Αφηρημένο

Η έκτακτη βιολογική ποικιλότητα των τροπικών δασών φιλοξενεί μια πλούσια χημική πολυμορφία με τεράστιες δυνατότητες ως πηγή νέων βιοδραστικών ενώσεων. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα νέα περιβάλλοντα για μικροβιακή ανακάλυψη. Βραδύποδες – δενδρόβια θηλαστικά που βρίσκονται συνήθως στα δάση πεδινών του Παναμά – φέρουν μια ευρεία ποικιλία των μικρο- και μακρο-οργανισμούς σε χοντρό εξωτερικό μαλλιά τους. Εδώ αναφέρουμε για πρώτη φορά την απομόνωση των διαφορετικών και βιοενεργών στελέχη των μυκήτων από τα μαλλιά οκνηρία, και ταξινομική τοποθέτηση τους. Ογδόντα τέσσερις απομονώσεων μυκήτων λήφθηκαν με τον πολιτισμό από την επιφάνεια της τρίχας που συλλέχθηκαν από ζωντανούς τρεις-toed βραδύποδες (

Bradypus variegatus

, Bradypodidae) στο Εθνικό Πάρκο Soberanía, Δημοκρατία του Παναμά. Η φυλογενετική ανάλυση αποκάλυψε μια διαφορετική ομάδα Ascomycota που ανήκουν σε 28 ξεχωριστές λειτουργικές μονάδες ταξινομική (Otus), αρκετά από τα οποία αποκλίνουν από τα προηγουμένως γνωστά taxa. Εβδομήντα τέσσερα προϊόντα απομόνωσης καλλιεργήθηκαν σε υγρό ζωμό και ακατέργαστα εκχυλίσματα ελέγχθηκαν για βιοδραστικότητα

in vitro

. Βρήκαμε ένα ευρύ φάσμα δραστηριοτήτων εναντίον στελεχών των παρασίτων που προκαλούν την ελονοσία (

Plasmodium falciparum

) και η νόσος του Chagas (

Trypanosoma cruzi

), και ενάντια στον καρκίνο των κυττάρων του μαστού ανθρώπινη γραμμή MCF-7 . Πενήντα εκχυλίσματα από μύκητες ελέγχθηκαν για αντιβακτηριακή δράση σε μια νέα οθόνη αντιβιοτικό προφίλ που ονομάζεται BioMAP? Από αυτούς, 20 ήταν δραστικά έναντι τουλάχιστον ενός βακτηριακού στελέχους, και ένας είχε ένα ασυνήθιστο μοτίβο βιοδραστικότητας έναντι Gram-αρνητικών βακτηρίων που υποδηλώνει μια δυνητικά νέο τρόπο δράσης. Μαζί τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν τη σημασία της εξερεύνησης νέων περιβαλλόντων για βιοενεργά μύκητες, και να αποδείξει για πρώτη φορά την ταξινομική σύνθεση και βιοδραστικότητα των μυκήτων από τα μαλλιά νωθρότητα

Παράθεση:. Higginbotham S, Wong WR, Linington RG, Spadafora C , Iturrado L, Arnold ΑΕ (2014), νωθρότητα μαλλιά ως νέα πηγή των μυκήτων με ισχυρός αντι-παρασιτική, Anti-Cancer και αντι-βακτηριακή βιοδραστικότητας. PLoS ONE 9 (1): e84549. doi: 10.1371 /journal.pone.0084549

Επιμέλεια: Χαρά Sturtevant, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο της Λουιζιάνα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 31ης Ιουλίου του 2013? Αποδεκτές: 15 Νοέμ 2013? Δημοσιεύθηκε: 15 Ιανουαρίου του 2014

Copyright: © 2014 Higginbotham et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το πρόγραμμα του Διεθνούς Συνεταιριστικής βιοποικιλότητα Ομάδες (ICBG-Παναμά https://www.icbg.org/, χορηγεί αριθμό 2 U01 TW006634-06) και το Κολέγιο Γεωργίας και Επιστημών ζωής στο Πανεπιστήμιο της Αριζόνα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Παρά τις τεράστιες αυξήσεις στις δαπάνες για τη διεθνή υγειονομική περίθαλψη κατά τη διάρκεια των τελευταίων 20 ετών, οι μεταδοτικές νόσοι εξακολουθούν να αποτελούν ένα τεράστιο βάρος για την παγκόσμια υγεία [1]. Χρόνιες μολυσματικές ασθένειες, όπως η ελονοσία και ποικίλη παραμελημένες τροπικές ασθένειες (NTDs) επηρεάζει εκατομμύρια ανθρώπους κάθε χρόνο, κυρίως γυναίκες και παιδιά στις αναπτυσσόμενες χώρες [2]. Η ταχεία εξάπλωση της ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά έχει μειωθεί το οπλοστάσιο διατίθενται για τη θεραπεία πολλών λοιμωδών νοσημάτων, με την πρόσφατη εμφάνιση της αντίστασης pandrug αποδίδοντας ασθένειες που είναι απείθαρχα σε θεραπευτική αγωγή με οποιαδήποτε γνωστή [3] ναρκωτικών. Παράλληλα οι μη μεταδοτικές ασθένειες αυξάνονται σε συχνότητα σε σχέση με μεταδοτικές ασθένειες: τον καρκίνο του 2008 ήταν υπεύθυνη για περίπου 7,8 εκατομμύρια θανάτους (περίπου το 13% όλων των θανάτων σε όλο τον κόσμο? [4])

