Abstract

microRNA-34α (MIR-34α), ένας ισχυρός μεσολαβητής της ογκοκατασταλτικών ρ53, έχει αναφερθεί ότι λειτουργεί ως καταστολέας όγκου και miR-34a βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε ιστούς καρκίνου του προστάτη. Μελετήσαμε τις λειτουργικές επιδράσεις του miR-34a επί συμπλοκών μεταγραφική γ-Myc σε PC-3 καρκίνου του προστάτη κύτταρα. Η επιμόλυνση του miR-34a σε κύτταρα PC-3 αναστάλθηκε ισχυρώς

in vitro

κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την κυτταρική εισβολή και προώθησε την απόπτωση. Η επιμόλυνση του miR-34a σε PC-3 κύτταρα επίσης ανέστειλε σημαντικά

in vivo

ανάπτυξης όγκου ξενομοσχεύματος σε γυμνά ποντίκια. miR-34a ρυθμίζεται προς τα κάτω την έκφραση του c-myc ογκογονιδίου μέσω στόχευσης 3 ‘UTR του, όπως φαίνεται από λουσιφεράση δοκιμασίες ανταποκριτή. miR-34a βρέθηκε να καταστείλει RhoA, ένα ρυθμιστή της κυτταρικής μετανάστευσης και εισβολής, καταστέλλοντας συγκρότημα της μεταγραφής c-Myc-Skp2-Miz1 που ενεργοποιεί RhoA. Η υπερέκφραση του c-myc αντιστραφεί καταστολή miR-34a έκφρασης RhoA, γεγονός που υποδηλώνει ότι miR-34a αναστέλλει εισβολή καταστέλλοντας RhoA μέσω c-Myc. miR-34a βρέθηκε επίσης να καταστέλλει c-Myc-pTEFB συγκρότημα επιμήκυνσης της μεταγραφής, υποδεικνύοντας έναν από τους μηχανισμούς με τους οποίους miR-34a έχει έντονη επίδραση στα κυτταρικά λειτουργία. Αυτή είναι η πρώτη έκθεση που τεκμηριώνει ότι το miR-34a καταστέλλει τη συναρμολόγηση και λειτουργία του συγκροτήματος c-Myc-Skp2-Miz1 που ενεργοποιεί RhoA και το συγκρότημα c-Myc-pTEFB που επιμηκύνει τη μεταγραφή διαφόρων γονιδίων, γεγονός που υποδηλώνει ένα μυθιστόρημα ρόλο του ΜΙΚ 34α στη ρύθμιση της μεταγραφής από πολύπλοκες c-Myc

Παράθεση:. Yamamura S, Saini S, Majid S, Hirata η, Ueno Κ, Ντενγκ G, et al. (2012) microRNA-34α διαμορφώνει c-Myc Μεταγραφική Συγκροτήματα για την καταστολή της κακοήθειας σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 7 (1): e29722. doi: 10.1371 /journal.pone.0029722

Επιμέλεια: Alfons Navarro, Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης, Ισπανία

Ελήφθη: 27 Δεκεμβρίου 2010? Αποδεκτές: 3 Δεκέμβρη 2011? Δημοσιεύθηκε: 3 Γενάρη 2012

Copyright: © 2012 Yamamura et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις R01CA138642, T32DK007790 (ΝΙΗ), VA Έρευνας Enhancement Program Award (REAP) και επιχορηγήσεις Merit Review. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα microRNAs (miRNAs) είναι εξαιρετικά διατηρημένη, μονόκλωνα, μη-κωδικοποίησης RNAs περίπου 22 νουκλεοτιδίων που ρυθμίζουν γονιδιακή έκφραση με μετα-μεταγραφική σίγηση συγκεκριμένων mRNAs στόχου, με την καταστολή της μετάφρασης ή διάσπαση μεταγραφές RNA [1]. miRNAs ρυθμίζουν διάφορες κυτταρικές διεργασίες όπως την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, του πολλαπλασιασμού, της απόπτωσης και της ανάπτυξης. έχουν miRNAs δειχθεί ότι λειτουργεί ως ογκογονίδια ή γονίδια καταστολής όγκων [2].

Το ογκοκατασταλτικό ρ53 διαγράφεται ή μεταλλάσσεται σε περισσότερο από το 50% των ανθρώπινων όγκων και είναι ένα βασικό μόριο το οποίο καταστέλλει κακοήθειες [3]. p53 έχει βρεθεί να στοχεύουν την οικογένεια miR-34 [4], [5], [6] και ο έκτοπη έκφραση του miR-34 γονιδίων έχει δραστικές επιπτώσεις επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την επιβίωση. Έκτοπη miR-34a προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην G1 φάση [6], [7] και της απόπτωσης [7], [8]. Όπως p53 έχει βρεθεί να στοχεύσει miR-34a και δεδομένου ότι, διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης είναι επίσης ακραία σημεία ενεργοποίησης ρ53, το γονίδιο miR-34a μπορεί να είναι ένας μεσολαβητής της λειτουργίας ρ53.

Το πρωτο-ογκογονίδιο c-Myc ρυθμίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και μεταμόρφωση τόσο μεταγραφικά και μη μεταγραφικά και συχνά απορυθμισμένη στους ανθρώπινους καρκίνους [9], [10]. c-Myc είναι ένας βασικός παράγοντας μεταγραφής έλικας-βρόχου-έλικα και φερμουάρ λευκίνης που δεσμεύεται με στοιχεία Enhancer Box (E-boxes) και ενεργοποιεί την μεταγραφή των γονιδίων τα οποία διεγείρουν την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και την ανάπτυξη των κυττάρων. c-Myc καταστέλλει τη μεταγραφή γονιδίων που συλλαμβάνουν τον κυτταρικό κύκλο, μέσω Miz1, c-Myc πρωτεΐνη που συνδέεται. c-Myc έχει επίσης μια λειτουργία για να recruite ιστόνης ακετυλτρανσφεράσες (καπέλα). c-Myc αλληλεπιδρά μη-μεταγραφικά με συστατικά του μηχανισμού αντιγραφής να ρυθμίσει θετικά τη σύνθεση του DNA, οδηγώντας σε γενωμική αστάθεια.

c-Myc αναφέρθηκε για την ενεργοποίηση MiR-17-92, ένα πολυσιστρονικό σύμπλεγμα microRNA που αποτελείται από miR -17, 18α, 19α, 20α, 19β και 92α [11], [12]. miR-19 βρέθηκε να είναι η κύρια ογκογόνων συστατικό αυτού του συμπλέγματος, με στόχο την ογκοκατασταλτικό PTEN [13]. miR-34c έχει δειχθεί ότι ρυθμίζουν αρνητικά c-Myc σε απόκριση σε βλάβη του DNA και να αναστέλλουν ο-Μγο-επαγόμενη σύνθεση του DNA [14]. Κατά τη διάρκεια της ογκογονίδιο που προκαλείται από τη γήρανση, miR-34a βρέθηκε επίσης να στοχεύσει c-Myc [15].

