Αφηρημένο

Στόχος

Η genistein είναι ένας ισοφλαβονών σόγιας που έχει αντικαρκινική δράση in vitro και in vivo. Έχει αποδειχθεί ότι η γενιστεΐνη αναστέλλει πολλά είδος των καρκίνων συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη (PCA) ρυθμίζοντας διάφορες οδούς κυτταρικής σηματοδότησης και microRNAs (miRNAs). Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι οι μεγάλες μη-κωδικοποίησης RNAs (lncRNAs) συμμετέχουν επίσης σε πολλές κυτταρικές διεργασίες. Προς το παρόν δεν υπάρχουν αναφορές σχετικά με τη σχέση μεταξύ gensitein, miRNAs και lncRNAs. Σε αυτή τη μελέτη, εστιάσαμε στην miRNAs, lncRNA που ρυθμίζονται από genistein και διερευνήθηκαν λειτουργικό ρόλο τους στη ΣΕΣΣ.

Μέθοδος

μικροσυστοιχιών (SurePrint G3 Ανθρωπίνων GE 8 × 60K) χρησιμοποιήθηκε για την έκφραση χαρακτηριστικών των genistein θεραπεία και τον έλεγχο των κυττάρων του προστάτη (PC3 και DU145). Λειτουργική δοκιμασία (κυτταρικό πολλαπλασιασμό, μετανάστευση, εισβολή, απόπτωση και κυτταρικό κύκλο δοκιμασίες) πραγματοποιήθηκαν με τη ΣΕΣΣ κυτταρικές σειρές, PC3 και DU145. Τόσο in vitro και in vivo (γυμνό ποντίκι) μοντέλα χρησιμοποιήθηκαν για δοκιμασίες ανάπτυξης. Λουσιφεράσης δοκιμασίες ρεπόρτερ χρησιμοποιήθηκαν για δέσμευση του miR-34a να Hotair.

Αποτελέσματα

LncRNA προφίλ έδειξε ότι Hotair ήταν ιδιαίτερα ρυθμίζεται από γενιστεΐνη και η έκφρασή της ήταν υψηλότερη σε ευνουχισμό ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές προστάτη από σε φυσιολογικά κύτταρα του προστάτη. Νοκ ντάουν (siRNA) της Hotair μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του προστάτη, τη μετανάστευση και την εισβολή και την επαγόμενη απόπτωση και διακοπή του κυτταρικού κύκλου. miR-34a ήταν επίσης επάνω-ρυθμίζονται από genistein και μπορούν να στοχεύουν άμεσα θερμού αέρα στα δύο κύτταρα PC3 και DU145 του προστάτη.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η genistein ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων του προστάτη μέσω ρύθμισης προς τα κάτω της ογκογόνο θερμού αέρα που είναι επίσης στοχευμένες από ογκοκατασταλτικό miR-34a. Τα ευρήματα αυτά ενισχύουν την κατανόηση του πώς ρυθμίζει genistein lncRNA Hotair και miR-34a σε προστάτη

Παράθεση:. Chiyomaru Τ, Yamamura S, Fukuhara S, Yoshino Η Kinoshita Τ, Majid S, et al. (2013) Γενιστεΐνη Αναστέλλει τον καρκίνο του προστάτη κυτταρική ανάπτυξη κατά Στόχευση miR-34a και Ογκογόνες θερμού αέρα. PLoS ONE 8 (8): e70372. doi: 10.1371 /journal.pone.0070372

Επιμέλεια: Arun Ρίσι, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο Wayne, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23 Απριλίου, 2013? Αποδεκτές: 17 του Ιουνίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 1 Αυγούστου του 2013

Copyright: © 2013 Chiyomaru et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Κέντρο Έρευνας Πόρων των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας, μέσω επιχορήγησης Αριθμός R01CA160079, R01CA138642, T32DK007790 και VA κριτική Αξιών και VA Έργου του Προγράμματος. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η genistein είναι ένα διατροφικό ισοφλαβονών σόγιας. Η δομή του είναι παρόμοια με εκείνη του ανθρώπινου 17-β-οιστραδιόλη που προκαλούν οιστρογονική ή /και αντι-οιστρογονική δράση [1]. Η genistein είναι επίσης ένας αναστολέας της πρωτεϊνικής κινάσης της τυροσίνης [2], και έχει αντικαρκινική δράση in vitro και in vivo. Έχει αποδειχθεί ότι η γενιστεΐνη αναστέλλει πολλά είδος των καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη (PCA) [3], [4] μέσω της ρύθμισης των αρκετών κυτταρικών μονοπατιών σηματοδότησης όπως η Wnt, Akt και μονοπάτια JAK /STAT [5] – [8].

Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι οι μη-κωδικοποίησης RNAs (ncRNAs) εμπλέκονται σε πολλές κυτταρικές διεργασίες. microRNAs (miRNAs), την κατηγορία των μικρών ncRNAs περίπου 22 νουκλεοτίδια σε μήκος, λειτουργούν ως αρνητικοί ρυθμιστές των mRNA στόχου μεταγραφικά και μετα-μεταγραφικά [9]. Είναι γνωστό ότι miRNAs ρυθμίζουν έως και δύο τρίτα του ανθρώπινου γονιδιώματος [10] και παίζουν σημαντικό ρόλο σε πολυάριθμες βιολογικές διαδικασίες όπως η ανάπτυξη, η διαφοροποίηση, τον πολλαπλασιασμό, αγγειογένεση, ο μεταβολισμός και πλειοδυναμία [11], [12]. Έχει αναφερθεί ότι η genistein αυξημένη έκφραση ογκοκατασταλτικών miR-146a, προκαλώντας την αναστολή του EGFR και NF-kB μονοπάτι [13], [14]. miR-27a έχει αναφερθεί να είναι ένα ογκογόνο miRNA ρυθμίζονται από genistein και ρυθμίζει τη σηματοδότηση του VEGF με τη στόχευση ZBTB10 [15], [16]. προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι η genistein θεραπεία σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται την έκφραση των ογκογόνων miR-151, το οποίο στοχεύει άμεσα SOX17 και ARHGDIA [17]. SOX17 αναφέρθηκε ότι είναι ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο που αναστέλλει σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης με στόχευση τόσο β-κατενίνης και παράγοντας Τ-κυττάρων (TCF) /λεμφοειδή παράγοντας ενισχυτή (LEF) πρωτεΐνες [18] – [20]. ARHGDIA ρυθμίζει αρνητικά την οικογένεια Rho των GTPases (Rho, Rac και Cdc42) [21] που εμπλέκονται στη σηματοδότηση Wnt μονοπατιού [22]. Βρήκαμε επίσης ότι η genistein ρυθμίζει προς τα κάτω την RAC1 και EP300 γονίδια που είναι σημαντικοί ρυθμιστές του VEGF-μεσολάβηση αγγειογένεσης [23], [24] και το γονίδιο EGFR από up-ρύθμιση miR-574-3p [25].