Φυσικά προϊόντα αντιπροσωπεύουν ένα από τα. πιο σημαντικές πηγές νέων φαρμάκων και σήμερα. Περίπου το 50% όλων των φαρμάκων που εισάγονται μεταξύ του 1981 και του 2006 ήταν φυσικής προέλευσης του προϊόντος [5], με επιπλέον 34 φυσικά φάρμακα που βασίζονται στα προϊόντα που ξεκίνησε μεταξύ του 1997 και του 2007 [6]. Από την ανακάλυψη της πενικιλίνης πάνω από 80 χρόνια πριν, οι μύκητες έχουν συμβάλει σημαντικά στην ανακάλυψη φαρμάκων φυσικό προϊόν, που παρέχει μια σειρά από πολύτιμες φάρμακα, συμπεριλαμβανομένων των αντιβιοτικών β-λακτάμης, γκριζεοφουλβίνη, κυκλοσπορίνη, φουσιδικό οξύ, και λοβαστατίνη [7]. Ωστόσο, τα τελευταία χρόνια, το χτύπημα-ποσοστό για βιοδραστικότητα από μύκητες έχει επιβραδυνθεί, ίσως δείχνοντας την επικείμενη εξάντληση των «φρούτα στα χαμηλά κλαδιά» – τα εύκολα και συχνά πρόσβαση μύκητες όπως microfungi εδάφους -. Ως πηγές νέων βιοδραστικών μεταβολιτών

Συντηρητικές εκτιμήσεις δείχνουν ότι ο συνολικός αριθμός των ειδών μυκήτων σε ύπαρξη υπερβαίνει τα 5 εκατομμύρια, έχουν ακόμα λιγότερες από 100.000 είδη μυκήτων έχουν περιγραφεί [8], [9]. Αυτό υποδηλώνει ότι η διερεύνηση νέων περιβάλλοντα που μπορεί να είναι το σπίτι σε προηγουμένως μη περιγραφείσα μύκητες θα μπορούσαν να είναι εξαιρετικά παραγωγικοί. Για παράδειγμα, πρόσφατη εξέταση των τροπικών από μύκητες ενδόφυτα έχει περιγραφεί τροπικά φύλλα ως «hotspot βιοποικιλότητας» [10], [11], [12] που αποδεικνύει γόνιμη ως πηγή νέων βιοδραστικών ενώσεων (βλέπε [13] για επανεξέταση) .

Gloer [14] πρότεινε ότι η παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών από μύκητες μπορεί να επηρεάζονται από τις επιλεκτικές πιέσεις που μεταδίδεται από άλλους οργανισμούς. Αυτό υποδηλώνει ότι τα περιβάλλοντα όπου υπάρχουν πολλά διαφορετικά είδη σε στενή γειτνίαση μπορεί να έχουν ιδιαίτερο δυναμικό ως πηγές βιοδραστικών μεταβολιτών. Ένα τέτοιο ανεξερεύνητο περιβάλλον είναι η μυκητιασική microbiome σχετίζεται με το χοντρό, σφουγγάρι-όπως τα μαλλιά του Τριδάκτυλος Βραδύπους (

Bradypus variegatus

), μια δενδρόβια θηλαστικά που βρίσκονται συνήθως στα πεδινά τροπικά δάση της Κεντρικής Αμερικής.

το τρίχωμα τρεις-συνοχή sloths αποτελείται από δύο διακριτά στρώματα: ένα εσωτερικό στρώμα από λεπτή, μαλακή τρίχα κοντά στο δέρμα, και ένα εξωτερικό στρώμα από χονδροειδείς τρίχες που είναι ωοειδή διατομή και είναι πλάτους περίπου 0,4 χιλιοστόμετρα [ ,,,0],15]. Αυτές οι εξωτερικές τρίχες φέρουν εγκάρσιες ρωγμές που είναι το σπίτι σε μια φαινομενικά πανταχού παρούσα πράσινη άλγη, συνήθως του γένους

Trichophilus

[16]. Η άλγη είναι ευρέως πιστεύεται ότι παρέχει καμουφλάζ για βραδύποδες κατά τη στίγματα φόντο των οικοτόπων τους, αλλά αυτό δεν έχει επιβεβαιωθεί με δεδομένα. Suutari

et al.

[16] πρότεινε ότι exopolymeric ουσίες που παράγονται από το φύκι θα μπορούσε να ενθαρρύνει την ανάπτυξη των ωφέλιμων βακτηρίων. Νωθρότητα μαλλιά είναι συνήθως στο σπίτι για τα κυανοβακτήρια και τα διάτομα, καθώς και μια ποικιλία από μακρο-οργανισμούς (π.χ. κατσαρίδες, ασκαρίδες, και τις προνύμφες σκώρων? [16]). Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τις κοινότητες των μυκήτων στα μαλλιά νωθρότητα.

Σε μια προσπάθεια να αποκαλύψει νέες πηγές των φαρμάκων για τη θεραπεία που μεταδίδονται από φορείς ασθενειών, του καρκίνου, και βακτηριακές λοιμώξεις, χρησιμοποιήσαμε μια προσέγγιση που βασίζονται στον πολιτισμό για να εξετάσει μυκητιασική κοινοτήτων που συνδέονται με το χοντρό, εξωτερική μαλλιά του

Bradypus variegatus

στον Παναμά. Εδώ αναφέρουμε την απομόνωση των μυκήτων με βιοδραστικότητα έναντι

Trypanosoma cruzi

, ο αιτιολογικός παράγοντας της ασθένειας Τσάγκας?

Plasmodium falciparum

, ο αιτιολογικός παράγοντας της ελονοσίας? η ανθρώπινου μαστού καρκινική κυτταρική γραμμή MCF-7? και μια σειρά από Gram-αρνητικά και Gram-θετικά ανθρώπινα παθογόνα βακτήρια. Φυλογενετική αναλύσεις χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό αυτών των μυκήτων σε μια λεπτότερη και πιο ισχυρή από ό, τι το επίπεδο είναι δυνατό με τη χρήση τυπικών μεθόδων βάση δεδομένων αντιστοίχισης μόνο. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η νωθρότητα των μαλλιών είναι μια ενδιαφέρουσα νέα πηγή σημαντικών βιοδραστικών μυκήτων με πολλά περιθώρια για την εξερεύνηση των πέντε άλλα σωζόμενα είδη νωθρότητα που βρέθηκαν σε όλη την νεοτροπικές χώρες.

