολλημένα RO82-W-1 κύτταρα στο CLINO. C1-C7: Εικόνες που λαμβάνονται μετά την 7η. ML-1 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε φρεάτια αγαρόζης επικαλυμμένα, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα ή διάφορες δόσεις της IL-6 ή IL-8, αντιστοίχως. Β8: 7-ημερών σφαιροειδές και προσκολλημένων κυτταρικό πληθυσμό ML-1 μετά από επώαση στο 2D CLINO. D1-D7: εικόνες αντίθεσης φάσης που λαμβάνονται μετά την 7η. RO82-W-1 καρκίνου του θυρεοειδούς κύτταρα αναπτύσσονται σε φρεάτια αγαρόζης επικαλυμμένα, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα ή διάφορες δόσεις της IL-6 ή IL-8, αντιστοίχως. D8:. 7-ημερών MCS και προσκολλημένη RO82-W-1 κύτταρα μετά από καλλιέργεια στην CLINO

Η

Τυχαία θέσης Machine

Το RPM αγοράστηκε από τις διαφημίσεις, πρώην ολλανδική Space , Leyden, τις Κάτω Χώρες (Σχήμα 1Α). την κατασκευή και τη λειτουργία του περιγράφηκε νωρίτερα από van Loon [30]. Αποτελείται από δύο ανεξάρτητες περιστρεφόμενων πλαισίων μέσα στο άλλο. Στα πειράματά μας, η RPM λειτούργησε σε «τυχαίο τρόπο» (60 ° /s), στην οποία κατεύθυνση αλλάζει συνεχώς και τυχαία. Την πάροδο του χρόνου, το διάνυσμα βαρύτητας της Γης εκμηδενίζεται. Κατά τη διάρκεια των πειραμάτων, η RPM φορτώθηκε με έως και 15 εκατοστά Τ25

2 φιάλες που είχαν καθοριστεί στην πλάκα γείωσης του μηχανήματος. Στην πραγματικότητα, όλες οι φιάλες διαμείνει σε απόσταση 7,5 cm από το κέντρο της περιστροφής. Στη σχετικά χαμηλή ταχύτητα (60 ° /s) του RPM, η φυγόκεντρος δύναμη που βιώνουν οι κύτταρα ακόμη και στα πλέον απομακρυσμένα σημεία από το κέντρο της περιστροφής υποτίθεται ότι είναι αμελητέα [30].

2D Clinostat

Η συσκευή 2D CLINO (που κατασκευάζεται από την DLR, Κολωνία, Γερμανία, Σχήμα 1Β) αποτελείται από έξι βραχίονες που επιτρέπουν την περιστροφή των δειγμάτων γύρω από έναν άξονα κάθετο προς τη δύναμη της βαρύτητας [31]. Κάθε περιστρεφόμενος βραχίονας φορτώθηκε με 4 φιάλες διαφανειών, για συνολικά 24 φιάλες ανά εκτέλεση. Από την CLINO, το διάνυσμα βαρύτητας είναι τυχαία η σταθερή και γρήγορη περιστροφή. δόθηκε μεγάλη προσοχή για να εξασφαλιστεί ότι όλες οι φιάλες που έχουν επιλεγεί για clinorotation ήταν απαλλαγμένο από φυσαλίδες αέρα που διαφορετικά θα προκληθεί χαοτική κίνηση ρευστού. Το 2D CLINO περιστρεφόμενο συνεχώς σε 60 rpm παράγει υπολειμματική επιταχύνσεις μέσα στην απόσταση από 3 mm γύρω από το κέντρο περιστροφής της τάξεως των 0.012

g

, ενώ τα κύτταρα βρίσκονται σε περαιτέρω εμπειρία απόσταση μέχρι 0,036

g

[18, 31]. Αν και η βαρύτητα που σχετίζονται με κατώφλι των καρκινικών κυττάρων του θυρεοειδούς είναι άγνωστη, μόνο τα κύτταρα που βρίσκονται μέσα στην απόσταση 3 mm γύρω από τον άξονα περιστροφής συλλέχθηκαν για τις αναλύσεις, που σημαίνει ότι αυτά τα κύτταρα είχαν υποστεί πολύ χαμηλή υπολειμματική επιτάχυνση.