Rho ΟΤΡάσες είναι μικρές πρωτεΐνες G που ρυθμίζουν διάφορες κυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της δυναμικής του κυτταροσκελετού, η μετανάστευση, η διακίνηση κυστίδιο, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων , απόπτωση, και μεταγραφή [16], [17], [18]. Rho ΟΤΡάσες, ρυθμιστές τους, και τελεστές τους έχουν προταθεί για τον έλεγχο του σχηματισμού και εξέλιξης του όγκου. RhoA έχει αποδειχθεί για τον έλεγχο της μετάστασης του καρκίνου και της εξέλιξης [19], [20], [21]. Πρόσφατα, ο-Μγο συγκρότημα βρέθηκε να ενεργοποιήσει το γονίδιο RhoA [22].

Η θετική επιμήκυνση της μεταγραφής του παράγοντα β (Ρ-TEFb) ρυθμίζει τον υποκινητή-εγγύς απελευθέρωση παύση της φάσης επιμήκυνσης της μεταγραφής του Pol II [23] και ενσωματώνει τη σύνθεση του mRNA με τροποποίηση ιστονών, την επεξεργασία προ-πιΚΝΑ και πιΚΝΑ εξαγωγή [24]. P-TEFb αποτελείται από κυκλίνη (CycT1, CycT2a, CycT2b ή CycK) και εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση 9 (CDK9) [23]. c-Myc αλληλεπιδρά με κυκλίνη Τ1 (CycT1), το ρυθμιστικό στοιχείο της P-TEFb, και ελέγχει τη φάση επιμήκυνσης της μεταγραφής του Pol II [25], [26], [27].

Η C- Met οδός δυσρυθμισμένη στις περισσότερες ανθρώπινες κακοήθειες και ρυθμίζει το σχηματισμό όγκων και την εξέλιξη της [28], [29]. c-Met αλληλεπιδρά με τον παράγοντα αυξητικού παράγοντα ηπατοκυττάρων /διασποράς και έχει εμπλακεί σε εισβολή όγκου και η μετανάστευση, συμπεριλαμβανομένων PC-3 κύτταρα [30], [31], [32], [33], [34], [35].

Αναφέρουμε εδώ ότι το miR-34a ήταν προς τα κάτω σε ιστούς του καρκίνου του προστάτη. miR-34a ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων

in vitro

,

in vivo

ανάπτυξη του όγκου και προώθησε την απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Βρήκαμε επίσης miR-34a στόχους c-Met και αναστέλλει PC-3 εισβολή των κυττάρων. Ερευνήσαμε τα αποτελέσματα των miR-34a στα δύο συγκροτήματα μεταγραφική γ-Myc. Με τη στόχευση c-myc, miR-34a μείωσε το συγκρότημα c-Myc-Miz-Skp2 που προκαλεί RhoA μεταγραφή και ανέστειλε την εισβολή των κυττάρων, δείχνοντας ότι miR-34a ρυθμίζει έμμεσα RhoA. miR-34a κατέστειλε επίσης το σύμπλοκο ο-Μγο-Ρ-TEFb που παίζει καθοριστικό ρόλο στον έλεγχο της φάσης επιμήκυνσης της μεταγραφής από την RNA πολυμεράση II (ροΙ II), υποδηλώνοντας έναν από τους μηχανισμούς με τους οποίους miR-34a έχει δραματικές συνέπειες στην κυτταρική λειτουργία. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι στον καρκίνο του προστάτη PC-3 κύτταρα miR-34a καταστέλλει τη συναρμολόγηση και τη λειτουργία του συμπλόκου c-Myc που ενεργοποιεί ή επιμηκύνει μεταγραφή, αποκαλύπτοντας μία νέα ρόλος του miR-34a στην ρύθμιση της μεταγραφής από το c-Myc.

Αποτελέσματα

miR-34a είναι μειωτικά στον καρκίνο του προστάτη

Εξετάσαμε τα επίπεδα έκφρασης του miR-34a στη σύλληψη λέιζερ μικροτομή (LCM) σε ιστούς του καρκίνου του προστάτη (n = 10) και να συνδυαστούν γειτονικό φυσιολογικό περιοχές με πραγματικού χρόνου PCR. Όλοι οι ιστοί του καρκίνου έδειξαν χαμηλότερα επίπεδα miR-34a σε σύγκριση με συμφωνημένα παρακείμενο φυσιολογικό περιοχές, αποδεικνύοντας ότι miR-34a είναι μειωτικά στον καρκίνο (Εικ. 1Α). Η ιστολογική στοιχεία δείχνουν ότι οι ιστοί αυτοί είναι αδενοκαρκίνωμα με Gleason σκορ 6 ή 7. πρότυπα Gleason και άλλα κλινικά δεδομένα παρουσιάζονται στον Πίνακα S1.

