Αφηρημένο

Οι αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) μπορεί να ξεκινήσει νέους όγκους στο αναπλαστικό καρκίνωμα θυρεοειδούς (ATC), μία από τις πιο επιθετικές συμπαγών όγκων στον άνθρωπο. Ωστόσο, η συμμετοχή των ΚΕΠ στην καρκινογένεση στον άνθρωπο δεν έχει προηγουμένως μελετηθεί σε επικυρωμένο κυτταρικές σειρές ATC. Εδώ δείχνουμε έναν λειτουργικό ρόλο των ΚΕΠ σε τέσσερις νέες επικυρωμένες ανθρώπινες κυτταρικές σειρές ATC (THJ-11T, THJ-16T, THJ-21T και THJ-29T). Εντοπίσαμε και εμπλουτίζεται ΚΕΠ χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία σφαιροειδή σχηματίζουν. Περίπου 3 έως 9% των κυττάρων από τέσσερις κυτταρικές σειρές ATC σχηματίζεται thyrospheres. Οι thyrospheres εξέφρασε την βλαστικών κυττάρων δείκτες Nanog και Oct4 και διέθετε την ικανότητα να αυτο-ανανέωση. Ένεση αυτών των thyrospheres στις θυρεοειδείς NOD του /SCID

Il2rg – /- ποντίκια

είχε ως αποτέλεσμα το σχηματισμό των μεταστατικών όγκων που ανακεφαλαιώνει τα κλινικά χαρακτηριστικά της ανθρώπινης ATC. Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη

in vivo

χαρακτηρισμό των ΚΕΠ του θυρεοειδούς με τη χρήση επικυρωμένων ανθρώπινες κυτταρικές σειρές ATC. Η διαθεσιμότητα των thyrospheres συγκεκριμένες ασθένειες και ορθοτοπική μοντέλα όγκων μας θα επιτρέψει τη διαλεύκανση των μηχανισμών της νόσου και την περιβαλλοντική θέση των ΚΕΠ. Μπορούν επίσης να είναι χρήσιμη για την προκλινική θεραπευτική επιλογή και για την παρακολούθηση των επιπτώσεων των βιολογικών θεραπειών για ATC

Παράθεση:. Λι W, Reeb AN, Sewell WA, Elhomsy G, Lin RY (2013) φαινοτυπική Χαρακτηρισμός του μεταστατικού αναπλαστικό καρκίνο του θυρεοειδούς βλαστικά κύτταρα. PLoS ONE 8 (5): e65095. doi: 10.1371 /journal.pone.0065095

Επιμέλεια: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Ιταλία

Ελήφθη: 18 του Οκτωβρίου 2012? Αποδεκτές: 22 Απριλίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: May 28, 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας επιχορήγησης R01 DK068057 και Προέδρου του Ταμείου Έρευνας του Πανεπιστημίου του Saint Louis (RYL). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

αναπλαστικό καρκίνωμα θυρεοειδούς (ATC) είναι μία από τις πιο θανατηφόρες ανθρώπινες κακοήθειες. Ενενήντα τοις εκατό των ασθενών με ATC πεθαίνουν εντός έξι μηνών από τη διάγνωση. Αν και είναι σχετικά σπάνια – αντιπροσωπεύει μόνο το 2% του συνόλου των περιπτώσεων καρκίνου του θυρεοειδούς – ATC προκαλεί περισσότερο από το 50% όλων των θανάτων από καρκίνο του θυρεοειδούς κάθε χρόνο. Οι τρέχουσες θεραπείες για ATC είναι επιθετικοί, και περιλαμβάνουν χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία. Ωστόσο, ATC είναι ανθεκτικό σε όλα τα είδη της θεραπείας και την πρόγνωση της νόσου έχει παραμείνει αμετάβλητη για περισσότερο από 50 χρόνια [1]. Σαφώς, ATC είναι μια σημαντική διαγνωστική και θεραπευτική πρόκληση

Ένα υποσύνολο καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) έχει υποτεθεί για την ανασύσταση και τη διατήρηση της ανάπτυξης του όγκου στο ATC [2] -. [7]. ΚΕΠ είναι ογκογενή κύτταρα που διαθέτουν βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν ιδιότητες. Αυτές χαρακτηρίζονται από μία ικανότητα να υφίστανται δύο συμμετρικές και ασύμμετρες διαίρεση, καθώς και να διαφοροποιηθούν σε ένα πλήθος καρκινικών κυτταρικών τύπων. Είναι σε μεγάλο βαθμό ηρεμίας, η οποία τους επιτρέπει να ξεφύγουν πρότυπο χημειοθεραπείες που αποσκοπούν στην ταχέως διαιρούμενα κύτταρα. ΚΕΠ μπορούν να απομονωθούν από τις δύο καθιερωμένες κυτταρικές σειρές καρκίνου του θυρεοειδούς και δείγματα όγκου. Ωστόσο, ένα σοβαρό ζήτημα μόλυνσης κυτταρική σειρά έχει αμφιβολίες για τα αποτελέσματα της πολλές πρόσφατες μελέτες των ανθρώπινων κυτταρικών σειρών ATC, μεταξύ των οποίων δύο με τον οποίο εμείς και άλλα εργαστήρια περιγράφεται ένα CD133-θετικό πληθυσμό CSC στην κυτταρική σειρά ATC ARO που ήταν τόσο ογκογόνο και ανθεκτικά στη χημειοθεραπεία [8], [9]. Αυτή η κυτταρική γραμμή ARO έκτοτε έχει δειχθεί ότι έχουν μολυνθεί με τον καρκίνο του παχέος εντέρου ανθρώπινη κυτταρική σειρά ΗΤ-29. Στην πραγματικότητα, Schweppe

et al

διαπίστωσε ότι μέχρι 42% των κυτταρικών σειρών καρκίνου του θυρεοειδούς που χρησιμοποιούνται συνήθως στην έρευνα του θυρεοειδούς κατά τη διάρκεια των δύο τελευταίων δεκαετιών έχουν συγχέονταν, περιττές ή διασταυρούμενη μόλυνση [10]. Αυτή η ανησυχητική ανακάλυψη έχει οδηγήσει την έρευνα του θυρεοειδούς κοινότητα για τη δημιουργία νέων, επικυρωμένες κυτταρικές σειρές καρκίνου του θυρεοειδούς.

