Αφηρημένο

Ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να αξιολογήσει την έκφραση κυτοκίνης από μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα σταδίου Ι και να επιβεβαιώσουν αυτά τα πρότυπα έκφρασης εκθέτοντας PBMCs με τον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων

in vitro

. Πέντε μεταβάλλεται κυτοκινών σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα σταδίου Ι (CCL3, IL8, IL-1β, CXCL10, sIL2Rα) ταυτοποιήθηκαν στο πλάσμα από άτομα (n = 15) πριν και μετά την εκτομή χρησιμοποιώντας δοκιμασία 30-plex πρωτεΐνη πάνελ. μελέτες έκφρασης γονιδίων χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-qPCR διεξήχθησαν σε ΜΚΠΑ από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα σταδίου Ι (n = 62) πριν και μετά την εκτομή, και σε σύγκριση με ασθενείς μη καρκινικά (n = 32) πριν και μετά τη χειρουργική επέμβαση για καλοήθη νόσο. πειράματα συν-κουλτούρα που εκτίθενται υγιή PBMCs δότη στα κύτταρα του καρκίνου του πνεύμονα

in vitro

έγιναν για να αξιολογηθεί η επίδραση στην έκφραση κυτταροκινών PBMC. γονίδιο έκφρασης PBMC του CCL3, IL8 και IL-1β ήταν υψηλότερη σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα σε σύγκριση με τους ίδιους ασθενείς σε κάθε μία από τέσσερις διαδοχικές χρονικές στιγμές μετά την απομάκρυνση των όγκων τους, ενώ CXCL10 και IL2Rα ήταν ουσιαστικά αμετάβλητες. Αυτό το μοτίβο ανιχνεύθηκε επίσης όταν οι ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα συγκρίθηκαν με ασθενείς χωρίς καρκίνο. Όταν μη καρκινοπαθείς ασθενείς υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση για καλοήθεις παθήσεις, οι αλλαγές αυτές έκφραση κυτοκινών δεν ήταν αποδείξιμη. καρκινικές κυτταρικές σειρές πνεύμονα, αλλά όχι καλοήθη βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα, που προκαλείται από παρόμοιες αλλαγές στην γονιδιακή κυτοκίνης και η έκφραση πρωτεΐνης από υγιή δότη PBMCs σε

in vitro

σύστημα συν-καλλιέργειας. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι τα ΜΚΠΑ από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα σταδίου Ι διαθέτουν διακριτά πρότυπα έκφρασης κυτοκίνης σε σύγκριση με τους ασθενείς που δεν καρκίνο, και ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα μετά την απομάκρυνση του όγκου. Αυτά τα πρότυπα έκφρασης αντιγράφεται από υγιή δότη PBMCs εκτίθεται σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα, αλλά όχι καλοήθη βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα

in vitro

. Τα ευρήματα αυτά έχουν επιπτώσεις για την κατανόηση της ανοσολογικής απόκρισης σε καρκίνο του πνεύμονα

Παράθεση:. Chang DH, Rutledge JR, Patel ΑΑ, Heerdt BG, Augenlicht LH, Korst RJ (2013) Η επίδραση του καρκίνου του πνεύμονα στην έκφραση κυτοκινών σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος. PLoS ONE 8 (6): e64456. doi: 10.1371 /journal.pone.0064456

Επιμέλεια: Sai Yendamuri, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 12 Οκτώβρη του 2012? Αποδεκτές: 15 του Απριλίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 6 του Ιούνη 2013

Copyright: © 2013 Chang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα Valley Hospital. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα παραμένει η κύρια αιτία θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο στις Ηνωμένες Πολιτείες, και αναμένεται να λογοδοτήσει για περισσότερους θανάτους το 2012 από ό, τι του παχέος εντέρου, του μαστού και του προστάτη μαζί [1]. Αν και ο καρκίνος του πνεύμονα έχει θεωρηθεί ότι είναι ένα λίγο ανοσογόνα κακοήθεια, αρκετές σειρές αποδείξεων υποδεικνύουν μια επιρροή του ανοσοποιητικού συστήματος του ξενιστή στη μεταβολή ανάπτυξη και την εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα. Αυτά περιλαμβάνουν αναφορές αυξημένη επιβίωση σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα με μετεγχειρητικές λοιμώξεις [2], αυξημένα ποσοστά υποτροπής μεταξύ των ασθενών που λαμβάνουν περιεγχειρητική μεταγγίσεις αίματος [3], [4], και τα υψηλότερα ποσοστά επίπτωσης μεταξύ ανοσοκατασταλμένα άτομα, όπως εκείνοι που είναι θετικό για το ιό της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV) [5]. Παρά τις παρατηρήσεις αυτές, ο ρόλος του ανοσοποιητικού συστήματος του ξενιστή στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα παραμένει ασαφής.

Οι κυτοκίνες και οι χημειοκίνες (χημειοτακτικές κυτοκίνες) είναι σημαντικοί ρυθμιστές ενδογενείς του ανοσοποιητικού συστήματος και εκκρίνονται από τα κύτταρα του ανοσοποιητικού, καθώς επίσης και από τον όγκο. Στην ασθενή με καρκίνο, αυτά τα μόρια διαθέτουν ποικίλες και πολύπλοκες ρόλους στη λειτουργία και τη διακίνηση των ανοσολογικών και άλλων κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων [6]. Κυτταροκινών και χημειοκινών δίκτυα μπορούν επίσης να «ομηρία» από τα καρκινικά κύτταρα για να παρέχουν ένα περιβάλλον ευνοϊκό για την ανάπτυξη του όγκου [6], [7].

