You must be logged into post a comment.
Αφηρημένο
οισοφάγου καρκίνος είναι μία από τις πιο κοινές μορφές καρκίνου, και το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών είναι λιγότερο από 10%, λόγω της έλλειψης αποτελεσματικών θεραπευτικών παραγόντων. Αυτή η μελέτη ήταν να αξιολογήσει αντικαρκινική δράση των Ec-LDP-Hr-AE, που αναπτύχθηκε πρόσφατα διπλής ειδικότητας ενεδιύνιο-ενεργοποιείται πρωτεΐνη σύντηξης που στοχεύουν τόσο του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) και ο παράγοντας υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού 2 (HER2), για τον καρκίνο του οισοφάγου. Η πρωτεΐνη σύντηξης Ec-LDP-Hr-ΑΕ αποτελείται από δύο συνδέτες ολιγοπεπτιδίου και ενός ενεδιύνιο αντιβιοτικό lidamycin (LDM) για θανάτωση κυττάρων σύνδεσης υποδοχέα και, αντίστοιχα. Η τρέχουσα μελέτη κατέδειξε ότι Ec-LDP-Hr είχαν υψηλή συνάφεια να δεσμεύεται με οισοφαγικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (ESCC) κύτταρα, και η πρωτεΐνη σύντηξης ενεδιύνιο απενεργοποιείται Ec-LDP-Hr-AE έδειξε ισχυρή κυτοτοξικότητα σε κύτταρα ESCC με διαφορική έκφραση του EGFR και HER2. Ec-LDP-Hr-AE θα μπορούσε να προκαλέσει σημαντική G2-M σύλληψης στις EC9706 και KYSE150 κύτταρα και αυτό επάγεται επίσης απόπτωση σε κύτταρα ESCC σε μία δόση-εξαρτώμενο τρόπο. δοκιμασίες κηλίδας Western έδειξε ότι Ec-LDP-Hr-AE προωθούνται κασπάσης-3 και κασπάσης-7 δραστηριότητες, καθώς και διάσπαση PARP. Επιπλέον, Ec-LDP-Hr-AE ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω φθίνουσα φωσφορυλίωση του EGFR και HER2, και περαιτέρω εξασκείται αναστολή της ενεργοποίησης των κατάντη μορίων σηματοδότησης τους.
In vivo
, σε μία ανεκτή δόση, Ec-LDP-Hr-AE ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου κατά 88% όταν χορηγήθηκε σε γυμνούς ποντικούς που φέρουν ανθρώπινο κύτταρο ESCC KYSE150 ξενομοσχεύματα. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Ec-LDP-Hr-ΑΕ εμφάνισε ισχυρή αποτελεσματικότητα αντι-Caner για ESCC, γεγονός που υποδηλώνει ότι θα μπορούσε να είναι μια πολλά υποσχόμενη υποψήφιος για στοχευμένη θεραπεία του καρκίνου του οισοφάγου
Παράθεση:. Guo XF, Zhu XF, Γιανγκ WC , Zhang SH, Τζεν YS (2014) Μια EGFR /HER2-Διπλά ειδικά και πρωτεΐνη ενεδιύνιο ενέργειας από σύντηξη Δείχνει υψηλή αποτελεσματικότητα κατά του καρκίνου του οισοφάγου. PLoS ONE 9 (3): e92986. doi: 10.1371 /journal.pone.0092986
Επιμέλεια: Karl X. Chai, University of Central Florida, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής
Ελήφθη: 29, Νοέμ του 2013? Αποδεκτές: 27, Φεβρουαρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 24 Μάρτη 2014
Copyright: © 2014 Guo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται
Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται εν μέρει από το Ερευνητικό Πρόγραμμα Φυσικών Επιστημών του τμήματος Εκπαίδευσης της επαρχίας Henan, Κίνα (Αρ 12B350004 να ΓΑ), Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81202447 έως ΓΑ, https://www.nsfc.gov. cn /Portal0 /default152.htm), και μια επιχορήγηση από το USCACA (αρ USCACA-TIGM-001 για να WCY). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου
Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα
Εισαγωγή
