Αφηρημένο

Η θεραπεία του καρκίνου, όπως ολιγονουκλεοτίδια ή πεπτίδια απαιτεί αποτελεσματικά συστήματα παράδοσης. Ένα νέο πεπτίδιο, TMTP1, που προέρχεται προηγουμένως και που προσδιορίζονται στο εργαστήριο μας έδειξαν αξιοσημείωτη ικανότητα να στοχεύουν ιδιαίτερα μεταστατικών όγκων και

in vitro και in vivo

, ακόμη και σε πρώιμο στάδιο της απόκρυφης μετάσταση εστίες. TMTP1 ανέστειλε μετρίως βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων, αν και όχι αρκετά για να κρίνουν μια αποτελεσματική δολοφόνος των καρκινικών κυττάρων. Σε αυτή τη μελέτη, επιδιώξαμε να ενισχυθεί η αντικαρκινική δραστικότητα των TMTP1. Για να γίνει αυτό, θα το συγχωνευμένο με ένα αντιμικροβιακό πεπτίδιο,

D (KLAKLAK)

2, και ονομάζεται πεπτίδιο που προκύπτει TMTP1-DKK. Βρήκαμε ότι TMTP1-DKK θα μπορούσε να προκαλέσει ταχεία απόπτωση σε ανθρώπινα προστάτη και γαστρικό καρκίνο κυττάρων τόσο μέσω της μιτοχονδριακής απόπτωσης μονοπάτι και οδού του υποδοχέα θανάτου. Επιπλέον, η άμεση ένεση TMTP1-DKK σε ποντίκια με προστάτη και γαστρικό ξενομόσχευμα καρκίνους είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του όγκου του όγκου και μια σημαντική καθυστέρηση στην πρόοδο του όγκου και των μεταστάσεων

in vivo

. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι TMTP1-DKK μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα ισχυρό θεραπευτικό μέσο για μεταστατικούς όγκους

Παράθεση:. Ma Χ, Ξι L, Luo D, Liu R, Λι S, Liu Y, et al. (2012) Αντι-όγκου Επιπτώσεις του πεπτιδίου TMTP1-GG-

D (KLAKLAK)

2 σε άκρως μεταστατικούς καρκίνους. PLoS ONE 7 (9): e42685. doi: 10.1371 /journal.pone.0042685

Επιμέλεια: Hiroshi Shiku, Mie Πανεπιστημίου Graduate School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 5 του Φεβ 2012? Αποδεκτές: 11 Ιουλίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 11 Σεπτεμβρίου, 2012

Copyright: © Ma et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση ήταν που παρέχονται από το Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών της Κίνας (No.30973472? 81.001.006? 30.973.148), το πρόγραμμα σημαντική καινοτομία Ιατρικής (2009ZX09103-738? 2009ZX09103-739? 2009ZX09103-740), και το «973» πρόγραμμα της Κίνας (Αρ 2009CB521808). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η πλειοψηφία της θνησιμότητας που σχετίζεται με τον καρκίνο οφείλεται μετάσταση των αρχικών κυττάρων όγκου προς θέσεις μακριά από την αρχική ή πρωτογενούς όγκου. Επί του παρόντος διαθέσιμες θεραπευτικές επιλογές είναι σπάνια σε θέση να θεραπεύει μεταστατικών καρκίνων, όπως αυτά που προέκυψαν κυρίως από καρκίνο του προστάτη και του στομάχου. Παγκοσμίως, ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο κοινή κακοήθεια στους άνδρες και η δεύτερη κύρια αιτία των θανάτων που σχετίζονται με τον καρκίνο. Γαστρικό καρκίνος παραμένει μια από τις πιο συχνές νεοπλάσματα, προκαλώντας το 12% όλων των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με κάθε έτος [1], [2], [3]. Επιπλέον, η κλινική θεραπεία αυτών των συμπαγών όγκων παραμένει σχετικά αναποτελεσματική. Ως εκ τούτου, την ανίχνευση και τη θεραπεία της μετάστασης των όγκων, ιδιαίτερα απόκρυφη μεταστάσεις, ήταν η κύρια προσέγγιση που αναπτύχθηκαν πρόσφατα και θεραπείες του καρκίνου. Τα τελευταία χρόνια της έρευνας για τον καρκίνο έχει παράσχει γνώσεις σχετικά με τις διεργασίες υπεύθυνες για την ανάπτυξη του καρκίνου και προσδιόρισε πολυάριθμες μοριακοί στόχοι για πιθανή θεραπεία του καρκίνου [4], [5]. Ωστόσο, η διαδικασία έγκρισης για νέες θεραπείες του καρκίνου είναι χρονοβόρα. Η ελπίδα είναι ότι με τη στόχευση συγκεκριμένων μεταβολές στα καρκινικά κύτταρα στο πρώιμο στάδιο της μετάστασης, οι θεραπείες μπορεί να αναπτυχθεί για να είναι πιο αποτελεσματική στη θανάτωση κυττάρων όγκου

in situ

και μετάσταση εστίες, ενώ λιγότερο επιβλαβείς για τα φυσιολογικά κύτταρα. Ως αποτέλεσμα, αυτές οι καινοτόμες θεραπείες θα κάνει μια σημαντική θετική επίδραση στην επιβίωση και την ποιότητα ζωής των ασθενών με καρκίνο.

Κατά την τελευταία δεκαετία, ο τομέας της ανάπτυξης του καρκίνου του φαρμάκου έχει μεταμορφωθεί με τον προσδιορισμό συγκεκριμένων μοριακών στόχους [6], [7], [8]. Στοχευμένη γονιδιακή θεραπεία μπορεί να επιτευχθεί μέσω μιας ποικιλίας τεχνικών, συμπεριλαμβανομένων γονιδιακή θεραπεία και γονιδιακή μεταγραφή. Πρόσφατα πλεονεκτήματα στη στοχευμένη παράδοση περιλαμβάνουν την επιτυχή χρήση μικρών μοριακών αναστολέων, μονοκλωνικά αντισώματα, και μικρά πεπτίδια στόχευσης [9], [10]. Η ανάπτυξη των μικρών πεπτιδίων στόχευσης φαίνεται να είναι μια πολλά υποσχόμενη λεωφόρος για την επιτυχή στοχευμένη γονιδιακή θεραπεία. Σύντομη πεπτίδια στόχευσης έχουν εξαιρετική διαπερατότητα του ιστού και ελάχιστη τοξικότητα και ανοσογονικότητα, καθιστώντας τα ικανά για την αποδοχή από τους ασθενείς και τους κλινικούς γιατρούς.

