Αφηρημένο

Θεραπεία

EGFR

μεταλλαγμένου μη μικροκυτταρικό ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα με τους αναστολείς της τυροσινικής κινάσης erlotinib ή αποτελέσματα gefitinib στο υψηλά ποσοστά ανταπόκρισης και παρατεταμένη επιβίωση χωρίς εξέλιξη. Παρά την ανάπτυξη των ευαίσθητων προσεγγίσεων ανίχνευση μετάλλαξης, μια διεξοδική επικύρωση από αυτά σε ένα κλινικό περιβάλλον έχει μέχρι στιγμής λείπει. Πραγματοποιήσαμε, σε κλινικό περιβάλλον, μια συστηματική επικύρωση των διδεσοξυνουκλεοτιδίων «Sanger» και Pyrosequencing εναντίον μαζικά παράλληλη αλληλουχίας ως μια από τις πιο ευαίσθητες τεχνολογίες ανίχνευσης μετάλλαξης διαθέσιμα. Μεταλλάξεων σχολιασμό των κλινικά δείγματα όγκου πνεύμονα αποκάλυψε ότι από όλους τους ασθενείς με επιβεβαιωμένη ανταπόκριση στο

EGFR

αναστολή, μόνο μαζικά παράλληλη αλληλουχίας ανιχνεύονται όλες οι σχετικές μεταλλάξεις. Αντίθετα, διδεσοξυνουκλεοτιδίων έχασε τέσσερις ανταποκρίθηκαν και Pyrosequencing έχασε δύο ανταποκρίθηκαν, υποδεικνύοντας μια δραματική έλλειψη ευαισθησίας των διδεσοξυνουκλεοτιδίων, η οποία εφαρμόζεται ευρέως για το σκοπό αυτό. Επιπλέον, η ακριβής ποσοτικοποίηση των μεταλλαγμένων αλληλίων αποκάλυψε χαμηλή συσχέτιση (r

2 = 0,27) του ιστοπαθολογική εκτιμήσεις του περιεχομένου του όγκου και της συχνότητας των μεταλλαγμένων αλληλομόρφων, αμφισβητώντας έτσι τη χρήση ιστοπαθολογία για τη διαστρωμάτωση των δειγμάτων για τις μεμονωμένες αναλυτικές διαδικασίες. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η ενισχυμένη αναλυτική ευαισθησία κριτικά απαιτείται να προσδιορίσει σωστά ασθενείς που ανταποκρίνονται σε

EGFR

αναστολή. Γενικότερα, τα αποτελέσματά μας υπογραμμίζουν την ανάγκη για ενδελεχή αξιολόγηση όλων ανίχνευσης μετάλλαξης προσεγγίσεις ενάντια μαζικά παράλληλη αλληλουχίας ως προϋπόθεση για οποιαδήποτε κλινική εφαρμογή

Παράθεση:. Querings S, Altmüller J, Ansén S, Zander Τ, Seidel D , Gabler F, et al. (2011) Συγκριτική αξιολόγηση της μετάλλαξης Διάγνωση στην Κλινική Καρκίνο του Πνεύμονα δείγματα. PLoS ONE 6 (5): e19601. doi: 10.1371 /journal.pone.0019601

Επιμέλεια: Markus Schuelke, Charité Universitätsmedizin Βερολίνο, NeuroCure Clinical Research Center, Γερμανία

Ελήφθη: 7 Δεκεμβρίου 2010? Αποδεκτές: 2 Απρ 2011? Δημοσιεύθηκε: 5 Μαΐου 2011

Copyright: © 2011 Querings et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τη γερμανική Καρκίνο ενίσχυσης στο πλαίσιο των Κέντρων αριστείας στο πρόγραμμα Ογκολογίας στο Κέντρο Ολοκληρωμένης Ογκολογίας Köln – Βόννης και από το Ομοσπονδιακό Υπουργείο Επιστημών και Παιδείας (BMBF) Γερμανικά ως μέρος του προγράμματος Εθνικού Γονιδιώματος Δίκτυο Έρευνας (NGFNplus , χορηγεί 01GS08100 και 01GS08101) να Jürgen Wolf, Peter Νυρεμβέργη και Ρωμαϊκή Θωμά. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Roman Κ Thomas λάβει την υποστήριξη της έρευνας από την AstraZeneca και έλαβε διάλεξη ή αμοιβές συμβούλων από τη Roche , Boehringer Ingelheim, η Johnson & amp? Johnson, AstraZeneca, Lilly, Merck, Atlas Biolabs και Sanofi-Aventis. Jürgen Wolf έλαβε τη στήριξη της έρευνας και υπηρέτησε ως σύμβουλος για την Roche και η AstraZeneca. Έρευνα υποστήριξης που αναφέρονται σε αυτή την ενότητα δεν χρησιμοποιήθηκε για τη διεξαγωγή αυτής της μελέτης. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

Αρχικά περιορίζεται σε σπάνιες όγκους όπως χρόνια μυελογενή λευχαιμία (ΧΜΛ) ή στρωματικών όγκων του γαστρεντερικού (GIST), η επιτυχία της θεραπείας μεταλλαξιακά κινάσες που ενεργοποιούνται με αναστολείς κινάσης έχει φτάσει την ομάδα των συχνών «στερεά» όγκους και έχει ως εκ τούτου αλλάξει ριζικά την κλινική ογκολογία. Η θεραπεία των ασθενών που πάσχουν από

EGFR

μεταλλαγμένου καρκίνους με

EGFR

αναστολείς οδηγεί σε αντικειμενική ανταπόκριση [1], [2], [3], με διπλασιασμό σε επιβίωση χωρίς εξέλιξη σε σύγκριση στη συνήθη χημειοθεραπεία και σε μεγάλες συνολική επιβίωση [4], [5]. Παρόμοια ζεύγη γονιδιωματική βλαβών και στοχευμένα φάρμακα είναι

BRAF

μετάλλαξη και

BRAF

αναστολή [6]

PARP

αναστολή και

BRCA1 /BRCA2

μεταλλάξεις [7 ], [8] ή

PDGFRA

/

KIT

μετάλλαξη και imatinib [9]. Υπό το πρίσμα των τρεχουσών προσπαθειών για την ακολουθία συστηματικά τα γονιδιώματα του όλους τους βασικούς τύπους όγκων (https://www.icgc.org/ή www.cancergenome.nih.gov), ο κατάλογος των γενετικά καθορισμένων όγκων που είναι ευαίσθητα σε μια συγκεκριμένη θεραπευτική παρέμβασης είναι πιθανό να επεκταθεί δραματικά τα επόμενα χρόνια. Μαζί, αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν μια ραγδαία αυξανόμενη ανάγκη για το ευαίσθητο και ακριβή ανίχνευση μετάλλαξης σε κλινικά δείγματα, ως μέρος της ρουτίνας κλινικής φροντίδας.