(A) Σχετική έκφραση του miR-34a στη σύλληψη λέιζερ μικροτομή (LCM) του προστάτη καρκινικούς ιστούς (C) και συμφωνημένα γειτονικό φυσιολογικό περιοχές (Ν). (Β) miR-34a υπερέκφραση καταστέλλει μαλακό άγαρ σχηματισμού αποικίας ενός σταθερά διαμολυσμένη κυτταρική σειρά miR-34a PC-3. Μετά από 14 ημέρες επώασης, μετρήθηκαν οι αποικίες με πάνω από 50 κύτταρα. Οι τιμές κανονικοποιούνται προς εκείνες του ελέγχου. (C) Εκπρόσωπος εικόνες των αποικιών. αναστέλλει (D) miR-34a

in vivo

την ανάπτυξη του όγκου. Χρονική πορεία της ανάπτυξης του όγκου σε γυμνά ποντίκια μετά από υποδόρια ένεση μιας σταθερώς επιμολυσμένα miR-34a PC-3 κυτταρική γραμμή ή ελέγχου κυτταρική γραμμή. *, P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο. (Ε) Αντιπροσωπευτικές εικόνες των όγκων σε γυμνούς ποντικούς σε 5 εβδομάδες μετά την υποδόρια ένεση μιας σταθερώς επιμολυσμένα miR-34a PC-3 κυτταρική γραμμή ή ελέγχου κυτταρική γραμμή. (F) miR-34a επάγει απόπτωση σε κύτταρα PC-3. κύτταρα PC-3 επιμολύνθηκαν με προ-miR αρνητικό έλεγχο (NC) ή προ-miR-34a για 3 ημέρες. κύτταρα PC-3 βάφτηκαν με AnnexinV-FITC /7-AAD και απόπτωση αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα στοιχεία δείχνουν το ποσοστό των πρώιμων αποπτωτικών και αποπτωτικών κυττάρων από το συνολικό πληθυσμό κυττάρων PC-3 κύτταρα. *, P & lt?. 0.05 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

προσδιορίστηκαν επίσης τα επίπεδα έκφρασης του miR-34a σε κακοήθη και μη κακοήθη κύτταρα του προστάτη RWPE-1 (, LNCaP και DU145 κύτταρα PC-3). Real-time RT-PCR αποκάλυψε ότι το επίπεδο έκφρασης της miR-34a ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε κύτταρα PC-3 σε σύγκριση με κύτταρα μη-κακοήθεις κυτταρικές επιθηλιακών προστάτη RWPE-1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό το αποτέλεσμα ήταν σύμφωνο με τις προηγουμένως αναφερθείσες δεδομένα χρησιμοποιώντας PrEC φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα ανθρώπινου προστάτη [36]. Μπορούμε επίσης σύγκριση των επιπέδων έκφρασης του miR-34a σε κακοήθη κύτταρα του προστάτη και η μικροτομή σύλληψης λέιζερ (LCM) προστάτη φυσιολογικούς ιστούς (n = 10). Real-time RT-PCR έδειξε ότι το επίπεδο έκφρασης της miR-34a ήταν χαμηλότερη σε κακοήθη κύτταρα του προστάτη σε σύγκριση με το μέσο όρο του επιπέδου έκφρασης του miR-34a στους φυσιολογικούς ιστούς (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα ήταν επίσης συνεπής με τα προηγούμενα αναφερθέντα δεδομένα χρησιμοποιώντας κανονικούς ανθρώπινους ιστούς [37].

miR-34a αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του PC 3-κύτταρα

Για να μελετηθεί η επίδραση της miR-34a σε η ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη, έχουμε παροδικά επιμολυσμένα αρκετές κυτταρικές σειρές με προ-miR αρνητικό έλεγχο (NC) ή προ-miR-34a. Η παροδική επιμόλυνση των προ-miR-34a αυξημένα επίπεδα miR-34a σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη (Σχ. S1 Α). δοκιμασία MTS έδειξαν ότι miR-34a ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό PC-3 κατά περίπου 40% την ημέρα 4, αλλά δεν είχε σημαντική επίδραση επί LNCaP και κυττάρων DU145 (Εικ. S2A). Μια πρόσφατη έκθεση δείχνει ότι κύτταρα PC-3 έχουν χαρακτηριστικά προστάτη καρκίνωμα μικρών κυττάρων και όχι των αδενοκαρκινώματος [38], ωστόσο χρησιμοποιήσαμε κύτταρα PC-3 για περαιτέρω μελέτη επειδή η επίδραση καταστολής πολλαπλασιασμού του miR-34a ήταν σημαντική, η οποία ήταν σύμφωνη με τα προηγουμένως αναφερθέντα δεδομένα [36]. Παροδική επιμόλυνση των προ-miR-34a προκάλεσαν επίσης σημαντικές μορφολογικές αλλαγές στα κύτταρα PC-3 (Εικ. S2B).

Σας απασχολούσε λεντοϊού σύστημα για να εκφράσουν miR-34a. Το φακοϊικών σύστημα HIV, που εκφράζουν miR-34a ή φορέα ελέγχου, χρησιμοποιήθηκε για να μολύνει κύτταρα PC-3 και τα μολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν με πουρομυκίνη. Η σταθερή επιμόλυνση των προ-miR-34a αυξημένα επίπεδα miR-34a σε PC-3 κύτταρα (Σχ. S1B). Πραγματοποιήσαμε προσδιορισμού σχηματισμού αποικίας μαλακού άγαρ χρησιμοποιώντας τα μολυσμένα κύτταρα PC-3 που εκφράζουν miR-34a ή τον έλεγχο. miR-34a μείωση του αριθμού αποικιών έως περίπου 20% αυτής του ελέγχου, δείχνοντας ότι miR-34a ανέστειλε σημαντικά την ικανότητα σχηματισμού PC-3 κύτταρα (Σχ. 1 Β και C) αποικίας.

Για να εξεταστούν οι επιδράσεις της η έκτοπη έκφραση του miR-34a στο

in vivo

ανάπτυξη του όγκου, εμείς υποδόρια ένεση τη σταθερή miR-34a ή την κυτταρική γραμμή ελέγχου σε γυμνά ποντίκια. Οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν κάθε 7 ημέρες για 5 εβδομάδες μετά την ένεση. Ξενομοσχεύματος όγκους από PC-3 κύτταρα που υπερεκφράζουν miR-34a ήταν μικρότερες από ξενομοσχεύματος όγκους από τα κύτταρα ελέγχου. Την εβδομάδα 5, τα μεγέθη των όγκων ξενομοσχευμάτων ελέγχου ήταν περίπου 5 φορές μεγαλύτερα από εκείνα των ξενομοσχευμάτων miR-34a, υποδεικνύοντας ότι η έκτοπη έκφραση του miR-34a κατέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου in vivo (Σχ. 1D και Ε).