Πρόσφατα, ταυτοποιήσαμε ένα πεπτίδιο 5-αμινο οξύ, TMTP1, η οποία συνδέεται με μια σειρά από άκρως μεταστατικών καρκινικές κυτταρικές γραμμές

in vitro

και

in vivo

, ιδιαίτερα εκείνων που προέρχονται από άτυπη συκώτι micrometasteses που περιείχαν μικρές ποσότητες των νεοπλασματικών κυττάρων [11]. Ωστόσο, TMTP1 δεν αναγνώρισε την κανονική και μη μεταστατικές κυτταρικές γραμμές. Βρήκαμε επίσης ότι οι υψηλές συγκεντρώσεις του TMTP1 θα μπορούσε να μεσολαβήσει των κυττάρων όγκου απόπτωση. Από TMTP1 δεσμεύεται να μεταστατικών καρκίνων με υψηλή εξειδίκευση, θα μπορούσε να είναι χρήσιμο ως διαγνωστικό εργαλείο και /ή να έχουν κυτταροτοξική λειτουργία. Συγκεκριμένα, TMTP1 θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την κατασκευή προσαρμόσιμων

novo

συζυγών de πεπτιδίου. Αυτά τα πεπτίδια μπορεί να προσαρμοστεί για διάφορες διαγνωστικές και θεραπευτικές εφαρμογές μέσω συνδυασμό σε ένα ευρύ φάσμα των παραγόντων στόχευσης, όπως οι ιοί, οι πρωτεΐνες, και αντιμικροβιακά πεπτίδια. Σε αυτή τη μελέτη, συζευγμένο TMTP1 με ένα κατιονικό αντιμικροβιακό πεπτίδιο γνωστό για την ισχυρή κυτταροτοξική δράση της, προκειμένου να ενισχυθεί η αντι-νεοπλασματικές επιδράσεις της.

Υπάρχουν περισσότερα από 100 φυσικά αντιβιοτικά πεπτίδια και τους

de novo

σχεδιασμός έχει λάβει πολλή προσοχή [12], [13], [14], [15], [16]. Ellerby et

al

[17] βρήκαν ότι όταν συζευχθεί ένα κατιοντικό αντιμικροβιακό πεπτίδιο,

D (KLAKLAK)

2, στην παλιννόστησης τομέα CNGRC, το προκύπτον πεπτίδιο είχε δραστικότητα κατά του όγκου μέσω της την ικανότητα να στοχεύουν τα μιτοχόνδρια και να προκαλέσει την απόπτωση. Αυτά και άλλα δομικώς παρόμοια προ-αποπτωτικών αντιβιοτικό πεπτίδια παραμένουν σχετικά μη τοξικό έξω από ευκαρυωτικά κύτταρα. Ωστόσο, όταν παραλαμβάνεται από τα κύτταρα του όγκου, αυτοί που επάγεται μιτοχονδριακή διόγκωση και εξαρτώμενη από τα μιτοχόνδρια απόπτωση [18], [19], [20]. Ωστόσο, ένα σημαντικό πρόβλημα με αυτά τα πεπτίδια είναι η εξασφάλιση της εισαγωγής τους σε κύτταρα. Έτσι, αυτά τα πεπτίδια πρέπει να συζευχθούν σε πεπτίδια στόχευσης του όγκου που επιτρέπουν εσωτερικοποίηση τη μεσολάβηση υποδοχέων. Αυτό εξασφαλίζει ότι το χιμαιρικό πεπτίδιο θα εισέλθει στο κυτοσόλιο των στοχευόμενων κυττάρων, όπου μπορεί να προκαλέσει μιτοχονδριακής εξαρτώμενη απόπτωση.

Σε αυτή τη μελέτη, συγχωνευμένο

D (KLAKLAK)

2 έως TMTP1 με στερεά φάση πεπτιδική σύνθεση σε ένα αυτοματοποιημένο μοντέλο Applied Biosystems και ονομάστηκε το προκύπτον πεπτίδιο TMTP1-DKK [11]. Υποθέσαμε ότι το πεπτίδιο TMTP1 θα επιτρέψει για τη στόχευση, ενώ

D (KLAKLAK)

2 θα προωθήσει μιτοχόνδρια επαγόμενη απόπτωση. Σε αυτή τη μελέτη, αξιολογήσαμε την αξιοσημείωτη ιδιαιτερότητα και αντινεοπλασματική ικανότητα των TMTP1-DKK σε μεταστατικούς όγκους

in vitro

και

in vivo

.

Αποτελέσματα

TMTP1-DKK σπίτια σε ιδιαίτερα μεταστατικά κύτταρα όγκου in vitro και in vivo

Έχουμε προηγουμένως δείξει ότι TMTP1 δεσμεύεται ειδικά σε μεταστατικά κύτταρα όγκου [11]. Για να προσδιορίσετε αν το νεοσυντιθέμενες πεπτίδιο TMTP1-DKK διατηρεί την ειδικότητα δέσμευσης του τομέα του στόχευσης, TMTP1, εμείς συζευγμένο TMTP1-DKK με FITC. Στη συνέχεια εξετάστηκε η σύνδεση του FITC-συζευγμένο TMTP1-DKK σε αρκετές καρκινικές κυτταρικές γραμμές και κανονικά κύτταρα

in vitro

και

in vivo

. FITC-συζευγμένο TMTP1-DKK δεσμεύεται ειδικά με το εξαιρετικά μεταστατικό καρκίνο του προστάτη κυτταρική γραμμή PC-3M-1Ε8 και του γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή ΜΚΝ-45sci (Σχήμα 1Α, Α και C,). Ωστόσο, TMTP1-DKK δεν στοχεύουν τα κύτταρα μη-μεταστατική κυτταρική γραμμή PC-3M-2Β4, το κυτταρική σειρά ινοβλαστών ποντικού ΝΙΗ /3Τ3, φυσιολογικό μαστικό επιθηλιακό κύτταρο MCF-10Α, η κανονική LO2 ηπατικών κυττάρων και κυττάρων ΗΕΚ293 (Σχήμα 1Α, b , δ και Β).