Σε αυτή τη μελέτη, αξιολογήθηκαν τέσσερις επικυρώνονται ανθρώπινες κυτταρικές σειρές ATC (THJ-11T, THJ-16T, THJ-21T και THJ-29T) για την ύπαρξη ΚΕΠ που μπορεί να κινήσει νεοπλασματική ανάπτυξη. Όπως αναφέρεται λεπτομερώς σε έκθεση Marlow

et al

, οι τέσσερις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές ATC καθιερώθηκαν από όγκους αφαιρέθηκαν από ασθενείς ATC και εξετάστηκαν για την παρουσία γνωστών αλλαγές θυρεοειδούς ογκογένεση, συμπεριλαμβανομένων των μεταλλάξεων στο

BRAF, KRAS, οι ΕΡΑ

, και

HRAS

? μεταλλάξεις στο

RET /PTC1, RET /PTC2

, και /ή

RET /PTC3

σύντηξης-ογκογονίδια? και οποιαδήποτε από τις γνωστές παραλλαγές του

PAX8 /PPARγ

σύντηξης-ογκογονιδίου [11]. Μοναδικά γενετικές μεταλλάξεις και 12 επαναλαμβανόμενες DNA (STR) βραχείες αλληλουχίες tandem χρησιμοποιήθηκαν για να συνδεθούν οι κυτταρικές σειρές με τους αντίστοιχους όγκους τους -. Καθιστώντας τους το πρώτο σύνολο των κυτταρικών σειρών καρκίνου του θυρεοειδούς που μπορούν να ανιχνευθούν αναμφισβήτητα στον ιστό προέλευσής τους [11]

για να εξεταστεί αν υπάρχει ένας πληθυσμός CSC σε αυτές τις κυτταρικές σειρές, ιδρύσαμε πρώτα μια αξιόπιστη δοκιμασία σφαιροειδή σχηματίζουν για τον εντοπισμό και τον εμπλουτισμό ΚΕΠ του θυρεοειδούς. Στη συνέχεια, ελέγξαμε την επίδραση της σισπλατίνης παράγοντα χημειοθεραπείας σε αυτές τις κυτταρικές σειρές. Στη συνέχεια αξιολογείται η ικανότητα των κυττάρων αυτών για την έναρξη νέων όγκων κατά τη διάρκεια της σειριακής

in vivo

πέρασμα στον περιορισμό αραιώσεις σε ανοσοκατεσταλμένα NOD /SCID

Il2rg – /-

ποντίκια. Τέλος, διερευνήσαμε την μεταστατικό δυναμικό των thyrospheres ATC σε δύο μοντέλα ξενομεταμόσχευση: ορθοτοπική μεταμόσχευση θυρεοειδούς να καθοριστεί αν οι thyrospheres είναι ογκογόνα και ικανά να εισβάλλουν σε τοπικούς ιστούς, και ένα μοντέλο ένεση ουράς φλέβα πειραματικά επαγόμενης μετάστασης πνεύμονα για να δοκιμαστεί η ικανότητα του κύτταρα να μεταστάσεις σε μακρινές περιοχές.

Αποτελέσματα

κύτταρα ATC διατηρήσει κλωνογονικού χωρητικότητας

in vitro

η

Μελετήσαμε πρώτα τον πολλαπλασιασμό των τεσσάρων ανθρώπινων κυτταρικών σειρών ATC : THJ-11T (P67), THJ-16T (P88), THJ-21T (ρ56) και THJ-29T (σελ.89). Οι εικόνες αντίθεσης φάσης από αυτές τις κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI ως μονοστιβάδες και της καμπύλης του πολλαπλασιασμού των κυττάρων για μία περίοδο 96 ωρών φαίνεται στο Σχ. 1Α και 1Β. Σε πραγματικό χρόνο ποσοτική ανάλυση ανάστροφης μεταγραφάσης-PCR (qRT-PCR) έδειξαν ότι όλες οι κυτταρικές γραμμές εξέφρασαν ζευγαρωμένα γονίδιο θέση 8 (

PAX8

), ένας παράγοντας μεταγραφής του θυρεοειδούς-ειδική. Μία από τις κυτταρικές σειρές, THJ-21T, εξέφρασε επίσης παράγοντας μεταγραφής του θυρεοειδούς 1 (

TTF1

). Σε αντίθεση, κανένας από τις κυτταρικές σειρές που εκφράζονται δεικτών διαφοροποίησης του θυρεοειδούς όπως θυρεοσφαιρίνη (

Tg

), νάτριο /ιωδιούχο συμμεταφορέα (

NIS

), του θυρεοειδούς υπεροξειδάσης (

ΤΡΟ

) ή ο υποδοχέας για ορμόνη διέγερσης του θυρεοειδούς (

TSHR

) -. επιβεβαιώνοντας την αποδιαφοροποιημένα κατάσταση αυτών των κυτταρικών γραμμών ATC (Εικ. 1C)

(Α) εικόνες μικροσκοπία αντίθεσης φάσης των τεσσάρων κυτταρικών σειρών ATC καλλιεργήθηκαν ως μονοστοιβάδες σε μέσο RPMI. καμπύλη πολλαπλασιασμό (Β) Ανάπτυξη επί 96 ώρα καταδεικνύει την πολλαπλασιαστική δυνατότητα αυτών των κυτταρικών γραμμών ελέγχου εναέριας κυκλοφορίας. (C) Ανάλυση qRT-PCT των μεταγραφικών παραγόντων θυρεοειδούς

PAX8

και

TTF1

και δείκτες διαφοροποίησης του θυρεοειδούς

TSHR

,

TG

,

ΝΑΚ

, και

ΤΡΟ

. Ανθρώπινη GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως οικιακό γονίδιο κατά τη διάρκεια των επιμηκύνσεις.

Η

Για να χαρακτηριστεί CSCs σε αυτές τις κυτταρικές σειρές, αξιολογήσαμε την ικανότητά τους να σχηματίζουν αποικίες και thyrospheres