καρκίνος του οισοφάγου είναι μία από τις πιο κοινές μορφές καρκίνου, καθώς και η έκτη πιο κοινή αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους στον κόσμο. Οι βόρειες περιοχές στην επαρχία Henan της Κίνας έχουν την υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης καρκίνου του οισοφάγου, ιδιαίτερα το καρκίνωμα του οισοφάγου από πλακώδες επιθήλιο (ESCC) [1], [2]. Αν και πολλές επιλογές επεξεργασίας είναι πλέον διαθέσιμα, συμπεριλαμβανομένης της χειρουργικής επέμβασης, συνδυασμένες στρατηγικές τροπικότητα όπως πριν ή μετά τη λειτουργία χημειοθεραπεία με ή χωρίς ακτινοβολία, και οριστική chemoradiation, η πρόγνωση του καρκίνου του οισοφάγου είναι φτωχή με ποσοστό επιβίωσης 5-χρόνια λιγότερο από το 10% [3] – [5]. Λόγω των μειονεκτημάτων των χημειοθεραπευτικών παραγόντων, όπως σοβαρές τοξικές παρενέργειες, η υψηλή συχνότητα της ανθεκτικότητας στα φάρμακα, και λίγο επιδράσεις στην επιβίωση, υπάρχει επείγουσα ανάγκη για την ανάπτυξη νέων αποτελεσματικών θεραπευτικών παραγόντων, στόχευση συγκεκριμένων μοριακών ανωμαλιών στο οισοφάγου . καρκινώματα, ειδικά εκείνοι στον υποδοχέα ανθρώπινου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (HER) της οικογένειας [6]
Η οικογένεια HER υποδοχέων τυροσινικής κινάσης περιέχει τέσσερα μέλη: HER1 /EGFR, HER2 /neu, HER3 και HER4. Η σύνδεση του συνδέτη στους υποδοχείς οδηγεί σε διμερισμό του υποδοχέα, τότε ξεκινά μια σειρά ενδοκυτταρικών γεγονότων που τελικά προάγουν την κυτταρική ανάπτυξη, πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση και μετανάστευση [7]. Η υπερέκφραση του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) και ο παράγοντας του υποδοχέα του ανθρώπινου επιδερμικού αυξητικού 2 (HER2) έχει παρατηρηθεί σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους, όπως του πνεύμονα, της κεφαλής και του τραχήλου, του μαστού, των ωοθηκών, και έχει αποδειχθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο σε αμφότερες σχηματισμό και την εξέλιξη πολλών συχνά εμφανιζόμενων καρκίνων [8]. Στον καρκίνο του οισοφάγου, EGFR υπερέκφραση εμφανίζεται στο 30% -90% [9], [10], και HER2 κυμαίνεται υπερέκφραση από 19% -43% [11]. Επιπλέον, η υπερέκφραση του EGFR τόσο και HER2 παρατηρήθηκε στο 18% -25% των ασθενών με καρκίνο του οισοφάγου [12], [13]. Ως εκ τούτου, ένας παράγοντας που στοχεύει τόσο EGFR και HER2 θα εμφανίζουν πιο αποτελεσματική θεραπευτικά αποτελέσματα σε ασθενείς με καρκίνο του οισοφάγου.
Ec-LDP-Hr-AE, μια πρωτεΐνη σύντηξης διπλής ειδικότητας που αποτελείται από δύο ολιγοπεπτιδίων (Ec, 22 αμινοξέα του EGF και HR, VH CDR3 περιοχή της αντι-HER2 C6.5 αντίσωμα) ειδικό για EGFR και HER2, και ένα ενεδιύνιο αντιβιοτικό lidamycin (LDM), κατασκευάστηκε και αναφέρθηκαν σε προηγούμενη μελέτη μας [14]. Έδειξε ισχυρή κυτταροτοξικότητα σε μια ποικιλία κυττάρων καρκινώματος
in vitro
, και ήταν πολύ αποτελεσματική στην αναστολή της ανάπτυξης των ανθρώπινων ωοθηκών Caner SK-OV-3 ξενομοσχεύματα
in vivo
. Ωστόσο, η αντικαρκινική αποτελεσματικότητα της Ec-LDP-Hr-ΑΕ για τον καρκίνο του οισοφάγου δεν είναι καλά μελετημένη. Σε αυτή τη μελέτη, όχι μόνο μετρήθηκε η συγγένεια δέσμευσης της πρωτεΐνης σύντηξης Ec-LDP-Hr να οισοφάγου κύτταρα Caner, αλλά εκτίμησε επίσης την ισχύ των ενεργοποιημένο σύντηξης πρωτεϊνών
in vitro
και
in vivo
. Τα αποτελέσματα των Ec-LDP-Hr-ΑΕ για την κατανομή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης προσδιορίστηκαν επίσης. Για τη διαλεύκανση των μηχανισμών που εμπλέκονται στην κυτταροτοξικότητα και την απόπτωση-επαγωγή Ec-LDP-Hr-ΑΕ, την έκφραση των μορίων που σχετίζονται με την απόπτωση και βασικά μόρια στα μονοπάτια σηματοδότησης HER αναλύθηκαν επίσης.
Υλικά και Μέθοδοι
Ηθική δήλωση
Γυναίκα BALB /c γυμνά ποντίκια (6-8 εβδομάδες) που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα είχαν αγοραστεί από το Ινστιτούτο Εργαστήριο ζώων Επιστημών, κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών, και φιλοξενείται κάτω από ειδικά παθογόνα -δωρεάν συνθήκες. Το πειραματικό πρωτόκολλο εγκρίθηκε από τα πειράματα σε ζώα επιτροπή δεοντολογίας του Ινστιτούτου Φαρμακευτικών Βιοτεχνολογίας, Κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών.