μια φθορίζουσα εικόνες των κυττάρων του όγκου σε επεξεργασία με TMTP1-DKK εξετάστηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης με λέιζερ. (Α) κύτταρα PC-3M-1Ε8 (β) κύτταρα PC-3M-2Β4 (γ) ΜΚΝ-45sci κυττάρων (δ) ΝΙΗ /3Τ3 κύτταρα. FITC-TMTP1-DKK (πράσινο) και το πεπτίδιο ελέγχου εξετάστηκαν σε ξενομοσχεύματος όγκους, συμπεριλαμβανομένων PC-3M-1Ε8 (ε) TMTP1-DKK, (στ) svTMTP1-DKK, ΜΚΝ-45sci (ζ) TMTP1-DKK, (h) svTMTP1 -DKK. Οι πυρήνες συν-χρώση με ϋΑΡΙ (μπλε). Β φθορισμού εικόνες nomal κυττάρων (κανονική μαστικών επιθηλιακών κυττάρων ΜΟΡ-10Α, η κανονική LO2 ηπατικών κυττάρων και κυττάρων ΗΕΚ293) που έλαβαν θεραπεία με TMTP1-DKK εξετάστηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης με λέιζερ. Η μορφολογική αλλαγή nomal κυττάρων έγινε ορατή χρησιμοποιώντας ανεστραμμένο μικροσκόπιο.

Η

Είμαστε δίπλα φρόντισε να διαπιστώσει αν TMTP1-DKK δεσμεύεται σε αυτές τις εξαιρετικά μεταστατικών καρκινικών κυττάρων

in vivo

. Για το σκοπό αυτό, PC-3M-1Ε8 και ΜΚΝ-45sci κύτταρα εγχύθηκαν υποδόρια σε BALB /c γυμνά ποντίκια. Τα ποντίκια με όγκους 1-1,5 cm σε διάμετρο εγχύθηκαν με 300 μg FITC-TMTP1-DKK πεπτιδίου μέσω της φλέβας της ουράς. Μετά από 24 ώρες, οι όγκοι και τα όργανα ελέγχου αποκόπηκαν και υπέστησαν επεξεργασία για κατεψυγμένες τομές. Διαπιστώσαμε την Δυναμική βιοκατανομή του FITC συζευγμένο TMTP1-DKK από σε 1 ώρα, 6 ώρες, 12 ώρες, 24 ώρες, και 48 ώρες στα μοντέλα ποντικών του ΜΚΝ-45sci ορθοτοπικό καρκίνο του στομάχου και PC-3M-1Ε8 καρκίνο υποδόρια προστάτη με συνεστιακή μικροσκοπία. TMTP1-DKK ανιχνεύθηκε σε πολύ μεταστατικός PC-3M-1Ε8 και ΜΚΝ-45sci ιστούς ξενομοσχεύματος όγκου (Σχήμα 1Α, e και g). Με συνεστιακή μικροσκοπία έδειξε ότι TMTP1-DKK θα μπορούσε να συνεχιστεί σε υψηλότερο επίπεδο για 48 ώρες στα μοντέλα ποντικών του ΜΚΝ-45sci ορθοτοπικό καρκίνο του στομάχου και PC-3M-1Ε8 καρκίνος του προστάτη υποδόρια (Σχήμα S1). Που θα μπορούσε να δηλώσει ότι το πεπτίδιο θα μπορούσε σταθερό στον ιστό του όγκου. Ωστόσο, ο φθορισμός δεν ανιχνεύθηκε σε όργανα ελέγχου και τους ιστούς. Η δοκιμασία παλιννόστησης με το πεπτίδιο ελέγχου, svTMTP1-DKK, δεν έδειξε καμία εμφανή χρώση φθορισμού σε PC-3M-1Ε8 και ΜΚΝ-45sci ιστός ξενομοσχεύματος όγκου ή φυσιολογικούς ιστούς (Σχήμα 1Α, f και h, Σχήμα S2,).

TMTP1-DKK αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και επάγει την απόπτωση σε ιδιαίτερα μεταστατικά καρκινικά κύτταρα

επόμενο επιδίωξαν να καθορίσουν εάν TMTP1-DKK μπορούν να αναστείλουν τον πολλαπλασιασμό των εξαιρετικά μεταστατικών καρκινικών κυττάρων. Για να ελεγχθεί αυτό, PC-3M-1Ε8, ΜΚΝ-45sci, και ΝΙΗ /3Τ3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις (1-20 μΜ) TMTP1-DKK και πεπτίδια ελέγχου για 24 ώρες. Οι ρυθμοί ανάπτυξης των κυττάρων μετρήθηκαν με δοκιμασία ΜΤΤ. TMTP1-DKK ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό του PC-3M-1Ε8 και ΜΚΝ-45sci κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο με τη μέγιστη αναστολή που συμβαίνουν σε δόση 15-20 μΜ TMTP1-DKK (Σχήμα 2Α και Β

P

& lt?. 0.01 Επιπλέον, ο ρυθμός αναστολής από TMTP1 ήταν πολύ χαμηλότερη από ό, τι με TMTP1-DKK (Σχήμα 2Α και Β,

P

& lt? 0,01). η αναστολή επί του πολλαπλασιασμού των μυϊκών ινοβλαστών ΝΙΗ /3Τ3 δεν ανιχνεύθηκε (Σχήμα 2C). και svTMTP1-DKK δεν έδειξε καμία επίδραση στον προστάτη και γαστρικού καρκίνου κύτταρα (Σχήμα 2D, F).

ποσοστά επιβίωσης των κυττάρων προσδιορίστηκαν με δοκιμασίες ΜΤΤ πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν (

γραμμές σφάλματος

, ± SD). Τα δεδομένα που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν το ποσοστό των κυττάρων που επιβίωσαν σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Τα αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα φαίνονται. Οι διαφορές των ποσοστών επιβίωσης μεταξύ 10 μΜ και 20 μΜ TMTP1-DKK είναι πιο σημαντικό σε είτε PC- 3M-1Ε8 ή ΜΚΝ-45sci κύτταρα (

P

& lt? 0,01). Ωστόσο, ελάχιστη ή καμία επίδραση παρατηρήθηκε σε μυϊκά ινοβλαστών κυτταρικό πολλαπλασιασμό ΝΙΗ /3Τ3 όταν υποβλήθηκαν σε θεραπεία με TMTP1-DKK. D Κύτταρα βιωσιμότητα των ΜΚΝ-45 και τα καρκινικά κύτταρα PC-3M-1Ε8 αντιμετωπίζονται διαφορετικές συγκεντρώσεις (0-20 μΜ) svTMTP1-DKK 24ωρου για μετρήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Ε Μορφολογικά ποσοτικοποίηση της κυτταρικής απόπτωσης από ανεστραμμένο μικροσκόπιο σε PC-3M-1Ε8 και ΜΚΝ-45sci κύτταρα επεξεργασμένα με 10 μΜ TMTP1-DKK. Μετά από επεξεργασία με DKK, τα κύτταρα έδειξαν συρρίκνωση κυττάρων, αποσύνθεση μεμβράνης και πυρηνική συμπύκνωση /κατακερματισμό. F Μικρή μορφολογική μεταβολή παρατηρήθηκε από ανεστραμμένο μικροσκόπιο σε PC-3M-1Ε8 και ΜΚΝ-45sci επεξεργασία με 10 μΜ svTMTP1-DKK για 24 ώρες.