in vitro

. Σύκο. 2Α δείχνει ότι όλες οι κυτταρικές σειρές σχημάτισαν αποικίες σε μεθυλοκυτταρίνη που βασίζεται μέσα ενημέρωσης μετά από επτά ημέρες σε καλλιέργεια. Διαμόρφωσαν επίσης ελεύθερης διακύμανσης thyrospheres όταν σπέρνονται σε συνθήκες βλαστικών κυττάρων καλλιέργειας σε τρυβλία εξαιρετικά χαμηλή προσκόλληση. Ανάλυση περιοριστικής αραίωσης έδειξε ότι το μέσο ποσοστό thyrospheres σχηματίστηκε ήταν 9,4 ± 0,8% σε κύτταρα THJ-11T, 4.5 ± 0.9% σε κύτταρα THJ-16T, 3.1 ± 0.6% σε κύτταρα THJ-21Τ και 8.8 ± 1.0% σε THJ-29T κύτταρα (Σχ. 2Β). Η διάμετρος των πρωτογενών thyrospheres κυμαίνονταν από 100 έως 150 μm. Αυτά thyrospheres μπορεί να επεκταθεί μετά από αρκετά περάσματα. Το μέσο ποσοστό των δευτερογενών thyrospheres μειώθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές: 5,5 ± 0,4% σε κύτταρα THJ-11T, 3.3 ± 0.5% σε κύτταρα THJ-16T, 1.2 ± 0.5% σε κύτταρα THJ-21Τ, και 4.9 ± 0.2% σε THJ -29T κύτταρα (Σχ. 2Β). Αυτή η μείωση μπορεί να είναι το αποτέλεσμα μιας αρχικής φάσης της συμμετρικής επέκταση των σπαρμένων θυρεοειδούς βλαστικά κύτταρα, που ακολουθείται από την ασύμμετρη διαίρεση που δημιουργεί την διαφοροποιημένους απογόνους που αποτελούν το μεγαλύτερο μέρος των κυττάρων thyrosphere. Εμείς επόμενο εκτιμήθηκε με έμμεσο ανοσοφθορισμό την έκφραση των δεικτών πλειοδυναμίας Nanog και Oct4 σε thyrospheres παράγονται και από τις τέσσερις κυτταρικές σειρές ATC. Εκπρόσωπος εικόνες ομοεστιακό μικροσκόπιο της thyrospheres THJ-21T έδειξε έκφραση Nanog και Oct4 (Σχ. 2C). Αντιπροσωπευτικές εικόνες αντίθεσης φάσης του THJ-21Τ κύτταρα γονική μονοστοιβάδα έδειξε ότι η έκφραση αυτών των δεικτών των βλαστικών κυττάρων είναι μοναδική για thyrospheres, και όπως σημειώνεται ανωτέρω, δεν παρατηρείται στα γονικά κύτταρα μονοστιβάδας. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι όλα κυτταρικές σειρές ATC έχουν την ικανότητα να αυτο-ανανέωση

in vitro

. Επιπλέον, υπάρχουν σαφείς ενδείξεις της έκφρασης των βλαστικών κυττάρων που σχετίζονται με τα γονίδια στα thyrospheres.

(Α) Εκπρόσωπος φάση της ανάλυσης μικροσκόπιο αντίθεσης των αποικιών (αριστερά) και thyrospheres (δεξιά) μετά από επτά ημέρες καλλιέργειας. μπαρ κλίμακα, 100 μm. (Β) Ποσοστό της πρωτοβάθμιας και δευτεροβάθμιας thyrospheres σε όλες τις τέσσερις κυτταρικές σειρές ATC. (C) Εκπρόσωπος εικόνες ομοεστιακό μικροσκόπιο της thyrospheres THJ-21T έδειξε την έκφραση του Nanog (κόκκινο), Oct4 (πράσινο) και DAPI (μπλε). μπαρ κλίμακα, 10 μm (άνω πάνελ). Αντιπροσωπευτικές εικόνες αντίθεσης φάσης του THJ-21Τ κύτταρα γονική μονοστοιβάδα υποδεικνύεται η έκφραση του Nanog και Oct4 είναι μοναδική για thyrospheres και δεν φαίνεται στα γονικά κύτταρα μονοστοιβάδας (κάτω πλαίσιο).

Η

Η επίδραση του χημειοθεραπευτικού σισπλατίνη σε κύτταρα ATC

Εξετάσαμε την επίδραση της σισπλατίνης χημειοθεραπευτικού παράγοντα, ο οποίος αυτή τη στιγμή δοκιμάζεται σε κλινική δοκιμή φάσης Ι /ΙΙ σε ασθενείς με ATC, σε κυτταρικές σειρές ATC μας. Σύκο. 3Α δείχνει αντιπροσωπευτικά φάση εικόνες μικροσκοπία αντίθεσης των κυττάρων THJ-11T εκτίθεται στην ενδεικνυόμενη δόση της σισπλατίνης για 48 ώρες. Τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν μια δόση-απόκριση της αναστολής από σισπλατίνη της κυτταρικής ανάπτυξης και καθιέρωσε μια IC

50 για κάθε κυτταρική γραμμή (Σχ. 3Β). Έχουμε καθορίζεται περαιτέρω αν οι thyrospheres εμφανίζουν σισπλατίνη χημειοαντίσταση συγκρίνοντας την ευαισθησία του thyrospheres προέρχονται από THJ-11Τ και τα κύτταρα THJ-16T με εκείνη των γονικών κυττάρων μονοστοιβάδας (Σχ. 3C). Μετά από 24 ώρες παρουσία 10 μΜ της σισπλατίνης, το ποσοστό επιβίωσης των thyrospheres THJ-11T ήταν -1.7 φορές υψηλότερη από εκείνη των κυττάρων μονοστοιβάδας THJ-11T (52,5 ± 3,5

vs.

30,0 ± 1,4,

P

& lt? 0,05). Αντίθετα, το ποσοστό επιβίωσης των thyrospheres THJ-16T υπό ταυτόσημες συνθήκες ήταν παρόμοια με εκείνη του THJ-16T κύτταρα μονοστοιβάδας ((49.7 ± 2.7

vs.

48,6 ± 1,5,

P

= 0.73 ) (Σχ. 3C). τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι ένας υποπληθυσμός σφαιροειδή σχηματίζουν κύτταρα σε κύτταρα THJ-11T, αλλά όχι σε THJ-16 κύτταρα, είναι ανθεκτική στη θεραπεία cisplatin.