Οι κυτταρικές σειρές και τον πολιτισμό
Ανθρώπινο οισοφάγου κυτταρικές γραμμές καρκινώματος EC1, ECa109, EC9706 και KYSE150 και κυτταρική σειρά ινοβλαστών ποντικού ΝΙΗ 3Τ3 ελήφθησαν από την Cell Κέντρο Ένωσης Ιατρικό Κολέγιο του Πεκίνου, Κίνα, και καλλιεργήθηκαν υπό υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO
2 στους 37 ° C σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό ( FBS, Gibco, Carlsbad, CA, USA), 2 mmol /L γλουταμίνη, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη.
Αντιδραστήρια και αντισώματα
(3- (4, 5-διμεθυλ-θειαζολ-2-υλ) -2, 5-dipheny-ltetrazolium βρωμίδιο (ΜΤΤ), ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) και isoprophyl-β-D-thiogalactopranoside (IPTG) αγοράστηκαν από την Sigma Chemical Aldrench Inc. (St. Louis, ΜΟ, USA). Όλα τα αντισώματα, συμπεριλαμβανομένων φωσφορυλιωμένων-HER2, -EGFR, -Akt, -extracellular ρυθμιζόμενη πρωτεΐνη κινάση (ΕΚΚ),-p38 που ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ), -C-Jun κινάση Ν-τερματικό ( JNK) μονοκλωνικά αντισώματα και αντι-EGFR, -HER2, -Akt, -ERK, -p38MAPK, -JNK, -caspase 3, -caspase 7, -cleaved αντισώματα PARP ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ, USA). αντισώματα αντι-β-ακτίνης αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Η υπεροξειδάση χράνου (HRP) κατσίκας αντι-κουνελιού /αντισώματα ποντικού επίσης αγοράστηκαν από με Cell Signaling Technology.
Παρασκευή ενεργοποιημένο πρωτεϊνών σύντηξης
Η παρασκευή πρωτεΐνης σύντηξης διπλής ειδικότητας Ec-LDP- hr-ΑΕ και πρωτεΐνες σύντηξης αντίστοιχη μονοδυναμικοί της Ec-LDP-ΑΕ και LDP-hr-ΑΕ περιγράφηκαν στην προηγούμενη μελέτη μας [14]. Εν συντομία, τα θραύσματα DNA που κωδικοποιούν για Ec-LDP-Hr, EC-LDP και LDP-Hr ελήφθησαν με τεχνικές κλωνοποίησης PCR και DNA, και στη συνέχεια εισήχθησαν εντός φορέα pET30a να δημιουργηθούν τα πλασμίδια έκφρασης ΡΕΤ
Ec-LDP- hr
, ΡΕΤ
Ec-LDP
και το κατοικίδιο ζώο
LDP-hr
. Αυτά τα πλασμίδια στη συνέχεια μετασχηματίστηκαν σε
Escherichia coli BL21
(
DE3
), και οι πρωτεΐνες σύντηξης εκφράστηκαν με την προσθήκη IPTG. Οι πρωτεΐνες σύντηξης που προέρχονται από το περιπλασμικό χώρο του
E.coli
από ωσμωτική μέθοδο σοκ (pet χειροκίνητο σύστημα, 9
η έκδοση, Novagen) και καθαρίζεται με χρωματογραφία συγγένειας (στήλη HisTrap HP, η GE Healthcare) . Οι πρωτεΐνες σύντηξης ενεργοποιημένο Ec-LDP-Hr-ΑΕ, Ec-LDP-ΑΕ και LDP-Hr-ΑΕ κατασκευάστηκαν με την ενσωμάτωση της χρωμοφόρου ενεργό ενεδιύνιο (ΑΕ) του lidamycin στην ΕΚ-LDP-Hr, Ec-LDP και LDP- πρωτεΐνες hr, αντίστοιχα.