NcRNAs χωρίζονται σε δύο κύριες κατηγορίες με βάση το μέγεθος μεταγραφής? μικρές ncRNAs και καιρό ncRNAs (lncRNAs). lncRNAs είναι σε γενικές γραμμές ορίζεται ως RNA γονίδια μεγαλύτερα από 200 νουκλεοτίδια που δεν έχουν δυνατότητες κωδικοποίησης της πρωτεΐνης. Μεγάλης κλίμακας αλληλουχίας των βιβλιοθηκών cDNA και αλληλουχίας επόμενη γενιά δείχνουν ότι lncRNAs στα θηλαστικά αριθμό σε δεκάδες χιλιάδες. Μέχρι στιγμής, μόνο 126 ανθρώπινα lncRNAs έχουν λειτουργικά σχολιασμένο lncRNA βάση δεδομένων [26]. Έτσι, δεν υπάρχουν αναφορές για τη σχέση μεταξύ gensitein και lncRNAs.

Η HOX μεταγραφή αντιπληροφοριακό RNA (Hotair) γονίδιο βρίσκεται εντός της συστάδας γονιδίων ομοιοκυτίου C (HOXC) στο χρωμόσωμα 12 και κωδικοποιεί s 2.2 kb lncRNA μόριο. Αυτό το γονίδιο αδιάκοπης από το χρωμόσωμα 12 στο χρωμόσωμα 2 με ένα συστατικό του Polycomb Κατασταλτικά Complex 2 (PRC2) και καταστέλλει τη μεταγραφή των γονιδίων ομοιοακολουθίας D (HOXD) [27]. Hotair αλληλεπιδρά τόσο με PRC2 και λυσίνη συγκεκριμένες διμεθυλάση 1 συμπλέγματα (LSD1) και τα ζευγάρια της ιστόνης H3 λυσίνη 27 μεθυλίωση και λυσίνη 4 απομεθυλίωση για την επιγενετική αποσιώπηση όχι μόνο HOXD γονίδια, αλλά και πολλά άλλα γονίδια [28]. Αυτό το γονίδιο εκφράζεται εντόνως σε αρκετές καρκίνους όπως του μαστού, του παχέος εντέρου, του ήπατος, του παγκρέατος και του καρκίνου του λάρυγγα [29] – [33]. Υψηλή έκφραση του θερμού αέρα στον καρκίνο του μαστού είναι ένας προγνωστικός δείκτης της μετάστασης και κακή έκβαση [29]. Hotair είναι επίσης πιστεύεται ότι είναι ένας πιθανός βιολογικός δείκτης για την ύπαρξη της μετάστασης λεμφαδένα σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [34]. Hotair είναι ένας αρνητικός προγνωστικός παράγοντας και δρα ως ένα ογκογονίδιο σε καρκίνο του παγκρέατος, τόσο in vitro όσο και in vivo [32]. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, εστιάσαμε στην lncRNA θερμού αέρα που ρυθμίζεται από genistein και διερευνήθηκαν λειτουργικό ρόλο της στον προστάτη.

Αποτελέσματα

Επίδραση της Γενιστεΐνη Θεραπεία για τη διάδοση, απόπτωση και του κυτταρικού κύκλου σε προστάτη κύτταρα

Για να επαληθεύσετε τα χαρακτηριστικά κατασταλτική του όγκου της genistein, πραγματοποιήσαμε ανάλυση λειτουργίας. Η δοκιμασία MTS έδειξε ότι το πολλαπλασιασμό των κυττάρων μειώθηκε κατά genistein θεραπείας και στις δύο κύτταρα PC3 και DU145 (Εικ. 1Α). δοκιμασία απόπτωσης έδειξαν ότι η genistein επάγεται σημαντικά την απόπτωση των DU145 κυττάρων (Εικ. 1Β). Ωστόσο, καμία σημαντική επίδραση της απόπτωσης παρατηρήθηκε στα κύτταρα PC3. δοκιμασία κυτταρικού κύκλου έδειξαν ότι η θεραπεία με γενιστεΐνη προκαλείται G2 /κυττάρων Μ φάση διακοπή κύκλου στις δύο PC3 και DU145 κύτταρα (Σχ. 1C).

(Α) Η γενιστεΐνη αναστέλλει σημαντικά την κυτταρική βιωσιμότητα. Η βιωσιμότητα των κυττάρων αναλύθηκε με την δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων MTS μετά από θεραπεία 4 ημέρες (25 μΜ). ** P & lt? 0,0001. *, P & lt? 0,01. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE. δοκιμασίας (Β) Η απόπτωση μέσω κυτταρομετρίας ροής. Αντιπροσωπευτικά στοιχεία τεταρτημόριο του ελέγχου και της genistein (25 μΜ) κατεργασμένων κυττάρων σε PC3 (αριστερά) και DU145 (δεξιά) κύτταρα. P & lt? 0,05. (C) Οι τυπικές μορφές ανάλυσης κυτταρικού κύκλου ελέγχου, ή γενιστεΐνη (25 μΜ) κατεργάζονται κύτταρα φαίνονται. Το ραβδόγραμμα φαίνεται στα δεξιά του κάθε στοιχεία αντιπροσωπεύει το ποσοστό των κυττάρων σε G0 /G1, S, ή G2 /M φάση όπως υποδεικνύεται. * P & lt? 0,05