(α) αντίθεσης φάσης Αντιπρόσωπος εικόνες μικροσκοπία THJ-11T γονική μονοστιβάδα προερχόμενα κύτταρα που εκτίθενται στην ενδεικνυόμενη δόση της σισπλατίνης για 48 ώρες. (Β) δόση εξαρτώμενη αναστολή της ανάπτυξης σε όλες τις κυτταρικές σειρές ελέγχου εναέριας κυκλοφορίας. IC

50 τιμές είναι όπως φαίνονται για κάθε κυτταρική σειρά . (γ) σύγκριση των

in vitro

αντοχή στη σισπλατίνη των γονικών κυττάρων μονοστοιβάδας και σφαιροειδή σχηματίζουν κύτταρα. Η THJ-11Τ και 16Τ THJ-γονικά κύτταρα μονοστοιβάδας προερχόμενα και τα κύτταρα που προέρχονται από thyrosphere υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ της σισπλατίνης και του κλάσματος των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων που παραμένουν στη συνέχεια υπολογίζεται με βάση τη δοκιμασία του πολλαπλασιασμού των κυττάρων Alamar Blue. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. ****,

P

& lt? 0,0001? ***

P

& lt? 0.001? **

P

& lt?. 0.05

Η

κύτταρα ATC ξεκινήσει όγκους σε σειριακά μεταμοσχευμένα ποντίκια με ανοσοανεπάρκεια

Για να ελέγξετε την υπόθεσή μας ότι μόνο ένας μικρός πληθυσμός των ΚΕΠ είναι υπεύθυνη για τον σχηματισμό όγκου, εμείς μεταμοσχεύονται κάθε μία από τις τέσσερις κυτταρικές σειρές ATC σε ομάδες των NOD /SCID

Il2rg – /- ποντίκια

– ένα εξαιρετικά ανοσοκατεσταλμένους στέλεχος που στερείται Τ κύτταρα, Β κύτταρα, και τα κύτταρα ΝΚ [12] . Ο Πίνακας 1 δείχνει ότι υποδόρια ένεση οποιουδήποτε από τις κυτταρικές σειρές, προκάλεσε το σχηματισμό όγκων στα ποντίκια. Ωστόσο, η διάρκεια του χρόνου από την ένεση για σχηματισμό όγκου, ή η λανθάνουσα κατάσταση των κυτταρικών γραμμών, ποικίλο: 28 ημέρες για THJ-11T, 28 έως 70 ημέρες για THJ-16T, 56 έως 77 ημέρες για την THJ-21Τ, και 56 έως 91 ημέρες για THJ-29T. Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι τα κύτταρα THJ-11T ξεκινήσει την ανάπτυξη του όγκου πιο αποτελεσματικά από ό, τι τις άλλες κυτταρικές σειρές ATC

Η

επόμενο σειριακά μεταμοσχεύθηκαν αυτά τα πρωτογενή ξενομοσχευμάτων σε άλλες NOD /SCID

Il2rg -. /-

ποντίκια για να προσδιοριστεί η μακροπρόθεσμη ογκογόνο δυναμικό αυτών των κυττάρων. Ο περιορισμός πειράματα μεταμόσχευσης αραίωση έδειξε ότι ο ρυθμός της ανάπτυξης του όγκου αυξάνεται με αύξοντα ξενομεταμόσχευση. Για παράδειγμα, ο λανθάνων χρόνος του δευτερογενούς ξενομοσχευμάτων 5 × 10

5 κύτταρα ATC (ανεξάρτητα από κυτταρική γραμμή) ήταν 14 έως 28 ημέρες, ενώ εκείνη ενός ισοδύναμου αριθμού των κυττάρων στην τριτοβάθμια ξενομοσχεύματα ήταν 7 έως 14 ημέρες (Πίνακας 1) . Παρατηρήσαμε επίσης ότι το μέγεθος των υποδόριων όγκων αντανακλά τον αριθμό των κυττάρων που εγχέονται (Fig3. 4 Α και Β). Οι όγκοι που προέρχονται από δευτερογενή και τριτογενή ξενομοσχεύματα κυττάρων THJ-11T αναπαράγονται με συνέπεια τις πρωτογενείς όγκους στο ιστολογικό επίπεδο, και κηλίδωση Western και η ανοσοϊστοχημική ανάλυση επιβεβαίωσε την έκφραση των καρκινικών δεικτών ΑΙ_ϋΗ, CD44 και CXCR4 στα ξενομοσχεύματα (Σχ. 4 Ο-Ε). Σημειώστε ότι τα ξενομοσχεύματα ποντίκι δεν εκφράζουν CD133, σύμφωνα με προηγούμενο εύρημα σε πρωτογενείς καλλιέργειες που προέρχονται από χειρουργικές δείγματα της ανθρώπινης ATC [5]. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι τέσσερις από αυτές τις κυτταρικές σειρές ATC έχει μακροπρόθεσμες ογκογόνο δυναμικό και ότι τα μοντέλα ξενομοσχεύματος μας ποσοτικά και ποιοτικά Ανακεφαλαιώνοντας ογκογένεση

in vivo

. Το εύρημα ότι κάθε γραμμή κυττάρων μπορεί να πολλαπλασιάζεται επί τρία περάσματα δείχνει τη δυνητική αυτο-ανανέωσή τους

in vivo

. Συγκεκριμένα, 42 στις 77 ημέρες ήταν απαραίτητα για τον σχηματισμό όγκου μετά την υποδόρια ένεση των 10.000 THJ-11T κύτταρα thyrosphere προερχόμενα (Πίνακας 1). Αυτή η αύξηση στην λανθάνουσα κατάσταση υποδηλώνει ότι η υποδόρια χώρος δεν μπορεί να παρέχει την κατάλληλη μικροπεριβάλλον για κύτταρα thyrosphere προέλευσης. Καμπύλη

(Α) Η ανάπτυξη του όγκου που παράγεται από υποδόρια ένεση THJ-11T γονικά κύτταρα μονοστοιβάδας προέλευσης. Ο αριθμός των κυττάρων που εγχύθηκαν υποδεικνύεται. (Β) Ένα αντιπροσωπευτικό του υποδόριου όγκου απομακρύνεται από ένα ξενομόσχευμα ποντικού. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western που δείχνει την έκφραση της ΑΙ_ϋΗ, CD44, και CXCR4 σε κύτταρα που προέρχονται από πρωτογενή, δευτερογενή και τριτογενή ξενομοσχεύματα. (Δ) Η &? Ε χρώση έδειξε ότι οι όγκοι που προέρχονται από πρωτογενή, δευτερογενή και τριτογενή ξενομοσχεύματα που αποτελείται από ένα εξαιρετικά ετερογενή πληθυσμό κυττάρων με μεγάλη αναλογία πυρήνα προς κυτόπλασμα. (Ε) Ανοσοϊστοχημική ανάλυση των επιπέδων ΑΙ_ϋΗ, CD44, CXCR4 και CD133 σε ξενομοσχεύματα ποντίκι που παράγεται από την πρωτοβάθμια ξενομοσχεύματα της THJ-11T και THJ-16T. Σημειώστε ότι ξενομοσχεύματα ποντίκι δεν εκφράζουν CD133.