μετρήσεις του ρΗ

Το ρΗ μετρήθηκε με ένα Metrohm 827 δεν πεχάμετρο περισσότερο από 1 ώρα μετά τη λήξη του πειράματος. Όλες οι μετρήσεις έγιναν δύο φορές, και τα δείγματα διατηρήθηκαν σε κλειστούς σωλήνες Eppendorf μέχρι μέτρηση για την αποφυγή αντιδράσεων με ατμοσφαιρικά αέρια.

μικροσκοπία αντίθεσης φάσης

Ο Axiovert 25 Μικροσκόπιο (Carl Zeiss Microscopy, LLC, USA) χρησιμοποιήθηκε για την οπτική παρατήρηση της μορφολογίας των κυττάρων.

κηλίδος Western αναλύσεις

αναλύσεις κηλίδος Western, ανοσοαποτύπωση, και πυκνομετρία εκτελέστηκαν σύμφωνα με ρουτίνα πρωτόκολλα [32-37]. Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση των αντιγόνων: Αντι-βήτα-ακτίνη, και αντι-Talin-1 χρησιμοποιήθηκαν σε αραίωση 1: 1000 (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, ΜΑ, USA)? καθώς και αντι-ιντεγκρίνης βήτα

1 αντίσωμα (Epitomics, Burlingame, USA)? Ki-67 αγοράστηκε από την Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, TX, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής (αραίωση 1: 500)? η δευτερεύουσα, HRP-συνδεδεμένη αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1: 4000 (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, ΜΑ, USA). Ως αφυδρογονάση ελέγχου φόρτωσης 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (ABR-Affinity Bioreagents, Χρυσή, USA? Αραίωση: 1:10 000) χρησιμοποιήθηκε

Οι μεμβράνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ (US National Institutes of Health, Bethesda. , MD, USA?. https://rsb.info.nih.gov/ij/), για densitrometric ποσοτικοποίηση των ζωνών

F-ακτίνης χρώση

F-ακτίνης εμφανίζεται διά χρώση με ροδαμίνη-φαλλοειδίνη (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) και οι πυρήνες βάφτηκαν με Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA), όπως δημοσιεύθηκε νωρίτερα [36, 37]. Τα δείγματα τοποθετήθηκαν με Vectashield (Vector, Burlingame, CA, USA) και αναλύθηκαν με μικροσκόπιο. Τα F-ακτίνης χρωματίζονται δείγματα εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα Zeiss 510 META ανεστραμμένο συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ (Zeiss, Γερμανία), εξοπλισμένο με ένα σχέδιο-Αχρωματικός 63 × 1,4 στόχο. Διέγερσης και εκπομπής μήκη κύματος ήταν: λexc = 488 nm και λem = ≥505 nm για FITC. Στη συνέχεια, τα δείγματα αναλύθηκαν με τη βοήθεια του προγράμματος ανάλυσης εικόνας Scion Image (Έκδοση 1.63 MacOS, Scion Corporation, USA).

μετρήσεις κυτοκινών με τεχνολογία Multi-Ουσία: Profiling

Η απελευθέρωση της κυτοκίνες ερευνήθηκε μέσω πολλών-αναλυτών Profiling (ΜΑΡ) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18, 22]. Για κάθε συνθήκη, πέντε υπερκείμενα συλλέχθηκαν μετά από 72 ώρες και αποθηκεύθηκε στους -80 ° C μέχρι τη δοκιμή. Ο ΧΑΡΤΗΣ διεξήχθη από την εταιρεία Myriad ΔΒΔ (Austin, Texas, USA), που καθόρισαν την Ανθρώπινη κυτοκίνες των επιλογών MAP Α και Β

μέτρηση κυτταροκινών από Enzyme Linked ανοσορροφητική δοκιμασία

IL-6, IL-8, και πρωτεΐνες MCP-1 που απελευθερώνεται από RO82 W–1 κύτταρα στα υπερκείμενα κυτταρικής καλλιέργειας κατά τη διάρκεια πειραμάτων RPM και CLINO ανιχνεύθηκαν με προσδιορισμούς ELISA αγοράσθηκαν από την R &? συστήματα D [38]. Οι δοκιμές ELISA έχουν πραγματοποιηθεί σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που παρέχονται από τον κατασκευαστή.

Στατιστική αξιολόγηση

SPSS 15.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) χρησιμοποιήθηκε για στατιστική αξιολόγηση. Το Mann-Whitney-U-Test εκτελέστηκε για σύγκριση 1 g και s-μα συνθήκες, καθώς και s-μg προσκολλημένα κύτταρα και s-μg κύτταρα MCTS. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD). Οι τιμές των p & lt? 0.05 θεωρήθηκαν σημαντικές.