Δεδομένου ότι η έκτοπη έκφραση του miR-34a κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PC-3, μελετήσαμε την επόμενη τις επιδράσεις του miR-34a επί της απόπτωσης σε κύτταρα PC-3 με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής. Βρήκαμε ότι η έκτοπη έκφραση του miR-34a αυξημένη PC-3 απόπτωση των κυττάρων να about4 φορές από ότι οι έλεγχοι (1Ρ και η Εικ. S3), καταδεικνύοντας ότι miR-34a έχει αποπτωτική δραστικότητα σε κύτταρα PC-3.

miR-34a αναστέλλει τον κυτταρικό εισβολή και τη μετανάστευση

Πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία φρεατίων εισβολή χρησιμοποιώντας Matrigel να διερευνήσει την επίδραση του miR-34a στην επεμβατική ικανότητα του PC-3 κύτταρα. Εμείς παροδικά επιμολυσμένα PC-3 κύτταρα με προ-miR αρνητικό έλεγχο (NC) ή προ-miR-34a και υποβλήθηκαν τα επιμολυσμένα κύτταρα να Transwell δοκιμασία εισβολής. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι σαφώς miR-34 μειώνεται εισβολή του PC-3 κύτταρα στο 20% εκείνης των ελέγχων (Σχ. 2Α και Β). Επούλωση πληγών δοκιμασία έδειξε επίσης ότι miR-34a μείωσε σημαντικά τη μετανάστευση των PC-3 κύτταρα (Σχ. 2C και D).

(Α) miR-34a αναστέλλει την εισβολή του PC-3 κύτταρα. κύτταρα PC-3 επιμολύνθηκαν παροδικά με προ-miR αρνητικό έλεγχο (NC) ή προ-miR-34a για 48 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία Transwell εισβολή. Οι τιμές κανονικοποιούνται προς εκείνες του NC. *, P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο. (Β) Εκπρόσωπος εικόνες των εισέβαλε κύτταρα. (C) miR-34a αναστέλλει την επούλωση των πληγών του PC-3 κύτταρα. κύτταρα PC-3 επιμολύνθηκαν παροδικά με προ-miR αρνητικό έλεγχο (NC) ή προ-miR-34a για 48 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε επούλωση πληγών δοκιμασίας. Το πλάτος του παραμένει ανοικτή πληγή υπολογίζεται σε σχέση με το διαχωρισμό στο χρόνο 0 h. *, P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο. (Δ) Εκπρόσωπος εικόνες της πληγής δοκιμασία επούλωσης.

Η

στόχων miR-34a c-Myc και c-Met

ογκογονίδια, c-Met και c-myc, έχουν προβλέψει δεσμευτική sites για miR-34a στο 3′-UTRs τους (Εικ. S4). c-Met έχει 2 προβλεπόμενες θέσεις πρόσδεσης για miR-34a σε 3′-UTRs (Εικ. S3) του. Εμείς κλωνοποιημένα τις υποτιθέμενες στόχους miR-34a στα 3’UTRs σε ένα κατασκεύασμα λουσιφεράσης. Λουσιφεράσης δοκιμασίες ρεπόρτερ με miR-34a-εκφράζουν PC-3 κύτταρα έδειξαν ότι miR-34a καταστέλλεται δραστικότητα λουσιφεράσης. Μετάλλαξη των υποθετικών θέσεων στόχων miR-34a σε αυτές UTRs μείωσε την απόκριση σε miR-34a. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι miR-34a προσδένεται στο 3′-UTRs του c-myc και c-Met (Σχ. 3Α).

(Α) κύτταρα PC-3 επιμολύνθηκαν παροδικά με προ-miR αρνητικό έλεγχο (NC) ή προ-miR-34a ή προ-miR-con για 8 ώρες, που ακολουθείται από παροδική επιμόλυνση με πλασμίδια ανταποκριτές έλεγχο ή 3’UTR πλασμιδίων για 48 ώρες. δραστηριότητα ανταποκριτή 3’UTR μετρήθηκε με δοκιμασία λουσιφεράσης και ομαλοποιήθηκε ως προς δραστηριότητα της λουσιφεράσης της Renilla. *, P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο. (Β) κύτταρα PC-3 επιμολύνθηκαν παροδικά με προ-miR αρνητικό έλεγχο (NC) ή προ-miR-34a ή προ-miR-con για 72 ώρες. επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης αναλύθηκε με κηλίδα Western.

Η

Εξετάσαμε τις επιδράσεις της διαμόλυνσης miR-34a σχετικά με τα επίπεδα πρωτεΐνης αυτών των γονιδίων. Η επιμόλυνση του miR-34a μείωσε τα επίπεδα της πρωτεΐνης του c-Met και c-myc, πρωτεΐνη σε κύτταρα PC-3 (Εικ. 3Β). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι miR-34a στοχεύει άμεσα c-Met και c-Myc μέσω σύνδεσης προς 3’UTRs τους σε PC-3 κύτταρα. miR-34a επίσης μείωσε τα επίπεδα του παράγοντα μεταγραφής E2F1 η οποία ρυθμίζει τον κυτταρικό κύκλο, την αντιγραφή του DNA και την κυτταρική πολλαπλασιασμού (Σχ. 3Β).

miR-34a αναστέλλει RhoA και καταστέλλει τη συναρμολόγηση του c-myc μεταγραφικό σύμπλοκο

Το σύμπλοκο μεταγραφικού ο-Μγο-Skp2-Miz1 έχει βρεθεί ότι ενεργοποιούν το γονίδιο RhoA και να είναι κρίσιμη για την κυτταρική εισβολή και τη μετάσταση του καρκίνου [22]. Επειδή βρήκαμε ότι το c-Myc είναι ένας στόχος του miR-34a, προς τα κάτω ρύθμιση έτσι την έκφραση του c-myc, εξετάσαμε αν η ρύθμιση προς τα κάτω του c-myc με miR-34a οδηγεί σε μείωση της έκφρασης RhoA καταστέλλοντας συναρμολόγηση του c- myc-Skp2-Miz1 συγκρότημα. Real-time PCR έδειξε miR-34a μειωμένο επίπεδο RhoA mRNA (Σχ. 4Α) και στύπωμα Western αποκάλυψαν ότι miR-34a ελαττωμένη RhoA έκφραση της πρωτεΐνης (Εικ. 4Β).