Δυστυχώς, παρά την εμφάνιση ασήμαντο, η κλινική εφαρμογή της ανίχνευσης μετάλλαξης συναντά δύο αφορούν το δείγμα και μεθοδολογικά προβλήματα : πρώτον, η πλειοψηφία των κλινικών δειγμάτων διαθέσιμες είναι μικρού μεγέθους, μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη και έχει εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) βιοψίες ή κυτταρολογικών δειγμάτων τυπικά αποδίδοντας περιορισμένες ποσότητες χαμηλής ποιότητας DNA, όλα εκ των οποίων να επηρεάσει σοβαρά την ενίσχυση PCR και μεταγενέστερες αναλύσεις. Περαιτέρω, η σύνθεση του όγκου, καθώς και πολλαπλούς τύπους μη νεοπλασματικά κύτταρα να επηρεάσουν την ανίχνευση σωματικών μεταλλάξεων όγκου-ειδικά σε ένα περιβάλλον μη-μεταλλαγμένο, «άγριου τύπου» αλληλόμορφα. Δεύτερον, συμβατικές προσεγγίσεις αλληλούχιση στερούνται ευαισθησίας για την ανίχνευση τέτοιων σπάνιων αλληλομόρφων.

καθορίστηκαν αρκετές μέθοδοι για να προσφέρουν ευαίσθητη ανίχνευση μετάλλαξης, όλες συμπεριλαμβανομένης της εξαγωγής του DNA, PCR ενίσχυση και μετέπειτα ανάλυση μετάλλαξης με αλληλούχιση ή δοκιμασίες προσδιορισμού του γονότυπου με βάση [ ,,,0],10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19]. Σε αρκετές περιπτώσεις, ο εμπλουτισμός των κυττάρων του όγκου επιτυγχάνεται πριν ανίχνευσης μετάλλαξης, π.χ., με τη βοήθεια λέιζερ μικροδιατομής των δειγμάτων όγκου [15], [17]. Δυστυχώς, υπάρχει μια σχεδόν καθολική έλλειψη επικύρωσης των κλινικά σχετικές ανίχνευσης μετάλλαξης προσεγγίσεις στην κλινική πράξη ενάντια σε ένα ευαίσθητο χρυσό πρότυπο προσέγγιση.

Έχουμε εισαγάγει πρόσφατα μαζικά παράλληλη αλληλουχίας για την ανίχνευση μεταλλάξεων σε κλινικά δείγματα καρκίνου [20]. Τέτοιες προσεγγίσεις είναι ευρέως θεωρείται ότι παρέχει την υψηλότερη ευαισθησία που διατίθενται σήμερα για το σκοπό αυτό, λόγω της ικανότητας να δοκιμάσουν σπάνια μεταλλαγμένα αλληλόμορφα σε ένα κυρίαρχο φόντο αλληλίων άγριου τύπου σε κάθε δείγμα όγκου [20]. Επιπλέον, η προσέγγιση αυτή δεν περιορίζεται σε ένα a-priori επιλογή μεταλλάξεων θεωρούνται σχετικές. Ως εκ τούτου, μαζικά παράλληλη αλληλουχίας είναι ιδανική για να επικυρώσει άλλες μεθοδολογίες ανίχνευσης μετάλλαξης.

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε επικυρωθεί δύο προσεγγίσεις ανίχνευσης μετάλλαξης αλληλουχίας-based (διδεοξυ και Pyrosequencing) κατά των παράλληλων αλληλουχίας σε κλινικό περιβάλλον, λαμβάνοντας υπόψη το περιεχόμενο των καρκινικών κυττάρων, καθώς και η ποιότητα και το είδος των ιστών (π.χ. FF, FFPE) για κάθε δείγμα.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου της Κολωνίας και όλοι οι ασθενείς έδωσαν γραπτή συγκατάθεση. Μια υποομάδα των ασθενών (n = 9), συμμετείχε στη δίκη ERLOPET (NCT00568841).

δείγματα όγκων και κυτταρικές σειρές

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε αναλύσει 24 δείγματα όγκων που προέρχονται από 22 ασθενείς ( Τραπέζι 1). Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την τοπική επιτροπή δεοντολογίας και όλοι οι ασθενείς έδωσαν γραπτή συγκατάθεση. Μια υποομάδα των ασθενών (n = 9), συμμετείχε στη δίκη ERLOPET (NCT00568841). δείγματα όγκων εξετάστηκαν από έναν παθολόγο αναφορά για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε καρκινικών κυττάρων για μετέπειτα ανατομή των περιοχών με υψηλότερη περιεκτικότητα καρκινικών κυττάρων. κυτταρικές σειρές NSCLC που φιλοξενούν διαφορετικές

EGFR

και

αποκτήθηκαν και καλλιεργήθηκαν KRAS

μεταλλάξεις όπως περιγράφηκε προηγουμένως (συμπληρωματικός Πίνακας S1) [21]. Γονιδιωματικό DNA όλων των δειγμάτων όγκου και κυτταρικές γραμμές εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας Gentra Kit Καθαρό Gene Tissue (Qiagen) ακολουθούμενη από DNA ποσοτικοποίηση χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια PicoGreen dsDNA (Invitrogen).

