Αφηρημένο

Ιστορικό

Κατά τη διάρκεια ανδρογόνων την ανάπτυξη και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη »να γίνει ανεξάρτητη των κανονικών ρυθμιστικών μηχανισμών. Αυτά τα ανδρογόνα ανεξάρτητο κύτταρα αποκτούν την αξιοσημείωτη ικανότητα προσαρμογής στον περιβάλλοντα μικροπεριβάλλον του οποίου παράγοντες, όπως οι νευροδιαβιβαστές, επηρεάζουν την επιβίωσή τους. Παρά το γεγονός ότι τα ευρήματα γίνονται εμφανείς για την έκφραση της α

1Α-αδρενεργικών υποδοχέων στα επιθηλιακά κύτταρα του καρκίνου του προστάτη, η ακριβής λειτουργικός ρόλος τους στην ανδρογόνα-ανεξάρτητους κύτταρα δεν έχει ακόμη καθοριστεί. Προηγούμενη εργασία έχει δείξει ότι λιπιδίων της μεμβράνης σχεδίες που σχετίζονται με τις βασικές πρωτεΐνες σηματοδότησης μεσολαβούν ανάπτυξη και οδών σηματοδότησης επιβίωσης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

Μεθοδολογία Κύρια Ευρήματα /

Για να αναλυθεί η τοπολογία της μεμβράνης του α

1Α-αδρενοϋποδοχέα ερευνήσαμε την παρουσία της με μια βιοχημική προσέγγιση σε καθαρίστηκε απορρυπαντικό κλάσματα ανθεκτική μεμβράνη του καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή ανεξάρτητου από ανδρογόνο DU145. παρατηρήσεις ηλεκτρονικής μικροσκοπίας έδειξαν την colocalisation της α

1Α-αδρενοϋποδοχέα με caveolin-1, το κύριο συστατικό πρωτεΐνη του μικροσπηλαίων. Επιπλέον, δείξαμε ότι η διέγερση αγωνιστού της α

1Α-αδρενεργικών υποδοχέων που επάγεται αντίσταση σε θαψιγαργίνη επαγόμενη απόπτωση και ότι caveolin-1 ήταν απαραίτητη για τη διαδικασία αυτή. Περαιτέρω, immunohistofluorescence αποκάλυψε τη σχέση μεταξύ των υψηλών επιπέδων της α

1Α-αδρενεργικών υποδοχέων και caveolin-1 έκφρασης με προχωρημένο στάδιο καρκίνου του προστάτη. Δείχνουμε επίσης με ανοσοκηλίδωση ότι η TG-επαγόμενη αντίσταση απόπτωσης περιγράφονται στα κύτταρα DU145 διαμεσολαβείται από το εξωκυτταρικό κινάσες σήματος ρυθμίζεται (ΕΚΚ).

Συμπεράσματα /Σημασία

Εν κατακλείδι, προτείνουμε ότι α

1Α-αδρενεργικών υποδοχέων διέγερσης σε ανδρογόνα ανεξάρτητο καρκίνο του προστάτη κύτταρα

μέσω

μικροσπηλαίων αποτελεί έναν από τους μηχανισμούς που συμβάλλουν στην προστασία τους από την TG-επαγόμενη απόπτωση

Παράθεση:. Katsogiannou Μ, Boustany CE , Gackiere F, Delcourt P, Athias Α, Mariot P, et al. (2009) ΜΙΚΡΟΣΠΗΛΑΙΑ συμβάλλουν στην αντοχή απόπτωση που επάγεται από το α

1Α-αδρενοϋποδοχέα σε κύτταρα ανδρογόνων-Ανεξάρτητη καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 4 (9): e7068. doi: 10.1371 /journal.pone.0007068

Συντάκτης: Τσαντ Creighton, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 Ιουν του 2009? Αποδεκτές: 25, Αύγ, 2009? Δημοσιεύθηκε: 18 Σεπ 2009

Copyright: © 2009 Katsogiannou et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το γαλλικό Υπουργείο Έρευνας και το Πανεπιστήμιο της Lille 1, INSERM και την περιοχή Nord-Pas de Calais, καθώς και την Ligue Nationale Contre le Καρκίνο (Comité du Nord) και την Ένωση pour la Recherche sur le Καρκίνο (ARC) . Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη είναι ένας από τους πιο κοινές μορφές καρκίνου στους άνδρες και η δεύτερη αιτία θανάτου από καρκίνο στις βιομηχανικές χώρες [1]. Διάφοροι παράγοντες, όπως τα ανδρογόνα και οι αυξητικοί παράγοντες ρυθμίζουν επιθηλιακών πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την απόπτωση στην κανονική του καρκίνου του προστάτη και σε πρώιμα στάδια του προστάτη (PCA). Ανδρογόνων εκτομή είναι σήμερα ο μεγαλύτερος θεραπεία χρησιμοποιείται για να εμποδίσει την ανάπτυξη του εξαρτώμενων από ανδρογόνα καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των κυττάρων του προστάτη », συχνά γίνονται ανεξάρτητοι των ρυθμιστικών μηχανισμών που οδηγούν σε μια ασθένεια ορμονοάντοχου [2], για τα οποία δεν υπάρχει σήμερα επιτυχημένη θεραπεία. Ανδρογόνο-ανεξάρτητα κύτταρα του προστάτη έχουν την αξιοσημείωτη ικανότητα να προσαρμοστούν στη γύρω μικροπεριβάλλον του οποίου η επιρροή στην ενδοκυτταρικά μονοπάτια επιβίωσης παραμένει αντικείμενο συζήτησης [3]. Πράγματι, τα κύτταρα του προστάτη είναι σε επαφή με διάφορους παράγοντες, όπως οι ορμόνες, οι αυξητικοί παράγοντες και οι νευροδιαβιβαστές οι οποίοι πιστεύεται ότι επηρεάζουν τη φυσιολογία των κυττάρων αυτών. Μεταξύ άλλων, το ενδιαφέρον έχει αποδειχθεί για την ενδογενείς κατεχολαμίνες νορεπινεφρίνης και επινεφρίνης. Στην πραγματικότητα, η υποεπιθηλιακή στρώμα του προστάτη είναι ιδιαίτερα πλούσια σε αυτόνομα νεύρα και α

1-αδρενεργικών υποδοχέων (α

1-AR). Ο υπότυπος α

1Α-AR, ειδικότερα, βρίσκεται σε λεία μυϊκά κύτταρα, αλλά η έκφρασή του έχει επίσης περιγραφεί σε επιθηλιακά κύτταρα [4], [5]. Η α

1Α-AR είναι ένα μέλος της υπεροικογένειας των G-πρωτεΐνη υποδοχείς (GPCR) που μεσολαβούν τις δράσεις των προαναφερθέντων κατεχολαμινών σε μία ποικιλία κυττάρων [6].