Αποτελέσματα

Τα κύτταρα των ωοθυλακίων καρκίνου του θυρεοειδούς κυτταρικές σειρές ML-1 και RO82-W-1 καλλιεργήθηκαν για 3d και 7η στο RPM, σχετικά με το 2D CLINO , και υπό κανονικές στατικό εργαστήριο 1

g

-οι όροι. Μέχρι την έβδομη ημέρα, το ρΗ παρέμεινε στην κανονική περιοχή, ανεξάρτητα από το αν τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στο RPM, υπό 1

g

ή στο CLINO. Ωστόσο, τα κύτταρα παρέμειναν αναπτύσσονται σε μονοστιβάδα μόνο εάν η καλλιέργεια πραγματοποιείται υπό 1

g

, ενώ, όταν καλλιεργείται υπό αλλαγμένες συνθήκες βαρύτητας, τα κύτταρα χωρίζονται σε δύο πληθυσμούς των οποίων το ένα αποτελείται κυττάρων που παραμένουν προσκολλημένα, ενώ από την άλλη περιείχαν κύτταρα που σχηματίζουν 3D αδρανών παρόμοιες με εκείνες που περιγράφονται για τα κύτταρα FTC-133 [18].

Λάβαμε παρόμοια αποτελέσματα με τα κύτταρα RO82-W-1 και ML-1. Και οι δύο τύποι κυττάρων πολλαπλασιάστηκαν όπως τα RO82-W-1 κύτταρα που φαίνεται στο σχήμα 2 ως μια προσκολλημένη μονοστιβάδα (Σχ 2Α και 2Ε) και ως πολυκύτταρους σφαιροειδή στο RPM (Σχ 2Β και 2F) και το CLINO (Σχ 2C και 2D). Δεν υπήρχαν διαφορές όσον αφορά τον αριθμό των σφαιροειδή κάθε κυτταρική σειρά που προέκυψαν είτε στο RPM ή του CLINO. Και οι δύο συσκευές παραδίδονται σφαιροειδή διαφόρων μεγεθών (μέγ. Διάμετρος 0,4 mm) και στα δύο χρονικά σημεία, όπως φαίνεται στο σχήμα 2Β, 2C, 2D και 2F. Αποκόλληση των κυττάρων Αϋ άρχισε νωρίς και κυττάρων απόσπαση και σχηματισμός σφαιροειδή εμφανίστηκε επίσης μετά 7δ.

Επιπτώσεις της IL-6 και IL-8 σε ML-1 κύτταρα αναπτύσσονται υπό 1

g

-οι όροι

IL-6 (0,03 ng /ml και 1 ng /mL) διέγερση αύξησε την ποσότητα της β-ακτίνης και SS

1-ιντεγκρίνης πρωτεΐνη σε προσκολλημένα κύτταρα mL-1. Επιπλέον, η IL-8 (1, 10 και 45 ng /mL) αύξησε την περιεκτικότητα πρωτεΐνης βήτα-ακτίνης σε αυτά τα κύτταρα, ενώ μόνο οι υψηλότερες δόσεις (10-100 ng /mL) αυξημένα την περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη των β

1-ιντεγκρίνης εντός 3 ημερών (σχήμα 3Α και 3Β).

Μετά την 7η, αύξηση βρέθηκε για β-ακτίνη πρωτεΐνη σε όλα τα δείγματα IL-6-αγωγή, καθώς και σε δείγματα που κατεργάζονται με 1 και 10 ng /mL IL -8 (Σχήμα 3C). Το SS

1-ιντεγκρίνη πρωτεΐνη προκλήθηκε με 0,03 ng /mL, καθώς και από 10 ng /mL IL-6, ενώ μόνο 10 ng /ml IL-8 που προκαλείται από την ποσότητα της πρωτεΐνης μετά από μια 7-ήμερη-διέγερση (Σχήμα 3D).