Υλικά και Μέθοδοι

Έγκριση για τη δειγματοληψία από νωθρότητα μαλλιά ελήφθη από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση (IACUC) του Smithsonian Tropical Research Institute και άδειες συλλογής ελήφθησαν από Παναμά Autoridad Nacional del Ambiente (ANAM). Ένα μόνο δείγμα από χονδροειδείς εξωτερικές τρίχες συλλέχθηκαν από όλο τον κάτω μέρος της πλάτης του καθενός από εννέα ζουν τρεις-toed βραδύποδες συνάντησε τον Φεβρουάριο του 2011, μαζί Pipeline Road στο Εθνικό Πάρκο Soberanía, Δημοκρατία του Παναμά (Ν 9 ° 9 ‘, W 79 ° 44’ ? [17]). δείγματα μαλλιών τοποθετήθηκαν σε αποστειρωμένους σωλήνες Falcon ήμισυ γεμάτη με σιλικαζέλ και αποθηκεύονται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος μέχρι να μεταποιηθούν.

Απομόνωση και καλλιέργεια των μυκήτων

Κάθε τρίχα ξεπλύθηκε με αποστειρωμένο νερό για να απομακρυνθούν οι ακαθαρσίες και χαλαρά συναφείς μικροοργανισμούς. Κάτω από ασηπτικές συνθήκες τρίχες κόπηκαν σε κομμάτια μήκους περίπου 2,5 cm και τοποθετούνται στην επιφάνεια του άγαρ δεξτρόζης πατάτας (PDA) ή 2% άγαρ εκχυλίσματος βύνης (ΜΕΑ) σε αποστειρωμένες πλάκες Petri. Οι πλάκες σφραγίστηκαν με Parafilm, επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου, και ελέγχθηκαν για νέα ανάπτυξη μυκήτων ημερησίως για 2 εβδομάδες. Υφές κόπηκαν άσηπτο τρόπο από κάθε πλάκα και μεταφέρθηκαν σε στείρα καλλιέργεια στο ίδιο μέσο. Απομονώσεις αποθηκεύονται ως κουπόνια διαβίωσης σε θερμοκρασία δωματίου (δηλαδή, όπως άγαρ με μυκήλιο σε αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό) και έχουν αρχειοθετηθεί στη συλλογή της Διεθνούς Συνεταιριστικής Ομάδας Βιοποικιλότητα (ICBG) στο Smithsonian Tropical Research Institute στον Παναμά (προσχωρήσεις διαθέσιμη στις αιτήματος)

μυκητιασικές ταυτοποίηση

Σύνολο γονιδιακό DNA εκχυλίζεται από φρέσκα καλλιέργειες μυκήτων σύμφωνα με Arnold & amp.? Lutzoni [11]. Οι πυρηνικές ριβοσωμικό εσωτερικά διαχωριστικά μεταγράφεται και 5.8S γονίδιο (ITSrDNA) και ένα προσκείμενο τμήμα του πυρηνικού ριβοσωμικής μεγάλη υπομονάδα (LSUrDNA) ενισχύθηκαν ως ένα ενιαίο τεμάχιο με τη χρήση εκκινητών ITS1F ή ITS5 και LR3 εξής Hoffman

et al.

[18]. PCR προϊόντα έγιναν ορατά χρησιμοποιώντας SYBR πράσινο μετά από ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης 1% και υποβλήθηκε στο Πανεπιστήμιο της Αριζόνα Genetics πυρήνα για καθαρισμό, κανονικοποίηση, και διπλής κατεύθυνσης προσδιορισμού αλληλουχίας Sanger. Ακολουθίες συναρμολογήθηκαν αυτόματα και βάσεις ονομάζονται χρησιμοποιώντας το

Phred

και

phrap

[19], [20] με ενορχήστρωση από Mesquite [21], ακολουθούμενη από την χειροκίνητη επεξεργασία στο Sequencher 4.5 (GeneCodes Corp.) . Οι αλληλουχίες συγκρίθηκαν έναντι της NCBI μη-πλεονάζουσα βάση δεδομένων χρησιμοποιώντας BLASTN [22] για την εκτίμηση ταξινομική τοποθέτηση και υποβλήθηκαν σε GenBank υπό Accession Nos. KF746076-KF746159 (Πίνακας S1).

Επειδή αναγνώρισης βασίζεται μόνο σε BLAST αγώνες πρέπει να αντιμετωπίζονται με προσοχή (π.χ. [23]) που χρησιμοποιείται για φυλογενετικές αναλύσεις για να παρέχει ισχυρότερη συμπέρασμα όσον αφορά την ταξινομική ασφάλισης. Τα δεδομένα αλληλουχίας για 84 μυκητιακές απομονώσεις φορτώθηκαν όπως μία ομάδα σε Mesquite [21] και να ευθυγραμμίζονται με MUSCLE [24]. Η προκύπτουσα ευθυγράμμιση, τα οποία εντοπίστηκαν συστάδες εύκολα σε ευθυγράμμιση αλληλουχιών, ήταν ακατάλληλη για ένα μόνο φυλογενετική ανάλυση, λόγω της επικράτησης των διφορούμενη και unalignable περιοχές. Ακολουθίες που ευθυγραμμίζονται με συνέπεια το ένα στο άλλο κατανεμήθηκαν σε ομάδες φαινομενικά συγγενικά στελέχη. Προκύπτουσες ομάδες στη συνέχεια αναλύθηκαν ως ξεχωριστά σύνολα δεδομένων ως ακολούθως: Όλες οι αλληλουχίες σε κάθε ομάδα συγκρίθηκαν με τη βάση δεδομένων NCBI χρησιμοποιώντας BLASTN. Τα κορυφαία 50 χτυπήματα για κάθε ακολουθία είχαν κατεβάσει και διηθείται για την απομάκρυνση (1) περιττές ακολουθίες, και (2) σειρές από δυνητικά mis-προσδιορίζονται στελέχη και unvouchered δείγματα (βλέπε [23]). Τουλάχιστον μία σειρά από αξιόπιστη συλλογή καλλιέργειας που περιλαμβάνονται σε κάθε σύνολο δεδομένων, και ένα ή δύο outgroups επιλέχθηκαν από είδη στενά συνδεδεμένη με το όνομά ακολουθίες στο σύνολο δεδομένων (που επιλέγεται από βιβλιογραφική ανασκόπηση).