η συγγένεια δέσμευσης δοκιμασία
Μια δοκιμασία ανοσοφθορισμού κυτταρομετρία ροής με βάση χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η συγγένεια δέσμευσης πρωτεΐνης σύντηξης Ec-LDP-hr έως καρκίνο του οισοφάγου κύτταρα [15] . Η πρωτεΐνη Ec-LDP-hr ήταν FITC επισημασμένο για 16 ώρες σε ένα ρυθμιστικό ανθρακικού διάλυμα (100 mmol /L NaHCO
3, 10 mmol /L Ν &
2CO
3, ρΗ 9.0) στους 4 ° C . Επισημασμένη πρωτεΐνη διαχωρίστηκε από μη δεσμευμένο FITC με χρήση Sephadex G-25 στήλης (GE Healthcare). Στη συνέχεια, το FITC-σημασμένη πρωτεΐνη Ec-LDP-Hr επωάστηκε με 10
6 EC9706 κύτταρα, KYSE150 κύτταρα ή κύτταρα ΝΙΗ 3Τ3 σε όγκο 100 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος (PBS + 2% FBS) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από τρεις πλύσεις με 500 μΙ ρυθμιστικού, τα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρόμετρο ροής (BD Company). Τα δεδομένα αναλύθηκαν με Prism 5 λογισμικό (GraphPad Software).
ΜΤΤ δοκιμασία
Τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με τρυψινοποίηση και επιστρώθηκαν σε 96 φρεατίων επίπεδου πυθμένα πλάκες, καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες πριν από την έκθεση σε διάφορες συγκεντρώσεις LDM, Ec-LDP-Hr-ΑΕ, Ec-LDP-ΑΕ ή LDP-Hr-ΑΕ για 48 ώρες. διάλυμα ΜΤΤ (5 mg /ml, 20 μΙ) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για άλλες 4 ώρες στους 37 ° C. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και 150 μΐ DMSO προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Η απορρόφηση στα 570 nm μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα όργανο Multiskan Φάσμα (Thermo Labsystems, Rochford, IL, USA). Οι τιμές απορρόφησης εκφράστηκαν ως ποσοστό του ότι για τα μη κατεργασμένα κύτταρα, και οι συγκεντρώσεις των δοκιμαζόμενων παραγόντων με αποτέλεσμα 50% αναστολή ανάπτυξης (IC
50) υπολογίστηκαν.
ανάλυση κυττάρων διανομή κύκλου
Τα αποτελέσματα της διπλής εξειδίκευσης πρωτεΐνης σύντηξης Ec-LDP-Hr-AE επί του κυτταρικού κύκλου αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας χρώση με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ). Μετά την κατεργασία με 0.1 nmol /L, 0.5 nmol /L και 1 nmol /L EC-LDP-Hr-AE για 48 ώρες, EC9706 και KYSE150 κύτταρα υποβλήθηκαν σε πέψη με θρυψίνη-ΕϋΤΑ και πλύθηκαν με PBS. Τα κύτταρα κατόπιν επαναιωρήθηκαν σε 500 μΐ PBS με 50 μg /ml ΡΙ και 100 μg /ml RNase Α Μετά από επώαση στους 37 ° C για 30 λεπτά, τα κύτταρα αναλύθηκαν για φθορισμό με κυτταρόμετρο ροής (BD Company).
κυτταρικής απόπτωσης δοκιμασία
Τα αποτελέσματα της διπλής εξειδίκευσης πρωτεΐνης σύντηξης Ec-LDP-Hr-ΑΕ για επαγωγή απόπτωσης σε κύτταρα ESCC μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας χρώση Hoechst και χρώση /ΡΙ Αννεξίνη V-FITC. Για τη χρώση Hoechst, KYSE150 κύτταρα αναπτύχθηκαν επί coverslides και επωάστηκαν για 24 ώρες, στη συνέχεια 0,1 nmol /L, 0.5 nmol /L και 1 nmol /L EC-LDP-Hr-AE προστέθηκαν και επωάστηκαν για άλλες 48 ώρες. Κύτταρα σε coverslides σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη, πλύθηκαν με PBS, και χρωματίστηκαν με 1 mg /ml Hoechst 33342 για 15 λεπτά. Οι εικόνες παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού (Nikon ΤΕ 2000 U). Για τη χρώση /ΡΙ Annexin V-FITC, τα αποπτωτικά κύτταρα μετρήθηκαν με μία V-FITC Annexin kit /ΡΙ χρώση (τεχνολογία Biosea). Μετά 0,1 nmol /L, 0.5 nmol /L και 1 nmol /L αγωγή Ec-LDP-Hr-AE για 48 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν δύο φορές με PBS, και φυγοκεντρήθηκαν στις 1000 rpm για 5 λεπτά. Οι σβώλοι κυττάρων επαναιωρήθηκαν σε 500 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει 10 μΐ αννεξίνης V-FITC και 5 μΐ ΡΙ δεσμευτική, επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά, και στη συνέχεια αναλύθηκαν για φθορισμό με κυτταρόμετρο ροής (BD Company).