Η

PCR και απευθείας διδεοξυ ανάλυση αλληλουχίας

EGFR

exon18-21 και

KRAS

εξόνιο 2 και 3 ενισχύθηκαν από ένθετη PCR και γονιδίων συγκεκριμένα ζεύγη εξωτερικών και εσωτερικών αστάρι (συμπληρωματικός Πίνακας S2). Οι εσωτερικοί εκκινητές εξοπλισμένα με την αλληλουχία M13-εκκινητή για να διευκολύνει αλληλούχιση. Για τις εξωτερικές αντιδράσεις PCR, χρησιμοποιήσαμε 5-10 ng (40-60 ng χαμηλή ποιότητα DNA) του γονιδιωματικού DNA. Οι αντιδράσεις PCR διεξήχθησαν σε ένα συνολικό όγκο 50 μΙ (0.2 μΜ από κάθε εκκινητή, 2 mM MgCl

2, 200 μΜ από κάθε dNTP και 1.25 U HotStarTaq

Plus

DNA Polymerase Kit (Qiagen)) και τις ακόλουθες συνθήκες κύκλων: 95 ° C για 5 λεπτά, 30 κύκλοι στους 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 60 ° C για 30 δευτερόλεπτα και 72 ° C για 1 λεπτό και τελική επέκταση στους 72 ° C για 10 λεπτά. Μετά ExoSAP-IT (Corporation USB) PCR επεξεργασία προϊόντων ήταν αμφίδρομη αλληλουχία χρησιμοποιώντας τους εκκινητές Μ13-αλληλουχίας και BigDye Terminator Mix έκδοση 3.1 (Applied Biosystems) σε ΑΒΙ 3730 (Applied Biosystems). ηλεκτροφορήματα αλληλουχίας αναλύθηκαν με οπτική επιθεώρηση των ηλεκτροφορήματα και Μετάλλαξη Surveyor 2,03 Λογισμικό (SoftGenetics). ανάλυση μήκος Θραύσμα

EGFR

εξόνιο 19 διεξήχθη με πρότυπη PCR (Για-Hex-ctggatccagaaggtgaga και Rev-ccacacagcaaagcagaaac) με αποτέλεσμα αμπλικόνια από 118-bp (Ta = 59 ° C) για άγριου τύπου εξόνιο 19 . τα προϊόντα PCR αναλύθηκαν σε ΑΒΙ 3700 sequencer DNA και σκόραρε από το λογισμικό GeneMarker (SoftGenetics).

Pyrosequencing δοκιμασίες

Έχουμε σχεδιάσει πέντε διαφορετικά Pyrosequencing [22] δοκιμασίες για ανάλυση της αλληλουχίας του

EGFR

εξόνιο 19-21 και

KRAS

εξόνιο 2 και 3 (Συμπληρωματική Πίνακας S3). Πρότυπο DNA (6 ng γονιδιακό DNA ή εξωτερικά προϊόντα PCR) ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας HotStarTaq

Plus

DNA Polymerase Kit (Qiagen) και τυπικό πρωτόκολλο (0.2 μΜ από κάθε εκκινητή, 160 mM dNTPs, 2 U ενζύμου) και συνθήκες ποδηλασίας (45 κύκλοι και Ta = 59 ° C για

EGFR

εξόνιο 19, Ta = 60 ° C για

KRAS

εξόνιο 2, Ta = 63 ° C για

EGFR

εξόνιο 20, Ta = 61 ° C για

EGFR

εξόνιο 21 και

KRAS

εξόνιο 3 και Ta = 60 ° C για

KRAS

εξόνιο 2). Αντίστροφη PCR εναρκτήρες βιοτινυλιώθηκαν για μετέπειτα ανάλυση Pyrosequencing. Pyrosequencing αντιδράσεις διεξήχθησαν στο όργανο PSQ HS96A χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια PSQ HS96A SNP και λογισμικό ανάλυσης Pyrosequencing SNP (Biotage ΑΒ, Ουψάλα, Σουηδία, τώρα το όνομά PyroMark ™ Q96MD από Qiagen). Για τις μελέτες ευαισθησίας, ποσοτικά τα προϊόντα PCR του

EGFR

μεταλλαγμένου κύτταρα ή

KRAS

μεταλλαγμένου κύτταρα αραιώνονται με άγριου τύπου

EGFR

ή άγριου τύπου

KRAS

αμπλικόνια, αντίστοιχα. Pyrosequencing σήματα ακατέργαστα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας γνωστές σήματα άγριου τύπου. Σημαντική καλώντας μετάλλαξη προσδιορίστηκε από την πειραματική θόρυβο από τη στατιστική ανάλυση των πρώτων στοιχείων με τη χρήση T-test (p ≤ 0,05).

μαζικά παράλληλη αλληλουχίας ανάλυση

μαζικά παράλληλη αλληλουχίας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το GS FLX Πρότυπο ή χημεία GS FLX Titanium σύμφωνα με πρότυπα πρωτόκολλα (Roche). βιβλιοθήκες αμπλικόνιο δημιουργήθηκαν με τη χρήση εξωτερικών προϊόντα PCR ως πρότυπα και πρότυπα πρωτόκολλα και τις συνθήκες του συστήματος FastStart Hifi PCR (Roche) (συμπληρωματικός Πίνακας S4). Χρησιμοποιήσαμε κατά μέσο όρο 340.000 σφαιρίδια ανά κίνηση αποδίδοντας 80,000 έως 120,000 διαβάζει συνολικά και μια κάλυψη αμπλικόνιο που κυμαίνεται από 600 έως 1500 × × με μέσο μήκος αμπλικόνιο 250-300 bp που καλύπτουν ολόκληρο εξόνιο. Όλα διαβάζει ευθυγραμμίστηκαν προς chromsome 7 και 12 του γονιδιώματος αναφοράς (hg18) χρησιμοποιώντας BWA [23]. Τέλος, σε ευθυγράμμιση διαβάζει έγιναν ορατές και αναλύθηκαν από την Integrative Genomics Viewer (https://www.broadinstitute.org/igv/). Η δοκιμή μαθητές Τ χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση της σχετικής συχνότητας ανάγνωσης μεταξύ

EGFR

μεταλλαχθεί και όγκους άγριου τύπου. Θέτουμε το ποσοστό σφάλματος αλληλουχίας στο 0,1% σε περιοχές χωρίς ομο [24]. Το όριο για σημαντική ανίχνευση των μεταλλαγμένων αλληλομόρφων ορίστηκε χρησιμοποιώντας μια κατανομή Poisson του γνωστού ποσοστού σφάλματος, λαμβάνοντας υπόψη την κάλυψη που οδηγεί σε ένα όριο ανίχνευσης μεταξύ 0,3 και 0,5% μεταλλαγμένα αλληλόμορφα.