Η

Είναι πιθανό ότι TMTP1-DKK περιορίζεται πολλαπλασιασμό επάγοντας απόπτωση σε υψηλά μεταστατικά καρκινικά κύτταρα. Για να ελεγχθεί αυτό, PC-3M-1Ε8, ΜΚΝ-45sci κύτταρα, η κανονική μαστικών επιθηλιακών κυττάρων ΜΟΡ-10Α, η κανονική LO2 ηπατικών κυττάρων και κυττάρων ΗΕΚ293 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ TMTP1-DKK και svTMTP1-DKK για 24 ώρες. Οποιεσδήποτε μορφολογικές αλλαγές στα κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. Ποσοστά των ποσοστών απόπτωσης προσδιορίστηκαν με FACS χρησιμοποιώντας ΡΙΤΟ-αννεξίνης V και χρώση με ιωδιούχο προπίδιο. PC-3M-1Ε8 και ΜΚΝ-45sci κύτταρα κατεργασμένα με TMTP1-DKK έδειξε συρρίκνωση κυττάρων, αποσύνθεση μεμβράνης και πυρηνική συμπύκνωση /κατακερματισμού (Σχήμα 2Ε), τα οποία είναι όλα χαρακτηριστικές μορφολογικές αλλαγές των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση. Ενώ TMTP1-DKK δεν επηρέασε τη βιωσιμότητα και τη μορφολογία αυτών των φυσιολογικών κυττάρων »κάτω από το μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (Σχήμα 1Β). FACS ανάλυση έδειξε επίσης ότι TMTP1-DKK επαγόμενη απόπτωση κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε δόσεις των 10 μΜ ή υψηλότερη, σε σύγκριση με τον έλεγχο (Σχήμα 3Α και C).

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί μία νύκτα με 10 μΜ TMTP1- DKK πεπτίδιο και στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής σε 12 ώρες, 24 ώρες, και 48 ώρες. Τα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα PC-3M-1Ε8 και ΜΚΝ-45sci κύτταρα κατεργασμένα με TMTP1-DKK πεπτίδιο (μαύρα ιστία) έδειξε μία μείωση στη βιωσιμότητα μέσω απόπτωσης την πάροδο του χρόνου (

P

& lt? 0,01). Ωστόσο, ποντικού ινοβλάστες ΝΙΗ /3Τ3 κύτταρα δεν έδειξαν σημαντικές μεταβολές. Β Σηματοδότηση μόρια που εμπλέκονται στην αποπτωτική επίδραση του πεπτιδίου TMTP1-DKK θεραπεία. Καλλιεργημένα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 10 μΜ TMTP1-DKK πεπτιδίου για 24 ώρες συλλέχθηκαν και λύθηκαν. Σύνολο κύτταρο πρωτεΐνες αναλύθηκαν με 12% ηλεκτροφορήσεως πήγματος SDS-PAGE και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Μετά από αποκλεισμό με 5% άπαχο γάλα, οι μεμβράνες επωάστηκαν για 1 ώρα με /ml πρωτογενή αντισώματα 1 μg (κασπάση 9 (35 KD, 17 Κϋ), κασπάσης 8 (20 Κο) και κασπάσης 3 (19 KD)) που ακολουθείται από χρένο αντι-κουνελιού δευτερογενή αντισώματα συζευγμένο με υπεροξειδάση. Τα στυπώματα εκτέθηκαν σε υπόστρωμα χημειοφωταύγειας και αναπτύχθηκε με Hyperfilm ΜΡ. C κύτταρα PC-3M-1Ε8 και ΜΚΝ-45sci κύτταρα προκλήθηκαν με 10 μΜ TMTP1-DKK παρουσία (+) του 40 μΜ Ζ-VAD-fmk για 24 ώρες. Μετά από 24 ώρες, η βιωσιμότητα των κυττάρων αναλύθηκε. Το ευρύ φάσμα αναστολέας κασπάσης Z-VAD-fmk μείωσε το ρυθμό απόπτωσης των PC-3 M-1Ε8 και ΜΚΝ-45sci κύτταρα.

Η

TMTP1-DKK ενεργοποιεί τόσο το μιτοχονδριακό και Fas-εξαρτώμενη οδών απόπτωσης

D (KLAKLAK)

2 είναι ένα αμφιπαθικό πεπτίδιο D-αμινοξύ το οποίο συνδέεται επιλεκτικά σε βακτηριακές, αλλά όχι ευκαρυωτικό, κυτταρικές μεμβράνες [9]. Σε ευκαρυωτικά, εκκινεί την απόπτωση μέσω διακοπής των μιτοχονδρίων, πιθανώς επειδή οι μεμβράνες των μιτοχονδρίων μοιάζουν με αυτά των βακτηρίων [10]. Υπάρχουν δύο κύριες οδούς σηματοδότησης για απόπτωση: το εξωκυτταρικό οδού του υποδοχέα θανάτου Fas και η ενδοκυτταρική μιτοχονδριακή οδό. Για τον προσδιορισμό το αποπτωτικό μονοπάτι πυροδοτείται από κατεργασία TMTP1-DKK σε PC-3M-1Ε8 και ΜΚΝ-45sci κύτταρα, εξετάσαμε την έκφραση της κασπάσης-3, 8, και 9 με κηλίδωση Western. Συγκροτήματα που αντιστοιχούν σε δραστική κασπάση 3 (19 kDa), κασπάσης 8 (20 kDa), και κασπάσης 9 (δύο ταινίες: 17 kDa και 35 kDa) ανιχνεύτηκαν. Έτσι, σε TMTP1-DKK αγωγή καρκινικά κύτταρα, η διάσπαση των κασπασών 3, 8, και 9 ήταν όλοι ανιχνευθεί. Αυτό έδειξε ότι τόσο η οδός υποδοχέα θανάτου Fas και το μιτοχονδριακό μονοπάτι ενεργοποιήθηκαν από TMTP1-DKK (Εικόνα 3Β).