Η

Αναγνώριση των γονιδίων στόχων και των μοριακών οδών που ρυθμίζεται από Γενιστεΐνη σε προστάτη

Για τον εντοπισμό γονιδίων και μονοπατιών στόχο genistein στα κύτταρα του προστάτη, πραγματοποιήσαμε γονιδιακής έκφρασης με τη χρήση. genistein και του οχήματος (έλεγχος) αντιμετωπίζονται PC3 και DU145 κύτταρα. Η έκφραση των γονιδίων 918 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω στις δύο κυτταρικές σειρές προστάτη (μέσος λόγος log2 & lt? -0,5, Πίνακας S1). Αυτά τα γονίδια είχαν ανατεθεί Κιότο Εγκυκλοπαίδεια γονιδίων και γονιδιωμάτων (KEGG) σχολιασμών χρησιμοποιώντας ανάλυση ενικό εμπλουτισμό της GeneCodis. Εμπλουτίζεται σημαντικά μονοπάτια στην KEGG προσδιορίστηκαν όπως «Μονοπάτια του καρκίνου», «κυτταρικού κύκλου», «ο κανονισμός της ακτίνης του κυτταροσκελετού» και «JAK-STAT σηματοδοτικό μονοπάτι» (P & lt? 0.05, Πίνακας S2). Είμαστε επικεντρώθηκε στην KEGG «Pathway στον καρκίνο και τα γονίδια σε αυτό το μονοπάτι επισημαίνονται στο χάρτη της KEGG (Εικ. S1).

Για τον προσδιορισμό της γονιδιακής έκφρασης σε προστάτη κλινικά δείγματα, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις έκφρασης για όλες τις υποψήφιες στοχεύσετε γονίδια που εμπλέκονται στα «Μονοπάτια του καρκίνου», χρησιμοποιώντας δεδομένα έκφρασης μικροσυστοιχιών, οι οποίες εγκρίθηκαν από το Gene Expression Omnibus (GEO). Τα επίπεδα έκφρασης αυτών των γονιδίων εξετάστηκαν σε 47 PCa και 47 φυσιολογικά δείγματα, όπως φαίνεται στο διάγραμμα χάρτη θερμότητας στο Σχ. S2. Τα γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω σε PCa εμφανίζονται με κόκκινο χρώμα, κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια δείχνονται στα μπλε, ενώ λευκές ράβδοι υποδεικνύουν γονίδια που εκφράζονται σε παρόμοια επίπεδα και στις δύο. Από την ανάλυση αυτή, εντοπίστηκαν αρκετά σημαντικά στόχους γονίδιο, συμπεριλαμβανομένων των αποακετυλασών των ιστονών 1 (HDAC1), αναστολέας της πρωτεΐνης των ενεργοποιημένων STAT, 3 (PIAS3), tropomyosin 3 (TPM3), παράγοντα μεταγραφής 7-σαν 2 (Τ-κυττάρων ειδικών, HMG- box) (TCF7L2), υποδοχέα αρυλ-υδρογονανθράκων πυρηνικό μεταθέτη 2 (ARNT2), τη δέσμευση CREB πρωτεΐνης (CREBBP), διασταύρωση πλακοσφαιρίνης (JUP), και v-ΑΚΤ ποντικού thymoma ογκογονίδιο ιού ομόλογο 2 (ΑΚΤ2).

ταυτοποίηση των lncRNAs Εποπτεύεται από γενιστεΐνη σε προστάτη

Η SurePrint G3 Ανθρωπίνων GE 8 × 60K πλατφόρμα μικροσυστοιχιών περιλαμβάνει επίσης ανιχνευτές για lincRNAs. Για τον εντοπισμό των lncRNAs ρυθμίζεται από genistein στα κύτταρα του προστάτη, πραγματοποιήσαμε γονίδιο προφίλ έκφρασης. Πέντε lncRNAs ήταν κάτω-ρυθμίζονται στις δύο κυτταρικές σειρές προστάτη (μέσος δείκτης log2 & lt? -1.0, Πίνακας 1) με lncRNA θερμού αέρα που δείχνει τη μεγαλύτερη επίδραση. Για τον προσδιορισμό των σχετικών επιπέδων έκφρασης των Hotair σε κύτταρα προστάτη, πραγματοποιήσαμε ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας μη επεξεργασμένων κυτταρικών σειρών προστάτη και τα συνέκριναν με κανονικό προστάτη επιθηλιακά κύτταρα (RWPE-1). Παρατηρήσαμε ότι η έκφραση Hotair ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε ευνουχισμό ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές προστάτη (PC3 και DU145) σε σύγκριση με RWPE-1 κύτταρα (PC3 3,35 φορές, DU145 6,47 φορές) (Εικ. 2Α). Για την επιβεβαίωση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών, εκτελέσαμε TaqMan ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση και παρατηρήθηκε ότι η έκφραση Hotair ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται με θεραπεία γενιστεΐνη (Εικ. 2Β). Έτσι επικεντρώθηκε στην Hotair επειδή πολλοί ερευνητές έχουν αναφέρει ότι Hotair έχει ογκογόνο λειτουργία σε αρκετούς άλλους καρκίνους (μαστού, του ήπατος, του παγκρέατος, του παχέος εντέρου και του λάρυγγα καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων) [29] – [33].