α

1 -AR ανταγωνιστές χρησιμοποιούνται ήδη για την κλινική θεραπεία της καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη (ΚΥΠ) [7], όπου θεραπευτικό όφελος τους αποδίδεται σε άμεση δράση στους α

1-AR παρόντες στον προστάτη λεία μυϊκά κύτταρα [8]. Ωστόσο, αρκετές μελέτες έχουν προσκομίσει αποδεικτικά στοιχεία σχετικά με πρόσθετες επιπτώσεις της α

ανταγωνιστές 1-AR, όπως δοξαζοσίνη σε μακροχρόνια θεραπεία καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη. Αυτοί οι παράγοντες έχουν αποδειχθεί ότι αναστέλλουν την ανάπτυξη του προστάτη με την επαγωγή της απόπτωσης σε στρωματικά και επιθηλιακά κύτταρα και αναδύονται ως πιθανοί θεραπευτικές αγωγές για την πρόληψη και τη θεραπεία του μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα PCa [9], [10], [11]. Επιπλέον, προηγούμενες μελέτες από τους συναδέλφους για τα ανθρώπινα επιθηλιακά καρκίνου του προστάτη (HPCE) κύτταρα και το ανδρογόνο-εξαρτώμενη προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή LNCaP έδειξε ότι φαινυλεφρίνη (ΡΗΕ), ένα α

αγωνιστή 1Α-AR, διεγείρει τον πολλαπλασιασμό τους [12 ], [13]. Παρά αυτά τα ελπιδοφόρα ευρήματα, το λειτουργικό ρόλο των α

1Α-AR στα ανδρογόνα-ανεξάρτητους κύτταρα του προστάτη δεν έχει ακόμη καθοριστεί.

Έχει περιγραφεί ότι η σηματοδότηση και η διακίνηση πολλών GPCR ρυθμίζονται από εξειδικευμένους domains μεμβράνη πλάσματος γνωστό ως λιπιδικές σχεδίες [14]. Επιπλέον, πρόσφατα στοιχεία σχετικά με καρδιομυοκύτταρα έχουν δείξει ότι α

1-AR, καθώς και τα μόρια που εμπλέκονται στην οδό μεταγωγής σήματος του συσσωρευτεί σε μικροσπηλαίων, μια υποκατηγορία μικροεπικράτειες μεμβράνης [15], [16]. ΜΙΚΡΟΣΠΗΛΑΙΑ είναι 50-100 nm εγκολπώσεις μεμβράνη φιάλη σχήματος πλάσμα, η οποία χαρακτηρίζεται από τη μία πλευρά με υψηλή περιεκτικότητα σε χοληστερόλη και γλυκοσφιγγολιπίδια και αφ ‘ετέρου από την παρουσία του caveolin-1 (CAV-1), το κύριο συστατική πρωτεΐνη 20-25 kD [17]. Είναι ενδιαφέρον ότι, CAV-1 έχει συσχετισθεί με πολλές ασθένειες όπως η αθηροσκλήρωση και η νόσος του Alzheimer [18], [19]. Αναφορικά με το ρόλο του στον καρκίνο, έχει διαπιστωθεί ότι PCA είναι συνδέεται με αυξημένη έκφραση CAV-1 [20]. Στην πραγματικότητα, αυτή η πρωτεΐνη έχει ταυτοποιηθεί ως ένας δείκτης που σχετίζεται με προστάτη εξέλιξη και ορμόνες ανθεκτική νόσο, παίζοντας ένα καθοριστικός ρόλος στην ανδρογόνο ανεξαρτησία των κυττάρων προστάτη [21]. Με τη σύνδεσή του με ειδικούς υποδοχείς και ένζυμα επί της μεμβράνης πλάσματος, CAV-1 μπορεί να είναι μια άμεση μεσολαβητής της επιβίωσης, της ανάπτυξης και μετάστασης σήματα σε κύτταρα προστάτη [22].

Μέχρι σήμερα, δεν γνωρίζουμε πολλά για το μηχανισμοί που βρίσκονται πίσω εμπλοκή νευροδιαβιβαστές στην επιβίωση των κυττάρων προστάτη, ας-alone του ρόλου της α

1Α-AR σε επιθηλιακά κύτταρα μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα και της εξέλιξης του προστάτη. Σε αυτό το πλαίσιο, είναι δελεαστικό να συνδέσει την παρουσία της α

1Α-AR και CAV-1 και να υποθέσει ότι η α

1Α-AR θα μπορούσε να μεσολαβήσει

μέσω

μικροσπηλαίων λειτουργικές επιπτώσεις της στην ανάπτυξη ή την επιβίωση των προηγμένων κυττάρων σταδίου του προστάτη.

Ο στόχος του έργου μας ήταν, επομένως, να διερευνήσει το ρόλο της α

1Α-AR στα ανδρογόνα-ανεξάρτητους κύτταρα του προστάτη. Εδώ, θα διερευνηθεί η παρουσία των α

1Α-AR στο μικροσπηλαίων των κυττάρων DU145, ένα ανδρογόνο-ανεξάρτητο προστάτη κυτταρική γραμμή που προέρχεται από μετάσταση στον εγκέφαλο. Αναλύουμε την συνέπεια της α

1Α-AR διέγερση από ΡΗΕ στον υποδοχέα και τη διανομή μεμβράνη CAV-1, καθώς και η επίδρασή του στην λιπιδική σύνθεση των κλασμάτων σχεδία μεμβράνης καθαρίζεται από κύτταρα DU145. Επιπλέον, περιγράφουν την επίδραση του ΡΗΕ στην αντίσταση απόπτωση αυτών των κυττάρων μέσω της ενεργοποίησης της ERK και τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν έντονα τη συμμετοχή των μικροσπηλαίων σε αυτό το μονοπάτι σηματοδότησης. Τέλος, από immunohistofluorescence και RT-PCR, παρατηρούμε μια θετική συσχέτιση της α

1Α-AR και CAV-1 έκφρασης και προχωρημένο στάδιο του προστάτη. Η παρουσία των α

1Α-AR-πλούσια μικροσπηλαίων θα μπορούσε, επομένως, να συμβάλει στη γενικευμένη αντίσταση απόπτωση χαρακτηρίζει ανδρογόνα-ανεξάρτητους προστατικό ιστό.

Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Η ανδρογόνο ανεξάρτητος ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή DU145, που λαμβάνεται από την Συλλογή Καλλιεργειών Αμερικανικού τύπου, διατηρήθηκε σε καλλιέργεια σε μέσο RPMI 1640 (Life Technologies, Inc) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) FCS (Seromed, Poly-Labo, Στρασβούργο , Γαλλία), 5 mM L-γλουταμίνη και 2 mM καναμυκίνη (Sigma). Τα κύτταρα συνήθως αναπτύσσονται σε φιάλες των 50 ml (Nunc, PolyLabo, Στρασβούργο, Γαλλία) στους 37 ° C σε

2-95% ατμόσφαιρα αέρα υγροποιημένη 5% CO. Τα κύτταρα αυτά αποτελούν ένα κατάλληλο μοντέλο για τον εγκέφαλο μεταστατικών καρκινικών κυττάρων που υπάρχουν στο ορμονοάντοχου καρκίνο του προστάτη.

επιμολύνσεις κυττάρων και την παραγωγή των CAV-1 knock-down κυτταρική σειρά DU145

Δύο έτοιμα προς χρησιμοποιούν siRNAs έναντι α

1Α-AR (siADR1A, Eurogentec) διαμολύνθηκαν παροδικά (50 ηΜ) με Αντιδραστήριο HiPerfect Transfection (Qiagen) σε κύτταρα DU145. Έλεγχος siRNA (siCTL) πειράματα πραγματοποιήθηκαν με επιμόλυνση siRNA κατά της λουσιφεράσης

siLuciferase (siCTL):. 5′-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3 ‘. siADR1A-1 (μίγμα): 5’-CAGGAAAGAUGCAGAGGA-3 ‘και 5′-UUCCUCUGCAUCUUUCCU-3’. siADR1A-2 (μίγμα):. 5′-GCGUCUACGUGGUGGCCA-3 ‘και 5′-UUGGCCACCACGUAGACG-3’

Σταθερές κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν με επιμόλυνση κυττάρων DU145 με ένα φορέα που κωδικοποιεί Psuper μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) έναντι CAV-1 (ακολουθία: CTGGAATAAGTTCAAATTCTT 2121 3’UTR) (DUshcav-1) (ή κενού φορέα Psuper για την κυτταρική γραμμή ελέγχου, DUshCTL) χρησιμοποιώντας Nucleofector, όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή (Amaxa GmbH, Köln, Γερμανία). Εμείς επιμολυσμένα 2 × 10

6 θρυψίνη κατεργασμένα κύτταρα DU145 με 3 μα φορέα και στη συνέχεια χρησιμοποιούνται τα επιμολυσμένα κύτταρα να σπείρουν ένα καλά πλάκα 24 (Nunc) σε πολύ χαμηλή πυκνότητα. Οι κλώνοι υποέκφραση επιλέχθηκαν CAV-1 με βάση αντιβιοτικά αντοχή τους σε Πουρομυκίνης και επικυρώνεται από Western Blot.

Αντισώματα και Αντιδραστήρια

Τα πρώτα αντισώματα χρησιμοποιούνται για ανοσοφθορισμού (IF) μικροσκοπία και ανοσοαποτύπωσης (IB ) ήταν: (1:100) κουνελιού αντι-α

1Α αδρενεργικών υποδοχέων (Santa Cruz Biotechnology), (, (1:50) ποντικού αντι-caveolin- 1:100) κουνελιού αντι-caveolin-1 (Santa Cruz Biotechnology) 1 (BD Laboratories μεταγωγή), (1:400) ποντικού αντι-β-ακτίνης (Sigma), (1:200) αντι-καλνεξίνη (Chemicon, Millipore, Παρίσι, Γαλλία), (1:1000) ποντικού αντι-κυτοκερατίνης 18 (Chemicon, Millipore, Παρίσι, Γαλλία), (1:1000) κουνελιού αντι-PARP (Cell Signaling), (1:100) ποντικού αντι-bax (6A7) (Santa Cruz Biotechnology) που αναγνωρίζει ένα επίτοπο εκτεθειμένο του Βαχ στην ενεργοποιημένη διάπλαση, (1:1000) κουνελιού αντι-procaspase 3 (Upstate), (1:1000) αντι-φωσφο-ρ44 /42 ΜΑΡ κινάσης και (1:1000) αντι-ρ44 /42 ΜΑΡ κινάσης (Cell Signaling). Δευτερογενής αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για IB ήταν: (1:10000) υπεροξειδάση αρμορακίας-συνδεδεμένη αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού (Chemicon). Για IF, χρησιμοποιήσαμε (1:1000) Alexa Fluor® 488-σημασμένο και (1:2000) 546-επισημασμένο δευτερογενή αντισώματα (Molecular Probes).

Τα κύτταρα επεξεργάστηκαν με 10 μΜ L-φαινυλεφρίνη Υδροχλωρική (Phe ), 1 μΜ πραζοσίνης (PRA) και 10 μΜ PD98059 για τρεις ημέρες (ανανεώνεται κάθε 24 ώρες) και 10 μΜ θαψιγαργίνη (TG) για 48 ώρες σε μέσο RPMI. Βραχυπρόθεσμες θεραπείες ΡΗΕ πραγματοποιήθηκαν σε διάλυμα που περιείχε (mM): NaCl, 116? ΚΟΙ, 5.6? CaCl

2, 1.8? MgCl

2, 1.2? NaHCO

3, 5? Ν &

2 ΡΟ

4, 1? HEPES, 20? pH 7.3. Όλα τα χημικά προϊόντα που παρέχονται από τη Sigma εκτός TG (Alomone) και PD98059 (Calbiochem).