Κάθε προκύπτουσα σύνολο δεδομένων ευθυγραμμίστηκε ξεχωριστά στους μυς. Ακολουθίες σε κάθε ευθυγράμμιση ήταν στολισμένα με συνεπή σημεία έναρξης και λήξης, καθώς και η ποιότητα της ευθυγράμμισης επαληθεύθηκε με οπτικό έλεγχο σε Mesquite. Όλες οι ευθυγραμμίσεις υποβλήθηκαν TreeBASE (https://purl.org/phylo/treebase/phylows/study/TB2:S14945). Μοντέλα της εξέλιξης είχαν συναχθεί χρησιμοποιώντας jModeltest [25], [26]. Φυλογενετικά δέντρα είχαν συναχθεί από τη μέγιστη πιθανότητα στην GARLI [27], με την υποστήριξη καθορίζονται από 100 bootstrap επαναλήψεων εφαρμοστεί στη δικτυακή πύλη Cipres [28], και με τη χρήση Bayesian μέθοδοι στην MrBayes (πρόσβαση μέσω Cipres [28]). Για το τελευταίο, αναλύσεις αποτελούνταν από 5 εκατομμύρια γενιές, με τέσσερις αλυσίδες, τυχαία δέντρα εκκίνησης, και τη δειγματοληψία σε κάθε χιλιοστό δέντρο. Πληρότητα αξιολογήθηκε με βάση ασύμπτωτες των τιμών li -ln και την αξιολόγηση των τυπικών αποκλίσεων της διαίρεσης συχνοτήτων. Οπίσθιο πιθανοτήτων παρέχονται συμπερασματικά ανεξάρτητες αξίες για να υποστηρίξει τις τοπολογικές σχέσεις και συναφείς αξίες υποστήριξη από τις αναλύσεις μέγιστης πιθανοφάνειας. Τα αποτελέσματα της κάθε φυλογενετική ανάλυση συγκρίθηκαν με την υπάρχουσα βιβλιογραφία για κάθε ταξινομική ομάδα για να εξασφαλίσει ότι οι σχέσεις των γνωστών taxa ήταν σκόπιμο, παρέχοντας έτσι την εμπιστοσύνη όσον αφορά την τοποθέτηση μας μυκήτων νωθρότητα των μαλλιών.

Προετοιμασία της μυκητιασικής εκχυλίσματα

ένα ενιαίο βύσμα άγαρ από κάθε στέλεχος που επιλέγεται για περαιτέρω ανάλυση μεταφέρθηκε υπό στείρες συνθήκες σε ένα φρέσκο ​​πιάτο 2% ΜΕΑ και επωάζονται επί του πάγκου σε θερμοκρασία δωματίου μέχρι περίπου το 50% της πλάκας καλύφθηκε με μυκηλιακή ανάπτυξη. Δεκαπέντε βύσματα άγαρ (κάθε 5 mm σε διάμετρο) κόπηκαν με ένα αποστειρωμένο φελλοτρυπητήρα κάτω από στείρες συνθήκες και μεταφέρθηκαν σε φιάλες που περιέχουν 37 ml 2% ζωμού εκχυλίσματος βύνης (MEB). Οι φιάλες επωάστηκαν σε ένα τροχιακό αναδευτήρα (28 ° C, 125 rpm) για 2 εβδομάδες.

Υγρές καλλιέργειες αναμίχθηκαν με ίσο όγκο οξικού αιθυλεστέρα και αναμείχθηκε για 2 λεπτά στις 9000 στροφές ανά λεπτό με ένα Polytron (Lauda- Brinkmann, Delran, NJ, USA). Μυκητιακή βιομάζα απομακρύνθηκε με διήθηση κενού μέσω διηθητικού χάρτου Whatman (# 1) και το διήθημα εκχυλίζεται δύο φορές με έναν όγκο οξικού αιθυλεστέρα 1:01. Η υδατική στιβάδα απορρίφθηκε και η οργανική στιβάδα ξηράνθηκε και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C.

Οι βιολογικές δοκιμασίες

Ακατέργαστα οργανικά εκχυλίσματα μυκητικών καλλιέργειες χρησιμοποιήθηκαν σε βιολογικές δοκιμασίες έναντι εστιακό στελεχών των παραγόντων συνάφειας του της ελονοσίας (

Plasmodium falciparum

) και η νόσος του Chagas (

Trypanosoma cruzi

), καθώς και κατά του καρκίνου του μαστού κυτταρική σειρά MCF-7, όπως περιγράφεται από Higginbotham

et al

. [29]. Βιοδραστικότητα των εκχυλισμάτων, τα οποία αραιώθηκαν σε DMSO (10 μg /ml), μετρήθηκε ως επί τοις εκατό αναστολή της ανάπτυξης (% IG) σε σύγκριση με τον αρνητικό μάρτυρα (DMSO χωρίς εκχύλισμα? 0% IG).

BioMAP αναλύει

ένα αντιβιοτικό οθόνη προφίλ δραστηριότητας, BioMAP (Anti

βιο

tic

m

ωδή του

μια

ΔΡΑΣΗ

σ

rofile? [30]), χρησιμοποιήθηκε για τη δοκιμή δραστικότητας 50 ακατέργαστα οργανικά εκχυλίσματα έναντι 15 ανθρώπινα παθογόνα βακτήρια. Εκχυλίσματα με ισχυρή βιοδραστικότητα αραιώθηκαν σειριακά (16 2-φορές αραιώσεις) και εκ νέου διαλογή έναντι του ίδιου πίνακα των βακτηρίων. Καμπύλες ανάπτυξης παρίστανται γραφικώς με την καταγραφή OD

600 τιμές ανά ώρα για 24 ώρες και ελάχιστες ανασταλτικές συγκεντρώσεις (MIC) στη συνέχεια υπολογίζεται για κάθε εκχύλισμα. Για τη δημιουργία ανεξάρτητη από τη συγκέντρωση προφίλ βιοδραστικότητας για κάθε εκχύλισμα, πρώτες τιμές MIC κανονικοποιήθηκαν με αποτέλεσμα σε ένα εύρος τιμών από 0 (αδρανής) έως 1 (τα περισσότερα βιοδραστικά). Αυτά τα προφίλ δραστηριότητα στη συνέχεια συγκρίθηκαν με τα προφίλ γνωστών αντιβιοτικών που ανήκουν σε όλες τις κύριες δομικές κατηγορίες. Αυτή η μέθοδος είναι αποτελεσματική στην πρόβλεψη της διαρθρωτικής κατηγορία άγνωστο αντιβιοτικών ενώσεων από πολύπλοκα ή ακατέργαστα μίγματα [30].