Η

ATC thyrosphere που προέρχονται από κύτταρα είναι ογκογόνο και μεταστάσεις στο θυρεοειδή και άλλους ιστούς που περιβάλλουν πιο επιθετικά από ό, τι τα γονικά κύτταρα μονόστοιβης προέρχεται σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο ποντικού του καρκινώματος του θυρεοειδούς

Για να μελετήσει περαιτέρω μετάσταση ATC σε βιολογικό περιβάλλον που μιμείται στενά την εξέλιξη της νόσου σε ανθρώπους, ιδρύσαμε ένα ορθοτοπικό μοντέλο ποντικού από καρκίνωμα του θυρεοειδούς με απευθείας έγχυση κυττάρων ATC στο θυρεοειδή αδένα (Εικ. 5Α). Οι ορθοτοπική όγκοι θεσπίστηκε με αυτή τη μέθοδο εισέβαλαν στην τραχεία και τους μυς κοντά στον οισοφάγο εντός δύο εβδομάδων από την ένεση. Μετά από τέσσερις εβδομάδες, οι όγκοι εμφανίζονται πολλά κλινικά χαρακτηριστικά του ελέγχου εναέριας κυκλοφορίας – ένα υψηλής ποιότητας κακόηθες νεόπλασμα χαρακτηρίζεται από υψηλό δείκτη μιτωτική, πυρηνική ατυπία, κυτταρική πλειομορφία και νέκρωση. Πέντε από πέντε ποντικούς εγχύεται στο θυρεοειδή με 10,000 κύτταρα thyrosphere προερχόμενα ανέπτυξαν όγκους. Πέντε από πέντε ποντικούς ένεση με 500.000 κύτταρα THJ-11T (αύξηση 50-φορές σε αριθμό κυττάρων) καλλιεργήθηκαν σε μονοστιβάδα επίσης ανέπτυξαν όγκους. Ωστόσο, οι όγκοι thyrosphere προερχόμενο αυξήθηκε ταχύτερα και ήταν μεγαλύτερα από τέσσερις εβδομάδες μετά την ένεση από ήσαν οι όγκοι που προκύπτουν από την ορθοτοπική ένεση των πολύ μεγαλύτερων αριθμών γονικών κυττάρων μονοστοιβάδας προερχόμενα (Εικ. 5). Οι όγκοι των όγκων thyrosphere προερχόμενα ήταν επίσης σημαντικά μεγαλύτερες από εκείνες των όγκων μονοστιβάδας προερχόμενων (60 ± 30 mm

3

vs

40 ± 20 mm

3?.

P

= 0,25) (Σχήμα 5C). Η ιστολογική ανάλυση των όγκων που προκύπτουν ορθοτοπική και από τις δύο κύτταρα thyrosphere και μονοστοιβάδα αποκάλυψε εξωθυρεοειδική επέκταση γύρω από την τραχεία, και τραχείας εισβολή σε λείο μυ και του οισοφάγου (Εικ. 5Β). Αν και ανοσοϊστοχημική ανάλυση επιβεβαίωσε την έκφραση του ΑΙ_ϋΗ, CD44 και CXCR4 σε όγκους που προέρχονται από κάθε κυτταρικό τύπο (Εικόνα 5D) – ένα αποτέλεσμα συνεπές με τα ευρήματα από την υποδόρια μοντέλο (Σχήμα 4Ε.) – Ένα σημαντικά μεγαλύτερο ποσοστό κυττάρων σε thyrosphere προερχόμενα όγκοι εκφράζονται αυτούς τους δείκτες (Εικ. 5D). Μαζί, αυτές οι παρατηρήσεις επικυρώνει την τοπική μεταστατικό δυναμικό των thyrosphere-παραγόμενα κύτταρα στο θυρεοειδή και άλλους γειτονικούς ιστούς.

(Α) Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα που δείχνει τη θέση του θυρεοειδούς αδένα και της τραχείας. (Β) ορθοτοπική όγκους που δημιουργούνται με 500.000 γονικά κύτταρα μονοστιβάδας προερχόμενων και 10.000 κύτταρα thyrosphere προέλευσης. Η &? Χρώση Ε αποκάλυψε την εισβολή του αναπλαστικού όγκων στον θυρεοειδή αδένα, την τραχεία, λείων μυών και του οισοφάγου. F, η κανονική θυλάκια του θυρεοειδούς? S, λείο μυ? αστερίσκο, όγκοι του θυρεοειδούς? Ε, του οισοφάγου. (C) ορθοτοπική όγκοι προκύπτουν από κύτταρα thyrosphere που προέρχονται είχε ένα μεγαλύτερο όγκο του όγκου από ό, τι εκείνες που προκύπτουν από πρόδρομα κύτταρα που προέρχονται μονόστοιβης (60 ± 30 mm

3

έναντι

40 ± 20 mm

3 ?

P

= 0,25). (Δ) Η ανοσοϊστοχημική χρώση του ΑΙ_ϋΗ, CD44, CXCR4 και CD133 σε ορθοτοπική όγκους που δημιουργούνται από monolayer- και thyrosphere προερχόμενα κύτταρα. Σημειώστε την έντονη ανοσοαντιδραστικότητα των ΑΙ_ϋΗ, CD44 και CXCR4 σε thyrosphere προερχόμενα όγκους τέσσερα εβδομάδες μετά την ένεση. (Ε) Σχηματική αναπαράσταση της δοκιμασίας αποικισμού πνεύμονα με μοντέλο ένεση φλέβα της ουράς. Εκπρόσωπος εικόνες ιστολογία των ποντικών με μετάσταση στους πνεύμονες που προκαλείται από τα κύτταρα μονοστοιβάδας THJ-11T. Σημειώστε ότι τα ποντίκια που ενέθηκαν με κύτταρα προερχόμενα thyrosphere δεν ανέπτυξαν μετάσταση στους πνεύμονες. μπαρ κλίμακα, 100 μm.

Η

ATC thyrosphere που προέρχονται από τα κύτταρα να μην προκληθεί μετάσταση στους πνεύμονες

Καθώς το πρότυπο ορθοτοπικής μεταμόσχευσης δεν μπορεί να παράγει πάντα μακρινή μετάσταση στον πνεύμονα (μια σημαντική αιτία θανάτου σε ATC), μπορούμε με ένεση 10,000 thyrosphere προερχόμενα κύτταρα ή 500.000 κύτταρα THJ-11T καλλιεργήθηκαν σε μονοστιβάδα σε φλέβες της ουράς του NOD /SCID

Il2rg – /- ποντίκια

να επάγουν πειραματικά μετάσταση πνεύμονα. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν και τα τμήματα του πνεύμονα αναλύθηκαν μετά από έξι εβδομάδες. Πολυάριθμες μεταστατικά οζίδια παρατηρήθηκαν στους πνεύμονες των ποντικών που έλαβαν ένεση με κύτταρα THJ-11T καλλιεργήθηκαν σε μονοστιβάδα, αλλά κανένα δεν βρέθηκε στους πνεύμονες των ποντικών που έλαβαν ένεση με κύτταρα προερχόμενα thyrosphere (Σχ. 5Ε). Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι thyrosphere που προέρχονται από κύτταρα δεν προωθούν την ανάπτυξη των μεταστάσεων του πνεύμονα σε αυτήν την πειραματικά προκαλούμενη μοντέλο μετάσταση στους πνεύμονες.