Για την περαιτέρω επικύρωση ότι TMTP1-DKK προωθείται απόπτωση, ελέγξαμε εάν οι αναστολείς κασπάσης θα μπορούσε να μειώσει το TMTP1- DKK που προκαλείται ποσοστό απόπτωσης σε PC-3M-1Ε8 και ΜΚΝ-45sci κυτταρικές σειρές. Η ευρεία αναστολέας φάσμα της κασπάσης Z-VAD-FMK θα μπορούσε να μειώσει αποπτωτικό ποσοστό TMTP1-DKK επεξεργασμένα PC-3 M-1Ε8 και ΜΚΝ-45sci κύτταρα από 45,2 ± 2,3% σε 22,1 ± 1,3% και 53,7 ± 2,6% σε 25 ± 0,8 % αντίστοιχα (Σχήμα 3C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι TMTP1-DKK απόπτωση που επάγεται μέσω τόσο την ενδοκυτταρική μιτοχονδριακή οδό και την οδό του υποδοχέα θανάτου Fas.

TMTP1-DKK αναστέλλει την εισβολή των καρκινικών

in vitro

Η

Για να εξετάσει εάν TMTP1-DKK προσβεβλημένα κύτταρα εισβολή, PC-3M-1Ε8 και ΜΚΝ-45sci κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με είτε TMTP1-DKK ή φίλτρο-αποστειρωμένο νερό για 12 ώρες, κατόπιν το οποίο εισβολή των κυττάρων προσδιορίστηκε με μία δοκιμασία Matrigel εισβολής (Σχήμα 4Α) . Το ποσοστό κυτταρικής μετανάστευσης των κυττάρων PC-3M-1Ε8 μειώθηκε κατά 52,38 ± 3,3% όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2 μΜ πεπτιδίου TMTP1-DKK. Ομοίως, η κυτταρική μετανάστευση των ΜΚΝ 45sci-κυττάρων μειώθηκε κατά 46,16 ± 2,7% κάτω από τις ίδιες συνθήκες (Σχήμα 4Β).

Τα κύτταρα επωάστηκαν με 2 μΜ TMTP1-DKK πεπτιδίου για 12 ώρες. Διεξήχθησαν δοκιμασίες Transwell μετανάστευση των κυττάρων PC-3M-1Ε8 και ΜΚΝ-45sci κύτταρα. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταρα από την άνω πλευρά του φίλτρου απομακρύνθηκαν και τα κύτταρα από την κάτω επιφάνεια του φίλτρου μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SE από τρία ανεξάρτητα πειράματα? κάθε πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Β Κυτταρική μετανάστευση μειώθηκε κατά 52,38 ± 3,3% σε κύτταρα PC-3M-1Ε8 και 46,16 ± 2,7% σε ΜΚΝ-45sci κυττάρων σε σύγκριση με τους κατάλληλους ελέγχους.

Η

TMTP1-DKK αναστέλλει την ανάπτυξη και την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

Η

Είμαστε δίπλα προσπάθησε να διερευνήσει αν TMTP1-DKK πεπτίδιο μπορεί να αντιπροσωπεύει μια πιθανή θεραπευτική στρατηγική για να καταστείλει την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

. Για να ελεγχθεί αυτό, αναλύσαμε την επίδραση της TMTP1-DKK για υποδόρια ανάπτυξη όγκου σε ποντικούς. ΜΚΝ-45sci ορθοτοπικό καρκίνο του στομάχου και PC-3M-1Ε8 κύτταρα καρκίνου του προστάτη εγχύθηκαν υποδορίως σε ποντικούς που είχαν στη συνέχεια κατεργάζεται με 50 μΜ TMTP1-DKK, TMTP1 ή φίλτρο-αποστειρωμένου νερού μέσα από ενδοπεριτοναϊκή ένεση (ΙΡ) κάθε δεύτερη ημέρα. PC-3M-1Ε8 ποντίκια φέροντα όγκο σε επεξεργασία με TMTP1-DKK έδειξε αύξηση της ποσοστό επιβίωσης από 55 ημέρες (εύρος από 49 έως 58 ημέρες) σε 65 ημέρες (εύρος από 60 έως 69 ημέρες) σε σύγκριση με ομάδες ελέγχου. Εν τω μεταξύ, ο χρόνος επιβίωσης των ΜΚΝ-45sci ποντίκια που φέρουν όγκο αυξήθηκε από 35 ημέρες (εύρος από 29 έως 39 ημέρες) 42 ημέρες (εύρος από 35 έως 44 ημέρες), όταν υποβάλλεται σε επεξεργασία με TMTP1-DKK.

TMTP1 -DKK θεραπεία, επίσης, την ανάπτυξη αισθητά ανέστειλε όγκου σε PC-3M-1Ε8 καρκίνο του υποδόριου προστάτη και ΜΚΝ-45sci ορθοτοπική γαστρικό καρκίνο φέρουν τα ποντίκια. Ο μέσος όγκος και των δύο τύπων όγκων ξενομοσχεύματος συρρικνωθεί στο TMTP1-DKK ομάδα αγωγής σε σχέση με τον έλεγχο (Σχήμα 5Β, C). Σαράντα ημέρες μετά την ένεση, ο υποδόριος όγκος του όγκου του προστάτη ξενομοσχεύματος καρκίνου PC-3M-1Ε8 ήταν κατά μέσο όρο 18% αυτής του ελέγχου σε TMTP1-DKK ποντίκια με αγωγή (Σχήμα 5D). Επιπλέον, ερευνήσαμε αν TMTP1-DKK πεπτίδιο απόπτωση που επάγεται στο ξενομόσχευμα όγκων του προστάτη

in vivo

με τη δοκιμασία TUNEL. Ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων που παρατηρήθηκαν σε αυξημένη TMTP1-DKK πεπτίδιο κατεργάζεται ομάδα σε σχέση με τον έλεγχο. Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν μια έντονη επίδραση κατά του όγκου του πεπτιδίου TMTP1-DKK

in vivo

.