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Ένα σύνολο 84 απομονώσεις μυκήτων εξετάστηκε από το χοντρό εξωτερικό για τα μαλλιά εννέα ζουν άτομα του Τριδάκτυλος Βραδύπους (

Bradypus variegatus

) που συναντώνται κατά μήκος του αγωγού Road στο Εθνικό Πάρκο Soberanía, Δημοκρατία του Παναμά. δείγματα τρίχας μεταφέρθηκαν στο εργαστήριο σε αποστειρωμένους σωλήνες Falcon που είχε το μισό γεμίσει με πυριτική πηκτή, ένα αποξηραντικό που είναι αποτελεσματική για την αποθήκευση μυκητιασική ιστό [31], [32]. Κάθε κομμάτι της τρίχας νωθρότητα τοποθετήθηκαν σε άγαρ απέδωσε πολλαπλές μυκητιακές απομονώσεις που αντιπροσωπεύουν μια ποικιλία morphotypes. Η φυλογενετική ανάλυση των αξενική στελεχών αποκάλυψε μια διαφορετική ομάδα από μύκητες, μερικά από τα οποία φαίνεται ότι είναι νέα σε σχέση με προηγουμένως παρατηρηθεί ή αλληλουχία taxa (Πίνακας 1? Εικόνα 1). Πολλά από αυτά τα προϊόντα απομόνωσης εμφανίζουν βιοδραστικότητα

in vitro

κατά των παρασίτων που προκαλούν ελονοσία και ασθένεια Chagas, κύτταρα καρκίνου του μαστού, και οι δύο Gram-θετικών και Gram-αρνητικών ανθρώπινα παθογόνα βακτήρια (Πίνακας 2? Πίνακας 3).

Τοπολογία του κάθε δέντρου αντανακλά την ανάλυση ML, και τιμές πάνω από τα υποκαταστήματα υποδεικνύουν τιμές bootstrap ML και Bayesian οπίσθιο πιθανοτήτων (& gt? 0.50 και & gt? 0,75, αντίστοιχα). Outgroups και δειγματοληψία ταξινομική βαθμίδα για κάθε δέντρο που επικυρώθηκαν από έρευνες της βιβλιογραφίας (βλέπε μεθόδους). Οι ταξινομικές συμπεράσματα παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Σχήμα 1 (Α): Τοποθέτηση της F5073 στην ομάδα 17? (Β) F4847 στην ομάδα 18? (Γ) F4831a στην ομάδα 19? (D) F4819 στην ομάδα 20? (Ε) F4801 της ομάδας 5? (F) F4806 στην ομάδα 7? (G) F4886 στην ομάδα 8? (H) F5071 στην ομάδα 15? (Ι) F4812-F4816, F4830, F4831, F4845, F4852, F4856, F4860, F4873, F4882, F4883 και F4900-F4902 στην ομάδα 1? (J) F4803, F4817, F4820, F4823, F4824, F4826, F4827, F4829, F4837, F4841, F4842, F4846, F4848, F4857, F4858, F4861, F4862, F4870, F4872, F4875, F4878, F4879, F4894-F4896 , F4908, F4909, F5069 και F5074 στην ομάδα 2? (Κ) F4818 και F4839 στην ομάδα 10? (L) F4877, F4890 και F4897 στην ομάδα 11? (Μ) F4828 και F4898 στην ομάδα 12? (Ν) F4876 και F4881 στην ομάδα 13? (O) F4863 και F4884 στην ομάδα 6? (P) F4821, F4874, F4889 και F4913 στην ομάδα 3? (Q) F4802, F4807, F4825, F4844, F4906 και F5068 στην ομάδα 4? (R) F4850 και F4891 στην ομάδα 9? (S) F4904 και F4905 στην ομάδα 14? και (Τ) F5070 και F5072 στην ομάδα 16.

Η

Η

Η φυλογενετική ανάλυση

Το 84 μυκητιακές απομονώσεις που αντιπροσώπευαν το 28 επιχειρησιακές ταξινομικές μονάδες (Otus) με βάση επί ομοιότητα αλληλουχίας 95% (Πίνακας 1). Οι δύο πιο άφθονες Otus αντιπροσωπεύεται 34 (40,5%) των προϊόντων απομόνωσης. Τα υπόλοιπα 50 απομονώσεις εκπροσωπήθηκαν από 26 διαφορετικές Otus.

συγκρίσεις BLAST με GenBank παρέχονται προκαταρκτικές εκτιμήσεις της ταξινομικής τοποθέτησης και ομοιότητα με προηγουμένως αλληλουχία μύκητες (Πίνακας 1). Όλα τα στελέχη ήταν Ascomycota. Δεκατέσσερις στελεχών είχαν ένα κορυφαίο αγώνα για να αμόρφωτος fugal κλώνους και 23 είχαν ένα κορυφαίο αγώνα για να καλλιεργηθούν, αλλά αγνώστων μύκητες. Τα υπόλοιπα 47 στελεχών είχαν αγώνες με το όνομα στελέχη που δειλά πρότεινε την τοποθέτηση στην Sordariomycetes (Xylariales, Glomerellales, Hypocreales), Dothideomycetes (Botryosphaeriales και Pleosporales), και Eurotiomycetes (Eurotiales). Για να προσδιοριστεί με μεγαλύτερη αυτοπεποίθηση ταξινομική τοποθέτηση, ακολουθίες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέγιστη πιθανότητα και Bayesian μέθοδοι