Αποτελέσματα

ασθενείς και δείγματα όγκων

από Σεπτέμβριος 2008-Απρίλιος 2009, έχουμε αναλύσει ασθενείς με ιστολογικά επιβεβαιωμένο NSCLC για την παρουσία των μεταλλάξεων στα εξόνια 18-21 του

EGFR

και τα εξώνια 2 και 3 του

KRAS

. Οι ασθενείς που συμμετείχαν σε αυτή τη μελέτη η ανάλυση μετάλλαξης δεν είναι αντιπροσωπευτικά για την επικράτηση αυτών των μεταλλάξεων στο NSCLC όπως είχαν εμπλουτιστεί για τις περιπτώσεις με αυξημένη πιθανότητα να είναι

EGFR

με θετικό στη μετάλλαξη με βάση τις ιστολογικές και κλινικά χαρακτηριστικά (π.χ., του πνεύμονα αδενοκαρκίνωμα στο ποτέ ή φως πρώην καπνιστές). Σε αυτή τη μελέτη συγκριτικής αξιολόγησης, έχουμε αναλύσει 24 όγκους από 22 ασθενείς (Πίνακας 1) για μια συστηματική σύγκριση των επιδόσεων ανίχνευσης μετάλλαξης της συμβατικής διδεοξυ και Pyrosequencing έναντι ενός της τεχνολογίας πιο ευαίσθητο αλληλουχίας, μαζικά παράλληλη αλληλουχίας [20]. Το περιεχόμενο κυττάρων όγκου καθενός από τα δείγματα αυτά εκτιμήθηκε από έναν παθολόγο και κυμαινόταν από 5% έως και 95%. Κλινικά δείγματα αποτελείται παραφίνη-ενσωματωμένες (FFPE) τμήματα ιστού του όγκου, καθώς και φρέσκα-κατεψυγμένα (FF) βιοψίες φορμόλη-σταθερό ή κυτταρολογική διαφάνειες που λαμβάνονται από πλευριτική συλλογή (Πίνακας 1).

Ανίχνευση κλινικά σχετικές μεταλλάξεις από μεθόδους διαφορετική ευαισθησία

Πραγματοποιήσαμε το πρώτο συμβατικό διδεόξυ-νουκλεοτίδιο αλυσίδας τερματισμού-based ( «Sanger») αλληλουχίας σε όλα αυτά τα δείγματα, γιατί, παρά τους περιορισμούς της, η μέθοδος αυτή εξακολουθεί να είναι η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη προσέγγιση για την ανίχνευση μετάλλαξης σε κλινικά δείγματα. Προσδιορίσαμε την ευαισθησία αυτής της τεχνικής προσδιορισμού αλληλουχίας να κυμαίνεται από 20-30% των μεταλλαγμένων αλληλομόρφων με ανάμιξη προϊόντα PCR του

KRAS

κυτταρικές σειρές μεταλλαγμένου και φυσικού τύπου (Συμπληρωματική εικ. S1). διαλογή Μετάλλαξη του 24 δείγματα όγκων με διδεοξυ ανάλυση αλληλουχίας αποκάλυψε μικρή σε πλαίσιο απαλοιφές νουκλεοτιδίου σε

EGFR

εξόνιο 19 (Πίνακας 1, Σχ. 1Α και 1Β) σε οκτώ δείγματα και μόνο ένα δείγμα (περίπτωση 03) έφερε το L858R σημειακή μετάλλαξη στο εξώνιο 21 του

EGFR

(Πίνακας 1). Επιπλέον, τρία δείγματα (περίπτωση 19, 24 και 30) είχαν μεταλλάξεις στο εξόνιο 2 του

KRAS

γονίδιο (Πίνακας 1).

αλληλουχίας ανάλυση των

EGFR

εξόνιο 19 διεξήχθη με διδεοξυ ανάλυση αλληλουχίας (ηλεκτροφορήματα στα αριστερά πάνελ), Pyrosequencing (pyrogams στα μεσαία πλαίσια) και μαζικά παράλληλη ανάλυση αλληλουχίας (προγράμματα στο δεξί πάνελ). (Α) Άγρια τύπου

EGFR

εξώνιο 19 ανιχνεύθηκε από τις τρεις τεχνικές αλληλούχισης? (Β) L747_A750del, P753S μετάλλαξη ανιχνεύτηκε από τις τρεις τεχνικές αλληλούχισης? (C) E746_A750del (Del-1Α) μετάλλαξη που προσδιορίζονται από Pyrosequencing και μαζικά παράλληλη αλληλουχίας? (D) E746_A750del (Del-1Β) ανιχνεύονται μόνο με μαζικά παράλληλη αλληλουχίας. del, διαγραφή? Mut, μετάλλαξη? WT, άγριου τύπου. Τα βέλη δείχνουν τη θέση του αναμένεται ειδικών σημάτων μετάλλαξη.

Η

Είμαστε δίπλα ελεγχθεί αν τα συμβατικά Pyrosequencing [22] ήταν σε θέση να επιβεβαιώσει μεταλλάξεις που βρέθηκαν με διδεοξυ ανάλυση αλληλουχίας και αν επιπλέον μεταλλάξεις θα μπορούσαν να βρεθούν με τη μέθοδο αυτή στην ομάδα των ασθενών δοκιμαστεί. Pyrosequencing προσφέρει οικονομικά αποδοτική ποσοτική ανίχνευση των παραλλαγών αλληλουχίας και δείχθηκε προηγουμένως να ενεργοποιήσετε ευαίσθητα

KRAS

ανίχνευση μεταλλάξεων σε καρκίνο του παχέος εντέρου [12], [25], [26]. Η αυξημένη ευαισθησία για την ανίχνευση σπάνιων παραλλαγών οφείλεται στην παραγωγή των μη παρεμβολής, μεμονωμένα σήματα για μεταλλάξεως και αγρίου-τύπου αλληλόμορφα. Ιδρύσαμε ευαίσθητα (5-10% μεταλλαγμένο αλληλόμορφο), να αναπαραχθεί και γραμμική δοκιμασίες Pyrosequencing για τις σημαντικότερες hotspots μετάλλαξη στο

EGFR

και

KRAS

(Συμπληρωματικές Εικ. S2, S3, S4, S5 , S6, S7, S8, S9, S10). Pyrosequencing επιβεβαίωσε όλες οι μεταλλάξεις ανιχνεύονται με διδεοξυ ανάλυση αλληλουχίας (Πίνακας 1). Ωστόσο, ανιχνεύσαμε επίσης τέσσερις επιπλέον μεταλλάξεις σε κοόρτη δείγμα μας που είχαν χάσει με διδεοξυ ανάλυση αλληλουχίας (Πίνακας 1, Σχ. 1C και Συμπληρωματικό Σχ. S3A, S6B, S9A). Για παράδειγμα, εντοπίσαμε τη μετάλλαξη αντίστασης erlotinib, Τ790Μ, σε δείγμα όγκου 10 (80% περιεκτικότητα των καρκινικών κυττάρων) που λαμβάνεται κατά τη διάρκεια της υποτροπής (Συμπληρωματικές Εικ. S6B) και το δείγμα αυτό έτρεφε επίσης οι L747_S752del_P753S διαγραφή ανιχνεύθηκε αρχικά από διδεσοξυνουκλεοτιδίων (Πίνακας 1 και Σχ. S4C). Βρήκαμε επίσης μια προηγουμένως απαρατήρητα υποκατάστασης G12A στο εξόνιο 2 του