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε τρία πιάτα των 60 mm ανά συνθήκη και τα ναρκωτικά εφαρμόσθηκαν όπως περιγράφηκε πάνω από. Μετά τις θεραπείες, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε 0.2 ml αποστειρωμένου PBS. 1 ml ψυχρής αιθανόλης 70% προστέθηκε σε κυτταρικά εναιωρήματα ενώ στροβιλισμό. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν, πλύθηκαν σε στείρο PBS και κατόπιν επωάστηκαν με ριβονουκλεάση (2 μg /ml) για 15 λεπτά. Ιωδιούχο προπίδιο (25 μg /ml τελική σε PBS-Triton Χ-100 0,1%) προστέθηκε στη συνέχεια και αφέθηκε να επωαστεί για άλλα 30 λεπτά. περιεκτικότητα DNA μετρήθηκε με συναρπαστικό ιωδιούχο προπίδιο στα 488 nm και μέτρηση της εκπομπής στα 520 nm (FL3) χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής (Beckman Coulter Epics XL4-MCL με απόκτηση Expo32). Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τέσσερις φορές.

Western Blot

Το μέσο κυτταρικής καλλιέργειας απορρίφθηκε και οι φιάλες πλύθηκαν με παγωμένο PBS. Κυτταρικές πρωτείνες στη συνέχεια εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό RIPA [1% (ν /ν) Triton Χ-100, 1% (w /v) Na δεοξυχολικό, 150 mM NaCl και 20 mM φωσφορικό νάτριο ή κάλιο, ρΗ 7,2] με 5 mM EDTA και αντι-πρωτεάσες κοκτέιλ (P8340? Sigma) για 30 λεπτά επί πάγου. Μετά το ξύσιμο, οποιοδήποτε αδιάλυτο υλικό απομακρύνθηκε με φυγοκέντρηση στα 30.000 χ

g

για 10 λεπτά στους 4 ° C και η ποσότητα της πρωτεΐνης εκτιμήθηκε με την μέθοδο BCA (Pierce Chemical Company, Rockford, IL, USA). Ίσες ποσότητες πρωτεϊνών υποβλήθηκαν σε SDS /PAGE (16% πηκτώματα). Τέλος, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης για τη χρήση ενός ημίξηρου ηλεκτρο-στυπόχαρτο (Bio-Rad). Μετά από 1 ώρα κορεσμού σε 5% γάλα χωρίς λιπαρά (ή 5% BSA (αλβουμίνη βόειου ορού) μόνο για αντι-φωσφο-ρ44 /42 ΜΑΡΚ), οι μεμβράνες επωάστηκαν για μια νύχτα με αραιωμένο πρωτογενή αντισώματα (βλέπε «Αντισώματα και Αντιδραστήρια»). Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν (3 χ 10 min) με ρυθμιστικό ΤΝΤ (15 mM Tris /HCl, ρΗ 8, 140 mM NaCl και 0.05% Tween 20) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τα δευτερογενή αντισώματα υπεροξειδάσης-συνδεδεμένη αντίστοιχη χρένο (αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού, Pierce), (1:10000) αραιωμένο σε TNT /γάλα (ή TNT /BSA) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από αρκετές πλύσεις σε ρυθμιστικό ΤΝΤ, ​​οι μεμβράνες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανίχνευση χημειοφωταύγειας χρησιμοποιώντας το υπόστρωμα χημειοφωταύγειας σήμα υπέρ West Dura (Pierce) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι μεμβράνες τελικά εκτέθηκαν σε X-Omat AR φιλμ (Eastman Kodak Company, Rochester, ΝΥ, USA). Η ένταση των σημάτων αξιολογήθηκε με πυκνομετρία και ημι-ποσοτικά χρησιμοποιώντας την αναλογία για κάθε δείγμα μεταξύ της έντασης της πρωτεΐνης ενδιαφέροντος διαιρείται με την ένταση της ακτίνης ή καλνεξίνη. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον δύο φορές.

Απομόνωση απορρυπαντικών Resistant Οι μεμβράνες (DRM) και Dot blot

Τα κύτταρα ξεπλύθηκαν, η αχρήστευση, φυγοκεντρήθηκαν και το υπερκείμενο απομακρύνθηκε. Το σφαιρίδιο επανααιωρήθηκε με ρυθμιστικό απομόνωσης Β (σύμφωνα με το Φύλλο Axis-Shield S33 Application) και ομογενοποιήθηκαν με ομογενοποιητή Dounce (Kontes) 15 μm κάθαρσης γουδοχέρι συνέχεια φυγοκεντρήθηκε για 10 λεπτά στα 1000 χ

g

. Το υπερκείμενο που αντιστοιχεί στο εκχύλισμα σχεδία ακατέργαστο λιπιδικό απομονώθηκε και προστέθηκε 0,2% Triton Χ-100. Μια ασυνεχής 5-βήμα Optiprep® (Axis-Shield PoC AS) βαθμίδα σχηματίστηκε με ρυθμιστικό διάλυμα D (ρυθμιστικό Β + 1% Triton Χ-100) (w /v) για να ληφθεί 1.66 ml 35%? 2.5 ml 20%? 2,5 ml του 15%? 2.5 ml 10%? 0,83 ml 5%. Ακατέργαστο εκχύλισμα λιπιδίων σχεδία έγινε πυκνό με σακχαρόζη (230 mg για 0,5 κ.εκ. προϊόντος λύσης) και που στη διεπαφή μεταξύ κλίσεις 35% και 20%. Υπερφυγοκέντρηση στα 165400 χ

g

για 4 ώρες στους 4 ° C σε 50 Ti δρομέα (Beckman Coulter) ακολουθήθηκε από συλλογή από κάτω προς τα πάνω του 1,1 ml κλασμάτων. 1.1 ml 20% (ν /ν) TCA (τριχλωροξεικό οξύ) προστέθηκε σε κάθε κλάσμα προκειμένου να καθιζάνει πρωτεΐνες. Σωλήνες διατηρήθηκε σε πάγο για 20 λεπτά υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 10,000 χ