Οι ακολουθίες που ευθυγραμμίζονται και μεταξύ τους κατανεμήθηκαν σε ομάδες για να δημιουργήσουν 20 ομάδες προφανώς παρόμοια είδη (Πίνακας 1? Σχήμα 1).. Μία ομάδα περιείχε 29 αλληλουχίες από μύκητες νωθρότητα-μαλλιά, μια ομάδα περιείχε 20 αλληλουχίες, και τα υπόλοιπα 18 ομάδες που περιέχονται μεταξύ 1 και 6 σειρές καθεμία. Μεταξύ 34 και 165 σειρές από άλλα συγγενικά είδη, έχουν συγκεντρωθεί για κάθε ομάδα να μη απολύονται σύνολα δεδομένων στα οποία ένα ή δύο κατάλληλες outgroups προστέθηκαν με βάση την ανασκόπηση της βιβλιογραφίας.

Μετά φυλογενετικές αναλύσεις, ταυτότητες υψηλό επίπεδο (τάξη, προκειμένου, οικογένεια) θα μπορούσε να αποδοθεί με βεβαιότητα σε 82 μύκητες που εκπροσωπούν 15 οικογένειες και 10 παραγγελίες (Πίνακας 1? Σχήμα 1). Η πλειοψηφία (81,7%) από αυτά ήταν Sordariomycetes. Μύκητες από αυτή την κατηγορία είναι καλά τεκμηριωμένες πηγές βιοδραστικών μεταβολιτών (π.χ., [33], [34]). Οι υπόλοιπες απομονώσεις ήταν Dothideomycetes (15,9%) και Eurotiomycetes (2,4%)

Ογδόντα απομονώσεις θα μπορούσε με βεβαιότητα να ανατεθεί σε 15 γένη (Πίνακας 1? Εικόνα 1).. Δύο απομονώσεις δόθηκαν πιο δειλά φυλογενετική τοποθετήσεις. F4886 (Σχήμα 1 (G)) αναγνωρίστηκε ως

Robillarda

sp. ή ως μέλος μιας στενά συνδεδεμένη γένος εντός του Amphisphaeriaceae. Απομονώστε F4831a (Σχήμα 1 (Γ)) αναγνωρίστηκε ως μέλος της

Paraconiothyrium

sp. ή ένα στενά συνδεδεμένη γένος εντός του Montagnulaceae. Τα δύο πιο κοινά γένη,

Pestalotiopsis

sp. και

Hypocrea

sp., απομονώθηκαν από 7 από 9 και 5 δείγματα τριχών 9 οκνηρία, αντίστοιχα.

Απομονώστε F4891 (Σχήμα 1 (R)) δεν φαίνεται να σχετίζεται στενά με οποιαδήποτε ονομάζεται ακολουθίες στην GenBank και θα μπορούσε να χαρακτηριστεί μόνο ως πιθανώς ένα μέλος της τάξης Pleosporales (Dothideomycetes). Απομονώστε F4850 (Σχήμα 1 (R)) είχαν 96% ομοιότητα αλληλουχίας με πλησιέστερο αγώνα της στην GenBank, μια αμόρφωτος μύκητα του εδάφους κλώνος (Πίνακας 1? [35]). Περαιτέρω αναλύσεις δικαιολογείται, προκειμένου να επιβεβαιώσει εάν απομονώνει F4891 και F4850 είναι νέα είδη μυκήτων. Σε γενικές γραμμές, ταυτοποιήσεις ανατεθεί από φυλογενετικές αναλύσεις στενά αντιστοιχισμένο εκείνες του top BLAST χτυπά για κάθε προϊόν απομόνωσης (Πίνακας 1).

Η βιολογική δράση των μαλλιών νωθρότητα απομονώνει

νωθρότητα μύκητες μαλλιά που καλλιεργούνται σε υγρό μέσο και εκχυλίζεται με οξικό αιθυλεστέρα ελέγχθηκαν για βιοδραστικότητα. Θεωρήσαμε εκχυλίσματα να είναι άκρως βιοδραστικά αν προκαλείται τουλάχιστον 50% αναστολή της ανάπτυξης (δηλαδή, ≥50% IG) παρασίτων ή καρκινικών κυττάρων

in vitro

.

Γενικά, δύο από 70 (2,5%) εκχυλίσματα δοκιμάστηκαν ήταν πολύ δραστική έναντι

P. falciparum

, οκτώ από 62 (12,9%) εκχυλίσματα που εξετάστηκαν ήταν ιδιαίτερα δραστική έναντι

T. cruzi

, και 15 του 73 (20,6%) εκχυλίσματα ελέγχθηκαν ήταν εξαιρετικά δραστικό εναντίον του MCF-7 κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού (Πίνακας 2). Τα περισσότερα εκχυλίσματα με βιοδραστικότητα ήταν ενεργά σε μία μόνο δοκιμασία (Πίνακας 2). Βιοδραστικών στελέχη απομονώθηκαν με την ίδια συχνότητα για ΜΕΑ και PDA (Πίνακας 2). Αξιοσημείωτα, που συνδέονται στενά με απομονώσεις συχνά διέφεραν σε βιοδραστικότητας: για παράδειγμα, τρεις από 20 απομονώσεις που προσδιορίζονται ως

Hypocrea

sp. (Πίνακας 1) είχαν βιοδραστικότητα μόνο έναντι MCF-7 κύτταρα καρκίνου του μαστού? τρία ήταν δραστικά έναντι MCF-7 κύτταρα καρκίνου του μαστού και

T. cruzi

(Πίνακας 2)? και ένα ήταν ενεργή μόνο κατά του ανθεκτικού στη μεθικιλλίνη

S. aureus

(Πίνακας 3).