KRAS

σε δείγμα 11 (50% περιεκτικότητα των καρκινικών κυττάρων, συμπληρωματικό σχήμα. S9A) και επιβεβαίωσε την εν λόγω μετάλλαξης με υποκλωνοποίηση του

KRAS

εξόνιο 2 αμπλικόνια και επακόλουθη ανάλυση αλληλουχίας διδεοξυ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

EGFR

εξόνιο 19 πυρογραμμάτων του δείγματος 27 (40% των κυττάρων του όγκου) και του δείγματος 05 (50% καρκινικά κύτταρα) εμφάνισαν σήματα φθορισμού ενδεικτικό για την παρουσία μεταλλάξεων που ήταν σημαντικά πάνω από το επίπεδο του πειραματικού θορύβου (Σχ. 1C και Συμπληρωματική Σχ. S3A). Θραύσμα μήκους αναλύσεις

EGFR

εξόνιο 19 προϊόντα PCR επικυρωθεί αυτή τη διαγραφή σε δείγμα 27 (Συμπληρωματικές Εικ. S11).

Τέλος, έχουμε απασχολούνται μαζικά παράλληλη συστοιχία με βάση Pyrosequencing-από-σύνθεση [ ,,,0],20] για την επικύρωση των αποτελεσμάτων μετάλλαξη που λαμβάνονται από συμβατική διδεόξυ και Pyrosequencing. Εμείς αλληλουχία όλα τα 24 δείγματα για μία μέση απόδοση 1079 × και ελάχιστη κάλυψη 600 × ανά εξώνιο και το δείγμα. Η ανάλυση των δεδομένων επιβεβαίωσαν την παρουσία του

EGFR

και

KRAS

μεταλλάξεις σε 13 δείγματα εντοπίστηκαν αρχικά από τους δύο, διδεσοξυνουκλεοτιδίων και Pyrosequencing (Πίνακας 1). Επιπλέον, μαζικά παράλληλη αλληλουχίας επικυρωθεί επίσης τα τέσσερα επιπλέον μεταλλάξεις που ανιχνεύτηκαν νεωστί από ευαίσθητες Pyrosequencing:

EGFR

εξόνιο 19 διαγραφές σε δείγμα 05 και 27, την G12A μετάλλαξη του

KRAS

σε δείγμα 11 και η μετάλλαξη T790M του

EGFR

σε δείγμα 10 (Πίνακας 1). Η παράλληλη φύση αυτής της προσέγγισης αλληλούχισης ενεργοποιημένη ακριβή ποσοτικοποίηση και ταυτοποίηση αυτών των παραλλαγών χαμηλής συχνότητας. Συγκεκριμένα, εντοπίσαμε το εξόνιο 19 μετάλλαξης στο δείγμα 05 για να είναι ένα 9-bp διαγραφή εντός πλαισίου που κωδικοποιεί την διαγραφή-υποκατάσταση αμινοξέος E746_R748del_A750, σε συχνότητα 11% του 1315 αναφέρει (Πίνακας 1). Επιπλέον, προσδιορίζεται ποσοτικά ένα 12-bp διαγραφή (E746_A750) να εμφανίζονται με συχνότητα από 11% των 854 διαβάζει σε δείγμα 27 (Εικ. 1 C). Η υποκατάσταση G12A σε δείγμα 11 ήταν παρούσα στο 21% των 1358 διαβάζει και η αντίσταση Τ790Μ μετάλλαξη σε δείγμα 10 εμφανίστηκαν σε συχνότητα 20% από 909 διαβάζει (Πίνακας 1).

Εκτός από την επικύρωση το προηγουμένως ανιχνεύονται μεταλλάξεις παράλληλα αλληλουχίας προσδιορίζονται

EGFR

εξόνιο 19 διαγραφές σε δείγμα 31 και 13α, οι οποίες ήταν δυσδιάκριτες από πειραματικό θόρυβο της συμβατικής διδεοξυ και αναλύσεις Pyrosequencing. Παράλληλη ανάλυση αλληλουχίας επέτρεψε την ανίχνευση ενός E746_A750del σε δείγμα 31 σε συχνότητα 6% του 1081 αναφέρει (Πίνακας 1 και Εικ. 1 D). Είναι αξιοσημείωτο ότι, αυτό το δείγμα είχε εκτιμηθεί ότι περιέχει κύτταρα όγκου 60% με ιστοπαθολογική (Πίνακας 1). Ομοίως, flowgrams του 13α δείγματος (κύτταρα όγκου 5%) αποκάλυψε ένα 12-bp διαγραφή (L747_A750del_T751P) σε συχνότητα περίπου 8% των 658 διαβάζει (Πίνακας 1). Αυτή η μετάλλαξη ήταν ταυτόσημη με εκείνη που έχει ήδη ανιχνευθεί με διδεοξυ ανάλυση αλληλουχίας σε ένα άλλο δείγμα του ίδιου ασθενούς (δείγματα 13β) με υψηλότερη περιεκτικότητα όγκου (70%), που λαμβάνεται κατά τη διάρκεια της υποτροπής (Πίνακας 1). Έτσι, πέρα ​​από την επικύρωση όλων των άλλων μεταλλάξεων που είχε κληθεί με διδεοξυ ανάλυση αλληλουχίας (n = 12) και Pyrosequencing (n = 16), μαζικά παράλληλος αλληλούχιση προσδιόρισε δύο περαιτέρω μεταλλαγμένα δείγματα που είχαν χαθεί από τις άλλες δύο μεθόδους λόγω της ανεπαρκούς ευαισθησίας . (Πίνακας 1 και Πίνακας Συμπληρωματική S5)

επόμενο αναλύεται υψηλής ποιότητας 454 αλληλουχίας διαβάζει (Phred βαθμολογίας & gt? 30), με στόχο την ανίχνευση μεταλλάξεων Τ790Μ συμβαίνουν σε χαμηλή συχνότητα σε δείγματα που λαμβάνονται πριν από τη θεραπεία. Το εξόνιο 20 καλύφθηκε ένα μέσο όρο βάθος 1018 διαβάζει στην περιοχή του κωδικονίου 790. Σε ασθενείς των οποίων οι όγκοι είχαν μία διαγραφή στο εξώνιο 19 ή L858R παρατηρήσαμε σημαντικά υψηλότερο (ρ = 0,03) τον αριθμό των διαβάζει περιέχει την μετάλλαξη Τ790Μ σε σύγκριση με ασθενείς με άγριου τύπου