κηλίδος Western ανάλυση
τα κύτταρα λύθηκαν για 30 λεπτά σε δοκιμασία ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA) ρυθμιστικό διάλυμα περιείχε αρκετές αναστολείς πρωτεάσης (π.χ. 1 μg /ml απρωτινίνη, 10 μg /ml λευπεπτίνη, 1 mmol /L φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο, 2 mmol /L NaVO
4, και 50 mmol /L NaF). Πρωτεΐνη που εξάγεται από τα κύτταρα μετρήθηκε ποσοτικά με τη χρήση κιτ bicinchoninic οξύ (Pierce Biochemicals), και 30 μg εκάστου συνολικής πρωτεΐνης εφαρμόστηκαν σε 10% SDS-PAGE και στη συνέχεια ηλεκτροστυπώθηκαν πάνω σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Millipore). Οι μεμβράνες επωάστηκαν με 1% BSA για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου πριν από την επώαση όλη τη νύκτα στους 4 ° C με πρωτεύοντα αντισώματα (αραιωμένα 1:1000 με ρυθμιστικό TBST, Cell Signaling Technology). Στη συνέχεια, οι μεμβράνες επωάστηκαν με δευτερογενές συζευγμένο με HRP αντισώματα (αραίωση 1:5000? Cell Signaling Technology) για 1 ώρα μετά από πλύση τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα TBST. Οι ειδικές ζώνες έγιναν ορατές με το κιτ Immobilon Western χημειοφωταύγειας HRP Substrate (Millipore) και συλλαμβάνονται από ChemiImager 5500 σύστημα απεικόνισης (Άλφα Innotech Corp.).
In vivo
δοκιμασία αποτελεσματικότητα
In vivo
αποτελεσματικότητα ενεργοποιημένο πρωτεϊνών σύντηξης αξιολογήθηκε σε μία KYSE150 ξενομοσχεύματα γυμνό μοντέλο ποντικού. 1 × 10
7 KYSE150 κύτταρα αιωρούνται σε 200 μΐ PBS ενοφθαλμίστηκαν υποδορίως στη δεξιά μασχάλη του άτριχων ποντικών. Μετά από 3 εβδομάδες, οι όγκοι αφαιρέθηκαν από γυμνούς ποντικούς και τεμαχίστηκαν ασηπτικά στο αποστειρωμένο αλατούχο διάλυμα. Τα τεμάχια του ιστού του όγκου (2 mm
3 σε μέγεθος) στη συνέχεια μεταμοσχεύονται στο δικαίωμα μασχάλη γυμνών ποντικών με τροκάρ, και η πληγή σφραγίστηκε με κολλόδιο. Ποντικοί που φέρουν όγκο χωρίστηκαν τυχαία σε 3 ομάδες (η = 7), όταν το μέγεθος του όγκου ήταν πάνω από 100 mm
3 (περίπου 10 ημέρες αργότερα). Lidamycin εγχύθηκαν (0,05 mg /kg) και πρωτεΐνη σύντηξης διπλής ειδικότητας Ec-LDP-Hr-ΑΕ (0,3 mg /kg) ενδοφλεβίως στην ουραία φλέβα και χορηγούνται σε όγκο 200 μΐ PBS κατά την ημέρα 11 και την ημέρα 21, αντίστοιχα. Η ομάδα ελέγχου των ποντικών έλαβε 200 μΙ PBS αγωγή συγχρόνως ως πρωτεΐνες σύντηξης. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε κάθε 3 μέρα και ο όγκος του όγκου προσδιορίστηκε με μήκος Χ πλάτος
2/2. Τα ποσοστά αναστολής υπολογίστηκαν από 1 -. Όγκος του όγκου (θεραπεία) όγκος /όγκου (μάρτυρας) χ 100%
Στατιστική ανάλυση
Τα αποτελέσματα των ποσοτικών δεδομένων σε αυτήν την μελέτη παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± το SD. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν στατιστικά χρησιμοποιώντας αταίριαστο δύο-tailed t-test, και P-τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές
Αποτελέσματα
Προετοιμασία ενεργοποιημένο πρωτεϊνών σύντηξης
Σύμφωνα με την προηγούμενη προσέγγιση μας, τα γονίδια που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες σύντηξης Ec-LDP-Hr, EC-LDP, και LDP-Hr κατασκευάστηκαν και οι κωδικοποιημένες πρωτεΐνες εκφράζονται στον περιπλασμικό χώρο του
E.coli
. Οι πρωτεΐνες σύντηξης καθαρίστηκαν με Ni
2+ χρωματογραφία συγγένειας και η καθαρότητα των πρωτεϊνών σύντηξης ήταν όλα πάνω από 90% όπως προσδιορίζεται με SDS-PAGE και υψηλής απόδοσης-υγρής χρωματογραφίας (HPLC). Η δραστική χρωμοφόρο ενεδιύνιο (ΑΕ) του LDM και τριών πρωτεϊνών σύντηξης ανασυσταθέν
in vitro
για τη δημιουργία των ενεργοποιημένο πρωτεΐνες σύντηξης Ec-LDP-Hr-ΑΕ, Ec-LDP-ΑΕ και LDP-Hr-ΑΕ. Τα αποτελέσματα από HPLC αντίστροφης φάσης έδειξε ότι τρία ενεργοποιημένα πρωτεΐνες σύντηξης συναρμολογήθηκαν με επιτυχία.