Από τους 16 μύκητες που είχαν υψηλή% IG σε ένα τουλάχιστον

in vitro δοκιμασία

, 13 ανήκαν στην Hypocreales (Hypocreaceae, Bionectriaceae και Nectriaceae) . Οι υπόλοιπες τρεις μύκητες ανήκαν στο Valsaceae (Diaporthales), Amphisphaeriaceae (Xylariales) και Trichocomaceae (Eurotiales). Κατά της ελονοσίας και οι δραστηριότητες κατά του καρκίνου έχουν προηγουμένως αναφερθεί στην βιβλιογραφία από αυτά τα σχετικά καλά μελετημένο από μύκητες καταγωγές (π.χ., [36], [37], [38], [39], [40], [41], [42], [43]). Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας αντιπροσωπεύουν, για το καλύτερο της γνώσης μας, οι πρώτες αναφορές αντιτρυπανοσωμιακοί δραστηριότητα στο

Cytospora

(Valsaceae) και

Bionectria

(Bionectriaceae).

Η αριθμό στελεχών υψηλής βιοενεργών ενάντια

T. cruzi

(Πίνακας 2) παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον καθώς τόσο σπάνια συναντάμε μικρόβια με βιοδραστικότητα σε αυτή τη δοκιμασία: μόνο 104 από 2698 ενδόφυτα από μύκητες (3,9%) από τη συνολική συλλογή του πολιτισμού μας είναι εξαιρετικά βιοενεργά κατά του εν λόγω παρασίτου [29]. Επί του παρόντος, οι μόνες διαθέσιμες θεραπείες για την ασθένεια αυτή είναι νιτροφουρανίου και βενζιδαζόλη, τα οποία συνδέονται με τέτοιες τοξικές παρενέργειες ότι η θεραπεία είναι συχνά εγκαταλείπονται [44].

50 μυκητιασική εκχυλίσματα εξετάζονται με BioMAP, 20 ήταν βιοενεργά κατά τουλάχιστον ένα οργανισμό δοκιμής (Πίνακας 3). Η πλειοψηφία των στελεχών (16 από 20) δραστικό έναντι βακτηρίων στη δοκιμασία BioMAP ανήκε στην οικογένεια Lasiosphaeriaceae (Sordariales), Glomerellaceae (Glomerellales), Valsaceae (Diaporthales), Botryosphaeriaceae (Botryosphaeriales), και Amphisphaeriaceae (Xylariales). Οι υπόλοιπες τέσσερις μύκητες ανήκαν στο Nectriaceae, Bionectriaceae και Hypocreaceae (Hypocreales). Δραστικότητα έναντι Gram-θετικών βακτηριδίων ανιχνεύθηκε πολύ συχνότερα από ό, τι κατά Gram-αρνητικά βακτήρια (Πίνακας 3)

Πέντε απομονώσεις (

Colletotrichum sp

F4806 (Σχήμα 1 (F))?..

Cytospora

sp 1, στέλεχος F4818 (Σχήμα 1 (Κ))?.

Fusarium sp

1, στέλεχος F4898 (Σχήμα 1 (Μ))?.

Lasiodiplodia

sp. 1, στέλεχος F4807 (Σχήμα 1 (Q))? και

Lasiodiplodia

sp 1, στέλεχος F4844 (Σχήμα 1 (Q)) είχαν ιδιαιτέρως ισχυρή δραστικότητα στη δοκιμασία BioMAP και επιλέχθηκαν για περαιτέρω δοκιμή αραιώνεται εν σειρά.. εκχυλίσματα επανελέγχονται για δράση κατά του πίνακα των 15 βακτηρίων και προφίλ βιοδραστικότητας κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας κανονικοποιημένες τιμές MIC (Πίνακας 4).

Η

το εκχύλισμα από το

Lasiodiplodia

sp. 1 ( στέλεχος F4807) παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον δεδομένου ότι είχε ισχυρή και ειδική δραστικότητα έναντι Gram-αρνητικών βακτηριδίων (Πίνακας 4). το προφίλ βιοδραστικότητας του προϊόντος απομόνωσης δεν ταιριάζει με εκείνη των οποιαδήποτε από τις γνωστές κατηγορίες αντιβιοτικών προηγουμένως δοκιμάζονται στη δοκιμασία BioMAP, γεγονός που υποδηλώνει μια δυνητικά νέο τρόπο δράσης (βλέπε [30]). Λοιμώξεις που προκαλούνται από τις αναδυόμενες πολυανθεκτική (MDR) Gram-αρνητικά βακτήρια γίνονται μια σημαντική κλινική ανησυχία σε όλο τον κόσμο [45]. Οι λοιμώξεις αυτές περιλαμβάνουν συνήθως MDR

Pseudomonas aeruginosa

, ευρέος φάσματος β-λακταμάση που παράγουν Enterobacteriaceae, και MDR

Acinetobacter baumannii

[46]. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι οι λοιμώξεις εντοπιστεί σε

Staphylococcus aureus

αίματος απομόνωσης είναι σε παρακμή, αλλά ότι οι λοιμώξεις από

Escherichia coli

, οι πιο κοινές Gram-αρνητικά είδη υπεύθυνο για λοιμώξεις σε απομονώνει ανθρώπινο αίμα, είναι αυξάνονται σε συχνότητα [47]. Η εν λόγω έκθεση [47] υπογραμμίζει επίσης την ανεπάρκεια των αντιβακτηριακών παραγόντων υπό ανάπτυξη για Gram-αρνητικά βακτήρια, με τα περισσότερα προσπάθεια που επικεντρώθηκε σε Gram-θετικά MRSA. Η αυξανόμενη επικράτηση της MDR οργανισμών οφείλεται κυρίως στην κατάχρηση των αντιβιοτικών ευρέος φάσματος και η κακή διαχείριση αντιβιοτικών [48]. Εξ ου και η ιδιαιτερότητα του εκχυλίσματος από το στέλεχος F4807 για Gram-αρνητικά στελέχη είναι εξαιρετικά πολύτιμη και αξίζει να επιδιωχθεί για περαιτέρω ανάλυση.