g

στους 4 ° C για 10 λεπτά. Το ίζημα πλύθηκε με μεθανόλη, φυγοκεντρείται στη συνέχεια επανα-εναιωρήθηκε σε 4% (ν /ν) SDS. Δεδομένου ότι τα δείγματα δεν είχαν υψηλή συγκέντρωση σε πρωτεΐνες και ανίχνευση με κλασική κηλίδα western ήταν δύσκολο να ληφθούν, τα δείγματα φορτώθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης σε μια 96 φρεατίων μονάδα Dot-Blot, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Bio-Rad). Εν συντομία, τα δέκα κλάσματα κηλίδα επί μεμβράνης νιτροκυτταρίνης σε σειρά. Όταν στεγνώσει, η μεμβράνη επωάστηκε σε διάλυμα αποκλεισμού για 1 ώρα (TNT /γάλα) και στη συνέχεια υβριδοποιήθηκε με τα επιθυμητά αντισώματα μετά κλασική διαδικασία ΙΒ όπως περιγράφεται ανωτέρω (βλέπε «Western Blot»). Προφυλάξεις ήταν επομένως λαμβάνονται κρατώντας μερικούς σημαντικούς παράγοντες σταθερή για τα κατεργασμένα και μη κατεργασμένα συνθήκες. Η πυκνότητα των κυττάρων που χρησιμοποιούνται για τα πειράματα ήταν συνεχής και όταν είναι κρύο εκχύλιση με απορρυπαντικό διεξήχθη τόσο η συγκέντρωση του απορρυπαντικού και η αναλογία της συγκέντρωσης αριθμός κυττάρων /απορρυπαντικό ήταν τα ίδια. Κάθε φρεάτιο φορτώθηκε με 25 μΙ από κάθε κλάσμα. Αυτή η τυποποιημένη μέθοδος επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές και χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει τις αλλαγές στην στεγανοποίηση ενός μορίου στόχου σε DRM, αποφεύγοντας ψευδείς εκτιμήσεις όταν βασίζεται στις σχετικές ποσότητες σε σχέση με όλα τα άλλα μόρια που υπάρχουν.

Ποσοτικοποίηση της φωσφατιδυλοχολίνη (PC) και σφιγγομυελίνη (SM)

τα λιπίδια εκχυλίστηκαν σύμφωνα με την μέθοδο του Folch et al. [23]. Διμυριστοϋλφωσφατιδυλοχολίνη (DMPC Sigma), διμυριστοϋλφωσφατιδυλοσερίνη (DMPS Avanti Polar Lipids), lauroylsphingomyelin (LSM Avanti Polar Lipids) χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικά πρότυπα. Φωσφολιπιδίων ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε μια Hypersil Si στήλη 2 × 200 mm (Agilent Technologies, Massy, ​​Γαλλία) ακολουθώντας το πρωτόκολλο [24]. Θετικό ESI-MS διεξήχθη σε MSD 1100 Φασματόμετρο Μάζας (Agilent Technologies). Η τάση στόμιο ορίστηκε στα 120 V, η τριχοειδή τάση 3,5 kV, το αέριο ξήρανσης (άζωτο) ρέει σε 8 λίτρα /λεπτό και το εύρος σάρωσης από m /z 400 έως 950. Ολοκληρωμένη κορυφή ήταν από Εκχυλίσματα Ion χρωματογραφήματα (ΕΚΠ) για m /z = 700 να 950 στο χρόνο κατακράτησης (RT) του PC, PS, SM χωρίστηκαν από το EIC για m /z = 679 στο RT του DMPC, m /z = 681 στο RT του DMPS ή m /z = 647 στο RT του LSM. Επίπεδα προσδιορίστηκαν με σύγκριση του λόγου αυτού με μία πρότυπη καμπύλη γνωστών ποσοτήτων φωσφατιδυλοχολίνη και σφιγγομυελίνη.

Ποσοτικοποίηση της Χοληστερόλης

Η εκχύλιση και σαπωνοποίηση διεξήχθησαν σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφηκε προηγουμένως [25] με ορισμένες τροποποιήσεις. Ο ποσοτικός προσδιορισμός της χοληστερίνης διεξήχθη χρησιμοποιώντας ΗΡ6890 αέριο χρωματογράφο εξοπλισμένο με ένα εγχυτήρα HP7683 και Εκλεκτικό Ανιχνευτή Μάζας HP5973 (Agilent Technologies). Η χρωματογραφία πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ΗΡ-5MS τριχοειδή στήλη (30 m × 0,25 mm εσωτερική διάμετρος, 0,25 μm πάχος φιλμ, Agilent Technologies). Ένα επιλεγμένο πρόγραμμα ιόντων παρακολούθησης χρησιμοποιήθηκε για φασματομετρία μάζας. Τα ιόντα που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση (m /z) είχαν ως εξής: επικοπροστανόλη, 370? χοληστερόλη, 368. Οι καμπύλες βαθμονόμησης που λαμβάνονται με ανάλυση των προτύπων που παρασκευάζεται από αυθεντικά πρότυπα (Steraloids) και εκχυλίζεται με τη μέθοδο που χρησιμοποιείται για τα δείγματα.

Οι παραπάνω πρωτόκολλα ποσοτικού προσδιορισμού για τα λιπίδια και χοληστερόλη επαναλήφθηκαν τρεις φορές για τρία ξεχωριστά πειράματα σε μη-επεξεργασμένα (έλεγχος) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία DU145 κυττάρων με ΡΗΕ για 10 λεπτά. Δεδομένου ότι οι ποσότητες των λιπιδίων και της χοληστερόλης προσδιορίζεται ποσοτικά σε κάθε κλάσμα (ng /ml ή μg /ml) μεταβάλλεται ελαφρώς μεταξύ των πειραμάτων, τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν με προσδιορισμό μέσες τιμές για τα τρία πειράματα που αντιπροσωπεύεται από το ποσοστό των λιπιδίων και της χοληστερόλης σε κάθε κλάσμα σε συνθήκες ελέγχου σε σύγκριση με τις συνθήκες PHE-θεραπεία.