κύτταρα PC-3 επιμολύνθηκαν παροδικά με προ αρνητικός έλεγχος -miR (NC) ή προ-miR-34a για 72 ώρες. επίπεδο (Α) RhoA mRNA αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR. έκφραση της πρωτεΐνης (Β) RhoA αναλύθηκε με στύπωμα Western. (C) c-Myc γκρεμίζει ενδογενή Miz1, Skp2 και Max σε κύτταρα PC-3. κύτταρα PC-3 επιμολύνθηκαν παροδικά με προ-miR αρνητικό έλεγχο (NC) ή προ-miR-34a για 72 ώρες και το συνολικό προϊόντα λύσης κυττάρου ανοσοκαταβυθίστηκαν με c-Myc αντίσωμα ή IgG (έλεγχος), που ακολουθείται από ανάλυση κηλίδος Western. (D) miR-34a μειώνει την πρόσληψη του c-myc με τον υποκινητή RhoA. κύτταρα PC-3 επιμολύνθηκαν παροδικά με προ-miR αρνητικό έλεγχο (NC) ή προ-miR-34a για 72 ώρες και οι δοκιμασίες διεξήχθησαν ChIP. *, P & lt?. 0.05 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Πραγματοποιήσαμε ανοσοκατακρήμνιση (ΙΡ) για να μελετήσει τη συναρμολόγηση του συγκροτήματος της μεταγραφής c-Myc-Skp2-Miz1 στο miR-34a επιμολυσμένα κύτταρα. ΙΡ (Εικ. 4C) αποκάλυψε ότι το αντι-ο-Μγο ανοσοκαθιζήματα περιείχαν Miz1, Skp2 και Max (λωρίδα 5), αλλά όχι αντι-IgG (έλεγχος) ανοσοϊζήματα (λωρίδα 3), υποδεικνύοντας ότι το σύμπλεγμα ο-Μγο-Skp2-Miz1 είχε σχηματίζονται σε κύτταρα PC-3. IP έδειξε επίσης ότι miR-34a μείωσε τα επίπεδα αυτών των συστατικών στα ανοσοκαθιζήματα c-Myc [λωρίδες 4 (έλεγχος) και 6], υποδεικνύοντας ότι miR-34a κατέστειλε τη συναρμολόγηση του συγκροτήματος της μεταγραφής c-Myc-Skp2-Miz1 στο PC- 3 κύτταρα. miR-34a δεν μείωσε σημαντικά Skp2 στα ανοσοϊζήματα σε σύγκριση με τα άλλα συστατικά.

Πραγματοποιήσαμε ανοσοκαθίζηση χρωματίνης (chip) θα δοκιμασίες για να εξεταστεί αν miR-34a μειώνει σύνδεση του c-Myc προς την περιοχή προαγωγού RhoA περιέχουν E κουτιών 5 και 6, το οποίο είναι ένα κύριο σημείο δέσμευσης του c-myc [22]. Η δοκιμασία έδειξε ότι ChIP ενδογενές c-Myc δεσμεύεται στην Ε-κουτιά 5 και 6 και τα πειράματα ελέγχου έδειξαν ότι η RNA πολυμεράση II σύνδεση με τον υποκινητή αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) δεν μεταβλήθηκε (Εικ. 4D). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι miR-34a μείωσε την πρόσληψη του συμπλόκου c-Myc-Skp2-Miz1 με τον υποκινητή RhoA και μειώνει την έκφραση RhoA.

Η υπερέκφραση του c-myc αντιστρέφει την αναστολή της εισβολής

Για να καθοριστεί εάν η αναστολή της εισβολής miR-34a θα μπορούσε να αντιστραφεί μέσω αποκατάσταση του c-myc, επιμολύναμε κύτταρα PC-3 με ένα πλασμίδιο έκφρασης c-Myc μαζί με προ-miR-34a. c-Myc υπερέκφραση διασώθηκαν μερικώς έκφραση RhoA (Σχ. 5Α, συγκρίνετε λωρίδα 4 με 3) και miR-34-επαγόμενη καταστολή της εισβολής (Εικ. 5Β), υποδηλώνοντας ότι miR-34a αναστέλλει την εισβολή, τουλάχιστον εν μέρει, μέσω μείωσης RhoA από στόχευση c-Myc.

(Α) κύτταρα PC-3 διαμολύνθηκαν παροδικά με μόνο pCMV6-εισόδου ή pCMV6-entry-c-Myc για 8 ώρες ακολουθούμενη από παροδική επιμόλυνση με προ-miR αρνητικό έλεγχο (NC) ή προ-miR-34a για 72 ώρες. επίπεδο πρωτεΐνη αναλύθηκε με κηλίδα Western. έκφρασης (Β) γ-Myc διασώζει μερικώς αναστολή της εισβολής που προκαλείται από miR-34a. PC3 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με pCMV6-ΕΙΣΟΔΟΥ μόνο (έλεγχος) ή pCMV6-entry-c-Myc για 8 ώρες που ακολουθείται από επιμόλυνση με προ-miR αρνητικό έλεγχο (NC) ή προ-miR-34a για 48 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία Transwell εισβολή. *, P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο. (C) Εκπρόσωπος εικόνες εισέβαλε κύτταρα.