Μύκητες απομονώθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν ταξινομικά συνεπής με τις ομάδες των μυκήτων είναι γνωστό ότι εμφανίζονται στο έδαφος και στα φυτά ως παθογόνα, saprotrophs, ή ενδόφυτα [11], [49]. Βραδύποδες μπορεί να αντιμετωπίσουν, όπως μύκητες παρεμπιπτόντως από spora αέρα, είτε μέσω άμεσης επαφής όταν κατεβαίνουν από τα δέντρα για να αφοδεύσει και να ουρήσει, οπότε θα σκάψει μια τρύπα στο χώμα που στη συνέχεια καλύψτε το με απορρίματα φύλλων [50]. Εντυπωσιακά, η σύγκριση με μια μεγάλη συλλογή από ενδόφυτα από χερσαία φυτά στον Παναμά ([29]? 1269 στελέχη) αποκάλυψε ότι οι ακολουθίες από 29 απομονώσεις από νωθρότητα μαλλιά ήταν ταυτόσημα με στελέχη που λαμβάνονται από φυτά (100% ομοιότητα επί της πλήρους μήκους αλληλουχίας). Έτσι, η μελέτη αυτή επεκτείνει την γνωστή γκάμα υποδοχής και οικολογική λειτουργία του υποτιθέμενου ενδόφυτα. Μερικοί από αυτούς τους μύκητες μπορούν θυγατρικών άμεσα με την πράσινη άλγη που κατοικεί τρίχες του βραδύποδες, σαν endolichenic μύκητες συνεργάτης με πράσινα φύκια σε λειχήνες thalli και συχνά ταξινομικά παρόμοια με ενδόφυτα στα ίδια περιβάλλοντα [51], [52].

οι πιθανοί ρόλοι αυτών των μυκήτων στην υγεία του sloths δεν έχουν διερευνηθεί. Araújo Xavier

et al

. [50] ανέφεραν μυκητιάσεων σε

Β. variegatus

που προκαλείται από το παθογόνο μύκητα

Microsporum

(που επίσης προκαλεί δερματίτιδα σε ανθρώπους? [53]), αλλά αυτό το γένος δεν έχει εισπραχθεί στην παρούσα μελέτη ή σε προηγούμενες εργασίες από Suutari

κ.ά.

. [16]. Σε αντίθεση με την ανθρώπινη microbiome, όπου οι μύκητες αποτελούνται από & lt? 0,01% της μικροβιακής communites στις εξωτερικές επιφάνειες όπως το δέρμα [54], Suutari

κ.ά.

. [16] ανέφερε ότι οι μύκητες αντιπροσώπευαν το 8% της χλωρίδας στις έρευνες των μικροβίων νωθρότητα μαλλιά. Η μεγάλη αφθονία και την ποικιλία των μυκήτων που σχετίζονται με τα μαλλιά οκνηρία, σε συνδυασμό με βιοδραστικότητα τους, μπορούν να μιλήσουν σε μια βιολογική σημασία να βραδύποδες που είναι ακόμη ανεξερεύνητη.

Η πιεστική ανάγκη για νέα φάρμακα εξακολουθεί να αποτελεί μία από τις μεγαλύτερες προκλήσεις της ανθρωπότητας . Είναι κοινώς αποδεκτό ότι η συντριπτική πλειοψηφία των βιοδραστικών μικρόβια παραμένουν να ανακαλυφθούν [9] και πρόσφατα ανακαλύφθηκε μικροβιακή taxa κατέχουν ένα σημαντικό υπόσχεση της νέας χημείας. Άφθονα στοιχεία δείχνουν σε νέα περιβάλλοντα, όπως πολλά υποσχόμενη πηγές ακόμη undescribed μικροοργανισμών [55]. Εδώ έχουμε δείξει ότι τα μαλλιά του Τριδάκτυλος Βραδύπους (

Bradypus variegatus

) στον Παναμά είναι μια πλούσια πηγή των διαφόρων βιοδραστικών μύκητες. Στελέχη που απομονώθηκαν εδώ περιλαμβάνονται τα μέλη κάποιων καλά μελετηθεί καταγωγές (π.χ., Hypocreales? Pleosporales), αλλά και τα μέλη της μελετημένο ή δυνητικά νέες ομάδες (π.χ.,

Endomelanconiopsis

sp F4801?.

Robillarda

sp . F4886? Ascomycota sp F4891?.. Ascomycota sp F4850). Αναμένουμε ότι η πρόσθετη νέα taxa θα μπορούσε να βρεθεί για τα μαλλιά νωθρότητα με την επέκταση των μεθόδων έρευνας σε διάφορους τύπους μέσων και τη χρήση μεθόδων υψηλής απόδοσης για την αξιολόγηση της κοινότητας σύνθεση. Μπορούμε επίσης να αναμένουμε ότι διαφορετικά είδη μπορούν να απομονωθούν από βραδύποδες σε άλλες περιοχές, όσο και τις κοινότητες της ενδόφυτα σε τροπικά φυτά διαφέρουν σημαντικά σε περιφερειακή κλίμακα [56], [57]. Έτσι, το έργο μας δείχνει ότι καρποφόρα εξερεύνηση της μικροχλωρίδας νωθρότητα είναι εγγύηση για πιθανές εφαρμογές στην ανακάλυψη φαρμάκων.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1. αριθμούς ταυτότητας μύκητα μαλλιά και την ένταξη Genbank

νωθρότητα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0084549.s001

(DOCX)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Bryson Voirin για συλλογή δειγμάτων νωθρότητα των μαλλιών. Σας ευχαριστούμε Phyllis Δ Coley, Thomas A. Kursar, Meg Crofoot και Santosh Jagadeeshan για τα χρήσιμα σχόλια και άλλη βοήθεια, και Malkanthi Gunatilaka και Jakob αίνιγμα για ανάλυση ακολουθίας. Ευχαριστούμε την κυβέρνηση του Παναμά και, ιδίως, το προσωπικό του Παναμά Autoridad Nacional del Ambiente (ANAM), για τη διευκόλυνση αυτής της έρευνας. Ευχαριστούμε το Smithsonian Tropical Research Institute (STRI) για την υποστήριξη όλων των υλικοτεχνικές πτυχές αυτής της εργασίας και των πολλών φοιτητών και των βοηθών που συνέβαλαν σε αυτό το σώμα της έρευνας.