Επιπλέον, αμφότερες οι κυτοκίνες (IL-6 και IL-8, όλες οι δόσεις) προκάλεσε μια ανύψωση της περιεκτικότητας σε πρωτεΐνη Ki-67 μετά 3d (Σχήμα 3Ε). Μετά 7δ, όλοι οι IL-6 δόσεις, καθώς και 1 ng /ml και 100 ng /mL IL-8 αύξησε την ποσότητα του Ki-67 πρωτεΐνης σε ML-1 κύτταρα (Σχήμα 3G). Αντίθετα, η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες ταλίνη-1 ήταν σαφώς μειωμένος από την IL-6 και IL-8 εφαρμογή στο μέσο. Χαμηλές δόσεις της IL-6 και όλες οι δόσεις της IL-8 ήταν αποτελεσματικές (Εικ 3F) κατά τη διάρκεια της 3-ημερών-1

g

-experiment. Ένα άλλο αποτέλεσμα βρέθηκε μετά 7δ. IL-6 διέγερση οδήγησε σε αύξηση του ταλίνη-1 (Σχ 3Η). Ένα παρόμοιο εύρημα παρατηρήθηκε στα δείγματα IL-8-αγωγή (1, 10 και 45 ng /mL) της κυτταρικής γραμμής ML-1.

Τα πειράματα αυτά ορίζονται πρώτον, η βέλτιστη IL-6 και IL-8 δόσεις για την έκφραση διακριτών πρωτεϊνών υπό 1

g

-οι όροι και, δεύτερον, οι δόσεις να δοκιμάσουν την επίδρασή τους στην MCS χρησιμοποιώντας τη μέθοδο υγρού επικάλυψης (βλέπε παρακάτω και Σχήμα 4).

Επιπτώσεις της IL-6 και IL-8 στο σχηματισμό σφαιροειδές σύμφωνα με 1

g

-οι όροι

Μετά από 3d, ML-1 κύτταρα έδειξαν μόνο χαλαρά συσσωματώματα κυττάρων, όταν καλλιεργούνται κάτω από 1

g

-οι όροι για αγαρόζης. 10 και 100 ng /mL IL-6 και 1, 10 και 45 ng /mL IL-8 αγωγή είχε ως αποτέλεσμα μια καλύτερη συσσωμάτωση των κυττάρων ML-1 προς σφαιροειδή, όταν καλλιεργούνται σε φρεάτια αγαρόζης επικαλυμμένα (Liquid-επικάλυψη τεχνική) (Εικ 4A1-4A7). RO82-W-1 κύτταρα σχηματίζονται μεγάλες ακανόνιστες συσσωματώματα μετά από μια 3-ημερών επώαση σε φρεάτια αγαρόζης επικαλυμμένα. Και οι δύο κυτοκίνες βελτίωσε το σχηματισμό RO82-W-1 πολυκύτταρων σφαιροειδή χρησιμοποιώντας το υγρό επικάλυψης μέθοδο (Εικ 4B1-4B7).

Μετά την 7η, κυττάρων ML-1 έδειξε ακανόνιστα διαμορφωμένο κυτταρικών αδρανών υλικών σε αγαρόζη. Οι ομάδες κυτοκίνη αγωγή περιείχε διάφορα πυκνά σφαιροειδή μετά από μία εβδομάδα της διέγερσης (Σχ 4C). Τα σφαιροειδή ML-1 σχηματίζεται στην CLINO ήταν παρόμοια με τα σφαιροειδή υγρά επικάλυψη υποβάλλεται σε επεξεργασία με 45 ng /mL IL-8 (Σχ 4C7 και 4C8).

Μετά την 7η, τα RO82-W-1 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μορφή πυκνών πολυκύτταρων σφαιροειδών καθώς και μονά κύτταρα κολύμπι στο υπερκείμενο σε φρεάτια αγαρόζης επικαλυμμένα. εφαρμογή κυτοκίνης στο μέσο ενισχυμένη ελαφρώς το μέγεθος των σφαιροειδών (Εικ 4D1-4D7).

Τα σφαιροειδή και των δύο τύπων κυττάρων που σχηματίζεται μετά IL-6 και IL-8 αγωγή επέδειξε μία παρόμοια μορφολογία από το MCS που παράγονται μετά επώασης στο CLINO (Σχήμα 4Α8, 4B8, 4C8 και 4D8).