Με δεδομένη την ασαφή ρόλο των κατά του όγκου ανοσίας σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, σε συνδυασμό με το παγκόσμια σημασία κυτοκινών και χημειοκινών στην ανοσολογική αντίδραση, υποθέσαμε ότι ο καρκίνος του πνεύμονα θα έχει ειδικές επιπτώσεις στην κυτοκίνη /έκφρασης χημειοκίνης και έκκριση από μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC). Στο πλαίσιο αυτό, ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι τριπλός. Κατ ‘αρχάς, για να καθοριστεί εάν οι ασθενείς με σταδίου Ι καρκίνο του πνεύμονα παρουσιάζουν έκφραση μεταβάλλεται κυτοκινών στο πλάσμα της κυκλοφορίας και PBMCs πριν δυνητικά θεραπευτική εκτομή, σε σύγκριση με μετά από εκτομή, και να προσδιορίσει διαφορικά εκφρασμένων κυτοκινών. Δεύτερον, για να επιβεβαιωθεί αυτή η διαφορική έκφραση σε PBMCs που λαμβάνονται από μια μεγαλύτερη ομάδα των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα σταδίου Ι, και να συγκρίνουν τα αποτελέσματα αυτά σε μια ομάδα ασθενών που υποβάλλονται σε χειρουργική θώρακος για καλοήθεις παθήσεις. Τρίτον, για να διαπιστώσετε αν αυτή η έκφραση διαφορά κυτοκίνη ενεργοποιείται όταν είναι υγιή PBMCs δότη εκτίθενται σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα

in vitro

.

Υλικά και Μέθοδοι

Πληθυσμός Ασθενών

Αυτή η μελέτη αναθεωρήθηκε και εγκρίθηκε από το Διοικητικό κριτική Valley Hospital θεσμικές και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες στη μελέτη. Δύο ομάδες ασθενών μελετήθηκαν. Η ομάδα των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα περιλαμβάνονται τα άτομα που υποβάλλονται σε θεραπευτική πνευμονική λοβεκτομή και του μεσοθωρακίου ανατομή των λεμφαδένων, με την ιδιότητα του σταδίου Ι επιβεβαιωθεί παθολογικά. Η ομάδα των ασθενών ελέγχου περιελάμβανε ασθενείς με μη-καρκίνο που υποβάλλονται σε χειρουργική θώρακος για καλοήθεις καταστάσεις, όπως αυτόματου πνευμοθώρακα, διαγνωστικά εκτομή της καλοήθους όζου του πνεύμονα, πομφολυγώδη πνευμονοπάθεια, βρογχεκτασίες, μεσοθωρακίου /πνευμονική κύστεις, και hiatal αποκατάσταση της κήλης.

οι ασθενείς αποκλείστηκαν από τη μελέτη αν λάμβαναν χρόνια θεραπεία με στεροειδή, βρέθηκαν να έχουν προχωρημένο καρκίνο του πνεύμονα (στάδιο II, III, IV) παθολογικά μετά από εκτομή, είχε άλλα συγχορηγούμενα καρκίνους, εκτός από τον καρκίνο του δέρματος πλην του μελανώματος, απαιτείται πρόσθετο ή εισαγωγική χημειοθεραπεία , ακτινοθεραπεία ή και τα δύο, ή είχαν ένα ιστορικό της μόλυνσης από HIV, ηπατίτιδα Β ή C ή άλλα ανοσοκατασταλτικά ή μυελοπολλαπλασιαστικές ασθένειες. ασθενείς της ομάδας ελέγχου αποκλείστηκαν αν είχαν υποστεί χειρουργική θώρακος για φλεγμονώδεις /μολυσματικές συνθήκες (εμπύημα, διάμεση πνευμονοπάθεια, ή ενεργό πνευμονίτιδα) ή είχαν ιστορικό άλλων τύπων καρκίνου.

Η προεγχειρητική δείγματα αίματος συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια των δύο εβδομάδα παράθυρο πριν από την επέμβαση, ενώ μετεγχειρητική δείγματα λήφθηκαν σε 3 (2-4 μήνες), 6 (5-7 μήνες), 9 (8-10 μήνες) και 12 (11-13 μήνες) μετά την επέμβαση εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

αίματος Συλλογή δειγμάτων και επεξεργασία

πνεύμονα και τον έλεγχο του αίματος του ασθενούς συντάχθηκε από περιφερική φλεβοκέντηση σε BD Vacutainer CPT Παρασκευή κυττάρων σωλήνες με ηπαρίνη νατρίου (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). επεξεργασία του αίματος έγινε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. PBMC σφαιρίδια συλλέχθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C για την εκχύλιση του RNA και την επακόλουθη δοκιμασίες. Πλάσματος αποθηκεύονται επίσης και αποθηκεύονται στους -80 ° C.

Υγιεινό λευκοκύτταρα του αίματος του δότη (από στιβάδα λευκοκυττάρων) που χρησιμοποιούνται στο

in vitro

πειράματα αγοράστηκαν από τον κοινοτικό Υπηρεσίες Αίματος (Paramus, NJ) . Αυτά τα PBMCs παρασκευάσθηκαν με φυγοκέντρηση του αίματος σε Ficoll-Paque μέσο κλίσης πυκνότητας PLUS (GE Healthcare, Pittsburgh, ΡΑ) για 30 λεπτά στους 805 ×

g

RCF (σχετική φυγοκεντρική δύναμη) σε θερμοκρασία δωματίου. Απομονωμένα PBMCs ανακτήθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές σε PBS με φυγοκέντρηση για 15 και 10 λεπτά σε 453 χ

g

στους 4 ° C. Απομονωμένα PBMCs χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια για το

in vitro δοκιμασίες

συν-καλλιέργεια.