Συζήτηση

ATC είναι η πιο επιθετική υπότυπο του καρκίνου του θυρεοειδούς. Λόγω της αντοχής του σε όλους τους τύπους της θεραπείας του καρκίνου, η διάμεση επιβίωση του ATC είναι μόνο έξι μήνες. Ωστόσο, η ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών θεραπειών-έχει παρεμποδιστεί από την έλλειψη επικυρωμένων κυτταρικών σειρών καρκίνου του θυρεοειδούς για μεγάλης κλίμακας διαλογή φαρμάκων. Μετά από μια έκθεση του 2008 του σοβαρά θέματα καρκίνου του θυρεοειδούς κυτταρική σειρά διασταυρούμενης μόλυνσης [10], κατέστη αναγκαίο να δημιουργηθούν νέα, επικυρωμένη κυτταρικές σειρές με μια λεπτομερή χαρακτηρισμό της ακεραιότητας κυτταρική γραμμή και προφίλ STR που γενετικά συνδέουν τις γραμμές στον ιστό τους προέλευση. Οι τέσσερις κυτταρικές σειρές ATC χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αυτή αντιπροσωπεύει το πρώτο φύλλο των κυτταρικών γραμμών καρκίνου του θυρεοειδούς που πληροί τις αυστηρές αυτές νέα πρότυπα. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι και οι τέσσερις κυτταρικές σειρές ATC περιέχουν ένα μικρό πληθυσμό των ΚΕΠ με δυνατότητες αυτο-ανανέωση. Έχουμε αναπτύξει περαιτέρω έναν απλό και στιβαρό τρόπο για να δημιουργήσει μεταστατικό ATC σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο ποντικού χρησιμοποιώντας ανθρώπινα thyrospheres προέρχονται από αυτές τις κυτταρικές σειρές. Ένεση των κυττάρων που προέρχονται από thyrosphere στις θυρεοειδείς NOD του /SCID

Il2rg – /- ποντίκια

είχε ως αποτέλεσμα το σχηματισμό των μεταστατικών όγκων που ανακεφαλαιώνει τα κλινικά χαρακτηριστικά της ανθρώπινης ATC

θυρεοειδούς ΚΕΠ είναι. σπάνια, και η απουσία ειδικών δεικτών κυτταρικής επιφάνειας καθιστά την απομόνωσή τους προκλητική. Αρκετές δείκτες, συμπεριλαμβανομένων των CD44, ALDH και CD133, έχουν χρησιμοποιηθεί επιτυχώς για την απομόνωση CSCs από μαστού, του προστάτη, του παχέος εντέρου, γλοιοβλάστωμα, και του παγκρέατος [13] – [17], και CD133 έχει προηγουμένως ταυτοποιηθεί ως υποτιθέμενο δείκτη CSC για ATC . Ωστόσο, δημοσιεύματα αναφέρουν τις παρατηρήσεις αυτές έχουν επικριθεί για τη χρήση τους από ένα μολυσμένο καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή [8], [9]. Στην παρούσα μελέτη, καμία από τις κυτταρικές σειρές ATC εκφράζεται CD133, συνεπής με προηγούμενο εύρημα σε πρωτογενείς καλλιέργειες που προέρχονται από χειρουργική δείγματα ανθρώπινης ATC [5].

Τα πλεονεκτήματα των κυτταρικών σειρών ATC περιλαμβάνουν την ικανότητα να καλλιέργεια τους επί μακρές χρονικές περιόδους και για να τους μεγαλώνουν σε μεγάλες ποσότητες για υψηλής απόδοσης εφαρμογές διαλογής φαρμάκων. Παρά τα πλεονεκτήματα αυτά, είναι απαραίτητο να επιβεβαιώσουν τα ευρήματά μας σε πρωτογενή κύτταρα ATC επειδή κυτταρικές σειρές δεν Ανακεφαλαιώνοντας πάντα όλες τις πτυχές των πρωτογενών όγκων. Ωστόσο, η σπανιότητα και ταχέως μοιραία φύση αυτής της κακοήθειας έχει κάνει αυτό το δύσκολο να επιτευχθεί σε ρυθμίσεις εργαστήριο.

ΚΕΠ μπορούν να απομονωθούν μέσω μιας ποικιλίας τεχνικών, συμπεριλαμβανομένων κυτταρομετρία ροής με βάση την έκφραση ειδικών δεικτών κυτταρικής επιφάνειας όπως αυτά που συζητήθηκαν παραπάνω [18] – [21]. Η διαλογή των πληθυσμών πλευρά των καρκινικών κυττάρων μέσω χρωστική Hoechst 33342 αποκλεισμού είναι μια εναλλακτική προσέγγιση [22]. Πρόσφατες μελέτες έχουν επίσης δείξει ότι η δοκιμασία και καλλιέργεια σφαιροειδή σχηματισμού είναι μια εξίσου αποτελεσματική μέθοδο διαχωρισμού ΚΕΠ από πολλές συμπαγείς όγκους ή κυτταρικές γραμμές καρκίνου [23], ιδίως όταν – όπως είναι η περίπτωση με ATC – ένα αξιόπιστο κυτταρικής επιφάνειας CSC δείκτη δεν έχει ακόμη προσδιοριστεί.

Ο προσδιορισμός thyrosphere είναι μια καλά μελετημένη

in vitro

βλαστικών κυττάρων δοκιμασία για τον προσδιορισμό της κλωνικότητας και πολυδυναμικότητα των πιθανών θυρεοειδούς βλαστικών κυττάρων [2]. Ο διαχωρισμός thyrospheres σε μεμονωμένα κύτταρα, επιμετάλλωση τους για τον περιορισμό αραίωση και στη συνέχεια την υποβολή τους σε σειριακό πέρασμα στον πολιτισμό μπορεί να αξιολογήσει περαιτέρω το μακροπρόθεσμο δυναμικό πολλαπλασιασμό αυτών των κυττάρων. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι και οι τέσσερις κυτταρικές σειρές ATC μπορούν να καλλιεργηθούν ως thyrospheres και ενοφθαλμιστεί εκ νέου πολλές φορές, επιβεβαιώνοντας το δυναμικό αυτο-ανανέωσή τους

in vitro

. μελέτες κυτταροτοξικότητα μας έδειξε ότι ένας μικρός πληθυσμός της thyrospheres από την κυτταρική σειρά THJ-11T ήταν ανθεκτικά σε σισπλατίνη θεραπεία. Ωστόσο, υπό τις ίδιες συνθήκες, thyrospheres και τα κύτταρα μονοστοιβάδας που προέρχονται από κύτταρα THJ-16T ήταν εξίσου ευαίσθητα στην σισπλατίνη. Οι διαφορές αυτές μπορεί να οφείλονται σε μοριακές και γενετικές διαφορές μεταξύ των δύο κυτταρικές σειρές ATC και μπορεί να απαιτούν περαιτέρω διερεύνηση.