έκλυση κυτοκινών από ML-1 κύτταρα

Μέτρηση των κυτοκινών του Ανθρώπου κυτοκίνης επιλογές ΧΑΡΤΗΣ Α και Β που ανιχνεύεται IL- 4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-17, MCP-1, VEGF-Α και ηωταξίνη-1 στα υπερκείμενα των διαφόρων κυτταρικών καλλιεργειών. Μετρήσαμε περίπου 32 pg /ml IL-4 και IL-7 στα υπερκείμενα των καλλιεργειών 3-ημερών κύτταρο, ανεξάρτητα από το αν τα κύτταρα είχαν επωαστεί στο RPM, με CLINO ή στη στατική 1

g

-Έλεγχος. Μετά από μια 7-ήμερη έκθεσης, τα υπερκείμενα κυτταρικής καλλιέργειας περιείχε περίπου 47 pg /ml IL-4 και περίπου 43 pg /ml IL-7, ανεξάρτητα από τις συνθήκες καλλιέργειας (Σχήμα 5Α και 5C). Ένα παρόμοιο φαινόμενο παρατηρήθηκε σε σχέση με το IL-8 και VEGF-A. Περίπου 710 pg /ml VEGF-A και 11.000 pg /mL IL-8 βρέθηκε στα υπερκείμενα των 3-ημερών καλλιεργειών, ανεξάρτητα από το αν τα κύτταρα είχαν επωαστεί στο RPM, με CLINO ή υπό στατική 1

g

-οι όροι. Μετά από μία 7-ημερών έκθεσης, VEGF-Α και IL-8 συγκεντρώσεις ενισχυμένη σε περίπου 3000 pg /ml νΕΟΡ-Α και περίπου 35.000 pg /ml IL-8 ανιχνεύθηκαν, πάλι χωρίς σημαντική διαφορά σε σχέση με τις συνθήκες καλλιέργειας (Σχ 5D και 5F). Στο σύνολό τους, Σχήμα 5Α, 5C, 5D και 5F δείχνουν ότι η περιεκτικότητα της IL-4, IL-7, VEGF-Α και IL-8 στα υπερκείμενα καλλιέργειας ενισχύεται στα 7-ημερών δείγματα σε σύγκριση με το 3- ημέρα-δείγματα, ενώ μια σημαντική επιρροή της έκθεσης των κυττάρων στο RPM ή στο CLINO δεν θα μπορούσε να δει για αυτούς τους 4 τύπους κυτοκινών

α:. IL-4, Β: IL-6, C: IL- 7, D: IL-8, Ε: MCP-1, F: πρωτεΐνες VEGF-A που απελευθερώνεται από ML-1 κύτταρα εντός του υπερκειμένου μετά από ένα 3- και 7-ημερών έκθεση στον RPM ή στο 2D Clinostat, που προσδιορίζεται με πολυ -Analyte προφίλ του υπερκείμενου. RPM: Τυχαία Μηχάνημα τοποθέτησης? CLINO: 2D Clinostat? * Ρ & lt? 0,05

Η

Σε αντίθεση, η συσσώρευση της IL-6 και MCP-1 στα διάφορα υπερκείμενα καλλιέργειας εξαρτάται σαφώς από τις συνθήκες καλλιέργειας. Μια απελευθέρωση του 27 και 33 pg /ml IL-6 βρέθηκε στα υπερκείμενα των δειγμάτων RPM μετά 3δ και 7δ της καλλιέργειας, αντίστοιχα, ενώ ποσό 22,5 pg /ml IL-6 μετρήθηκε σε σχετική 1

g

-controls (Σχήμα 5Β). Ομοίως, μια συγκέντρωση των 24 και 36 pg /ml IL-6 βρέθηκε στα υπερκείμενα των δειγμάτων CLINO μετά από 3 και 7 ημερών πείραμα, αντίστοιχα, ενώ για μια ποσότητα 25 pg /ml IL-6 μετρήθηκε σε σχετικές 1

g

-controls (Σχήμα 5Β). Επιπλέον, τα επίπεδα μονοκυττάρων χημειοελκτική πρωτεΐνη-1 (MCP-1), άλλαξε όταν κύτταρο καλλιέργεια διεξήχθη σε συσκευές που προσομοιώνουν μικροβαρύτητα. Υπό κανονικές συνθήκες βαρύτητος, περίπου 600 pg /ml MCP-1 βρέθηκαν μετά από 3 ημέρες και μεταξύ 700 και 750 pg /mL μετά από 7 ημέρες, ενώ οι συγκεντρώσεις της MCP-1 αυξήθηκε από 750 έως 950 pg /mL για την RPM και από 700 έως 1000 pg /mL στο CLINO (Εικ 5Ε).