Luminex Δοκιμασία

Η δοκιμασία Luminex είναι ένα multiplex ανοσοανάλυση με βάση σφαιρίδια, η οποία επιτρέπει την ταυτόχρονη μέτρηση πολλαπλών αναλυτών (π.χ. κυτοκίνες) χρησιμοποιώντας μια βιβλιοθήκη του χρωματική κωδικοποίηση σφαιρίδια συζευγμένα με αντίσωμα (που ονομάζεται μικροσφαιρίδια). Για την αρχική διαλογή των πρωτεϊνών του πλάσματος, το πλάσμα συλλέχθηκε από τους ασθενείς 15 το στάδιο του καρκίνου του πνεύμονα που προεγχειρητικά και 3-7 μήνες μετεγχειρητικά. Τα δείγματα πλάσματος στη συνέχεια αναλύθηκαν με τη χρήση της 30-plex Panel κυτοκίνης Ανθρώπου, LHC6003, (πλατφόρμα Luminex? Life Technologies? Carlsbad, CA). Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή με την εξαίρεση ότι τα δείγματα, χάντρες και ρυθμιστικό επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το Luminex 100 μέσου (Luminex, Austin, TX), πρότυπες καμπύλες, και τα δεδομένα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Luminex 100 Ολοκληρωμένο Λογισμικό έκδοση 2.3. Τα υπερκείμενα από το

in vitro

πειράματα συν-καλλιέργειας αξιολογήθηκαν επίσης χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Luminex, σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφεται παραπάνω. Για αρχικές μελέτες διαλογής του πλάσματος, σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης εκφράστηκαν με υπολογισμό της αναλογίας της μέσης φορές μεταβολή στην έκφραση της πρωτεΐνης (προεγχειρητικά για μετεγχειρητικά), και μετατροπή των τιμών στο αρχείο καταγραφής

2 κλίμακα. Οι ασθενείς με τουλάχιστον ένα σημείο δεδομένων που παρουσιάζουν έκφραση πάνω από το ελάχιστο επίπεδο ανίχνευσης Luminex συμπεριλήφθηκαν στους υπολογισμούς αναλογία.

PBMC γονιδιακής έκφρασης Database

Η γονιδιακή έκφραση σε PBMC των έξι περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα, πριν και 2-5 μήνες μετά θεραπευτική εκτομή ελήφθη χρησιμοποιώντας Affymetrix U133 + 2,0 μικροσυστοιχίες, χρησιμοποιώντας RNA που απομονώνεται από κυτταρολύματα PBMC, σε αντίθεση με τα δείγματα πλάσματος. Η εργασία αυτή έχει περιγραφεί προηγουμένως [8]. εντάσεις υβριδισμού χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό φορές διαφορές μεταξύ προεγχειρητική και μετεγχειρητική δείγματα.

RNA Εξόρυξη και Αξιολόγησης της Ποιότητας

Το RNA που εξάγεται από λύματα PBMC χρησιμοποιώντας RNeasy Mini Kit (Qiagen Επιστημών, της Βαλένθια, CA) σύμφωνα με με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή με τις ακόλουθες τροποποιήσεις. Κατεψυγμένα PBMC σβώλοι λύθηκαν άμεσα σε RLT ρυθμιστικό για να ελαχιστοποιηθεί αποικοδόμηση RNA. Κυτταρολύματα πέρασαν μέσα QIAshredder (Qiagen) προ της εν συνεχεία καθαρισμό όπως περιγράφεται στο πρωτόκολλο. Ribonculease-free DNase (Qiagen) χρησιμοποιήθηκε κατά την διάρκεια της πέψης στη στήλη του DNA για την ελαχιστοποίηση της παρουσίας υπολειμματικού γενωμικού DNA.

ποιότητα του RNA και η συγκέντρωση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας RNA Nano τσιπ με Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Σάντα Clara, CA), και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το ειδικό λογισμικό 2100 (Agilent). Το RIN (RNA Ακεραιότητα Number) για το εξαγόμενο RNA ήταν στην περιοχή από 7,0 έως 10,0 με τη μέση τιμή των 8,8 ± 0,68 για όλα τα δείγματα RNA που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη.

πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR αντίστροφης μεταγραφής (RT -qPCR)

Τα πειράματα RT-qPCR πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του μέσου 7500 Real Time PCR από την Applied Biosystems (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). Όλα τα υλικά και τα πρωτόκολλα ελήφθησαν από την Applied Biosystems. Εκκινητών και ανιχνευτών σετ (Πίνακας S1) σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας Primer Express Λογισμικού (Applied Biosystems) σύμφωνα με το πρότυπο σύνολο κριτηρίων σχεδιασμού καθορίζονται από το λογισμικό. Σετ διευρυμένοι ένα ιντρόνιο και γεφυρώνονται μία σύνδεση εξονίου-εξονίου και έγιναν σύμφωνα με τις προδιαγραφές είτε από Applied Biosystems ή τη Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Οι εκκινητές και ανιχνευτές ελέγχθηκαν εμπειρικά για την απουσία παρεμβολής πριν χρησιμοποιηθεί για την πολυπλεξία. Ο έλεγχος ομαλοποίηση που χρησιμοποιείται για όλα τα πειράματα RT-qPCR ήταν β-ακτίνης (γονίδιο σύμβολο ACTB), το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς για όλους τους υπολογισμούς. RT-qPCR multiplex δοκιμασίες που αποτελείται από τρία έως τέσσερα σύνολα εκκινητών και ανιχνευτών (συμπεριλαμβανομένων και αυτών της ACTB.) Διεξήχθησαν [9].

Η αντίδραση RT πραγματοποιήθηκε με 2 μg RNA ανά αντίδραση με τη χρήση υψηλής χωρητικότητας RNA για κιτ cDNA (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). Ποσοτική PCR αντίδραση διεξήχθη χρησιμοποιώντας 30 ng του cDNA εις τριπλούν. Διπλώστε υπολογισμοί αλλαγή πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση της μεθόδου της «(Τ) συγκριτική C» ιδρύθηκε από τον κατασκευαστή [10]. C (T), το όριο του κύκλου, αναφέρεται επίσης ως τιμή Cq (κύκλος Ποσοτικοποίηση). Για τον υπολογισμό, ο μέσος όρος των τριπλών τιμών Cq χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση. τιμές Cq κανονικοποιήθηκαν με εκείνα για ACTB.