Η

miR-34a καταστέλλει τη συναρμολόγηση του c-myc-Ρ-TEFb συγκρότημα

Η θετική επιμήκυνση της μεταγραφής του παράγοντα β (P-TEFb) παίζει ένα βασικό ρόλο στον έλεγχο της φάσης επιμήκυνσης της μεταγραφής από την RNA πολυμεράση II (ροΙ II) [23]. Είναι μια εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση αποτελείται από CDK9 andcyclin. c-Myc έχει δειχθεί ότι αλληλεπιδρά με Ρ-TEFb μέσω CycT1 και ρυθμίζουν επιμήκυνση της μεταγραφής [25], [26], [27]. Δεδομένου ότι οι στόχοι miR-34a-c Myc, εκτελέσαμε ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) για να μελετήσει τη συναρμολόγηση του συμπλόκου επιμήκυνσης της μεταγραφής c-Myc-pTEFB σε Mir-34α-επιμολυσμένα κύτταρα PC-3. IP (Σχ. 6Α) αποκάλυψε ότι η αντι-ο-Μγο αντίσωμα που γκρέμισαν CycT1, CDK9 και Max (λωρίδα 5), αλλά IgG (έλεγχος) δεν γκρεμίζουν αυτές τις πρωτεΐνες (λωρίδα 3), υποδεικνύοντας ότι το c-Myc αλληλεπιδράσει με P- TEFb. IP έδειξε επίσης ότι miR-34a μείωσε την ποσότητα ρ-TEFb στα ανοσοκαθιζήματα c-Myc σε κύτταρα PC-3 [λωρίδες 4 (έλεγχος) και 6], υποδεικνύοντας ότι miR-34a κατέστειλε συναρμολόγηση του c-Myc-P- TEFb συγκρότημα σε PC-3 κύτταρα.

(Α) miR-34a καταστέλλει το σχηματισμό του ενδογενούς συμπλόκου c-Myc-Ρ-TEFb. κύτταρα PC-3 επιμολύνθηκαν παροδικά με προ-miR αρνητικό έλεγχο (NC) ή προ-miR-34a για 72 ώρες και το συνολικό προϊόντα λύσης κυττάρου ανοσοκαταβυθίστηκαν με c-Myc αντίσωμα ή IgG (έλεγχος), που ακολουθείται από ανάλυση κηλίδος Western. (Β) miR-34a καταστέλλει την έκφραση CAD και mRNA NUC και DRB revereses την καταστολή. PC-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με 20 μΜ της DRB για 12 ώρες και επιμολύνθηκαν παροδικά με προ-miR αρνητικό έλεγχο (NC) ή προ-miR-34a για 48 ώρες. CAD και το επίπεδο NUC mRNA αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR.

Η

c-Myc αναφέρθηκε στην ενεργοποίηση της μεταγραφής του CAD, καρβαμοϋλο-φωσφορικής συνθάσης /ασπαρτικό τρανσκαρβαμοϋλάση /διυδροοροτάση, και NUC με την τόνωση της κάθαρσης υποκινητή και επιμήκυνση, μέσω πρόσληψης της Ρ-TEFb [25], [39], [40]. Μελετήσαμε εάν miR-34a επηρέασε το επίπεδο έκφρασης των CAD και NUC χρησιμοποιώντας DRB (5,6-δι-χλωρο-1-BD-ριβοφουρανοσυλ-bensimidazole), η οποία καταστέλλει ειδικά την έκφραση του c-myc-απόκρισης CAD και NUC με αναστολή P-TEFb [ ,,,0],40]. Βρήκαμε ότι miR-34a μειώθηκε CAD και mRNA έκφραση NUC σε PC-3 κύτταρα ενώ DRB αποκατέστησε την έκφραση (Σχ. 6Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι miR-34a καταστέλλεται αυτά τα γονίδια με την καταστολή του συμπλόκου c-Myc-pTEFb.

Η υπερέκφραση του c-Met αντιστρέφει την αναστολή της εισβολής

Έχει προταθεί ότι αναστέλλει miR-34a κελί εισβολή σε ένα c-Met-εξαρτώμενο τρόπο [41], [42]. Ως εκ τούτου, μελετήσαμε επιδράσεις του miR-34a για c-Met και εισβολή αφού στόχους miR-34a c-Met (Εικ. 1). PC-3 κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα πλασμίδιο έκφρασης c-Met μαζί με προ-miR-34a. επίπεδα έκφρασης c-Met εξετάστηκαν με Western blot η οποία έδειξε ότι η έκφραση του c-Met αυξήθηκε στα c-Met επιμολυσμένα κύτταρα (Εικ. 7Α). c-Met προωθείται εισβολή σε πειράματα ελέγχου. c-Met αντιστραφεί miR-34-επαγόμενη καταστολή της εισβολής, υποδεικνύοντας ότι miR-34a αναστέλλει την εισβολή, τουλάχιστον εν μέρει, με στοχοθέτηση c-Met (Σχ. 7Β και C).

(Α) PC-3 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με μόνο pCMV6-εισόδου ή pCMV6-entry-c-Met για 8 ώρες ακολουθούμενη από παροδική επιμόλυνση με προ-miR αρνητικό έλεγχο (NC) ή προ-miR-34a για 72 ώρες. επίπεδο πρωτεΐνη αναλύθηκε με κηλίδα Western. έκφρασης (Β) γ-Met διασώζει μερικώς αναστολή της εισβολής που προκαλείται από miR-34a. PC3 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με pCMV6-ΕΙΣΟΔΟΥ μόνο (έλεγχος) ή pCMV6-entry-c-Met για 8 ώρες που ακολουθείται από επιμόλυνση με προ-miR αρνητικό έλεγχο (NC) ή προ-miR-34a για 48 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία Transwell εισβολή. *, P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο. (C) Εκπρόσωπος εικόνες εισέβαλε κύτταρα.