πλασματική μεμβράνη «Rip Off»

Αυτή η μέθοδος βασίζεται σε ένα δημοσιευμένο πρωτόκολλο [26]. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες. Formvar® επικαλυμμένα πλέγματα χαλκού (σύμφωνα με το [27]) επικαλύφθηκαν με πολυλυσίνη. Οι καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν πλευρά κύτταρο κάτω πάνω στα πλέγματα και μία ελαφρά πίεση ασκείται με ένα λαστιχένιο πώμα κατόπιν καλυπτρίδες αναστρέφονται και τα πλέγματα προσεκτικά μονοκατοικιών συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε 8% (ν /ν) PFA (παραφορμαλδεΰδη). Μετά την πλύση σε PBS και του κορεσμού σε PBS /2,5 mM, γλυκίνης /γάιδαρος ανοσοσήμανση ορού διεξήχθη σύμφωνα με πρότυπες τεχνικές, χρησιμοποιώντας πρωτογενή αντισώματα που ακολουθείται από συζεύγματα χρυσού είδος-ειδικών αντι-IgG από 6 nm, 12 nm και 18 nm. Τέλος, πλέγματα αντίθεση και προετοιμάζονται για την παρατήρηση σε ένα Hitachi Η-600 ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (μεγέθυνση × 20000) σε 75 kV.

Υπερδομική Μικροσκοπία

Για την ηλεκτρονική μικροσκοπία, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 2,5% γλουταραλδεΰδη παρασκευάζεται σε 0,1 Μ κακοδυλικό ρυθμιστικό διάλυμα και μετα-σταθεροποιήθηκαν σε 1% τετροξείδιο του οσμίου στο ίδιο ρυθμιστικό. Μετά ακετονιτρίλιο αφυδάτωση, το ίζημα ενσωματωμένο σε Εροη. Serial λεπτές τομές (90 nm) κόπηκαν χρησιμοποιώντας ένα υπερμικροτόμου Reichert Ultracut Ε και συλλέγονται σε 150 mesh εξαγωνικό παραγραφεί δίκτυα χαλκού. Μετά από χρώση με 2% οξικό ουρανύλιο παρασκευάστηκε σε 50% αιθανόλη και η επώαση με ένα προβάδισμα κιτρικό διάλυμα τομές παρατηρήθηκαν σε ένα Hitachi Η-600 ηλεκτρονικού μικροσκοπίου μετάδοσης.

Έμμεσος Ανοσοφθορισμός

δείγματα εκτομή ΒΡΗ από ανθρώπινο προστάτη καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο ψυγμένο ισοπεντάνιο και διατηρείται σε «Tissue-Tek®» στους -80 ° C πριν παρασκευάστηκαν 10 μm τομές στους -20 ° C με ένα κρυοστάτη, τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες και προχώρησε σε IF μελέτη. Φυσιολογικών και καρκινικών ιστών του προστάτη που παρέχονται από διαφάνειες ιστό-array (SuperBioChips Laboratories), αποπαραφινοποιούνται σύμφωνα με τις ενδείξεις του κατασκευαστή (Cliniscience) πριν από την προετοιμασία για IF σύμφωνα με το [28]. Εν συντομία, όλες οι διαφάνειες μπλοκαρίστηκαν επί 30 λεπτά με PBS /1,2% (ν /ν) ζελατίνη στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα επιθυμητά για 1 ώρα στους 37 ° C, στη συνέχεια, δευτερογενή αντισώματα (1 ώρα, 37 ° C). Απεικόνιση διεξήχθη χρησιμοποιώντας Zeiss LSM 510 συνεστιακή κεφαλή (Carl Zeiss) συνδεδεμένη με Zeiss Axiovert 200 Μ μικροσκόπιο με ένα Χ 40 ελαιοκαταδυτικό αντικειμενικό φακό (αριθμητικό άνοιγμα 1,45). Τα πλακίδια σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα λέιζερ ιόντων αργού και ένα λέιζερ ιόντων ηλίου /νέον. Όλες οι παράμετροι σάρωσης διατηρήθηκαν σταθερές σε όλες τις διαφορετικές πειράματα. AIM 3,2 ομοεστιακό μικροσκόπιο λογισμικό (Carl Zeiss) χρησιμοποιήθηκε για την απόκτηση και την ανάλυση των δεδομένων.

RT-PCR

Η αντίστροφη μεταγραφή-PCR διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Το 178 pb α

1Α-AR ισομορφή 1 αμπλικόνιο ενισχύθηκε με 5′-AGACCAATCCTCCTGTACCAC-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-CTCTGCATCTTTCATGTCCTAG-3′ (αντίστροφο). Το 220 pb CAV-1 αμπλικόνιο ενισχύθηκε με 5’-AGTGCTCCTGTTCTCCCTTC-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-CTTGTCGATGGCTTCCTTCAC-3′ (αντίστροφο) (Eurogentec). Το 236 pb GAPDH αμπλικόνιο εσωτερικού ελέγχου ενισχύθηκε με 5’-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3′ (αντίστροφο). Το 241 pb κυτοκερατίνη 18 αμπλικόνιο ενισχύθηκε με 5’-TGAGTCAGAGCTGGCACAGA-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-TGGTGTCATTGGTCTCAGACA-3′ (αντίστροφο). Τέλος, το 210 pb κυτοκερατίνη 14 αμπλικόνιο ενισχύθηκε με 5’-TGCGAGATGGAGCAGCAGAA-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-TGCCATCGTGCACATCCATGA-3’ (αντίστροφο). α

1Α-AR, CAV-1, κυτοκερατίνης 14 και 18 mRNA εκφράσεις επικυρώθηκαν με ανάλυση πυκνότητας gel χρησιμοποιώντας GAPDH mRNA ως εσωτερικού ελέγχου.

Ανθρώπινα δείγματα ιστών

βιοψίες Ανθρωπίνων καλοήθη υπερπλασία του προστάτη ελήφθησαν από συναινούντες ασθενείς μετά τις τοπικές ηθικούς παράγοντες. Όλα τα πειράματα που περιλαμβάνουν ιστούς των ασθενών πραγματοποιήθηκαν με αριθμό έγκρισης »CP 01/33», που εκδίδεται από τις «Comité Consultatif de Προστασίας des Άτομα dans la Recherche Biomédicale de Lille».

Η στατιστική ανάλυση

τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση μη ζευγαρωμένου

t

εξετάσεις (για σύγκριση δύο ομάδες) ή ανάλυση των δοκιμών διακύμανσης ακολουθούμενη από Dunnett (για πολλαπλές έλεγχος

έναντι

δοκιμή συγκρίσεις). Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές όταν

σ

& lt? 0,05 (*),

σ

& lt? 0.01 (**) και

σ

& lt? 0.001 (***).