συγγένεια του Ec-LDP-Hr πρωτεΐνη για καρκίνο του οισοφάγου κύτταρα
EC9706 κύτταρα, KYSE150 κύτταρα και ΝΙΗ 3Τ3 Binding κύτταρα επωάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις FITC-επισημασμένο Ec-LDP-Hr, και οι εντάσεις φθορισμού μετρήθηκαν με κυτταρόμετρο ροής. Οι εντάσεις μέσου φθορισμού (ΝΧΙ) κυττάρων EC9706 και KYSE150 κύτταρα τόσο σημαντικά αυξημένη (Ρ & lt? 0,05), η οποία έδειξε Ec-LDP-Hr είχε ισχυρή δραστικότητα πρόσδεσης στα οισοφάγου καρκινικά κύτταρα (Εικ 1Α, 1C). Ωστόσο, οι ΝΧΙ των κυττάρων ΝΙΗ 3Τ3 δεν έδειξαν σημαντική αύξηση, πράγμα που σήμαινε Ec-LDP-Hr δεν ήταν σε θέση να δεσμεύονται με EGFR και αρνητικά κύτταρα ΝΙΗ 3Τ3 HER2 (Σχήμα 1 Ε). Σύμφωνα με τα ΝΧΙ και τις συγκεντρώσεις Ec-LDP-Hr, η συγγένεια δέσμευσης (
δ Κ) τιμές υπολογίστηκαν με Prism 5 λογισμικού. Το K
δ τιμές για Ec-LDP-Hr δεσμεύεται να EC9706 και KYSE150 κυττάρων ήταν 5.283 μmol /L και 3.562 μmol /L, αντίστοιχα (Εικ. 1Β, 1Δ).
EC9706 κύτταρα (Α) , KYSE150 κύτταρα (C) ή κύτταρα ΝΙΗ 3Τ3 (Ε) επωάστηκαν με ΡΙΤΟ-επισημασμένη πρωτεΐνη Ec-LDP-Hr σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις, και οι εντάσεις φθορισμού μέση (ΝΧΙ) αναλύθηκαν με κυτταρόμετρο ροής. Αυξημένες συγκεντρώσεις FITC-επισημασμένων πρωτεϊνών Ec-LDP-Hr επωάστηκαν με EC9706 κύτταρα (Β) ή KYSE150 κύτταρα (D). Μετά FACS, τα ΝΧΙ χαράχθηκαν έναντι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης.
Η
Η κυτταροτοξικότητα των ενεργοποιημένο πρωτεϊνών σύντηξης
in vitro
Η
Η κυτταροτοξικότητα της διπλής εξειδίκευσης ενεργοποιείται πρωτεΐνη σύντηξης Ec-LDP- hr-AE διεξήχθη σε τέσσερις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές οισοφαγικού καρκινώματος πλακωδών κυττάρων (ESCC) που εκφράζουν διαφορετικά επίπεδα του EGFR και HER2 και του EGFR /HER2 αρνητικά κύτταρα ΝΙΗ 3Τ3 χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς ΜΤΤ (Εικ. 2Α). LDM και μονοειδικό ενεργοποιούνται πρωτεΐνες σύντηξης Ec-LDP-ΑΕ και LDP-Hr-ΑΕ ελέγχθηκαν επίσης για σύγκριση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β, η διπλής εξειδίκευσης πρωτεΐνη σύντηξης ενεργοποιείται Ec-LDP-Hr-ΑΕ σκότωσε τα δύο κύτταρα ESCC και κύτταρα ΝΙΗ 3Τ3 με πολύ υψηλή ισχύ. Το IC
50 τιμές Ec-LDP-Hr-ΑΕ για 4 κύτταρα ESCC ήταν κάτω από το 10
-10 επίπεδο mol /L (Σχ. 2C). Ωστόσο, η διπλής εξειδίκευσης πρωτεΐνης Ec-LDP-Hr-AE δεν ήταν πάντα πιο ισχυρό από τα αντίστοιχά μονοειδικά και LDM. Τα αποτελέσματα από τη στατιστική ανάλυση αποκάλυψε ότι οι διαφορές στο IC
50 τιμές LDM, Ec-LDP-Hr-ΑΕ, Ec-LDP-ΑΕ και LDP-Hr-ΑΕ για την ΕΚ-1, ECa109 και EC9706 κύτταρα δεν ήταν στατιστικά σημαντικές . Αλλά οι διαφορές στην IC
50 τιμές για KYSE150 κύτταρα ήταν σημαντικές (P & lt? 0,05). Επιπλέον, IC
50 αξία των Ec-LDP-Hr-ΑΕ για ΝΙΗ 3Τ3 κύτταρα δεν παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με τα τέσσερα κελιά ESCC.