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη δείξαμε για πρώτη φορά τα λειτουργικά αποτελέσματα του miR-34a σε συγκροτήματα μεταγραφική γ-Myc στο PC- 3 κυττάρων καρκίνου του προστάτη. Βρήκαμε ότι η έκφραση miR-34a ρυθμίζεται προς τα κάτω ιστός καρκίνου του προστάτη και ότι miR-34a επανέκφραση ισχυρώς αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων,

in vivo

ανάπτυξη ξενομοσχεύματος και κυτταρική διείσδυση. Δείξαμε ότι miR-34a ανέστειλε c-Myc με σύνδεση προς 3’UTR της σε κύτταρα PC-3 και κατέστειλε συναρμολόγηση των συμπλοκών μεταγραφικής c-Myc. Οι μεταλλάξεις του c-myc που βρέθηκαν σε διάφορους καρκίνους και απορυθμισμένη έκφραση του προκαλεί την ανεξέλεγκτη έκφραση πολλών γονιδίων μερικά από τα οποία ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και τα αποτελέσματα στην ανάπτυξη του όγκου [43], [44]. Αν και c-Myc μόνη της δεν είναι σε θέση να μετατρέψει τα κύτταρα και απαιτεί συνεργαζόμενο ογκογονιδίου όπως ογκογονίδιο ras [45], c-Myc είναι ένας σημαντικός παράγοντας στην ανάπτυξη του όγκου. Έτσι, η αναστολή της c-Myc πιστεύεται ότι είναι μια σημαντική λειτουργία του miR-34a. Δείξαμε επίσης ότι miR-34a ανέστειλε PC-3 εισβολή των κυττάρων με τη στόχευση c-Met.

Rho ΘΤΡάσες, μια οικογένεια μικρών πρωτεϊνών G, ρυθμίζουν τη δυναμική ενδοκυτταρικής ακτίνης, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων της πολικότητας, της μετανάστευσης, της διακίνησης κύστη κ.λπ. Αυτά μόρια ρυθμίζουν επίσης τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση, γονιδιακή έκφραση [17]. RhoA, ένα μέλος της οικογένειας Rho του GTPases, εμπλέκεται στο μετασχηματισμό και μετάσταση. RhoA έχει δειχθεί ότι είναι ένας σημαντικός παράγοντας που σχετίζεται με διάφορους ανθρώπινους καρκίνους [46].

Το σύμπλοκο μεταγραφικού ο-Μγο-Skp2-Miz1 έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι ενεργοποιεί RhoA και είναι ουσιώδες για την κυτταρική εισβολή και τον καρκίνο μετάσταση [22]. Βρήκαμε ότι το c-Myc είναι ένας στόχος του miR-34a σε PC-3 κύτταρα, και μελετήθηκε η επίδραση του miR-34a στην ενεργοποίηση RhoA μέσω του συμπλόκου της μεταγραφής c-Myc-Skp2-Miz1. miR-34a μειωμένη έκφραση RhoA και υπερέκφραση του c-myc αντέστρεψε την μείωση του RhoA και την αναστολή της κυτταρικής εισβολής. δοκιμασία ChIP αποκάλυψε miR-34a καταστέλλει την πρόσληψη του c-myc με τον υποκινητή RhoA. Έχουμε αποδείξει ότι miR-34a καταστέλλεται RhoA μεταγραφή μειώνοντας το συγκρότημα της μεταγραφής c-Myc-Skp2-Miz1. Τα στοιχεία αυτά τεκμηριώνουν το γεγονός ότι miR-34a καταστέλλει την ενεργοποίηση των RhoA κατά την έναρξη της μεταγραφής μέσω της στόχευσης c-Myc. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι miR-34a καταστέλλει τη συναρμολόγηση και λειτουργία του συγκροτήματος c-Myc που ενεργοποιεί τη μεταγραφή του RhoA.

Η θετική επιμήκυνση της μεταγραφής του παράγοντα β (P-TEFb) ρυθμίζει τον προαγωγό-εγγύς απελευθέρωση παύση της επιμήκυνσης φάση της μεταγραφής του Pol II [23]. c-Myc αλληλεπιδρά με CycT1, το ρυθμιστικό συστατικό του Ρ-TEFb, και ελέγχει τη φάση επιμήκυνσης της μεταγραφής του Ροΐ II [25], [26], [27]. P-TEFb είναι παγκοσμίως που απαιτούνται για την παραγωγή των mRNA και της έκφρασης του γονιδίου [27], [47] και στρατολογείται σε γονίδια από μια ποικιλία παραγόντων μεταγραφής [23], [48]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι miR-34a καταστέλλει τη συναρμολόγηση και τη λειτουργία του συμπλόκου c-Myc που επιμηκύνεται μεταγραφή. Είναι γνωστό ότι η Ρ-TEFb εμπλέκεται σε παρεκκλίνουσα μεταγραφική επιμήκυνση σε μεικτές-συγγενικής λευχαιμία (MLL) [49], [50]. Διάφορες κυτταρικές σειρές όγκων υπερεκφράζουν Ρ-TEFb και CycT1 υπερέκφραση προωθεί τη μετατροπή και την ανάπτυξη του όγκου [51]. Η μελέτη μας δείχνει εδώ ότι miR-34a καταργεί το συγκρότημα c-Myc-Ρ-TEFb στοχεύοντας c-Myc. Συσσωρευμένα στοιχεία έχουν δείξει τη σημασία της P-TEFb σε κακοήθεια, συνδέοντας έτσι miR-34a έως P-TEFb είναι ένα σημαντικό εύρημα στη βιολογία του καρκίνου. Η μελέτη μας δίνει εν μέρει λογαριασμό των παγκόσμιων και βαθιές συνέπειες του miR-34a για τις κυτταρικές διεργασίες αποδειχθεί εδώ και σε προηγούμενες εκθέσεις [4], [5], [7], [8].

Όσον αφορά όπως γνωρίζουμε, τα αποτελέσματα των microRNAs για τη συναρμολόγηση των πρωτεϊνικών συμπλόκων δεν έχουν αναφερθεί ποτέ. Εδώ αναφέρουμε τα αποτελέσματα των miR-34a στο συγκρότημα του c-myc λειτουργικά συγκροτήματα, το c-Myc-Skp2-Miz1 και συγκροτήματα c-Myc-Ρ-TEFb. c-Myc ενεργοποιεί μια ποικιλία γονιδίων ως μέρος ενός συμπλόκου πρωτεΐνης, ρυθμίζει μεταγραφικής επιμήκυνσης και κυρίως λειτουργίες μέσω διαφορετικών σύμπλοκα με άλλες πρωτεΐνες. Τα αποτελέσματα του miR-34a σε αυτά τα λειτουργικά συγκροτήματα c-Myc παρέχουν άμεση απόδειξη του πώς λειτουργεί miR-34a για να καταστείλει c-Myc. Τα σύμπλοκα c-Myc που επάγεται από miR-34a ήταν ετερογενής, δεδομένου ότι οι αναλογίες των συστατικών ήταν διαφορετικές από εκείνες των ανοσοσυμπλόκων ελέγχου (Σχ. 4C και 6Α). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα σύμπλοκα τροποποιήθηκαν με miR-34a, προτείνοντας ένα νέο συγκρότημα συναρμολόγησης. Η αλλοίωση των συμπλοκών c-Myc με miR-34a δείχνει επίσης ότι η καταστολή του συγκροτήματος των συμπλοκών c-Myc μπορεί να περιλαμβάνει άγνωστους μηχανισμούς σε Εκτός από την απλή μείωση της ποσότητας του c-myc πρωτεΐνης με miR-34a αφού ΜΙΚ 34α έχει δραματικές συνέπειες για τις κυτταρικές διεργασίες.