Εκτός από τις έξι κυτοκίνες που φαίνεται στο σχήμα 5 ψάξαμε για περαιτέρω κυτοκίνες όπως φαίνεται στον πίνακα 1. Εντούτοις, δεν είχαμε ανιχνεύσει περαιτέρω κυτοκίνες που απελευθερώνονται στο υπερκείμενο κατά τη διάρκεια των τριών ημερών της κυτταρικής καλλιέργειας κάτω από οποιεσδήποτε συνθήκες. Απελευθέρωση της IL-17 και ηωταξίνη ήταν ανιχνεύσιμη σε δείγματα καλλιεργήθηκαν για 7 ημέρες στο CLINO, στο RPM καθώς και στο έδαφος χωρίς σημαντικές διαφορές σε συγκεντρώσεις περίπου 1 pg /mL (IL-17) και 15 pg /mL (εοταξίνη) (Πίνακας 1).

η

έκλυση κυτοκινών από RO82 W-1 κύτταρα-

Ερευνήσαμε την απελευθέρωση των επιλεγμένων κυτοκινών στο υπερκείμενο του RO82 W-1-κύτταρα μετά από ένα 3-ημέρα-έκθεση στον RPM ή τις συσκευές CLINO. Η ποσότητα της IL-6 ήταν σημαντικά αυξημένα από 56,9 pg /mL έως 75,2 pg /mL στο RPM (Σχήμα 6Α). Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα ελήφθη για την IL-8 (Σχήμα 6Β). Μη σημαντικές αυξήσεις για τις δύο κυτοκίνες μετρήθηκαν για τις CLINO-δείγματα.

Η έκκριση MCP-1 κυττάρων RO82-W-1 ήταν πολύ χαμηλότερη από την απελευθέρωση των κυττάρων ML-1 (Σχήματα 5Ε και 6C ). Πολιτισμού RO82 W-1-κύτταρα στο RPM ή την CLINO αμβλύνθηκε εντελώς την απελευθέρωση της MCP-1 (Σχήμα 6C)

Α:. IL-6, Β: IL-8, και C: MCP- 1 πρωτεΐνες που απελευθερώνονται από RO82-W-1 καρκίνος του θυρεοειδούς κύτταρα εντός του υπερκειμένου μετά από μια 3-ημερών έκθεση στον RPM ή στο 2D CLINO, προσδιορίζεται με τεχνική ELISA. RPM: Τυχαία Μηχάνημα τοποθέτησης? CLINO: 2D Clinostat? * P & lt?. 0.05

Η

Επιπτώσεις της προσομοιωμένης μικροβαρύτητας για το κυτταροσκελετού

Από προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι οι πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού των διαφορετικών τύπων κυττάρων έχουν πληγεί σοβαρά από μικροβαρύτητας [11-13, 37, 39-41], εκτελέσαμε χρώση F-ακτίνης σε κύτταρα καλλιεργημένα στην RPM και με 2D CLINO για 3d και 7δ. Μετά από 3 ημέρες, μια συσσώρευση F-ακτίνης κατά μήκος της εξωτερικής κυτταρικής μεμβράνης ήταν ορατή σε κύτταρα ML-1 καθώς επίσης και σε κύτταρα που καλλιεργήθηκαν στο CLINO και το RPM (Σχήμα 7) 1 RO82-W-. Μετά από 7 ημέρες, τα κύτταρα ήταν τελείως συρροή και overgrew κάθε άλλο. Ένα πάχυνση της εξωτερικής μεμβράνης βρέθηκε κάτω από δύο προϋποθέσεις (1

g

και προσομοίωση μικροβαρύτητας), αλλά ήταν πιο έντονη στο RPM και το CLINO

AC:. ML-1 3-ημέρα -πείραμα. Α: ML-1 κύτταρα, 3δ, 1

g

-condition: φυσιολογικά κύτταρα με φυσιολογική κυτταροσκελετό F-ακτίνης Β: κύτταρα ML-1, 3δ, συσσώρευση F-ακτίνης στην εξωτερική κυτταρική μεμβράνη (κίτρινα βέλη ) μετά RPM έκθεσης. Το λευκό βέλος σηματοδοτεί την αποσύνδεση των κυττάρων αδρανών υλικών από το συγκολλητικό στρώμα κυττάρων. C: κύτταρα ML-1, 3δ, παχύτερα στρώματα F-ακτίνης στην εξωτερική κυτταρική μεμβράνη (κίτρινα βέλη). D-F: ML-1 7-ημερών-πείραμα. D: κύτταρα ML-1, 7δ, 1