( Α) Έκφραση Hotair σε κυτταρικές γραμμές PCa (LNCaP, PC3 και DU145) και φυσιολογικό προστάτη επιθηλιακά κύτταρα (RWPE-1). PCR πραγματικού χρόνου έδειξαν ότι τα επίπεδα έκφρασης του θερμού αέρα ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε ευνουχισμό ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές προστάτη (PC3 και DU145). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE. *, P & lt? 0,05. επίπεδα (Β) Έκφραση Hotair μετά τη θεραπεία με γενιστεΐνη (25 μΜ). έκφραση Hotair μειώθηκε κατά 30-40% σε κύτταρα κατεργασμένα genistein σε σύγκριση με τους μάρτυρες. έκφραση Hotair ομαλοποιήθηκε σε GAPDH. *, P & lt? 0,05. (Γ) έκφραση του miR-34a σε κυτταρικές σειρές προστάτη (PC3 και DU145) και φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα προστάτη (RWPE-1). PCR πραγματικού χρόνου έδειξαν ότι τα επίπεδα έκφρασης του miR-34a είχαν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε ευνουχισμό ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές προστάτη (PC3 και DU145). έκφραση του miR-34a ομαλοποιήθηκε σε RNU48. (D) Τα επίπεδα έκφρασης του miR-34a μετά από θεραπεία με γενιστεΐνη (25 μΜ) σε DU145 κυττάρων. P & lt?. 0.05

Η

Κανονισμός του θερμού αέρα έκφραση σε προστάτη κυτταρικές γραμμές με miR-34a

Πρόσφατα, αναφέρθηκε ότι κάποιοι miRNAs ρυθμίζουν την έκφραση των lncRNAs [35] – [37]. Για να κάνετε αναζήτηση για πιθανά miRNAs που ρυθμίζουν Hotair, χρησιμοποιήσαμε τον αλγόριθμο miRcode. Σε αρκετές υποψήφιες miRNAs στοχεύουν Hotair, εστιάσαμε στην miR-34a από το εργαστήριο μας έχει αναφερθεί προηγουμένως λειτουργεί ως ογκοκατασταλτικό και ρυθμίζεται προς τα κάτω σε προστάτη ιστούς [38]. Για τον προσδιορισμό των σχετικών επιπέδων έκφρασης του miR-34a σε κύτταρα προστάτη, πραγματοποιήσαμε ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας κυτταρικές σειρές προστάτη (PC3 και DU145) και συγκρίθηκαν με τους κανονικό προστάτη επιθηλιακά κύτταρα (RWPE-1). Παρατηρήσαμε ότι η έκφραση miR-34a ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω σε ευνουχισμό ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές προστάτη (PC3 και DU145) σε σύγκριση με RWPE-1 κύτταρα (PC3 0,22 φορές, DU145 0,14 φορές) (Σχ. 2C). Για να αναζητήσετε την επίδραση της γενιστεΐνης στην έκφραση του miR-34a, πραγματοποιήσαμε TaqMan ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση και παρατηρήθηκε ότι η έκφραση του miR-34a ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα με genistein θεραπεία σε κύτταρα DU145 (1,36 φορές) (Εικ. 2D) .

για να επιβεβαιώσει τη δέσμευση του miR-34a σε Hotair, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις λουσιφεράσης δημοσιογράφος. Hotair έχει ένα προβλεπόμενο θέση δέσμευσης για miR-34a (Σχ. 3Α), η οποία θα κλωνοποιηθεί σε έναν φορέα λουσιφεράσης δοκιμασίας ανταποκριτή. δοκιμασίες λουσιφεράσης έδειξαν ότι miR-34a μείωσε τις σχετικές δραστικότητες λουσιφεράσης του φορέα άγριου τύπου (σχ. 3Β). Μετάλλαξη των υποθετικών θέσεων πρόσδεσης miR-34a μείωσε επίσης την απάντηση για miR-34a δείχνει ότι miR-34a συνδέεται άμεσα με Hotair. Ποσοτική ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR έδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης του θερμού αέρα σε PC3 και DU145 κατεστάλησαν στα επιμολυσμένα miR-34a σε σύγκριση με τους ελέγχους (Σχ. 3C).

(Α) Υποθετικές δεσμευτικός miR-34a και μεταλλαγμένες θέσεις στην θερμού αέρα. δοκιμασίες (Β) λουσιφεράσης ανταποκριτή χρησιμοποιώντας φορείς που κωδικοποιούν υποθετικές θέσεις πρόσδεσης. PC3 και DU145 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με πρόδρομο Pre-miR miRNA ή αρνητικό μάρτυρα, που ακολουθείται από παροδική επιμόλυνση με βασικό φορέα ή πλασμίδια ανταποκριτές άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο πλασμιδίων για 24 ώρες. δραστικότητα Reporter μετρήθηκε με λουσιφεράσης δοκιμασία και ομαλοποιήθηκε ως προς τη δραστικότητα της λουσιφεράσης της Renilla. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE. *, P & lt? 0,05. (Γ) Το επίπεδο έκφρασης του Hotair προσδιορίστηκε με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR αναλύσεις μετά από επιμόλυνση με μιμείται miR-34a και αρνητικού μάρτυρα σε κυτταρικές σειρές προστάτη (PC3 και DU145). έκφραση Hotair ομαλοποιήθηκε σε GAPDH. *, P & lt?. 0.05

Η

In vitro και in vivo Επίδραση του θερμού αέρα σε προστάτη του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, στη μετανάστευση και εισβολή

Για να εξετάσει το λειτουργικό ρόλο του θερμού αέρα, πραγματοποιήσαμε ζημιογόνων των λειτουργιών μελέτες που χρησιμοποιούν si-RNA νοκ ντάουν με PC3 και DU145 κύτταρα. Αρχικά περιορίζεται ότι η έκφραση του Hotair αξιοσημείωτα καταστέλλεται σε si-RNA μορφομετατροπείς σύγκριση με τους ελέγχους (Σχ. 4Α). Κυττάρων πολλαπλασιασμό (Εικ. 4Β) και δοκιμασία επούλωσης τραύματος (Εικ. 4C) έδειξε σημαντική αναστολή σε σι-Hotair επιμολύνσεις στα δύο κύτταρα PC3 και DU145 σε σύγκριση με τα προϊόντα επιμόλυνσης ελέγχου. δοκιμασία εισβολής (Matrigel) έδειξε επίσης ότι ο αριθμός των εισβάλλοντας κυττάρων μειώθηκε σημαντικά σε si-Hotair επιμολύνσεις σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Εικ. 4D). Για να επιβεβαιώσετε το αποτέλεσμα του θερμού αέρα για ογκογονικότητας in vivo, Hotair siRNA και si-ελέγχου-επιμολυσμένα κύτταρα DU145 υποδόρια ένεση σε γυμνά ποντίκια. Παρατηρήσαμε ότι οι knock-down της έκφρασης Hotair ανέστειλε το σχηματισμό καρκινικών κυττάρων DU145 in vivo (Εικ. 4Ε). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι Hotair παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του PCa κύτταρο.