Ένα Ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με το πεπτίδιο TMTP1-DKK επιβίωσαν περισσότερο από τα ποντίκια ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με ένα ισομοριακό μίγμα του πεπτίδιο TMTP1 ή φίλτρου-αποστειρωμένο νερό, όπως φαίνεται από οικόπεδο επιβίωσης Kaplan-Meier. B, C PC-3M-1Ε8 καρκίνου του προστάτη και ΜΚΝ-45sci ορθοτοπική γαστρικό καρκίνο που έλαβαν θεραπεία με το πεπτίδιο TMTP1-DKK ήταν μικρότερες από αυτές που έλαβαν θεραπεία με το πεπτίδιο μάρτυρα. Η ανάπτυξη του όγκου D σε PC-3M-1Ε8 ποντίκια φέροντα όγκο που υποβάλλονται σε θεραπεία πεπτίδιο TMTP1-DKK. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή για μία περίοδο 40 ημερών (

n

= 9). Κατά τη διάρκεια της περιόδου θεραπείας, οι όγκοι μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα. Όγκοι όγκο σε ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με πεπτίδιο TMTP1-DKK ήταν κατά μέσο όρο 18% του μεγέθους του ελέγχου. Οι όγκοι των όγκων αξιολογήθηκαν την ημέρα 1 (○) και την ημέρα 40 (•). Ρ & lt? 0,05, t-test. Ε ζώα θυσιάστηκαν έξι ημέρες μετά την αγωγή TMTP1-DKK. Ο όγκος ανακτήθηκε και απεικονίζεται αμέσως μετά την ανάλυση του αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου με δοκιμασία TUNEL. Ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά σε TMTP1-DKK όγκους πεπτίδιο-θεραπεία. a, Μεγέθυνση: × 100. β Μεγέθυνση:. × 200

Η

TMTP1-DKK καταστέλλει την μετάσταση του όγκου και της εξέλιξης του ΜΚΝ-45sci ορθοτοπική ξενομοσχευμάτων σε ποντίκια χωρίς θύμο αδένα

Για να ελέγξετε αν TMTP1-DKK μπορεί να μειώσει τη μετάσταση

in vivo

, εξετάσαμε τις επιδράσεις αυτού του πεπτιδίου σε ένα μοντέλο μετάστασης. Ορθοτοπική εμφύτευση του ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου ΜΚΝ-45sci θραύσματα στο στομάχι έξι γυμνούς ποντικούς προκάλεσε σημαντική αύξηση στον αριθμό των μεταστατικών ιστών, συμπεριλαμβανομένων τεσσάρων ηπατικών μεταστάσεων, δύο μετάσταση σπλήνα, τρία κοιλιακό μετάσταση τοίχωμα, μία μετάσταση νεφρό, και δύο μεσεντερικών λεμφικών κόμβος μετάσταση (ένας ποντικοί ελέγχου πέθαναν εντός 16 ημερών από την εμφύτευση). Ωστόσο, η χορήγηση ΙΡ του TMTP1-DKK κάθε δεύτερη ημέρα για 20 ημέρες προκάλεσε μία δραματική και εξαρτώμενη από τη δόση μείωση στον αριθμό των μεταστατικών ιστών, χωρίς μετάσταση που παρατηρείται σε έξι TMTP1-DKK αγωγή γυμνά ποντίκια (Σχήμα 6Α, C). Επιπλέον, Η &? E-σαφρανίνη αναλύσεις ηπατικής μετάστασης, μετάσταση σπλήνα, το κοιλιακό τοίχωμα μετάσταση, και τα νεφρά μετάσταση αποκάλυψε ότι η ανάπτυξη του σταδίου της μεταστατικών εστιών (Σχήμα 6Β). Έτσι, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η θεραπεία TMTP1-DKK μειώθηκε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου και των μεταστάσεων

in vivo

. Επιπλέον, η απόπτωση των κυττάρων στο ορθοτοπική γαστρικού όγκου ανιχνεύθηκε με δοκιμασία TUNEL (Για ποσοτικοποίηση, βλέπε Σχήμα 6D).

TMTP1-DKK πεπτίδιο προκάλεσε μία δραματική και δοσο-εξαρτώμενη μείωση στον αριθμό των μεταστατικών όγκων (κίτρινο βέλη) στο ΜΚΝ-45sci ορθοτοπική γαστρικό καρκίνο. δείγματα ιστών C Μετάσταση συλλέχθηκαν και επιβεβαιώθηκε παθολογικά από την H & amp? χρώση Ε. D ορθοτοπική γαστρικών όγκων ανακτήθηκαν και απεικονίστηκαν αμέσως μετά την ανάλυση του αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου με δοκιμασία TUNEL. Στήλες, μέσος αριθμός TUNEL θετικών κυττάρων που μετρήθηκαν σε τρία τυχαία επιλεγμένα πεδία σε τρία δείγματα όγκου από κάθε ομάδα? Οι ράβδοι σφάλματος, SD. *, P & lt?. 0.001 από t-test του Student σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου

Η

TMTP1-DKK αγωγή ποντίκια επιβίωσαν καλά και δεν έδειξε σημάδια τοξικότητας ή απώλειας σωματικού βάρους σε όλα τα πειράματα. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι TMTP1-DKK μπορεί να αναστέλλουν την μετάσταση του όγκου και την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

.

Συζήτηση

Η θεραπεία του καρκίνου με τη χρήση μικρομοριακών θεραπευτικά όπως ολιγονουκλεοτίδια ή πεπτίδια απαιτεί αποτελεσματικά συστήματα διανομής ικανό ενδοκυτταρικής διείσδυσης. Πρόσφατα, μια σειρά από νέα πεπτίδια ταυτοποιήθηκαν τα οποία δεσμεύονται ειδικά με την μεμβράνη τόσο του καρκίνου και σχετίζονται με τον όγκο ενδοθηλιακά κύτταρα πλάσματος. Τα αναγνωρισμένα πεπτίδια υποσχόμενες εναλλακτικές λύσεις για να χρησιμοποιείται επί του παρόντος βιομόρια για στόχευση μεταστατικά κύτταρα λόγω της ταχείας κάθαρσης του αίματος τους, αυξημένη διάχυση και διείσδυση ιστού, μη ανοσογονικό φύση, και την ευκολία της σύνθεσης [21], [22], [23], [24], [25]. Έχουμε αποδείξει στο παρελθόν ότι απόκρυφη μεταστάσεις ή υποκλινικής μικρομεταστάσεων ήταν ευδιάκριτα εντοπιστεί από TMTP1 [11]. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε περαιτέρω αν TMTP1 θα μπορούσε να παραδώσει θεραπευτικούς παράγοντες αποτελεσματικά. Εξετάσαμε την ικανότητα των TMTP1 να παραδώσει ένα προαποπτωτικά πεπτιδίου σε ιδιαίτερα μεταστατικά καρκινικά κύτταρα με σύζευξη το στην προ-αποπτωτικών

D (KLAKLAK)

2 τομείς. Επιλέξαμε το συνθετικό πεπτίδιο 14-αμινοξέων KLAKLAKKLAKLAK επειδή ήταν αδρανής εκτός των κυττάρων αλλά έγινε τοξικό όταν εσωτερικεύεται προκαλώντας διάρρηξη της μιτοχονδριακής μεμβράνης, που οδηγεί σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο.