Κυτταροκαλλιέργεια και

in vitro

Πείραμα Συν-καλλιέργεια

Ο HCC827 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα Α549 και αγοράστηκαν από την ATCC ( Manassas, VA). Τα κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε μέσο F12K, HCC827 κύτταρα σε RPMI. Αμφότερα τα μέσα καλλιέργειας συμπληρώθηκαν με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 0,028% HEPES (4- (2-υδροξυαιθυλο) -1-πιπεραζινοαιθανοσουλφονικό οξύ), 0,02% πυροσταφυλικό νάτριο, 0,02% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, και 0,004% γενταμυκίνη. Όλα τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για καλλιέργεια κυττάρων αγοράστηκαν από την Life Technologies (Carlsbad, CA). Τα πρωτογενή ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (ΝΗΒΕ), αντίστοιχο μέσο BEBM καλλιέργειας (συμπληρωμένο με BEGM κιτ σφαίρα), και τα αντιδραστήρια αγοράστηκαν από την Lonza (Allendale, NJ). ΝΗΒΕ τον πολιτισμό και την υποκουλτούρα έγινε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του πωλητή (Lonza). Οι κυτταρικές καλλιέργειες διατηρήθηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2.

Α549, HCC927 και ΝΗΒΕ κύτταρα αναπτύχθηκαν για δύο ημέρες σε 3 ml μέσου σε 35 mm (6-φρεατίων) πιάτα (BD Biosciences , Franklin Lakes, NJ) σε 80-90% συρροή. Μετά από δύο ημέρες, 0,4-μm transwell ένθετα (Corning Corp, Corning, ΝΥ) τοποθετήθηκαν στα φρεάτια και 5 × 10

6 υγιών PBMCs δότη, αιωρήθηκε σε 3 ml αντίστοιχο μέσο κυτταρικής καλλιέργειας, προστέθηκαν σε κάθε transwell . έλεγχοι Συν-καλλιέργεια αποτελούνταν από τα φρεάτια που περιέχουν μόνο πλήρες μέσο κυτταρικής καλλιέργειας (Ρ12Κ, RPMI ή BEBM, συμπληρωμένο όπως περιγράφεται ανωτέρω) χωρίς τα κακοήθη ή καλοήθη επιθηλιακά κύτταρα. Συν-καλλιέργειες κατόπιν επωάστηκαν για 6 και 18 ώρες. Μετά την επώαση, τα υπερκείμενα κυτταρικής καλλιέργειας συλλέχθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν (453 χ

g

RCF, 4 ° C, 15 λεπτά), και δείγματα αποθηκεύονται στους -80 ° C για τη δοκιμασία Luminex. Για ανάλυση έκφρασης γονιδίου, τα ένθετα Transwell απομακρύνθηκαν και PBMCs λύονται αμέσως

in situ

χρησιμοποιώντας RLT ρυθμιστικού (RNeasy κιτ? Qiagen) και είτε αποθηκεύεται στους -80 ° C ή χρησιμοποιήθηκε αμέσως για την εκχύλιση του RNA για RT-qPCR. Για την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της έκφρασης πρωτεΐνης, 10 ώρες μετά την προσθήκη PBMCs στα ένθετα Transwell, 1 μl /ml του Golgi-Plug /Brefeldin Α (BD Biosciences) προστέθηκε για την αναστολή της μεταφοράς των πρωτεϊνών. ΡΜΑ (φορβόλη-12-μυριστική-13-οξεική, Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) προστέθηκε σε επιλεγμένα φρεάτια ως θετικός έλεγχος κατά την ίδια στιγμή με GolgiPlug. Μετά από 8 περισσότερες ώρες επώασης, PBMCs συλλέχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για την κυτταρομετρία ροής για την ανίχνευση ενδοκυτταρικών κυτοκινών.

κυτταρομετρίας ροής

Για να ορίσετε κυτταρικούς πληθυσμούς PBMC, το αίμα του ασθενούς συντάχθηκε σε BD Vacutainer Plus Πλαστικά K

2EDTA ταυτόχρονα συλλέχθηκαν για εξαγωγή RNA. Ανοσοποιητικών κυττάρων πληθυσμοί χαρακτηρίζονται από κυτταρομετρία ροής ακολουθώντας τις τυποποιημένες διαδικασίες λειτουργίας που ορίζονται από το The Valley Hospital Εργαστήριο Κλινικής Παθολογίας. Κυτταρομετρία ροής εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας Beckman Coulter Cytomics FC500 και CXP κυτταρόμετρο λογισμικού. Η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού Καλούζα από Beckman Coulter. Τα αντιδραστήρια για κυτταρομετρία ροής αγοράστηκαν από διάφορες πηγές: Αντι-ανθρώπινο-CD11b-PECF594, αντι-ανθρώπινο-IL8-ΡΕ, αντι-ανθρώπινο-CD14-FITC και αντι-ανθρώπινο-IL-1β-ΡΕ από την BD Biosciences? αντι-ανθρώπινο-CD8-ΡΕ-Cy5, αντι-ανθρώπινο-CD56-ΡΕ-Cy7, και αντι-ανθρώπινο-CCL3-ΡΕ από eBioscience (San Diego, CA)? αντι-ανθρώπινου-CD3-ECD και αντι-ανθρώπινο-CD45-ΡΕ-Cy7 από Beckman Coulter (Brea, CA)? αντι-ανθρώπινο-CD4-FITC και αντι-ανθρώπινο-CD19-ΡΕ-Cy5 από Dako (Carpinteria, CA).

Για το

πειράματα in vitro

συν-καλλιέργειας, η χρώση ενδοκυτταρικής κυτοκίνης ήταν εκτελείται σύμφωνα με το πρωτόκολλο Cytofix /Cytoperm από BD Biosciences. Εν συντομία, PBMCs από τα πειράματα συν-καλλιέργειας συλλέχθηκαν, πλύθηκαν και χρωματίστηκαν για δείκτες κυτταρικής επιφάνειας. Μετά τη χρώση επιφάνεια, τα κύτταρα πλύθηκαν, σταθεροποιήθηκαν με Cytofix /Cytoperm και χρωματίζονται για ενδοκυτταρική CCL3, IL8 και IL-1β. Μετά την χρώση, τα κύτταρα πλύθηκαν και πάλι πριν από την ανάλυση.