(α) Επίπεδα Hotair έκφρασης σε κυτταρικές γραμμές προστάτη (PC3 και DU145) καθορίστηκαν με PCR πραγματικού χρόνου στις 96 ώρες μετά την παροδική επιμόλυνση των siRNA . Η γονιδιακή έκφραση κανονικοποιήθηκε προς GAPDH. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE. ** P & lt? 0,0001. *, P & lt? 0,0005. (Β) εξόντωση Hotair αναστέλλει σημαντικά την κυτταρική βιωσιμότητα. Η βιωσιμότητα των κυττάρων αναλύθηκε με την δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων MTS 96 ώρες μετά την παροδική επιμόλυνση. (Γ) εξόντωση Hotair αναστέλλει σημαντικά τη μετανάστευση των κυττάρων. Μετά την επιμόλυνση (48 ώρες), ένα τραύμα σχηματίστηκε με απόξεση και μετρώνται μετά 24 ώρες. Αντιπροσωπευτικά εικόνες των πληγών δοκιμασία επούλωσης παρουσιάζεται στο 200 × μεγέθυνση. ** P & lt? 0,0001. (D) εξόντωση Hotair μειώθηκαν σημαντικά την κυτταρική διείσδυση. Αντιπροσωπευτικά εικόνες της ανάλυσης εισβολής εμφανίζεται στο 200 × μεγέθυνση. ** P & lt? 0,0001. (Ε) Αντιπροσωπευτικές εικόνες των όγκων σε γυμνά ποντίκια 5 εβδομάδες μετά την υποδόρια ένεση των επιμολυσμένων κυτταρικών γραμμών Hotair siRNA DU145 ή κυτταρικές γραμμές ελέγχου και χρονική πορεία της ανάπτυξης του όγκου.

Η

Hotair Επιρροές κυτταρική απόπτωση και του κυτταρικού κύκλου σε προστάτη κύτταρα

δοκιμασία

Η απόπτωση αποδειχθεί ότι knock-down της Hotair σημαντικά την απόπτωση που επάγεται στα δύο κύτταρα PC3 και DU145 (Εικ. 5Α). δοκιμασία κυτταρικού κύκλου έδειξαν ότι knock-down του θερμού αέρα που προκαλείται G2 /M φάση διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα PC3 (Εικ. 5Β), ενώ τα κύτταρα DU145 επιμολυσμένα είχαν σημαντική αύξηση στην φάση S του κυτταρικού κύκλου.

( Α) δοκιμασία απόπτωσης μέσω κυτταρομετρίας ροής. Αντιπροσωπευτικά στοιχεία τεταρτημόριο του ελέγχου και si-Hotair αντιμετωπίζονται κύτταρα PC3 (άνω) και DU145 (κάτω) κύτταρα. ** P & lt? 0.005. *, P & lt? 0,05. (Β) Τα τυπικά στοιχεία της ανάλυσης του κυτταρικού κύκλου ελέγχου, ή si-Hotair επεξεργασμένα κύτταρα εμφανίζονται. Το γράφημα ράβδων που φαίνεται στα δεξιά του κάθε αριθμός αντιπροσωπεύει το ποσοστό των κυττάρων σε G0 /G1, S, G2 ή /Μ φάση όπως υποδεικνύεται. ** P & lt? 0.001. *, Ρ & lt?. 0.005

Η

Συζήτηση

γονιδίων που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη να περιλαμβάνει μόνο ένα μικρό μέρος του γονιδιώματος, και το υπόλοιπο αποτελείται από ncRNAs, ιντρόνια και /ή άλλες ακολουθίες στην οποία καμία λειτουργία έχει ακόμη ανατεθεί [39]. NcRNAs (miRNAs και lncRNAs) έχουν δειχθεί ότι παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση των κυτταρικών διαδικασιών όπως η ανάπτυξη των κυττάρων και την απόπτωση σε φυσιολογικά και κακοήθη κύτταρα. Οι ρόλοι των miRNAs σε καρκίνους έχουν εκτεταμένα διερευνηθεί και πρόσφατα, έχουν πολλές lncRNAs έχουν συσχετιστεί με την ανάπτυξη και την εξέλιξη του καρκίνου. Η έκφραση του lncRNAs αλλάζει συχνά κατά τη διάρκεια κακοήθους μετασχηματισμού και ncRNAs αναδύονται ως βασικά μόρια σε ανθρώπινο καρκίνο, με τη δυνατότητα να χρησιμεύσει ως μία νέα δεικτών και θεραπευτικών στόχων. Ωστόσο, μέχρι σήμερα ο ρόλος του λίγες μόνο lncRNAs έχουν χαρακτηριστεί σε ΣΕΣΣ. αλληλούχιση υψηλής απόδοσης έδειξε ότι καρκίνο του προστάτη που σχετίζεται με ncRNA μεταγραφής 1 (pCAT-1) είναι ένα ειδικό για τον προστάτη ρυθμιστής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε PCa και ένας στόχος της PRC2 [40]. γονίδιο του καρκίνου του δείκτη έκφρασης του προστάτη 1 (PCGEM1) πολυμορφισμοί μπορεί να συμβάλει στην προστάτη του κινδύνου [41]. Έκφραση των PlncRNA-1 είναι σημαντικά υψηλότερη σε προστάτη και αυτό lncRNA ρυθμίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση μέσω της στόχευσης υποδοχέα ανδρογόνων [42]. Σε αυτή τη μελέτη, εστιάσαμε στην lncRNAs ρυθμίζεται από genistein στα κύτταρα του προστάτη και προσδιορίζονται Hotair στο προφίλ έκφρασης αυτών των lincRNAs.

Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε υψηλή έκφραση του θερμού αέρα στον ευνουχισμό ανθεκτικές κυτταρικές σειρές του προστάτη. λειτουργικές δοκιμασίες μας έδειξαν ότι knockdown του Hotair μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων του προστάτη in vitro και in vivo και απόπτωση. Ως εκ τούτου Hotair μπορεί να παίζει ένα λειτουργικό ρόλο στην κυτταρική ανάπτυξη του όγκου σε PCa. Αύξηση στοιχεία δείχνουν ότι Hotair ρυθμίζει βασικές οδούς στην εισβολή καρκίνου και μετάσταση. Hotair αυξημένη διεισδυτικότητα του καρκίνου του μαστού και τη μετάσταση με επαγωγή θετικοί ρυθμιστές της μετάστασης του καρκίνου (ABL2 σαλιγκαριού, LAMB3 και LAMC2) με τρόπο που εξαρτώνται από την PRC2 [29]. Υψηλή έκφραση θερμού αέρα αποτελεί κίνδυνο για υποτροπή μετά την ηπατεκτομή σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα και μπορεί να ρυθμίζει τις MMP9 και VEGF γονίδια [34]. λειτουργικές δοκιμασίες μας έδειξαν ότι η εξουδετέρωση του θερμού αέρα μειώθηκε μετανάστευσης προστάτη των κυττάρων και εισβολή. δεδομένων σειρά mRNA μας και βιοπληροφορική ανάλυση έδειξε επίσης ότι genistein στοχεύει MMP9 και VEGF γονίδια που είναι συστατικά του KEGG «Pathway στον καρκίνο». Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι Hotair μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της PCa.

Ως ρυθμιστές γονιδίου, miRNAs δεσμεύονται στον 3’UTR του mRNA και μπορεί ατομικά στόχευση ενός αριθμού γονιδίων που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη. Ωστόσο, απομένει να καθοριστεί αν miRNAs μπορούν επίσης να στοχεύουν lncRNAs. Πρόσφατα, μερικές μελέτες έχουν περιγράψει τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ miRNAs και lncRNAs. miR-29 ρυθμίζει έμμεσα έκφραση ογκοκατασταλτικών lncRNA, μητέρα εξέφρασε 3 (MEG3) ενεργώντας για μεθυλίωση του σε ηπατοκυτταρικό καρκίνο [35]. miR-671 κατευθύνει τη διάσπαση ενός αντινοηματικού μεταγραφήματος του παρεγκεφαλιδική εκφύλιση που σχετίζονται με πρωτεΐνη 1, 34 kDa (CDR1), που οδηγεί σε μια συνακόλουθη μείωση στην CDR1 [37]. Στην παρούσα μελέτη, κοιτάξαμε να δούμε αν η έκφραση του miR-34a επιπτώσεις lncRNA. δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης μας και σε πραγματικό χρόνο τα αποτελέσματα της PCR έδειξε ότι miR-34a συνδέεται με την ακολουθία Hotair mRNA και ρυθμίζει προς τα κάτω την έκφραση θερμού αέρα σε κυτταρικές σειρές του προστάτη. Ως εκ τούτου, αυτή η μελέτη είναι η πρώτη που αποδεικνύει ότι miR-34a στοχεύει άμεσα Hotair τόσο PC3 και τα κύτταρα DU145 του προστάτη.

Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η γενιστεΐνη αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων του προστάτη μέσω της κάτω ρύθμιση των ογκογόνων θερμού αέρα που είναι στόχο ογκοκατασταλτικό miR-34a. Αυτά τα ευρήματα ενισχύσουν την κατανόησή μας για το πώς genistein αλληλεπιδρά με lncRNA σε προστάτη και υποδεικνύει επιπλέον πιθανών στόχων για τη θεραπεία του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου προστάτη, LNCaP, PC3 και DU145 και μία μη-κακοήθη επιθηλιακά κυτταρική σειρά προστάτη, RWPE-1, αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Οι κυτταρικές γραμμές του προστάτη καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO2 και 95% αέρα στους 37 ° C. RWPE-1 κυτταρική γραμμή καλλιεργήθηκε σε μέσο ανάπτυξης κερατινοκυττάρων συμπληρωμένο με 5 ng /ml ανθρώπινου ανασυνδυασμένου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα και 0.05 mg /mL εκχύλισμα βόειας υπόφυσης (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). κύτταρα Υποσυρρέουσες (60% -70% συρροή) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με γενιστεΐνη (25 μmol /L? Sigma, St Louis, ΜΟ, USA) και κύτταρα σε αγωγή με φορέα (διμεθυλοσουλφοξείδιο) χρησίμευσαν ως μάρτυρες. μέσων κυττάρων και γενιστεΐνη αλλάχθηκαν κάθε μέρα και τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για 4 ημέρες.

RNA Extraction

Ολικό RNA εκχυλίσθηκε από κυτταρικές σειρές του προστάτη και μη κακοηθών επιθηλιακών κυττάρων του προστάτη σειρά χρησιμοποιώντας ένα miRNeasy μίνι κιτ (Qiagen, Valencia, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

microarray

για μικροσυστοιχιών, ολικό RNA εκχυλίστηκε από PC3 και DU145 κύτταρα επεξεργασμένα με γενιστεΐνη χρησιμοποιώντας ένα miRNeasy Mini Kit . SurePrint G3 Ανθρωπίνων GE 8 × 60K μικροσυστοιχιών (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε για τη σκιαγράφηση της έκφρασης των κυττάρων genistein επεξεργασία και έλεγχο. Τα τρέχοντα δεδομένα μικροσυστοιχιών εγκρίθηκαν από το GEO και αποδόθηκαν GEO αριθμό ένταξης GSE47657.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Εκχυλίσματα ολικού RNA μεταγράφεται αντίστροφα σε μονόκλωνο cDNA χρησιμοποιώντας ένα iScript cDNA Σύνθεση Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) και ένα TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Ποσοτική ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR διεξήχθη με ένα Applied Biosystems Prism7500 Fast Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας, χρησιμοποιώντας TaqMan καθολικής PCR μάστερ μιξ σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Applied Biosystems). Τα επίπεδα έκφρασης του RNA προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το 7500 γρήγορο σύστημα SDS έκδοση λογισμικού 1.3.1 (Applied Biosystems). παράμετροι της PCR για το ποδήλατο ήταν ως ακολούθως: 95 ° C για 20 δευτερόλεπτα, 40 κύκλοι PCR στους 95 ° C για 3 δευτερόλεπτα, και 60 ° C για 30 δευτερόλεπτα. Όλες οι αντιδράσεις έγιναν σε ένα 10-μι όγκος αντίδρασης εις τριπλούν. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη δέλτα-δέλτα μέθοδος Ct για τον υπολογισμό της πολλαπλής μεταβολής. ανιχνευτές TaqMan και εκκινητές για (ID δοκιμασία: Hs03296680_s1) Hotair, GAPDH (ID δοκιμασία: Hs02758991_g1), miR-34a (ID δοκιμασία: 000426), και RNU48 (Δοκιμασία ID: 001006) ελήφθησαν από την Applied Biosystems. GAPDH και RNU48 χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικοί έλεγχοι