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι TMTP1-GG-

D (KLAKLAK)

2 δεσμεύεται ειδικά με ιδιαίτερα μεταστατικές κυτταρικές γραμμές όγκου, του προστάτη καρκινικών κυττάρων PC-3M-1Ε8 και γαστρικού καρκίνου ΜΚΝ-κυττάρων 45sci

in vitro

και

in vivo

. Ωστόσο, TMPT1-GG-

D (KLAKLAK)

2 δεν συνδέονται προς το nometastatic καρκίνου του προστάτη κυττάρων PC-3M-2Β4 και ποντικού κυτταρική σειρά ινοβλαστών ΝΙΗ /3Τ3 φυσιολογικό μαστικό επιθηλιακό κύτταρο MCF-10Α, φυσιολογικό ήπαρ κύτταρο LO2 και ΗΕΚ293 κύτταρα (Σχήμα 1). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι TMTP1-DKK δεν επηρέασε τη βιωσιμότητα και τη μορφολογία αυτών των φυσιολογικών κυττάρων ». Από τη στιγμή που παρατηρείται FITC-TMTP1-GG-

D (KLAKLAK)

2 σύνδεση προς αμφότερες τις κυτταρικές σειρές και όγκους ξενομοσχεύματος σε γυμνά ποντίκια, εμείς αιτιολογημένη ότι TMTP1 θα στοχεύσει παράδοση του προ-αποπτωτικών πεπτιδίου προς εξαιρετικά μεταστατικών όγκων.

εξετασθούν περαιτέρω τα αποτελέσματα αντι-όγκου του πεπτιδίου σύντηξης TMTP1-DKK. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι TMTP1-DKK μεσολάβηση αξιόλογη δραστηριότητα κατά του όγκου τόσο i

n vitro

και

in vivo

, σε σύγκριση με είτε TMTP1 ή DKK μόνο. Το πεπτίδιο σύντηξης TMTP1-DKK απόπτωση που επάγεται ταχέως και ισχυρά. Χαμηλές συγκεντρώσεις TMTP1-DKK μπορεί να επάγει το θάνατο των καρκινικών κυττάρων ενώ έχει μικρή επίδραση επί των κυττάρων ινοβλαστών ποντικού ΝΙΗ /3Τ3. TMTP1-DKK έδειξαν υψηλά αποτελέσματα κατά των όγκων σε εξαιρετικά μεταστατικό ΜΚΝ-45sci και τα κύτταρα PC-3M-1Ε8, σε σύγκριση με TMTP1. DKK από μόνη της δεν θα μπορούσε να προκαλέσει την απόπτωση, δεδομένου ότι δεν μπορούσε να μεταχθούν στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων. Όταν συνδέεται με το πεπτίδιο στόχευσης TMTP1, micromolar επίπεδα DKK είχε ως αποτέλεσμα τουλάχιστον 100-πλάσια αύξηση της θανάτωσης αποτελεσματικότητας σε καρκινικά κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον ότι η αυξημένη αποτελεσματικότητα θανάτωσης δεν παρατηρήθηκε στην μυοειδούς κυτταρική σειρά ινοβλαστών ΝΙΗ /3Τ3. Επιπλέον, TMTP1-DKK ανέστειλε σημαντικά την διεισδυτικότητα των καρκινικών κυττάρων

in vitro

σε μία δοκιμασία transwell. Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν επίσης την αρθρωτή φύση της στόχευσης περιοχής /μεταγωγής και της περιοχής προ-απόπτωσης σε TMTP1-DKK. Κάθε τομέας παρέχει ιδιότητες κατά του συζευγμένου πεπτιδίου για να δημιουργήσει ένα βιολογικά δραστικό παράγοντα.

D (KLAKLAK)

2 έχει αντιβακτηριακή δράση αλλά είναι σχετικά μη τοξικά σε ευκαρυωτικά κύτταρα. Ωστόσο, έχει αποδειχθεί ότι αν

D (KLAKLAK)

2 παραδίδεται στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων θηλαστικού, αναστατώνει τα μιτοχόνδρια, λόγω της ομοιότητας των mitochonrdrial και βακτηριακές μεμβράνες, και εκκινεί την απόπτωση [26]. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι όταν

D (KLAKLAK)

2 συζεύχθηκε με ένα πεπτίδιο παλιννόστησης μέσω ενός συνδετήρα GG ότι τα σπίτια για να αγγείωσης του όγκου και επιλεκτικά κυτταροτοξική για αγγειογόνων ενδοθηλιακών κυττάρων και είχαν δραστικότητα κατά του όγκου

σε vivo

[26]. Μετά την εσωτερίκευση, η προ-αποπτωτικών

D (KLAKLAK)

2 πεπτίδιο ενήργησε με διάσπαση μιτοχονδριακή μεμβράνη, η οποία προκαλεί το κυτόχρωμα c εκροή στο κυτταρόπλασμα με αποτέλεσμα την απόπτωση. Στο κυτταρόπλασμα, το κυτόχρωμα c σχηματίζει ένα σύμπλοκο με Apaf-1 και procaspase-9. Αλληλεπίδραση με procaspase-9 αποτελέσματα στην διάσπαση και ενεργοποίηση του, την έναρξη διάσπαση των κατάντη κασπάσες ενέργειας. Στη μελέτη μας, παρατηρήσαμε ενεργοποιημένη κασπάση 9 με κηλίδα western σε κύτταρα κατεργασμένα όγκου TMTP1-DKK, υποδεικνύοντας εμπλοκή της μιτοχονδριακής οδού (Σχήμα 3). Παρατηρήσαμε επίσης ενεργοποίηση της κασπάσης 8, το οποίο πρότεινε η Fas-συνδέτη εξωκυττάριο μονοπάτι κυτταρικού θανάτου είχε εμπλακεί σε TMTP1-DKK απόπτωση που επάγεται επίσης. Η αποτελεσματικότητα του TMTP1-DKK επαγόμενη απόπτωση ανεστάλη από το ευρύ φάσμα αναστολέα κασπάσης Ζ-VAD-fmk σε PC-3M-1Ε8 και ΜΚΝ-45sci κύτταρα. Ως εκ τούτου, η μελέτη μας έδειξε ότι TMTP1-DKK ενεργοποιούνται απόπτωση τόσο μέσω της μιτοχονδριακής οδού και της οδού του υποδοχέα θανάτου.