(Α) έκφραση του EGFR και HER2 σε διαφορετικές οισοφάγου καρκινικά κύτταρα και κύτταρα ΝΙΗ 3Τ3 αναλύθηκαν με κηλίδα Western. (Β) Το κύτταρο σκοτώνει αποτελέσματα των Ec-LDP-Hr-ΑΕ για καρκίνο του οισοφάγου κυτταρικές σειρές KYSE150, EC9706, ECa109 και ΕΚ-1 και ινοβλαστών ποντικού κυτταρική γραμμή ΝΙΗ 3Τ3 ελέγχθηκαν με αναλύσεις ΜΤΤ. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις Ec-LDP-Hr-AE για 48 ώρες και τα αποτελέσματα ελήφθησαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Γ) Το IC
50 τιμές lidamycin (LDM), Ec-LDP-Hr-ΑΕ, Ec-LDP-ΑΕ και LDP-Hr-ΑΕ κατά 4 είδη οισοφάγου καρκινικά κύτταρα και κύτταρα ΝΙΗ 3Τ3 μετρήθηκαν με ΜΤΤ δοκιμασία. Στήλες, σημαίνει πειραμάτων εις τριπλούν, μπαρ, SD.
Η
Επιπτώσεις της διπλής εξειδίκευσης πρωτεΐνης σύντηξης Ec-LDP-Hr-ΑΕ για τον κυτταρικό κύκλο
διανομή
EC9706 και KYSE150 κύτταρα εκτέθηκαν σε 0,1 , 0,5 και 1 nmol /L EC-LDP-Hr-AE για 48 ώρες, και η κατανομή του κυτταρικού κύκλου αξιολογήθηκε με χρώση ΡΙ και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. κύτταρα ελέγχου (EC9706 και KYSE150) διανέμονται σε φάση G2-M ήταν 10,51% ± 0,98% και 6,26% ± 1,96% αντίστοιχα, ενώ τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 0,1 nmol /L Ec-LDP-Hr-ΑΕ διανέμεται στη φάση G2-M ήταν 86.00% ± 0,98% και 89,36% ± 0,71%, αντίστοιχα. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι μια σημαντική G2-M σύλληψη προκλήθηκε από κατεργασία Ec-LDP-Hr-ΑΕ (Εικ. 3). Αν και υπήρχε μια μεγάλη στροφή (περίπου 12,84% ~31.53% αυξήσεις) στη φάση G2-M μετά από έκθεση σε 0,5 nmol /L και 1 nmol /L Ec-LDP-Hr-ΑΕ, τα κύτταρα που διανέμεται στη φάση G2-M ήταν μικρότερη από εκείνη των επεξεργασμένων με 0.1 nmol /L EC-LDP-Hr-AE, η οποία έδειξε τα κύτταρα φάσης G2-M φτάσει στην κορυφή με 0,1 nmol /L αγωγή Ec-LDP-Hr-ΑΕ (Εικ. 3).
EC9706 κύτταρα ή KYSE150 κύτταρα εκτέθηκαν σε Ec-LDP-Hr-AE για 48 ώρες στις δεικνυόμενες συγκεντρώσεις και διανομή του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση ΡΙ. Στήλες, σημαίνει πειραμάτων εις τριπλούν, μπαρ, SD.