Η επιμόλυνση

Hotair siRNA (SASI_Hs02_00380445 και SASI_Hs02_00380446, Sigma) και αρνητικού ελέγχου siRNA (D-001810 – 10?. Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα απώλειας λειτουργίας. Προ-miR πρόδρομος miRNA και αρνητικού ελέγχου (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα κέρδος-of-λειτουργίας. PC3 και DU145 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 αντιδραστηρίου επιμόλυνσης (Invitrogen), σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή.

Κυττάρων πολλαπλασιασμός, μετανάστευση, και εισβολή Δοκιμασίες

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα CellTiter 96 υδατική Λύση Κυττάρου Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού (MTS) κιτ (Promega, Madison, WI, USA) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με μετρήσεις απορρόφησης στα 490 nm χρησιμοποιώντας SpectraMAX 190 (Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, USA). δραστικότητα μετανάστευσης των κυττάρων αξιολογήθηκε με δοκιμασία επούλωση της πληγής. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία έξι φρεατίων, και οι κυτταρικές μονοστοιβάδες αποξέστηκαν χρησιμοποιώντας ένα άκρο μικροπιπέτας Ρ-20. Το πλάτος της αρχικής διάκενο (0 h) και το υπολειμματικό κενό 24 ώρες μετά τον τραυματισμό υπολογίστηκαν από μικροφωτογραφίες. δοκιμασία κυττάρων εισβολή διεξήχθη χρησιμοποιώντας τροποποιημένο Boyden τμημάτων που αποτελούνται από transwell-προεπικαλυμμένα Matrigel ένθετα φίλτρο μεμβράνης με πόρους οκτώ micron σε πλάκες ιστοκαλλιέργειας 24 φρεατίων (Βϋ Biosciences, Bedford, ΜΑ, USA). Ελάχιστο βασικό μέσο που περιέχει 10% FBS στον κατώτερο θάλαμο χρησίμευσε ως χημειοελκυστικό, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [43]. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

In vivo όγκου Ανάπτυξης

Όλα φροντίδα των ζώων έγινε σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές του Ιατρικού Κέντρου του Σαν Φρανσίσκο Υποθέσεων Βετεράνων και η μελέτη εγκρίθηκε από το Σαν Φρανσίσκο VA (αριθμός πρωτοκόλλου: 11-008-01) IACUC. χρήστες ζώων έχουν ολοκληρώσει προγράμματα κατάρτισης για να χειριστεί και να συνεργαστεί με τα ποντίκια μέσω AALAS (Αμερικανική Ένωση για Εργαστήριο Επιστήμης Ζωικής Παραγωγής) πριν από τα πειράματα σε ζώα. Για την υποδόρια μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού, κύτταρα DU145 (5 × 10

6) που διαμολύνθηκαν παροδικά με SI-Hotair ή SI-ελέγχου εναιωρήθηκαν σε 100 μι RPMI 1640 και υποδόρια ένεση σε αριστερή και δεξιά πίσω πλευρά πλευρές των γυναικείων γυμνά ποντίκια, αντίστοιχα. (Στέλεχος BALB /c ηυ /ηυ? Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, ΜΑ, USA, ηλικίας 5 εβδομάδων). Ένα σύνολο από 4 γυμνά ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν και η ανάπτυξη του όγκου εξετάστηκε κατά τη διάρκεια των 35 ημερών. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε με βάση το πλάτος (x) και μήκος (y):. x

2y /2, όπου x & lt? y

Η απόπτωση και κυτταρικού κύκλου Αναλύσεις

Fluorescence- ενεργοποιημένων κυττάρων διαλογής (FACS) ανάλυση για απόπτωση έγινε 96 ώρες μετά την επιμόλυνση, χρησιμοποιώντας ένα Κιτ Annexin V-FITC /7-AAD (Beckman Coulter, Brea, CA, USA), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου διεξήχθη 96 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με ψυχρό PBS και επαναιωρήθηκαν στο πυρηνική χρώση 49,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (Beckman Coulter). Βιτρώ κύτταρα αναλύθηκαν αμέσως με ένα κυτταρόμετρο ροής (Cell Lab Quanta SC? Beckman Coulter).