EGFR

(EGFR mut: μέση τιμή = 2,5 /1000? εύρος 0-7,5 /1000? EGFR βάρος:. σημαίνουν 0.8 /1000 (μηδέν έως 2,3 /1000) Σημειώνουμε ότι αυτές οι συχνότητες αλληλόμορφων είναι το εύρος της τεχνολογικής όριο της ακρίβειας. Ωστόσο, ο αριθμός των διαβάζει με Τ790Μ ήταν πάνω από το όριο για μετάλλαξη καλώντας στο 27% των δειγμάτων με απαλοιφή στο εξόνιο 19 ή L858R αλλά σε καμία δείγμα χωρίς

EGFR

μετάλλαξη (Συμπληρωματικές Εικ. S12).

στο σύνολό τους, μαζικά παράλληλη αλληλουχίας εντόπισε συνολικά 18 μεταλλάξεις στο

EGFR

και

KRAS

με αποτέλεσμα μια ευαισθησία 67% για διδεόξυ αλληλουχίας και 89% για Pyrosequencing (Πίνακας 1 και Πίνακας Συμπληρωματική S5). Παρά το περιορισμένο μέγεθος του συνόλου του δείγματος μας, τα αποτελέσματα αυτά υπογραμμίζουν τη δραματική έλλειψη ευαισθησίας των διδεσοξυνουκλεοτιδίων στην ανίχνευση κλινικών μετάλλαξης.

ευαισθησία ανίχνευσης μετάλλαξης ως συνάρτηση του όγκου του περιεχομένου των κυττάρων

περιεχόμενο Tumor-κυττάρων είναι μία κρίσιμη παράμετρος για την εκτέλεση της ανίχνευσης μετάλλαξης στον καρκίνο [20] και αποτελεί τη βάση για τον εμπλουτισμό καρκινικών κυττάρων μικροδιατομής που βασίζονται. Ως εκ τούτου, επιδιώκεται να αναλυθεί η απόδοση των τριών μεθόδων ανάλυσης μετάλλαξης ως συνάρτηση του ιστοπαθολογικά εκτιμώμενη περιεκτικότητα καρκινικών κυττάρων. Η μέση περιεκτικότητα του όγκου των δειγμάτων προσδιορίζεται ως μεταλλαγμένο με διδεοξυ ανάλυση αλληλουχίας ήταν 78% (εύρος 35-95%) και 71% (εύρος 35-95%) στην περίπτωση του Pyrosequencing (Εικ. 2Α). Όλα τα δείγματα, στα οποία διδεσοξυνουκλεοτιδίων είχε χάσει μεταλλάξεις, περιείχε 80 κύτταρα% του όγκου ή λιγότερο. Αντίθετα, τα δείγματα στα οποία Pyrosequencing είχε χάσει μεταλλάξεις είχε περιεχόμενο όγκου ή λιγότερο (Εικ. 2Α) 60%.

(Α) Συσχέτιση μεταξύ της εκτιμώμενης περιεχόμενο των καρκινικών κυττάρων και την πραγματική συχνότητα των μεταλλαγμένα αλληλόμορφα καθορίζεται από μαζικά , παράλληλων δεδομένων αλληλούχισης. Μαύρο, μεταλλάξεις που ανιχνεύονται από διδεόξυ και Pyrosequencing? Πράσινο, μεταλλάξεις που ανιχνεύονται από Pyrosequencing, αλλά έχασε από διδεσοξυνουκλεοτιδίων? Κόκκινο, μεταλλάξεις που ανιχνεύονται μόνο με παράλληλη αλληλουχίας. (Β) Ευαισθησία των διδεσοξυνουκλεοτιδίων, Pyrosequencing και μαζικά παράλληλη αλληλουχίας σε ασθενείς με επιβεβαιωμένη κλινική ανταπόκριση στη θεραπεία με erlotinib.

Η

Είμαστε δίπλα αξιολόγησε τη συσχέτιση μεταξύ του περιεχομένου καρκινικών κυττάρων και η συχνότητα των μεταλλαγμένα αλληλόμορφα, όπως καθορίζεται με μαζικά παράλληλος αλληλουχίας (Σχ. 2Α). Παρατηρήσαμε μια χαμηλή συσχέτιση μεταξύ της προσδιορίζεται αναλυτικώς συχνότητα αλληλόμορφο και το περιεχόμενο καρκινικών κυττάρων (

r

2

= 0.27,

σ

= 0,029). Αξιοσημείωτα, τα όρια ανίχνευσης των διαφορετικών προσεγγίσεων προσδιορίζεται με μέτρηση των μεταλλαγμένων και αλληλόμορφα άγριου τύπου ανιχνεύθηκε με μαζικά παράλληλο αλληλούχιση στις πρωτογενείς όγκους ήταν πολύ παρόμοια με αυτά που παρατηρήθηκαν στα αρχικά πειράματα αλληλόμορφο ανάμιξης (Συμπληρωματικές Εικ. S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, S9, S10): 29% για διδεοξυ αλληλουχίας και 11% για Pyrosequencing (Πίνακας 1 και το Σχήμα 2Α).. Οι συχνότητες αλληλομόρφων των μεταλλάξεων που βρέθηκαν από Pyrosequencing αλλά όχι διδεσοξυνουκλεοτιδίων κυμάνθηκε μεταξύ 11% και 21% (Σχ. 2Α). Μεταλλάξεις ανιχνεύονται μόνο με μαζικά παράλληλο αλληλούχιση έγινε σε αλληλόμορφο συχνότητες μικρότερες από 10% (Πίνακας 1 και Εικ. 2Α). Εντυπωσιακά, η περιεκτικότητα του όγκου σε αυτές τις περιπτώσεις είχε εκτιμηθεί ότι είναι 60% και 5%, αντίστοιχα. Έτσι, ιστοπαθολογική εκτιμήσεις του περιεχομένου καρκινικών κυττάρων δεν είναι προβλεπτικά της συχνότητας των μεταλλαγμένων αλληλομόρφων, ενώ η ικανότητα για την ανίχνευση μεταλλάξεων περιορίζεται από την συχνότητα αλληλίου αλλά όχι από το περιεχόμενο των κυττάρων του όγκου.