TMTP1-DKK φάνηκε να αναστέλλουν επιλεκτικά την ανάπτυξη του όγκου και έχουν μικρή επίδραση επί άλλων ιστών στο υποδόριο ξενομόσχευμα και ορθοτοπική μοντέλα μεταμόσχευσης ποντίκια. Τόσο οι υποδόριου ξενομοσχεύματος όγκοι των PC-3M-1Ε8 και τα μυϊκά ΜΚΝ-45sci ορθοτοπική γαστρικών όγκων ήταν εντυπωσιακά αναστέλλεται από TMTP1-DKK. Ο χρόνος επιβίωσης των γυμνά ποντίκια με όγκους και στα δύο μοντέλα ήταν σημαντικά παρατεταμένη θεραπεία με TMTP1-DKK. Παύση της θεραπευτικής χορήγησης του πεπτιδίου, οδήγησε σε ταχεία ανάπτυξη του όγκου και του θανάτου των πειραματόζωων. Επιπλέον, παρέχεται άμεση πειραματική απόδειξη σε ένα προκλινικό μοντέλο της αποτελεσματικότητας της παρεμβολής ορθοτοπική ανάπτυξη του ανθρώπινου γαστρικού καρκινικών κυττάρων σε γυμνούς ποντικούς σε τόσο πρωτογενή θέση και μεταστάσεις. Παρατηρήσαμε μεταστάσεις όγκου σε όλα τα ζώα χωρίς θεραπεία, αλλά μόνο λίγα σε TMTP1-DKK μεταχείρισης των ζώων. Συνεπώς, τα αποτελέσματα από τις ορθοτοπική ΜΚΝ-45sci ξενομοσχεύματα αποκάλυψε ότι TMTP1-DKK ανέστειλε αποτελεσματικά μετάσταση όγκου σε ποντίκια. Τα θεραπευτικά αποτελέσματα του πεπτιδίου TMTP1-DKK

in vivo

επίσης αποδειχθεί ότι είναι το αποτέλεσμα της καρκινικών κυττάρων απόπτωσης με όπως αποδεικνύεται με δοκιμασία TUNEL (Σχήμα 5, 6).

Στο σύνολό τους, Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι TMTP1-DKK είναι ένας αποτελεσματικός παράγοντας κατά του όγκου τόσο

in vitro

και

in vivo

. Είναι προκάλεσε απόπτωση σε μια σειρά από άκρως μεταστατικών καρκινικών κυττάρων μέσω τόσο της μιτοχονδριακής οδού και οδού του υποδοχέα θανάτου. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι TMTP1-DKK μπορεί να είναι ένας ισχυρός υποψήφιος θεραπευτικός παράγοντας για μεταστατικούς όγκους με βάση την ειδική στόχευση και αποτελεσματική δράση όγκου-θανάτωση. Η περαιτέρω μελέτη των TMTP1-DKK και τα ανάλογά της μπορεί να οδηγήσει στην ανακάλυψη νέων αντι-όγκου και μετάσταση παράγοντες.

Υλικά και Μέθοδοι

σχεδιασμό και τη σύνθεση πεπτιδίων

TMTP1- DKK (NVVRQ -GG-

D (KLAKLAK)

2) και svTMTP1-DKK (VNQRV -GG-

D (KLAKLAK)

2), η οποία είναι το πεπτίδιο ελέγχου της TMTP1 (NVVRQ) , δημιουργήθηκαν από τη σύνδεση του τομέα στόχευσης (TMTP1) και το προ-αποπτωτικό

D (KLAKLAK)

2 τομείς μέσω μιας γέφυρας glycinylglycine όπως περιγράφεται [11]. Ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) συζεύχθηκε με το πεπτίδιο μέσω ενός επιπλέον γλυκίνη στο Ν-τελικό άκρο. TMTP1-DKK και πεπτίδια ελέγχου (DKK, TMTP1 και svTMTP1-DKK) συντέθηκαν χρησιμοποιώντας Fmoc χημεία σε ένα συνθέτη στερεάς φάσης και καθαρίστηκε με HPLC με Xi’an Huachen Bio-Tech Ltd (Xi’an, Κίνα). Η ακολουθία και η δομή των πεπτιδίων επιβεβαιώθηκαν με φασματομετρία μάζας. Τα πεπτίδια διαλύθηκαν σε φίλτρο-αποστειρωμένο νερό σε συγκέντρωση 1 mM.

Οι κυτταρικές σειρές και Αντιδραστήρια

Η άκρως μεταστατικών και μη μεταστατικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές ανθρώπινου προστάτη PC-3M-1Ε8 και PC-3M -2B4 αντίστοιχα ευγενώς από τον Dr. Jie Zheng (Πανεπιστήμιο του Πεκίνου, Πεκίνο, Κίνα) [27], [28]. Η ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου κυτταρική-lineMKN 45sci, το μυϊκό ινοβλάστη ΝΙΗ /3Τ3 κύτταρα, η κανονική μαστικών επιθηλιακών κυττάρων ΜΟΡ-10Α, η κανονική LO2 ηπατικών κυττάρων και τα κύτταρα ΗΕΚ293 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) στους 37 ° C με 5% CO

2. Z-VAD-FMK ελήφθη από Bachem (Χαϊδελβέργη, Γερμανία).

Κατασκευή μοντέλα ποντικών

Τέσσερις-εβδομάδων BALB /c

nu /nu

ποντίκια ήταν που λαμβάνεται από το SLAC Laboratory Animal Co. Ltd (Σαγκάη, Κίνα). Στις μελέτες άμεσου ψεκασμού ενδορραχιαία (IT), 3 × 10

6 κύτταρα PC3M-1Ε8 ανεστάλησαν σε 100 μl φυσιολογικού ορού και ενίεται υποδορίως (SC) στη δεξιά πλευρά των ποντικών (ηλικίας 4-6 εβδομάδων). Οι όγκοι αφέθηκαν να αναπτυχθούν 4-6 mm σε διάμετρο πριν από τη θεραπεία. θραύσματα Fresh όγκου (2 mm

3) στη συνέχεια εμφυτεύθηκαν SC μέσα στο οπίσθιο κορμό των αναισθητοποιημένων ποντικών.

Το μοντέλο ποντικού ΜΚΝ-45sci ορθοτοπική γαστρικό καρκίνο, η οποία έχει το δυναμικό για το ήπαρ-ειδική μετάσταση , παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Jinjun Λι (Σαγκάη Ινστιτούτο Καρκίνου, Ιατρικό Κολέγιο της Σαγκάης Jiao Tong University, Shanghai, Κίνα) [29], [30], [31]. Φρέσκα θραύσματα όγκου λήφθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Μετά αναισθητοποίηση ποντίκι, το στομάχι εκτέθηκε και το τμήμα της μεμβράνης ορογόνο ξύνεται με λαβίδα. Ένα κομμάτι ενός χιλιοστού

3 όγκου στη συνέχεια καθορίζεται με ξύνεται ιστοσελίδα της επιφάνειας του χορίου με ένα απορροφητικό ράμμα 5-0.