Στατιστική Ανάλυση

Οι διαφορές στα μέσα επίπεδα έκφρασης μεταξύ των ασθενών με καρκίνο και ασθενείς της ομάδας ελέγχου και αλλαγές στο μέσο επίπεδα έκφρασης κατά τη διάρκεια του χρόνου ήταν αξιολογήθηκαν ταυτόχρονα χρησιμοποιώντας επαναλαμβανόμενη ανάλυση μέτρα διακύμανσης (ANOVA). Αυτό το είδος της ANOVA αντιπροσωπεύει την ταυτόχρονη επίδραση των δύο παραγόντων στην έκφραση [11]. Η σύγκριση των ασθενών με καρκίνο και ασθενείς ελέγχου αξιολογεί ουσιαστικά την επίδραση της παρουσίας του όγκου στα επίπεδα έκφρασης, ενώ η εκτίμηση της έκφρασης ως συνάρτηση του χρόνου αξιολογεί την επίδραση που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση είχε για κάθε ασθενή στη μελέτη.

αξίες P ≤ 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. IBM SPSS Statistics-λογισμικού (έκδοση 19) χρησιμοποιήθηκε για όλες τις στατιστικές αναλύσεις.

Αποτελέσματα

Αρχική Ανάλυση του πλάσματος από το Στάδιο Ι καρκίνο του πνεύμονα ασθενείς για κυτοκίνης Πρωτεΐνη Επίπεδα

Για να αξιολογεί κατά πόσον οι κυτοκίνες και χημειοκίνες εκφράζονται διαφορικά στο πλάσμα από το στάδιο Ι ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα (n = 15) πριν και μετά (3-7 μήνες μετεγχειρητικά) θεραπευτική εκτομή χρησιμοποιήθηκε ένα ανθρώπινο ανοσοδοκιμασία multiplex, και τα αποτελέσματα εμφανίζονται στον πίνακα 1. από τους αρχικούς 30 στόχοι του ανοσοποιητικού συστήματος κυτοκίνης /χημειοκίνης /αυξητικού παράγοντα προσδιορίστηκε με Luminex, τα επίπεδα του 21 στόχοι ήταν πάνω από το όριο ανίχνευσης σε δείγματα πλάσματος των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα »(Πίνακας 1), ενώ τα επίπεδα έκφρασης της 9ης στόχων (παράγοντα Νέκρωσης όγκου άλφα, IL2, IL4, IL5, IL10, IL13, IL17, κοκκιοκυττάρων-μακροφάγων παράγοντα διέγερσης αποικιών, ιντερφερόνη γάμμα) ήταν κάτω από το όριο ανίχνευσης, τόσο στην προεγχειρητική και μετεγχειρητική δείγματα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

η

Αναγνώριση 5 γονίδια για περαιτέρω διερεύνηση

για να επιβεβαιώσουν τα αρχικά πορίσματα για τους 21 στόχους που προσδιορίζονται από τη δοκιμασία Luminex, και να συμβάλει στον καθορισμό στόχων για περαιτέρω έρευνα, θα ανακριθεί μια βάση δεδομένων μικροσυστοιχιών δημιουργήθηκε προηγουμένως στο εργαστήριο μας που συγκρίνει πρότυπα γονιδιακής έκφρασης σε ΜΚΠΑ που λαμβάνονται από ασθενείς σταδίου Ι καρκίνο του πνεύμονα πριν και μετά την θεραπευτική εκτομή. Παρόμοια με τα δεδομένα πρωτεΐνη, η έκφραση του γονιδίου για την πλειονότητα αυτών των 21 κυτοκινών ήταν υψηλότερη πριν από την θεραπευτική εκτομή του καρκίνου του πνεύμονα σταδίου Ι, σε σύγκριση με μετά την εκτομή (Πίνακας 1).

επελέγησαν πέντε κυτοκίνες για περαιτέρω έρευνα από εξετάζοντας τα αρχικά δεδομένα τις πρωτεΐνες του πλάσματος έλεγχο και την μικροσυστοιχιών βάση δεδομένων (mRNA) παράλληλα, με έμφαση σε στόχους που ήταν σημαντικά πάνω /μειωτικά (p & lt? /= 0,05). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, από τις τέσσερις κυτοκίνες (πρωτεΐνες) που ανιχνεύθηκαν στο πλάσμα στα υψηλότερα επίπεδα

πριν

στο στάδιο Ι εκτομή καρκίνου του πνεύμονα (CCL3 (χημειοκινών με CC μοτίβο συνδέτη 3), IL8 (ιντερλευκίνη 8), IL6 (ιντερλευκίνη 6), IL-1β (ιντερλευκίνη 1 beta)), τρεις είχαν επιβεβαιώνονται από τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης PBMC από τη βάση δεδομένων των μικροσυστοιχιών (

CCL3, IL8, IL-1β

) στο επίπεδο του mRNA. Ομοίως, οι δύο κυτοκίνες (πρωτεΐνες) που βρέθηκαν στα χαμηλότερα επίπεδα

πριν

στο στάδιο Ι εκτομή καρκίνου του πνεύμονα (CXCL10 και διαλυτές IL2Rα) ήταν τόσο ενισχύεται από τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης PBMC από τη βάση δεδομένων των μικροσυστοιχιών. Εικόνα S1 απεικονίζει γραφικά τα αποτελέσματα συνοψίζονται πρωτεΐνες του πλάσματος ελέγχου και τα ευρήματα της βάσης δεδομένων PBMC mRNA για τα 5 γονίδια που επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη:.