ΚΕΠ είναι σε θέση να αναπαράγουν την πλήρη ετερογένεια της μητρικής όγκου και αυξάνονται συνεχώς, ακόμη και μετά από πολλαπλές διόδους. Έτσι, ένας οριστικός τρόπος για να επιβεβαιώσετε τη δυνατότητα αυτο-ανανέωση και πολυδυναμικότητα της CSC

in vivo

είναι για την αναγέννηση του όγκου σε ανοσοκατεσταλμένα ζώα. Βρήκαμε ότι οι όγκοι από κάθε μία από τις τέσσερις κυτταρικές σειρές ATC όχι μόνο ανακεφαλαιωθούν την ιστολογία και τη δομή των μητρικών όγκων, αλλά θα μπορούσε επίσης να αναπαραχθεί

in vivo

για τρία περάσματα. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν κύρια υπόθεση μας ότι ορισμένα κύτταρα ATC παρουσιάζουν ιδιότητες βλαστοκυττάρων

in vivo

. Βρήκαμε επίσης ότι η τριτοβάθμια ξενομοσχεύματα από τις τέσσερις κυτταρικές σειρές ATC αυξήθηκε ταχύτερα σε NOD /SCID

Il2rg – /- ποντίκια

από ό, τι πρωτοβάθμια ξενομοσχεύματα. Αν και αυτά τα αποτελέσματα δεν μπορεί να υποδεικνύει απαραίτητα εμπλουτισμό βλαστικών κυττάρων, θα μπορούσαν να υποδεικνύουν ότι ορισμένα καρκινικά κύτταρα στα τριτογενή ξενομοσχεύματα είναι ιδιαίτερα πολλαπλασιαστικές. Περαιτέρω έρευνα απαιτείται για να εξηγήσει τις πιο επιθετικές ξενομοσχευμάτων τριτοβάθμια όγκου σε ATC και να προσδιορίσει τις συνέπειες, εάν υπάρχουν, για επαναλαμβανόμενες όγκους σε ανθρώπους ασθενείς.

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε NOD /SCID

Il2rg – /- ποντίκια

να δοκιμάσουν τις κυτταρικές σειρές ATC για την ανάπτυξη ξενομοσχεύματος. Αυτό το στέλεχος ποντικού στερείται ώριμα κύτταρα Τ και Β και είναι ανεπαρκές για αρκετά υψηλής συγγένειας υποδοχείς κυτοκίνης – συμπεριλαμβανομένων IL2, IL4, IL7, IL9, IL15 και IL21 – απαιτείται για την ανάπτυξη των κυττάρων ΝΚ και έμφυτη αποκρίσεις ανοσίας. Ως αποτέλεσμα, το ανοσοποιητικό σύστημα αυτού του στελέχους είναι πιο σοβαρά διαταραγμένη από εκείνη των πρότυπων NOD ποντίκια /SCID. Για παράδειγμα, έχει αναφερθεί ότι ένας στους τέσσερις τυχαία επιλεγμένα μεμονωμένων κυττάρων από ένα δείγμα ανθρώπινου μελανώματος θα μπορούσε να σχηματίσει έναν όγκο σε αυτό το μοντέλο ποντικού, η οποία είναι πολλές τάξεις μεγέθους μεγαλύτερη από Α-εκατομμύριο one-in-κύτταρα που προτείνεται από μελέτες σε πρότυπο NOD /SCID ποντίκια [12]. Σαφώς, η επιλογή των γενετικά τροποποιημένων μοντέλα ποντικών για μελέτες ξενομοσχεύματος των θεωρούμενων ΚΕΠ μπορούν να επηρεάσουν σημαντικά την ευαισθησία της ανάλυσης και πρέπει να εξετάζονται προσεκτικά κατά την ερμηνεία των δεδομένων. Αυτό NOD /SCID

Il2rg – /-.

Στέλεχος ποντίκι έχει γίνει το χρυσό πρότυπο για τη δοκιμή μοντέλο CSC οφείλεται σε ανώτερη ικανότητα ξενομεταμόσχευση της

Έχουμε χρησιμοποιούνται τρεις διαφορετικές προσεγγίσεις για τη μεταμόσχευση για να μελετήσει την ογκογόνο και μεταστατικό δυναμικό των κυττάρων thyrosphere προέλευσης. Από τις τρεις περιοχές μεταμόσχευση αποδείξαμε σε αυτή την έκθεση – υποδόρια, του θυρεοειδούς και ουραία φλέβα – μόνο το ορθοτοπικό μοντέλο μεταμόσχευσης του θυρεοειδούς που παράγεται επιθετική και μεταστατικούς όγκους εντός δύο εβδομάδων από την ένεση. Σε σύγκριση, το υποδόριο μοντέλο, αν και σε θέση να υποστηρίξει την έναρξη του όγκου, απαιτεί περισσότερο από 40 ημέρες για να παράγουν ανιχνεύσιμους όγκους από τον ίδιο αριθμό κυττάρων. Τέλος, το μοντέλο ένεση φλέβα της ουράς δεν μπορεί να κινήσει όγκους μετά από ακόμη και έξι εβδομάδες. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν την ύπαρξη μιας κόγχη του θυρεοειδούς που συμμετέχει άμεσα στη ρύθμιση των κυττάρων thyrosphere προέλευσης. ATC μετάσταση είναι μια περίπλοκη και εξαιρετικά οργανωμένη διαδικασία που προκαλείται από διάφορους παράγοντες που προέρχονται από όγκους. Η κατανόηση του πώς thyrosphere που προέρχονται από κύτταρα προώθηση των τοπικών, αλλά δεν είναι του πνεύμονα, μετάσταση μπορεί να είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών θεραπειών για το μεταστατικό ATC.