Αναγνώριση Γενιστεΐνη γονιδίων που ρυθμίζονται Target και βιοπληροφορική ανάλυση

Για να αναζητήσετε τα γονίδια που ρυθμίζονται από genistein, πραγματοποιήσαμε μικροσυστοιχιών. Για τον προσδιορισμό των βιολογικών διεργασιών ή πορείες δυνητικά ρυθμίζονται από genistein, πραγματοποιήσαμε GeneCodis ανάλυση [44], [45], χρησιμοποιώντας όλα τα υποψήφια γονίδια. Στη συνέχεια, για τον εντοπισμό των δικτύων μεταξύ genistein και τα γονίδια-στόχους τους, αναλύσαμε και χαρακτηρίζονται εκείνα τα γονίδια στο GO βιολογική διαδικασία και KEGG κατηγορίες μονοπάτι. Αυτά τα δεδομένα χρησιμοποιήθηκαν για την εξέταση genistein ρυθμιζόμενες μοριακό δίκτυα σε ανθρώπινα κύτταρα. Πραγματοποιήσαμε αναλύσεις της γονιδιακής έκφρασης όλων των υποψηφίων γονιδίων που εμπλέκονται σε καθεμιά από τις οδούς χρησιμοποιώντας δεδομένα έκφρασης μικροσυστοιχιών, οι οποίες εγκρίθηκαν από το GEO και αποδόθηκαν αριθμοί ένταξη GEO (GSE29079). Στην Affymetrix Human εξόνιο 1,0 ST Array (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) σειρές δεδομένων, εξετάσαμε 47 PCa ιστούς και 47 φυσιολογικούς ιστούς του προστάτη, τα οποία συλλέχθηκαν από ασθενείς που δεν είχαν εκτεθεί σε Νεο-επικουρική ακτινοθεραπεία, cytotoxic- ή ορμονική θεραπεία πριν την επέμβαση. Τα δεδομένα ήταν ομαλοποιημένη και αναλύονται με GeneSpring (Agilent Technologies). Οι στατιστικές αναλύσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το Mann Whitney U-test με cut-off Ρ & lt?. 0.05, και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως διάγραμμα χάρτη θερμότητας

Κατασκευή πλασμιδίου και Dual-λουσιφεράσης Δοκιμασίες Reporter

για να αναζητήσετε τους στόχους miRNA του θερμού αέρα, χρησιμοποιήσαμε τον αλγόριθμο miRcode (αφήστε 6.2, https://www.mircode.org/). MiRcode παρέχει ανθρώπινο προβλέψεις miRNA στόχου με βάση τη συνολική γονίδιο GENCODE σχολιασμό [46], συμπεριλαμβανομένης & gt? 10.000 μακρύ μη κωδικοποίησης γονιδίων RNA. Για τη δοκιμασία λουσιφεράσης, PmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target φορέα έκφρασης που χρησιμοποιείται (Promega). Οι αλληλουχίες ολιγονουκλεοτιδίου (άγριου τύπου) που χρησιμοποιούνται φαίνονται στον Πίνακα S3. Κατασκευάσαμε επίσης μεταλλαγμένο ολιγονουκλεοτίδια για κάθε ένα από τα ολιγονουκλεοτίδια φυσικού τύπου (Πίνακας S3). Σε ένα συνολικό όγκο 25 μΙ, 1 μΙ από έκαστο 100 μΜ εμπρόσθιο και ανάστροφο ολιγονουκλεοτίδιο, 2.5 μΐ 10 Χ ρυθμιστικού διαλύματος συγκολλήσεως (100 mM Tris-HCl, ρΗ 7.5, 1 Μ NaCl και 10 mM αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ) και 20.5 μΐ νερού ήταν επωάζονται στους 95 ° C για 3 λεπτά και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν στους 37 ° C για 15 λεπτά. Τα ολιγονουκλεοτίδια συνδέθηκαν εντός της θέσης PmeI-Xbal της Έκφρασης pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target φορέα. Για δοκιμασία λουσιφεράσης, τα κύτταρα του προστάτη ήταν συν-επιμολυσμένα με Pre-miR πρόδρομα miRNA και pmirGLO Dual-Luciferase miRNA στόχος φορέων έκφρασης χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen) και το αντιδραστήριο Χ-tremeGENE HP DNA επιμόλυνσης (Roche Διάγνωση, Βασιλεία, Ελβετία, ΗΠΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. δοκιμασία λουσιφεράσης ανταποκριτή διεξήχθη χρησιμοποιώντας το σύστημα δοκιμασίας Dual-Luciferase Reporter (Promega) 24 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Στατιστική Ανάλυση

Η σχέση μεταξύ δύο μεταβλητών και τις αριθμητικές τιμές που λαμβάνονται με πραγματικού χρόνου RT -PCR αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το μη παραμετρικό Mann-Whitney U. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ειδικών StatView (έκδοση 4, SAS Institute Inc.). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές ± τυπικό σφάλμα. Στη σύγκριση μεταξύ των τριών μεταβλητών, μια nonadjusted στατιστικό επίπεδο σημαντικότητας P & lt? 0,05 αντιστοιχεί σε Bonferroni προσαρμοσμένο επίπεδο της P & lt?. 0,0167

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1. Υποθετική genistein ρυθμίζονται τα γονίδια στο «Μονοπάτι στον καρκίνο». Η υποτιθέμενη genistein ρυθμιζόμενα γονίδια (επισημαίνονται με κόκκινο χρώμα), όπως ορίζεται από το Κιότο Εγκυκλοπαίδεια γονιδίων και γονιδιωμάτων (KEGG) μονοπάτι και καθορίζεται μέσω της ανάλυσης GENECODIS

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070372.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2. Το διάγραμμα χάρτη θερμότητας από τα «Μονοπάτια του καρκίνου». Ανάλυση εμφάνιση του καρκίνου του προστάτη ιστών (n = 47) και φυσιολογικά δείγματα προστάτη (n = 47). Κάθε τετράγωνο αντιπροσωπεύει το επίπεδο έκφρασης ενός δεδομένου γονιδίου σε ένα μεμονωμένο δείγμα. Το κόκκινο αντιπροσωπεύει αυξημένη έκφραση και το μπλε αντιπροσωπεύει μειωμένη έκφραση σε σχέση με την κανονικοποιημένη έκφραση του γονιδίου σε όλα τα δείγματα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070372.s002

(ΔΕΘ)

Πίνακα S1. Γονίδια ρυθμίζεται προς τα κάτω από genistein

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070372.s003

(XLS)

Πίνακας S2. Μονοπάτια ρυθμίζονται από τους στόχους της genistein (KEGG σχολιασμό)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070372.s004

(XLS)

Πίνακα S3. Primer αλληλουχίες ολιγονουκλεοτιδίων (αγρίου τύπου και μεταλλαγμένα)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070372.s005

(XLS)

Ευχαριστίες

Ευχαριστούμε τον Δρ Ρότζερ Erickson για την υποστήριξη και τη βοήθειά του με την προετοιμασία του χειρογράφου.