CCL3, IL8, IL-1β, CXCL10,

και

IL2Rα

Η

Επιβεβαίωση με RT-qPCR των διαφορικά εκφρασμένων κυτοκινών μετά την εκτομή του σταδίου Ι καρκίνο του πνεύμονα

Για την επικύρωση και την επέκταση των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται από τα αρχικά δεδομένα Luminex και μικροσυστοιχιών, η γονιδιακή έκφραση PBMC αξιολογήθηκε σε πολύ μεγαλύτερες ομάδες της ασθενείς με σταδίου Ι καρκίνο του πνεύμονα (n = 62) και ασθενείς που υποβάλλονται σε έλεγχο θωρακική χειρουργική επέμβαση για καλοήθεις παθήσεις (n = 32). Τα δημογραφικά χαρακτηριστικά των δύο αυτών ομάδες ασθενών παρουσιάζονται στον Πίνακα S2.The πέντε επιλεγμένων γονιδίων στόχων,

CCL3, IL8, IL-1β, CXCL10,

και

IL2Rα,

ερευνήθηκαν περαιτέρω από τον πραγματικό χρόνου RT-qPCR δοκιμασία. Από τους 62 ασθενείς στην ομάδα του καρκίνου του πνεύμονα που υποβλήθηκαν σε φλεβοτομία πριν από την εκτομή, 58 είχαν αίματος που για την ανάλυση κατά τη διάρκεια της μετεγχειρητικής περιόδου, όπως έκαναν 16 από τους ασθενείς της ομάδας ελέγχου 32. Το Σχήμα 1 καταδεικνύει τις σχετικές μεταβολές στην έκφραση ανιχνεύθηκε για τις 5 γονιδίων κατά τη διάρκεια της μετεγχειρητικής περιόδου για τον καρκίνο του πνεύμονα και οι ασθενείς ελέγχου. Είναι ενδιαφέρον ότι, η γονιδιακή έκφραση PBMC για τις τρεις κυτοκίνες (

CCL3, IL8, IL-1β

) ανιχνεύθηκε στο πλάσμα σε αυξημένα επίπεδα

πριν

να εκτομή του καρκίνου του πνεύμονα κατά τη διάρκεια της αρχικής διαλογής βρέθηκαν να ρυθμίζεται προς τα κάτω

μετά

εκτομή καρκίνου του πνεύμονα σε όλα τα χρονικά σημεία. Περαιτέρω, το ίδιο μοτίβο δεν ανιχνεύθηκε σε ασθενείς που υποβάλλονται σε έλεγχο θωρακική χειρουργική επέμβαση για καλοήθεις ασθένειες. Τέλος, η γονιδιακή έκφραση PBMC για τις 2 κυτοκινών (

CXCL10, IL2Rα

) που δεν ανιχνεύθηκαν στο πλάσμα σε αυξημένα επίπεδα

πριν

να εκτομή του καρκίνου του πνεύμονα κατά τη διάρκεια της αρχικής διαλογής δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές em

μετά

εκτομή (Σχήμα 1). Μετά από ανάλυση αυτών των δεδομένων με τη χρήση επαναλαμβανόμενων μετρήσεων ANOVA, γίνεται σαφές ότι

IL8

και

IL-1β

έκφρασης μειωτικά σημαντικά μετά από εκτομή καρκίνου του πνεύμονα σταδίου Ι, ένα εύρημα το οποίο δεν συνδέεται με το αποτέλεσμα του θώρακα χειρουργική επέμβαση σε ασθενείς με μη καρκινικά.

CCL3

επίσης φαίνεται να ρυθμίζεται προς τα κάτω κατά παρόμοιο τρόπο, στο βαθμό που προσεγγίζει στατιστική σημασία (Σχήμα 2). Περαιτέρω, κυτταρομετρία ροής των PBMCs δείχνει ένα ομοιόμορφο πληθυσμό υποτύπων λεμφοκυττάρου σε όλες τις ομάδες ασθενών, υποδηλώνοντας ότι οι αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση δεν φαίνεται να οφείλεται σε διαφορές στην αναπαράσταση των κυττάρων στους πληθυσμούς PBMC λεμφοκυττάρων, αν και τα δεδομένα αυτά δεν εξαλείφουν την πιθανότητα ανεπαίσθητες αλλαγές σε υποπληθυσμούς (Εικόνα S2).

Η γονιδιακή έκφραση για 5 επιλεγμένα κυτοκινών σε ΜΚΠΑ από καρκίνο του πνεύμονα σταδίου Ι (κλειστοί κύκλοι) και ασθενείς ελέγχου μη-καρκίνου (ανοικτοί κύκλοι) μετά από χειρουργική επέμβαση καταδεικνύονται. Κάθε μετεγχειρητική σημείο αντιπροσωπεύει την μέση (+/- SEM) φορές μεταβολή στην έκφραση στο εν λόγω ορισθέν μετεγχειρητική χρονικό σημείο σε σχέση με το επίπεδο προεγχειρητική, εκφρασμένη σε log

2 κλίμακα. Οι προεγχειρητικές τιμές (preop) εμφανίζεται ως μηδέν για σκοπούς αναφοράς. Αλλαγές μικρότερη του μηδενός αντιπροσωπεύουν μειορρύθμιση μετά την επέμβαση. Για τους ασθενείς με καρκίνο, ο αριθμός των δειγμάτων που χρησιμοποιούνται στους υπολογισμούς είναι: Preop: n = 58? 3 μήνα: n = 48? 6 μήνες: n = 43? 9 μήνες: n = 40? 12 μήνα: n = 40. Για τους ασθενείς της ομάδας ελέγχου, ο αριθμός των δειγμάτων που χρησιμοποιούνται στους υπολογισμούς είναι: Preop: n = 16? 3 μήνα: n = 11? 6 μήνα: n = 9? 9 μήνα: n = 6? 12 μήνα: n = 7.

Η

μέτρων Μία επαναλαμβανόμενη ανάλυση διακύμανσης χρησιμοποιήθηκε για να απομονώσει την επίδραση της παρουσίας ή απουσίας καρκίνου του πνεύμονα για την έκφραση του

CCL3

(p = 0.07),

IL8

(p = 0.01),

IL-1β

(p = 0,004),

CXCL10

(p = 0,4) και

IL2Rα

( p = 0.69). Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο όρο (+/- SEM) σχετική μεταβολή φορές για κάθε κυτοκίνη την ενσωμάτωση όλων των μετεγχειρητικών δεδομένων σε σύγκριση με την έκφραση πριν από την εγχείρηση, που εκφράζεται σε log

2 κλίμακα. Μια αρνητική σχετική μεταβολή φορές δείχνει προς τα κάτω ρύθμιση μετά την εκτομή του σταδίου Ι καρκίνο του πνεύμονα.