Εν κατακλείδι έχουμε δείξει για πρώτη φορά ότι το miR-34a καταστέλλει τη συναρμολόγηση και λειτουργία του συγκροτήματος c-Myc-Skp2-Miz1 που ενεργοποιεί RhoA και το c-Myc- pTEFB συγκρότημα που επιμηκύνει τη μεταγραφή διαφόρων γονιδίων. Ως εκ τούτου, η μελέτη μας αποκαλύπτει ένα νέο ρόλο του miR-34a στη ρύθμιση της μεταγραφής από το c-Myc.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

φορμόλη-σταθερό, παραφίνη -embedded δείγματα καρκίνου (FFPE) του προστάτη ελήφθησαν από τους Σαν Φρανσίσκο Υποθέσεων Βετεράνων (VA) Ιατρικό Κέντρο. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς και η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή UCSF για τα Ανθρώπινα Ερευνών (αριθμός έγκρισης: H9058-35751-01). Όλα φροντίδα των ζώων ήταν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές του Ιατρικού Κέντρου του Σαν Φρανσίσκο Υποθέσεων Βετεράνων και η μελέτη εγκρίθηκε από το Σαν Φρανσίσκο VA IACUC (αριθμός πρωτοκόλλου: 08-003-01).

Κυτταρική καλλιέργεια και επιμόλυνση

Ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκινώματος του προστάτη, PC-3, LNCaP και DU145 και μία μη-κακοήθη επιθηλιακά κυτταρική σειρά προστάτη, RWPE-1, αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). RWPE-1 κυτταρική γραμμή καλλιεργήθηκε σε μέσο ανάπτυξης κερατινοκυττάρων συμπληρωμένο με 5 ng /ml ανθρώπινο ανασυνδυασμένο επιδερμικό αυξητικό παράγοντα και 0.05 mg /mL εκχύλισμα υπόφυσης βοοειδούς (Invitrogen, Carlsbad, CA)

Κύτταρα σε 6 φρεατίων πλάκες επιμολυσμένα με 30 ηΜ προ-miR αρνητικό έλεγχο (NC) ή προ-miR-34a (Applied Biosystems, Foster City, CA) χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

δείγματα ιστών

φορμόλη-σταθερό, έχει εμπεδωθεί με παραφίνη δείγματα καρκίνου (FFPE) του προστάτη ελήφθησαν από το Σαν Φρανσίσκο Ιατρικό Κέντρο Veterans Affairs. Όλες οι διαφάνειες εξετάστηκαν από μια σκάφους επικυρωμένο παθολόγο για τον εντοπισμό των εστιών του προστάτη του καρκίνου, καθώς και παρακείμενο φυσιολογικό αδενικό επιθήλιο.

λεντοϊού συσκευασίας Παραγωγή κυτταρικών σειρών σταθερής miR-34a

Μια HIV-based σύστημα που περιλαμβάνει ένα πλασμίδιο που εκφράζει miR-34a ή φορέα ελέγχου αγοράστηκε από GeneCopoeia (Rockville, MD). σωματίδια Lentivirus παράχθηκαν με επιμόλυνση λεντοϊού πλασμίδιο έκφρασης σε κύτταρα 293Τ. κύτταρα PC-3 μολύνθηκαν με τον ιό HIV-based φακοϊό εκφράζουν miR-34a ή φορέα ελέγχου (1,5 × 10

6 μολυσματικών μονάδων ιού (IFU) (σε 20 μΐ), και τα μολυσμένα PC-3 κύτταρα επελέγησαν με πουρομυκίνη (0,5 μg /ml).

μαλακό άγαρ σχηματισμού αποικίας

δοκιμασία

προσδιορισμού σχηματισμού αποικίας μαλακού άγαρ διεξήχθη με εμβολιασμό κυττάρων σε μία στιβάδα του 0,35% άγαρ /RPMI /FBS πάνω από ένα στρώμα 0,5% άγαρ /RPMI /FBS. RPMI /FBS προστέθηκε κάθε 5 ημέρες για τη συνεχή τροφοδότηση συμπληρώματα ανάπτυξης για τα κύτταρα. οι καλλιέργειες διατηρήθηκαν σε υγροποιημένο ° C επωαστήρα 37. την ημέρα 14 μετά τη σπορά, την αποτελεσματικότητα σχηματισμού αποικίας προσδιορίστηκε ποσοτικά με μικροσκόπιο φωτός .

In vivo ανάπτυξης όγκου

Εναιωρήματα του σταθερού miR-34a κύτταρα που εκφράζουν ή τα κύτταρα ελέγχου (1 × 10

7 κύτταρα σε 100 μΐ μέσου RPMI) εγχύθηκαν υποδορίως σε θηλυκούς γυμνά ποντίκια (στέλεχος BALB /c ηυ /ηυ? Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, ΜΑ, ηλικίας 4-5 εβδομάδων) Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε με βάση πλάτους (x) και μήκος (y): x

2y /2, όπου x & lt?. y

εκχύλιση RNA και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy μίνι (Qiagen, Valencia, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή . Οι αντιδράσεις αντίστροφης μεταγραφής πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ Reverse Transcription System (Promega, Madison, WI). Τα δεδομένα είναι η μέση τιμή ± S.D.