Αποτελέσματα

α

1Α-AR συνδέεται με CAV-1 στην επιφάνεια των κυττάρων DU145

Προηγούμενες μελέτες έχουν περιγράψει μια άμεση αλληλεπίδραση της α

1Α -AR με CAV-1 [15]. Επιπλέον, α

σηματοδότηση 1Α-AR είναι γνωστό ότι εντοπίζονται σε μικροσπηλαίων [14], [30]. Για να εξερευνήσετε την τοπολογία της μεμβράνης του α

1Α-AR, χρησιμοποιήσαμε την τεχνική «rip-off» που αναπτύχθηκε στην προσκολλημένων κυττάρων που επιτρέπουν την απομόνωση και την παρατήρηση με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο των μεγάλων περιοχών της μεμβράνης πλάσματος [26]. α

1Α-AR χρώση immunogold (6 κουκίδες nm, μαύρο βέλος) συνεντοπίζεται με CAV-1 (18 κουκίδες nm, λευκό βέλος) σε μικροπεριοχές της πλασματικής μεμβράνης των περίπου 50-100 nm (Σχήμα 1).

μεμβράνες του πλάσματος ήταν «άρπαξαν-off», όπως περιγράφεται στην ενότητα «Μέθοδοι» και επωάστηκαν με αντι-CAV-1 και αντι-α

1Α-AR αντισώματα. Δευτερογενής αντισώματα συζευγμένα με 6 nm και 18 nm σωματίδια χρυσού χρησιμοποιήθηκαν εναντίον αντι-α

1Α-AR (μαύρο βέλος) και αντι-CAV-1 (λευκό βέλος), αντίστοιχα. Πλέγματα στη συνέχεια υπέστησαν επεξεργασία για την παρατήρηση με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Συνεντόπισης αμφοτέρων των πρωτεϊνών δεικνύεται με κύκλους. Bar, 200 nm.

Η

Plasma πρωτεΐνη μεμβράνης αναδιανομή και τη σύνθεση των λιπιδίων αλλαγές σε κλάσματα DRM που προκαλούνται από φαινυλεφρίνη

Ανάλυση μικροεπικράτειες μεμβράνης πλάσματος, μικροσπηλαίων ή σύνθεση σχεδία λιπιδίων συνήθως αρχίζει με απορρυπαντικό διαλυτοποίηση ολόκληρων κυττάρων ακολουθούμενο από φυγοκέντρηση σε κλίση πυκνότητας και ανάκτηση του DRM από το φως κλάσματα της κλίσης. Ερευνήσαμε τη σύνδεση των α

1Α-AR με καθαρό DRM από DU145 εκχυλίσματα μεμβράνης ολόκληρου κυττάρου σε μια βαθμίδα πυκνότητας OptiPrep®. Για τον χαρακτηρισμό των κλασμάτων DRM, η παρουσία ενός ειδικού μεμβράνης πλάσματος τηγάνι δείκτη καντερίνης για πρώτη φορά αξιολογήθηκε ως θετικός έλεγχος (Σχήμα 2Α, α). Η παρουσία του σε όλες τις 10 καθαρισμένα κλάσματα αποδεικνύει ότι τα απομονωμένα κλάσματα DRM αντιστοιχούν σε περιοχές της μεμβράνης πλάσματος. Επιπλέον, η PCNA πυρηνική πρωτείνη (πυρηνικό αντιγόνο κυττάρου πολλαπλασιασμού) και η μιτοχονδριακή πρωτεΐνη Βαχ χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες, δεδομένου ότι είναι γνωστό ότι δεν συνδέσει με μεμβράνη πλάσματος. Η απουσία τους σε κλάσματα DRM επικυρώνει την απουσία μόλυνσης από ενδοκυτταρικά μεμβράνες (Σχήμα 2Α, α).

(Α) κλάσματα DRM της αύξησης της πυκνότητας (από το κλάσμα 1 έως 10) που λαμβάνεται όπως αναφέρεται στην ενότητα «Μέθοδοι» και αναλύθηκε με dot blot. (Α) Pan καντερίνης χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος επιβεβαιώνει ότι τα κλάσματα που λαμβάνονται αντιστοιχούν σε μεμβράνη πλάσματος. PCNA (πυρηνικό αντιγόνο κυττάρου πολλαπλασιασμού) και Βαχ χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες, η απουσία τους επιβεβαιώνοντας τη μη μόλυνση των κλασμάτων DRM από ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες είναι γνωστό ότι δεν πρέπει να συνδέονται με σχεδίες. (Β) Dot blot της συλλογής κλάσματος DRM σε κατάσταση ελέγχου (CTL) και 10 λεπτά θεραπεία με 10 μΜ φαινυλεφρίνη (Phe). Purinergic Ρ2Υ2 υποδοχέα χρησιμοποιήθηκε ως ένας αρνητικός έλεγχος για την ειδικότητα της επίδρασης της φαινυλεφρίνης επί πρωτεΐνης ανακατανομή σε κλάσματα. Μαύρο ορθογώνιο σηματοδοτεί την στροφή της α

1Α-AR, CAV-1 και πρωτεΐνης Ga

Q11 σε κλάσματα αναπτήρα πυκνότητας. σύνθεση (Β) Lipid από τα 10 κλάσματα προσδιορίστηκε ποσοτικά όπως περιγράφεται στην ενότητα «Μέθοδοι» σε ελέγχου (μαύρη στήλη) και κύτταρα ΡΗΕ αγωγή (γκρι στήλες) για το (α) λυσοφωσφατιδυλοχολίνη (LPC), (β) φωσφατιδυλοχολίνη (PC), (γ) σφιγγομυελίνη (SM), (δ) χοληστερόλη. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM υπολογίζονται από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε το

t

δοκιμή? *,

σ

& lt? 0,05, **,

σ

& lt? 0,01 και ***,

σ

& lt?. 0.001

Η

προκειμένου να καθοριστεί αν ορίζεται προηγουμένως μικροεπικράτειες εμπλέκονται στην α

μονοπατιού σηματοδότησης 1Α-AR σε κύτταρα DU145, εξετάσαμε α

1Α-AR διέγερση με ειδικό φαινυλεφρίνης αγωνιστή της (Phe). Ανάλυση στυπώματος κηλίδων των κλασμάτων DRM αποκάλυψε διανομή του CAV-1 σε κλίση χαμηλής πυκνότητας (5% -20%) κλάσματα 1-6 και α