Η

Η έκφραση του

CCL3, IL8

και

IL-1β

είναι υψηλότερη σε PBMCs από το στάδιο Ι του πνεύμονα Οι ασθενείς με καρκίνο σε σύγκριση με ασθενείς χωρίς καρκίνο του πνεύμονα

για να προσδιορίσετε αν PBMCs από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα σταδίου Ι έχουν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του

CCL3, IL8

και

IL-1β

από τους ασθενείς χωρίς πνεύμονα καρκίνος, συγκρίθηκαν οι RT-qPCR αποτελέσματα από τα δείγματα προεγχειρητική PBMC από τον καρκίνο του πνεύμονα σταδίου Ι (n = 62) και ομάδες ελέγχου (η = 32). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, η μέση έκφραση σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα ήταν σημαντικά υψηλότερη σε σχέση με τους ελέγχους για το

CCL3

και

IL-1β

(10 και 29 φορές, αντίστοιχα). Αν και δεν είναι στατιστικά σημαντική, η μέση έκφραση του

IL8

ήταν 6 φορές υψηλότερη στους ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα σε σχέση με τους μάρτυρες. Σε αντίθεση, αν και στατιστικά σημαντική,

IL2Rα

έκφραση ήταν μόνο 2 φορές υψηλότερη στους ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, ενώ

CXCL10

έκφραση ήταν ουσιαστικά αμετάβλητη. Είναι σημαντικό ότι, σε τρεις και δώδεκα μήνες μετά την επέμβαση, τα επίπεδα έκφρασης φαίνονται να εξισώσει μεταξύ του καρκίνου και ομάδες ελέγχου (Σχήμα 3).

A. Η προεγχειρητική γονιδιακή έκφραση PBMC σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα σταδίου Ι (n = 62) σε σύγκριση με ασθενείς που δεν καρκίνο προγραμματισμένες να υποβληθούν σε χειρουργική θώρακος για καλοήθη νόσο (n = 32).

CCL3

: p = 0,003?

IL8

: p = 0,23?

IL-1β

: p = 0,05?

CXCL10

: p = 0,55?

IL2Rα

: p = 0.01. μετεγχειρητική έκφραση B. Τρεις μήνες PBMC γονιδίου σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα σταδίου Ι (n = 48) σε σύγκριση με ασθενείς που δεν καρκίνο (n = 11).

CCL3

: p = 0,79?

IL8

: p = 0.3?

IL-1β

: p = 0.1?

CXCL10

: p = 0.8?

IL2Rα

: p = 0,29. Γ Δώδεκα μήνες μετεγχειρητικά γονιδιακής έκφρασης PBMC σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα σταδίου Ι (n = 40) σε σύγκριση με ασθενείς που δεν καρκίνο (n = 7).

CCL3

: p = 0,76?

IL8

: p = 0,52?

IL-1β

: p = 0,87?

CXCL10

: p = 0,22?

IL2Rα

: p = 0,58. Για όλα τα πάνελ, κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει το λόγο του επιπέδου σημαίνει έκφραση σε ασθενείς με καρκίνο πάνω από το μέσο επίπεδο έκφρασης στους ασθενείς ελέγχου, που εκφράζονται σε log

2 κλίμακα. Μια θετική τιμή δεικνύει ότι η έκφραση είναι υψηλότερη σε ασθενείς με καρκίνο σε σύγκριση με τους ασθενείς ελέγχου. Δύο δείγμα t-tests χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η σημασία των διαφορών στην έκφραση.

Η

Η κυτοκίνης Προφίλ του Υγιή PBMCs Δωρητών Μιμείται

in vivo

Πορίσματα Μετά Συγκαλλιέργεια με Καρκίνο του Πνεύμονα κυτταρικές σειρές

για να επεκτείνει την ανάλυση των επιπτώσεων του καρκίνου του πνεύμονα στην έκφραση PBMC κυτοκίνη, χρησιμοποιήθηκε ένα

in vitro

σύστημα συγκαλλιέργειας, όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Δύο διαφορετικές ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα χρησιμοποιήθηκαν στις χαμηλότερες θαλάμους Transwell: Α549, μία κυτταρική γραμμή καρκινώματος πνεύμονα που φέρει μια μετάλλαξη Κ-Ras και HCC827, μία κυτταρική σειρά αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα με μια μετάλλαξη EGFR (Ε746-A750 del). Ως περαιτέρω έλεγχος, καλοήθη κύτταρα ΝΗΒΕ χρησιμοποιήθηκαν επίσης στους κατώτερους θαλάμους Transwell. PBMCs, που χρησιμοποιούνται στις άνω transwells, παρασκευάστηκαν από υγιείς δότες που δεν γνωστό ιστορικό καρκίνου του πνεύμονα.

Η έκθεση των υγιών PBMCs δότη για 6 και 18 ώρες για να είτε Α549 ή κυττάρων που επάγεται HCC827 προς τα πάνω ρύθμιση του

CCL3, IL8

και

IL-1β

mRNA σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο σε σύγκριση με ψευδο-εκτεθειμένο PBMC (Σχήματα 4Α και 4Β). Παρά το γεγονός ότι

IL2Rα

mRNA επίσης ρυθμίζεται προς τα πάνω, η έκταση είναι πολύ μικρότερη από αυτή που παρατηρείται για

IL8

και

IL-1β

. Σε αντίθεση,

CXCL10

έκφραση είτε έμεινε αμετάβλητη ή μειωτικά μετά συν-επώαση με τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα. Είναι ενδιαφέρον ότι, αυτό το μοτίβο της έκφρασης του γονιδίου κυτοκίνης δεν παρατηρήθηκε στην συν-καλλιεργήθηκαν με τα καλοήθη κύτταρα ΝΗΒΕ (Σχήμα S3) PBMC. Περαιτέρω, οι ίδιες φλεγμονώδεις πλακούντες που χρησιμοποιούνται για την συν-καλλιέργεια των κυττάρων ΝΗΒΕ και PBMC (που δεν εμφανίζει καμία απόκριση κυτοκίνης) εκτέθηκαν επίσης σε Α549 και HCC827 καρκινικά κύτταρα πνεύμονα όπου μια απόκριση παρόμοια με αυτή που φαίνεται στο Σχήμα 4, εκτιμήθηκε (τα δεδομένα δεν φαίνονται) .