Εν ολίγοις, η διαθεσιμότητα του ATC-ειδικά κύτταρα thyrosphere που προέρχονται και τα μοντέλα ορθοτοπική όγκου ότι ανακεφαλαιώνουν το μεταστατικό καρκίνο του τόσο θανατηφόρα σε ανθρώπους ασθενείς δίνει θυρεοειδούς ερευνητές του καρκίνου ένα πάνελ πρωτοφανή κλινικών εργαλείων. Τα ευρήματά μας μπορεί να αποδειχθεί χρήσιμη στην διαλεύκανση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν τη διάδοση των μεταστατικών ΚΕΠ και την εξερεύνηση των θεραπευτικών στρατηγικών που στοχεύουν άμεσα ΚΕΠ του θυρεοειδούς.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργεια κυττάρων του Ανθρώπου ATC, δοκιμασία σχηματισμού αποικίας, και thyrosphere δοκιμασία

Το ανθρώπινο κυτταρικές σειρές ATC THJ-11T, THJ-16T, THJ-21T και THJ-29T [11] δόθηκαν από τον Δρ John A. Copland (Mayo Clinic). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Cellgro, Manassas, VA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), μη απαραίτητα αμινοξέα, πυροσταφυλικό νάτριο, και πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη-αμφοτερικίνη Β καλλιέργειες διατηρήθηκαν σε υγροποιημένο θάλαμο σε ένα 5% CO

μίγμα 2 /αέρα στους 37 ° C. Για την δοκιμασία αποικίας-σχηματισμό, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μεθυλοκυτταρίνη που βασίζεται MethoCult μέσων σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (StemCell Technologies, Vancouver, Canada). Για την δοκιμασία σφαιροειδές σχηματισμού, μονής κύτταρα απλώθηκαν σε 5000 κύτταρα /φρεάτιο σε εξαιρετικά χαμηλού προσάρτησης πλάκες έξι φρεατίων (Fisher Scientific Co., Hampton, ΝΗ). Σφαίρες μετρήθηκαν μετά από επτά ημέρες. Το ποσοστό των κυττάρων που σχηματίζουν thyrospheres υπολογίζεται από το συνολικό αριθμό των κυττάρων σπάρθηκε. Ο αριθμητής είναι ο αριθμός των thyrospheres σχηματίζονται ανά καλά, και ο παρονομαστής είναι 5.000.

Για

in vitro

σειριακό πέρασμα, thyrospheres συλλέχθηκαν με ήπια φυγοκέντρηση στις 800 rpm για 5 λεπτά και διαχωρίστηκαν ενζυμικά με 0,05% θρυψίνη /ΕϋΤΑ. Τα διαχωρισμένα κύτταρα πέρασαν μέσω 40 φίλτρα πλέγματος μm (BD Falcon τηλέφωνα Σουρωτήρι, Franklin Lakes, NJ) για την εξάλειψη των διπλών ή τριπλών. Ενιαία κύτταρα απλώθηκαν σε 5000 κύτταρα /φρεάτιο σε εξαιρετικά χαμηλού προσάρτησης πλάκες έξι φρεατίων για να δημιουργήσει δευτερογενή thyrospheres. Διεξήχθησαν τρία τέτοια γύρους της σειριακής διόδου. Σε μερικά πειράματα, σφαίρες συλλέχθηκαν μετά από επτά ημέρες, επεξεργασία με θρυψίνη εντός ενός κυττάρου εναιωρήματα και στη συνέχεια αναμιγνύεται με Matrigel /RPMI σε μια αραίωση 1:01 για έγχυση σε ποντικούς.

απομόνωση RNA και qRT-PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε από 1 × 10

6 κύτταρα με το κιτ RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με RNase-free DNase (Qiagen). Δύο μικρογραμμάρια ολικού RNA μεταγράφηκαν ανάστροφα σε cDNA με τη χρήση του Thermoscript First Strand Synthesis System (Invitrogen, Grand Island, ΝΥ). Οι αλληλουχίες ολιγονουκλεοτιδίων των εκκινητών (

PAX8

,

TTF1

,

TSHR

,

TG

,

ΝΑΚ

και

ΤΡΟ

) έχουν δημοσιευθεί αλλού [24], [25]. Τα επίπεδα mRNA ποσοτικοποιήθηκαν εις τριπλούν με qRT-PCR σε ένα PCR System ViiA7 (Applied Biosystems, Foster City, CA). PCR πραγματοποιήθηκε με ένα βασικό μίγμα SYBR Green PCR. Ανθρώπινα GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο καθαριότητας κατά τη διάρκεια των επιμηκύνσεις.

In vivo πειράματα

ογκογενετικότητας

Οκτώ εβδομάδων θηλυκά NOD /SCID

Il2rg

– /-

ποντίκια ελήφθησαν από Taconic Farms Inc. και διατηρείται υπό ειδικές συνθήκες ελεύθερες παθογόνων με την έγκριση της Επιτροπής Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση του Saint Louis University School of Medicine. Για υποδόρια μεταμόσχευση, απλά κύτταρα επανα-εναιωρήθηκαν σε 100 μΙ Matrigel /RPMI σε 1:01 αραίωση και ενέθηκαν υποδορίως σε NOD /SCID

Il2rg

– /- ποντίκια

. φορτίο του όγκου μετρήθηκε δύο φορές την εβδομάδα με ψηλάφηση και δαγκάνες, και οι όγκοι του όγκου υπολογίστηκαν με τον ακόλουθο τύπο: (π /6) × μεγάλης διαμέτρου × (μικρής διαμέτρου)

2. Οι ποντικοί παρακολουθήθηκαν για τρεις έως πέντε μήνες για την εμφάνιση και την ανάπτυξη των όγκων. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν όταν οι όγκοι έφθασαν 1,5 cm

3.

Για σειριακή διέλευση, οι όγκοι συλλέχθηκαν, κιμά, με κολλαγενάση και πέρασε μέσα από τα φίλτρα 40 mesh μm για να ληφθεί μονού κυτταρικού εναιωρήματος. Το προκύπτον πληθυσμός κυττάρων που ονομάζεται «δευτερεύον πέρασμα» και καλλιεργήθηκε για τρεις έως επτά ημέρες σε ΚΡΜΙ /10% FBS μέσου και στη συνέχεια εκ νέου εμβολιάστηκε σε NOD /SCID

Il2rg

– /- ποντίκια

. Μεταγενέστερες όγκοι χρησιμοποιήθηκαν για επαναλαμβανόμενη γύρους απομόνωσης ATC κυττάρων και την παραγωγή επιπλέον σειριακά-περάστηκαν κύτταρα ATC μέχρι τρεις διόδους.