1Α-AR στα κλάσματα 1 και 3-6 στον έλεγχο (CTL) συνθήκες. Μετά τη θεραπεία 10 λεπτά με 10 μΜ PHE διανομής CAV-1 παρατηρήθηκε σε βαθμίδα χαμηλής πυκνότητας (5% -10%) κλάσματα 1-5 και α

1Α-AR τώρα ανιχνεύθηκε σε όλα τα κλάσματα 1-6 (συμπεριλαμβανομένης της χαμηλής πυκνότητας κλάσμα 2) (Σχήμα 2Α, b, άνω πάνελ CTL? κατώτερο PHE πάνελ). Είναι σημαντικό, Οα περιεχόμενο

Q11 (ένας α

1Α-AR-τελεστές) έδειξε μια μετατόπιση από τα κλάσματα 4-5 με κλάσματα 1 έως 5 μετά τη θεραπεία ΡΗΕ και εξακολουθούν να υπάρχουν σε κλάσματα υψηλότερης πυκνότητας, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ενεργοποίηση του υποδοχέα δεν συνεπάγεται όλες οι πρωτεΐνες Οα

Q11 που παρουσιάζονται στο επίπεδο της μεμβράνης. Εκτιμήσαμε επίσης την πουρινεργικών Ρ2Υ2 υποδοχέα που χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος για την ειδικότητα της τροποποίησης στη διανομή πρωτεϊνών που επάγεται από PWT. α

1Α-AR και Ρ2Υ2 είναι και οι δύο μοιράζονται παρόμοιες πορείες σηματοδότησης GPCR. Ρ2Υ2 βρίσκεται στα ίδια κλάσματα εάν τα κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ή όχι (Σχήμα 2Α, b, CTL και Phe), ως εκ τούτου αποδεικνύουν την ειδικότητα του προηγουμένως παρατηρηθεί ΡΗΕ επαγόμενη τροποποιημένη κατανομή πρωτεΐνης.

Επιπλέον, ήμασταν ενδιαφέρονται για την σύνθεση λιπιδίων των καθαρισμένων κλασμάτων DRM. Λιπίδια που είναι γνωστό ότι είναι εμπλουτισμένο σε βιολογικά λιπιδικές σχεδίες, όπως λυσοφωσφατιδυλοχολίνη (LPC), σφιγγομυελίνη (SM), φωσφατιδυλοχολίνη (PC) και της χοληστερόλης [31], [32], αναλύθηκαν. Για άλλη μια φορά, ερευνήσαμε πιθανές μεταβολές της σύνθεσης των λιπιδίων των κλασμάτων DRM μετά PHE διέγερση. Οι παρατηρήσεις μας δείχνουν σημαντική αύξηση των ποσοτήτων αυτών των λιπιδίων, κυρίως σε βαθμίδα χαμηλής πυκνότητας (5% -10%) κλάσματα 1-5 ως αποτέλεσμα της ΡΗΕ διέγερση (Σχήμα 2Β, a, b, c, d). Τα αποτελέσματα αυτά είναι σε συμφωνία με την καθιερωμένη γεγονός ότι η υψηλή περιεκτικότητα λιπιδίων προκαλεί κυμαινόμενο λιπιδίων μικροεπικράτειες σε κλάσματα χαμηλής πυκνότητας κατά τη διάρκεια της φυγοκέντρησης. Προηγουμένως δημοσιευθέντα δεδομένα σχετικά με τα συστήματα μοντέλο λιπιδίων δείχνουν ότι το μέγεθος των λιπιδικών σχεδιών εξαρτάται από τη σύνθεση των λιπιδίων της μεμβράνης [33], [34]. Οι παρατηρούμενες μεταβολές στις συνθέσεις των λιπιδίων λόγω της αναδιοργάνωσης της μεμβράνης μπορεί να ευθύνεται για αναπτήρα μικροεπικράτειες πυκνότητας με αποτέλεσμα την αναδιανομή του α

1Α-AR, CAV-1 και Gαq

11 παρατηρηθεί μέσα σε κλάσματα DRM.

Πρωτεΐνη και λιπιδίων αναδιοργάνωση που προκαλείται από φαινυλεφρίνη συνδέεται με CAV-1-πλούσια ομαδοποίηση μεμβράνη

θεωρείται ότι κατά εξωκυτταρικό ερέθισμα, η μεμβράνη πλάσματος παρασκευάζεται για το σχηματισμό περισσότερο σταθεροποιημένο τομέων και μοριακών συμπλεγμάτων με ενισχυμένη μέγεθος και τη διάρκεια ζωής όπως μικροσπηλαίων [35], [36]. Για να κατανοήσουμε τη συμμετοχή του μικροσπηλαίων στο α

σηματοδότηση 1Α-AR, διερευνήσαμε την επίδραση της ΡΗΕ διέγερσης στην κυτταρική επιφάνεια DU145 μορφολογία (Σχήμα 3Α). Τα κύτταρα σε αγωγή για 10 λεπτά με 10 μΜ ΡΗΕ παρουσιάζουν πολλές εγκολπώσεις επιφάνεια που αντιστοιχεί στο μικροσπηλαίων (Σχήμα 3Α, β) σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 3Α, α). Μικροσπηλαίων είναι εμφανής η κυκλική προφίλ με ομοιόμορφο σχήμα και διάμετρο 50-80 nm. Σε αυτό το αντιπροσωπευτικό μικροσπηλαίων ηλεκτρονίων μικρογραφία υπάρχουν ως ενιαίο λάκκους (Σχήμα 3Α, β, μαύρα βέλη) και μερικές φορές σε πιο πολύπλοκες ρυθμίσεις διασυνδέονται με κυτταροπλασματική caveolar προφίλ (Σχήμα 3Α, β, λευκά βέλη).

(Α) Εκπρόσωπος ηλεκτρονίων μικρογραφία των κυττάρων DU145 στο (α) μη επεξεργασμένα κατάσταση (β) μετά από 10 λεπτά θεραπείας με 10 μΜ PHE. Μικροσπηλαίων και caveolin περιέχουν κυστίδια με διάμετρο 50-80 nm είναι πυκνά σε ηλεκτρόνια υποδεικνύονται με μαύρα βέλη. Λευκή αιχμές βελών δείχνουν πολύπλοκο σχήμα μικροσπηλαίων.