μεταλλάξεις του EGFR και της κλινικής έκβασης

Προηγούμενες αναλύσεις του συλλόγου

EGFR

μεταλλάξεις και κλινικό όφελος που προκαλείται από το

EGFR

αναστολή έχει κατά καιρούς έδωσε αντιφατικά αποτελέσματα από το γεγονός ότι μερικές μελέτες έχουν αναφέρει την έλλειψη τέτοιας ένωσης [ ,,,0],27], [28], [29] Τέτοιες αντιφάσεις θα μπορούσε να προκύψει από τη μη ανίχνευση μεταλλάξεων με επαρκή ευαισθησία και ακρίβεια. Είναι σημαντικό, στην ομάδα μας, μόνο μαζικά παράλληλη αλληλουχίας ήταν σε θέση να εντοπίσει μια ευαισθητοποίηση

EGFR

μετάλλαξη στο

όλα

ασθενείς που είχαν υποστεί μερική ανταπόκριση (σύμφωνα με τα κριτήρια RECIST) μετά από αγωγή με erlotinib ( Σχ. 2Β). Αντιθέτως, μόνο 7 από τους 11 ασθενείς με επιβεβαιωμένη PR ανιχνεύθηκαν με διδεοξυ ανάλυση αλληλουχίας και 9 από τους 11 εντοπίστηκαν από Pyrosequencing (Σχ. 2Β). Έτσι, παρά το περιορισμένο μέγεθος της ομάδα μας ασθενή, τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν την ιδέα ότι οι δραματικές διαφορές στην ευαισθησία παραποιήσει σθεναρά τη συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας του

EGFR

μεταλλάξεις και την αντιμετώπιση της erlotinib. Οι ασθενείς με

EGFR

όγκους -wild τύπου και

KRAS

μεταλλαγμένου όγκους που είχαν λάβει erlotinib παρουσίασε σταθερή ή προοδευτική νόσο (Πίνακας 1), σύμφωνα με προηγούμενες αναφορές [30].

Συζήτηση

Εδώ, δείχνουμε πως η περιορισμένη ευαισθησία των μεθόδων που εφαρμόζονται ευρέως σε διαγνωστικά κλινικά μετάλλαξη θα μπορούσε να οδηγήσει σε μια κρίσιμη ανακρίβεια στην γενετική διαστρωμάτωση των ασθενών. Ειδικότερα, η χαμηλή ευαισθησία του προσδιορισμού αλληλουχίας διδεοξυ οδήγησε σε λανθασμένες διαγνώσεις σε 6 από 24 δείγματα καρκίνου του πνεύμονα. Εάν η παρουσία ενός

EGFR

μετάλλαξη ήταν το κριτήριο ένταξης για θεραπεία με

EGFR

αναστολείς, τέσσερις ασθενείς δεν θα έχουν λάβει την κατάλληλη θεραπεία. Έτσι, παρά το περιορισμένο μέγεθος του συνόλου του δείγματος μας, τα αποτελέσματα αυτά υπογραμμίζουν την ανεπάρκεια των διδεσοξυνουκλεοτιδίων για τη διάγνωση μετάλλαξη κλινική γονίδιο του καρκίνου. Αντίθετα, τα συμβατικά Pyrosequencing προσφέρει αυξημένη ευαισθησία με μόνο δύο ασθενείς που κακοί. Επιπλέον, μαζικά παράλληλη αλληλουχίας γερά και με ακρίβεια εντοπιστεί όλες οι μεταλλάξεις που υπάρχουν στο σύνολο δεδομένων. Δείχνουμε επίσης ότι παράλληλα αλληλουχίας μπορεί να ανιχνεύσει προϋπάρχουσες μεταλλάξεις Τ790Μ σε ένα κλάσμα 27% των

EGFR

μεταλλαγμένου ασθενείς [31]. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν το συμπέρασμα ότι μαζικά παράλληλη αλληλουχίας είναι η πιο ευαίσθητη τεχνολογία που διατίθενται σήμερα στην διαγνωστική κλινική μετάλλαξη και δείχνουν ότι Pyrosequencing θα μπορούσε να είναι μια εναλλακτική λύση για διδεόξυ αλληλούχιση.

Ενώ πολλές τεχνικές έχουν προκύψει τα τελευταία χρόνια για να ταιριάζει με η ολοένα αυξανόμενη ανάγκη να παρέχουν ακριβείς κλινικές μετάλλαξη αναλύσεις για ογκολόγους, κανένα από αυτά δεν έχουν συστηματικά συγκρίνονται με μαζικά παράλληλη αλληλουχίας, η μέθοδος με την υψηλότερη ευαισθησία για κλινική ανίχνευση μεταλλάξεων μέχρι σήμερα. Επεκτείνοντας διαφορές, όπως αυτές που παρατηρήθηκαν σε αυτή τη μελέτη του μεγάλου αριθμού των ασθενών με καρκίνο παγκοσμίως δείχνει ότι πολλοί ασθενείς γίνονται κακοί κάθε χρόνο. Έτσι, αναπτύχθηκε προσεκτικά διαγνωστικές προσεγγίσεις (περιλαμβανομένης της διεξοδικής επικύρωσης κατά μαζικά παράλληλο προσδιορισμό της αλληλουχίας) θα βοηθήσει τη στόχευση αποτελεσματική θεραπεία στα δεξιά πληθυσμό ασθενών.

μικροανατομίας έχει εφαρμοστεί ευρέως για την αύξηση του κλάσματος των κυττάρων του όγκου σε ένα δεδομένο δείγμα, προκειμένου για την ενίσχυση της ευαισθησίας των διδεσοξυνουκλεοτιδίων. Ταυτοποίηση των περιοχών όγκου πλούσιου αποτελεί προϋπόθεση για τέτοια διαδικασία. Βρήκαμε, όμως, μόνο ένα χαμηλό συσχέτιση του περιεχομένου καρκινικών κυττάρων και η συχνότητα των μεταλλαγμένων αλληλομόρφων. Υποθέτουμε ότι μια ρουτίνα έρευνα των ιστοπαθολογικών τμήματα δεν μπορεί να εκτιμήσει με ακρίβεια το βαθμό της «μόλυνση» του μεταλλαγμένου αλληλόμορφου από υγιή κύτταρα των παρευρισκομένων (π.χ. φυσιολογικό ιστό πνεύμονα), ότι επισκιάζει την συχνότητα του μεταλλαγμένου αλληλόμορφου. Έτσι, μικροανατομή μπορεί μόνο εν μέρει να σώσει την περιορισμένη ευαισθησία των διδεσοξυνουκλεοτιδίων και θα πρέπει, ως εκ τούτου, επίσης, να επικυρώνονται προσεκτικά έναντι μαζικά παράλληλη αλληλουχίας.