g

-condition: συρρέοντα φυσιολογικά κύτταρα με φυσιολογική κυτταροσκελετό F-ακτίνης. Ε: ML-1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν στο RPM για 7δ αποκάλυψε παχύτερα στρώματα F-ακτίνης στην εξωτερική μεμβράνη (ένθετο). F: A 7-ημερών-έκθεση των κυττάρων ML-1 στον CLINO προκάλεσε παρόμοιες αλλαγές του F-ακτίνης του κυτταροσκελετού. Το ένθετο δείχνει ticker F-ακτίνης ίνες στα κυτταρικές μεμβράνες. G-I: RO82-W-1 3-ημερών-πείραμα. G: κανονική F-ακτίνης του κυτταροσκελετού των κυττάρων RO82-W-1. Η: σχηματισμός MCS (κίτρινα βέλη) μετά από μια 3 ημερών επώασης για το RPM. Μια συσσώρευση του F-ακτίνης στην εξωτερική κυτταρική μεμβράνη είναι ορατή (κίτρινα βέλη). I: RO82-W-1 καλλιεργήθηκαν για 3D στο clinostat αποκάλυψε μια σαφή πάχυνση των F-ακτίνης ίνες (βέλη). Εισάγετε: 3D MCS. J-L: RO82-W-1 7-ημερών-πείραμα. J: F-ακτίνης του κυτταροσκελετού των κυττάρων συρροής RO82-W-1 καλλιεργούνται σε 1

g

. K, L: σχηματισμός MCS του RO82 W-1-κύτταρα μετά από RPM- (K) και CLINO έκθεσης (L). Τα βέλη δείχνουν την 3D MCS και πάχυνση του F-ακτίνης ίνες στις εξωτερικές μεμβράνες.

Η

κηλίδας Western αναλύσεις της β-ακτίνης σε ML-1 κύτταρα αποκάλυψε μια μείωση μετά 7δ του clinorotation (Εικ 8Α ), αλλά η πρωτεΐνη παρέμεινε αμετάβλητη μετά 7δ του RPM-έκθεσης. Η έκθεση των κυττάρων ML-1 των RPM και clinostat επάγεται σημαντικές μειώσεις των β

1-ιντεγκρίνης στην AD και κυττάρων MCS μετά 7δ (Σχήμα 8Β). πρωτεΐνη Talin-1 ήταν σημαντικά μειωμένη σε μόνο κύτταρα Αϋ, όταν τα κύτταρα ML-1 επωάστηκαν για την CLINO (Σχ 8C). Ki-67 πρωτεΐνη, μία πυρηνική πρωτεΐνη, που συνδέονται με τη διαδικασία κυτταρικό πολλαπλασιασμό, ήταν σημαντικά αυξημένα στα κύτταρα Αϋ σε σύγκριση με MCS και 1

g

-Έλεγχος κύτταρα και στις δύο συσκευές (Εικ 8D).

αναλύσεις Western blot AD: κύτταρα ML-1 μετά από 7 ημερών την έκθεση στο RPM και CLINO. Α: β-ακτίνη, Β: SS

1-ιντεγκρίνης, C: ταλίνη-1 και D: Ki-67 πρωτεΐνες. Οι σαφείς διαφορές μεταξύ των δύο συσκευών που βρέθηκαν για β-ακτίνη. αναλύσεις Western blot Ε-Η: RO82-1 W-κυττάρων μετά από 7 ημερών την έκθεση στο RPM και CLINO. Ε: β-ακτίνη, F: SS

1-ιντεγκρίνης, G: ταλίνη-1 και Η: Ki-67 πρωτεΐνες. Δεν υπήρξε καμία αλλαγή στο β-ακτίνης περιεχόμενο RO82-W-1 κύτταρα που καλλιεργήθηκαν στο RPM ή την CLINO για 7δ. Η ποσότητα των β

1-ιντεγκρίνης και Ki-67 ήταν συγκρίσιμη με τις καλλιέργειες ML-1 αναπτύχθηκαν κάτω από s-μ

g

. * P & lt?. 0.05

Η

Καμία αλλαγή στο β-ακτίνη βρέθηκε σε RO82 W-1-κύτταρα μετά από μια 7-ήμερη-πολιτισμού στο RPM ή την CLINO (Σχήμα 8Ε). Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη του β-ακτίνης παρέμεινε σταθερή.