πνεύμονα κυτταρικές σειρές καρκίνου του συν-καλλιεργήθηκαν με υγιή δότη PBMC όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. γονιδιακής έκφρασης PBMC και το υπερκείμενο επίπεδα πρωτεΐνης αξιολογήθηκαν για κάθε ένα από 5 επιλεγμένων κυτοκινών. έκφραση Α Gene σε PBMC εκτέθηκαν σε κύτταρα Α549. έκφραση Β Gene σε PBMC εκτέθηκαν σε HCC827 κύτταρα. Για πίνακες Α και Β, κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει τη μέση (η = 8 υγιείς δότες) σχετική μεταβολή φορές (+/- SEM) μεταξύ του καρκίνου του πνεύμονα που εκτίθενται PBMC και PBMC εκτέθηκαν σε μέσο μόνο, που εκφράζεται σε log

2 κλίμακα. Κλειστές μπάρες δείχνουν από 6 ώρες συν-καλλιέργειας, ενώ οι ανοιχτές μπάρες δείχνουν από 18 ώρες συγκαλλιέργειας. Γ Cytokine επίπεδα πρωτεΐνης στο υπερκείμενο επί συν-καλλιέργεια κυττάρων Α549 με υγιή δότη PBMC. επίπεδα πρωτεΐνης D. κυτοκίνης στο υπερκείμενο επί συν-καλλιέργεια κυττάρων HCC827 με υγιή δότη PBMC. Για πάνελ C και D, κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει τη μέση (η = 8 υγιείς δότες) σχετική μεταβολή φορές (+/- SEM) μεταξύ του καρκίνου του πνεύμονα που εκτίθενται PBMC (18 ώρες συν-καλλιέργειας) και PBMC εκτέθηκαν σε μέσο μόνο, που εκφράζεται σε log

2 κλίμακας. Ένα δείγμα t-tests χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η σημασία των παρατηρούμενων μέσων φορές αλλαγές. Σε όλους τους πίνακες, ένας αστερίσκος δηλώνει p & lt? 0,05. ND υποδεικνύει στοιχεία κάτω από το επίπεδο ανίχνευσης.

Η

Για την εκτίμηση των επιπέδων της πρωτεΐνης κυτοκίνης στο σύστημα συν-καλλιέργειας, τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν μετά από 18 ώρες συν-καλλιέργειας με τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα, και αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας την δοκιμασία Luminex (Εικόνες 4C και 4D). Ενώ IL8, CXCL10 και οι συγκεντρώσεις sIL2Rα μιμήθηκε τα αντίστοιχα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης (Σχήμα 4Α και 4Β), τα επίπεδα IL-1β και CCL3 ήταν κάτω από τα όρια ανίχνευσης σε όλα τα δείγματα και για τις δύο κυτταρικές σειρές. Για να αντιμετωπιστεί αυτή η έλλειψη ανιχνεύσιμου CCL3 και IL-1β στα υπερκείμενα καλλιέργειας, τα PBMC αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής για την ενδοκυτταρική παρουσία CCL3, IL8 και IL-1β. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, ενδοκυτταρική CCL3, IL8 και IL-1β ανιχνεύθηκαν στο κλάσμα CD3 + (Τ κύτταρα) του υγιούς PBMCs δότες που είχαν συν-καλλιεργήθηκαν με είτε πνεύμονα κυτταρική σειρά καρκίνου, αλλά όχι σε εκείνες που καλλιεργήθηκαν απουσία του καρκίνου του πνεύμονα κύτταρα. Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα λήφθηκε για το κλάσμα CD14 + PBMC (μονοκύτταρα), που φαίνεται στο Σχήμα 5Β. Αντιστρόφως, οι CD19 + κλάσμα (Β κύτταρα), και CD56 + κλάσμα (κύτταρα ΝΚ) δεν έδειξε καμία αύξηση στα ενδοκυτταρικά επίπεδα αυτών των κυτοκινών (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Μετά συν-καλλιέργεια, τα PBMC στερεώθηκαν και αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρίας ροής για την ενδοκυτταρική κυτοκίνες (CCL3, IL8 και IL-1β). Παρουσιάζεται είναι ένα αντιπροσωπευτικό υγιή δότη (από 3 εκτελείται). Α CD3 + κλάσμα κυττάρων. Η τετμημένη παριστά τη χρώση CD3, ενώ χρώση μεμονωμένων κυτοκίνη ανακλάται κατά μήκος της τεταγμένης. Το ποσοστό των διπλά χρωματισμένα κύτταρα απεικονίζεται στην επάνω δεξιά γωνία κάθε υποπίνακα. κλάσμα Β CD14 + κυττάρων. Η τετμημένη παριστά τη χρώση CD14, ενώ χρώση μεμονωμένων κυτοκίνη ανακλάται κατά μήκος της τεταγμένης. Το ποσοστό των διπλά χρωματισμένα κύτταρα απεικονίζεται στην επάνω δεξιά γωνία κάθε υποπίνακα.

Η

Συζήτηση

Ο ρόλος των κυτταροκινών στη βιολογία της ανθρώπινης κακοήθειας είναι πολύπλοκη, αλλά ένα μεγάλο μέρος της αλληλεπίδραση μεταξύ κυττάρων όγκου και κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος του ξενιστή πιστεύεται ότι προκαλείται από αυτή τη μεγάλη οικογένεια πρωτεϊνών και γλυκοπρωτεϊνών [6]. Ως αποτέλεσμα, υπάρχει ένα αυξανόμενο σώμα της βιβλιογραφίας αξιολόγηση επιπέδων κυτοκίνης στον ορό σε σχέση με κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά τόσο αιματολογικών και συμπαγών όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα. Πολλές από αυτές τις μελέτες, ωστόσο, μόνο σε σύγκριση επιπέδων κυτοκίνης στον ορό των ασθενών με καρκίνο με εκείνα των υγιών εθελοντών, με την έμφαση που δίνεται στην πιθανή χρησιμότητα αυτών των μετρήσεων ως βιοδείκτη [12], [13].