Μια άλλη συχνά συζητηθεί το θέμα είναι το ζήτημα του κατά πόσον γονότυπου ή αλληλουχίας μπορεί να είναι η βέλτιστη στρατηγική για την κλινική ανίχνευση μεταλλάξεων στον καρκίνο. Ακόμα κι αν τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι Pyrosequencing είναι μια ευαίσθητη, ακριβής και αποδοτική μέθοδος για την ανάλυση της συντριπτική πλειοψηφία των δειγμάτων με περιεκτικότητα όγκου του 20-70%, και άλλες μέθοδοι, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που βασίζονται σε γονοτυπική, μπορεί να εκτελέσει εξίσου καλά. Σε περίπτωση που ήδη γνωστών μεταλλάξεων hot-spot κλειδωμένο νουκλεϊκό οξύ (LNA) προσεγγίσεις είναι σε θέση να ανιχνεύουν αλλήλια μεταλλαγμένο εμφανίζονται σε συχνότητες τόσο χαμηλές όσο 0,1% [14], [16]. Άλλες τεχνικές που μπορεί να έχουν αξία στην κλινική εφαρμογή περιλαμβάνουν ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας το

EGFR

αντισώματα μετάλλαξη ειδικά [32] ή την εφαρμογή των μοριακών φάρων σε συνδυασμό με φθορίζουσα απεικόνιση [33]. Ωστόσο, είναι σημαντικό να έχουμε κατά νου ότι η εγγενής αδυναμία των μεθόδων προσδιορισμού του γονότυπου για να καλύψει όλες τις κλινικά σημαντικές μεταλλάξεις, προσθέτει σε κάθε αναλυτική αναισθησία. Με βάση αυτές τις εκτιμήσεις, είμαστε υπέρ της αλληλουχίας που βασίζεται σε ανίχνευση μεταλλάξεων πάνω του γονότυπου. Αν και το μέγεθος του δείγματος μας είναι πολύ περιορισμένα για να υπολογίσει συνολικά ευαισθησία και ειδικότητα της ανίχνευσης μετάλλαξης, πιστεύουμε ότι η εντυπωσιακή κατωτερότητας των συμβατικών αλληλουχίας Sanger για την ανίχνευση θεραπευτικά σχετικές ογκογονίδιο μεταλλάξεις είναι σημαντικό ενδιαφέρον για την μοριακή παθολόγους και κλινικές ογκολόγους.

Περιληπτικά, έχουμε δείξει πώς οι τεχνολογίες προσδιορισμού αλληλουχίας με κατώτερη ευαισθησία μπορεί να αποτύχει να ανιχνεύσει κλινικά σχετική ογκογονίδιο μεταλλάξεις σε ασθενείς με καρκίνο. Ως εκ τούτου, στο συμπέρασμα ότι οποιαδήποτε νέα μέθοδος για τη διάγνωση κλινικής μετάλλαξης θα πρέπει να επικυρωθεί διεξοδικά κατά μαζικά παράλληλη αλληλουχίας προκειμένου να παράσχει μια σωστή γενετική ανάλυση ως βάση για μοριακά στοχευμένη θεραπεία.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Ευαισθησία μελέτη των διδεσοξυνουκλεοτιδίων και Pyrosequencing. Διαφορετικά μείγματα των προϊόντων της PCR από άγριου-τύπου ή G12S κυτταρικές γραμμές μεταλλάγματος NSCLC χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό του ορίου ευαισθησίας του διδεοξυ αλληλούχισης (~20-30%) και Pyrosequencing (~ 5%). Τα ειδικά σήματα Μετάλλαξη σημειώνονται με αστερίσκους στο διδεοξυ ηλεκτροφορήματα (αριστερά πάνελ) και κόκκινα βέλη στα προγράμματα (δεξιά πάνελ). Mut, μετάλλαξη? . WT, άγριου τύπου

doi: 10.1371 /journal.pone.0019601.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Ευαισθησία και δοκιμών γραμμικότητα του

EGFR

δοκιμασία Pyrosequencing εξόνιο 19. Μείγματα E746_A750del (Del-1a) μεταλλάξεως και αγρίου-τύπου προϊόντα PCR των κυτταρικών γραμμών NSCLC χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση της όριο ανίχνευσης μετάλλαξης και γραμμικότητα της δοκιμασίας. Η δοκιμασία είναι ευαίσθητη σε τουλάχιστον 5 έως 10% των μεταλλαγμένων αλληλομόρφων. Οι μετάλλαξη ειδικά σήματα που χαρακτηρίζεται από κόκκινα βέλη. del, διαγραφή? Mut, μετάλλαξη? . WT, άγριου τύπου

doi: 10.1371 /journal.pone.0019601.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

Pyrosequencing ανάλυση των

EGFR

εξόνιο 19 σε δείγματα όγκων NSCLC. (Α)

EGFR

εξόνιο 19 διαγραφή εντοπίστηκαν σε δείγμα με το περιεχόμενο των κυττάρων του όγκου κατά 50% που ήταν προηγουμένως δεν προσδιορίζονται από διδεσοξυνουκλεοτιδίων? (Β) Δεν παρατηρήθηκε σημαντική ανίχνευση μεταλλάξεων σε δείγμα 13a με περιεκτικότητα σε καρκινικό κύτταρο 5%. Αναμενόμενη θέση των ειδικών σημάτων μετάλλαξη χαρακτηρίζεται από κόκκινο βέλος. del, διαγραφή? Mut, μετάλλαξη? . WT, άγριου τύπου

doi: 10.1371 /journal.pone.0019601.s003

(ΔΕΘ)

Εικόνα S4.

πυρογραμμάτων του

EGFR

εξόνιο 19 μεταλλαγμένη κυτταρική γραμμή και όγκου δείγματα NSCLC. (Α) Del-Β μετάλλαξη σε κυτταρική σειρά HCC827? (Β-D) Tumor δείγματα με περιεκτικότητα σε κύτταρο υψηλής όγκου που επιτρέπουν την ακριβή χαρακτηρισμό του ατόμου μετάλλαξης?