Η
Επιπτώσεις της διπλής εξειδίκευσης πρωτεΐνης σύντηξης Ec-LDP-Hr-AE στην απόπτωση
Τα αποτελέσματα από την Hoechst 33342 χρώση και Αννεξίνη V- δοκιμασίες χρώσης /ΡΙ FITC αποκάλυψε ότι αποπτωτικά κύτταρα (EC9706 και KYSE150) αυξήθηκε σημαντικά σε δόση-εξαρτώμενο τρόπο μετά από θεραπεία με Ec-LDP-Hr-ΑΕ. Η χρώση Hoechst 33342 για την ανίχνευση των αλλαγών στην πυρηνική μορφολογία. Οι πυρήνες των μη επεξεργασμένων κυττάρων ήταν κανονική σε εμφάνιση και παρουσίαζε διαχέεται χρώση της χρωματίνης. Μετά από έκθεση σε διαφορετικές συγκεντρώσεις Ec-LDP-Hr-AE για 48 ώρες, τα κύτταρα KYSE150 παρουσιάζονται τυπικές μορφολογικές μεταβολές απόπτωσης όπως συμπύκνωση χρωματίνης ή συρρικνωμένη πυρήνα (Σχ. 4Α). Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Β, οι αναλογίες των αποπτωτικών κυττάρων EC9706 μετά από θεραπεία με 0,1, 0,5 και 1 nmol /L EC-LDP-Hr-AE ήταν 15,06% ± 0,29%, 38,10% ± 0,64% και 50,00% ± 0,39%, αντίστοιχα, οι οποίες έδειξαν σημαντική αυξάνει σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (P & lt? 0,01). Τα αποπτωτικά κύτταρα αυξήθηκε επίσης πολλά για τα κύτταρα KYSE150 μετά από έκθεση σε 0,1, 0,5 και 1 nmol /L Ec-LDP-Hr-ΑΕ, με τις αναλογίες απόπτωση των 16,29% ± 0,35%, 21,54% ± 0,51% και 32.99% ± 0,38%, αντίστοιχα (P & lt? 0,01 έναντι του ελέγχου, Σχήμα 4C.). Επιπλέον, Ec-LDP-Hr-AE επαγόμενη απόπτωση σε EGFR /αρνητικά κύτταρα ΝΙΗ 3Τ3 HER2, και οι αναλογίες των αποπτωτικών κυττάρων μετά τη θεραπεία με 0,1, 0,5 και 1 nmol /L EC-LDP-Hr-AE ήταν 16,47% ± 0,44%, 15,28% ± 0,45% και 19,90% ± 0,12%, αντίστοιχα. Τα αποπτωτικά κύτταρα ΝΙΗ 3Τ3 ήταν σημαντικά μικρότερη από εκείνη της EC9706 κυττάρων και KYSE150 κύτταρα στις δόσεις έκθεσης των 0,5 nmol /L και 1 nmol /L EC-LDP-Hr-ΑΕ (Ρ & lt?. 0.05, Σχήμα 4D).
(Α) KYSE150 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Ec-LDP-Hr-AE στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις επί 48 ώρες, και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με Hoechst 33342. Οι εικόνες παρατηρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού σε × 200. κύτταρα EC9706 (Β), KYSE150 κύτταρα (C) ή κύτταρα ΝΙΗ 3Τ3 (D) εκτέθηκαν στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις Ec-LDP-Hr-AE για 48 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν με συνδυασμό ΡΙΤΟ-αννεξίνης V και ΡΙ. Οι κάτω αριστερά τεταρτημόρια (FITC
– /PI
-) ανέφερε τα βιώσιμα κύτταρα, και τα κάτω δεξιά τεταρτημόρια (FITC
+ /ΡΙ
-) έδειξε τα πρώτα αποπτωτικών κυττάρων. Οι άνω δεξιά τεταρτημόρια (FITC
+ /ΡΙ
+) έδειξε τα τέλη αποπτωτικά κύτταρα, και οι επάνω αριστερά τεταρτημόρια (FITC
– /PI
+) έδειξε τα νεκρά κύτταρα
Επιπτώσεις της διπλής εξειδίκευσης πρωτεΐνης σύντηξης Ec-LDP-Hr-ΑΕ στο EGFR /HER2 οδών σηματοδότησης
ενεργοποίηση
για τον χαρακτηρισμό των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην κυτταροτοξικότητα και την απόπτωση-επαγωγή Ec-LDP-HR- ΑΕ, εξετάσαμε τα αποτελέσματά του στην έκφραση των μορίων που σχετίζονται με την απόπτωση και αρκετές βασικές μόρια στις οδούς EGFR /HER2 σηματοδότηση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5, Ec-LDP-Hr-AE προωθούνται κασπάσης-3 και κασπάσης-7 δραστηριότητες, καθώς και τη διάσπαση PARP, υποδεικνύοντας ότι Ec-LDP-Hr-AE-επαγόμενη απόπτωση μπορεί να σχετίζεται με μιτοχονδριακές οδών. Επιπλέον, η θεραπεία με Ec-LDP-Hr-ΑΕ οδήγησαν σε σημαντική μείωση της φωσφορυλίωσης του EGFR και HER2, ενώ η έκφραση των αδρανοποιημένο EGFR και HER2 δεν είχαν αλλάξει. Η φωσφορυλίωση του κατάντη μορίων σηματοδότησης του EGFR /HER2 οδού, όπως ΑΚΤ, ERK, JNK και p38MAPK ανεστάλη περαιτέρω με την κατεργασία του Ec-LDP-Hr-ΑΕ (Εικ. 5). Τα δεδομένα πυκνομετρία απέδειξαν ότι η φωσφορυλιωμένη HER2 και p38MAPK μειώθηκε σημαντικά με όλες τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις της θεραπείας Ec-LDP-Hr-ΑΕ (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα, Ρ & lt? 0,05). Φωσφορυλιωμένη EGFR, ΑΚΤ και JNK μειώθηκε σημαντικά με 0,5 nmol /L και 1 nmol /L της θεραπείας Ec-LDP-Hr-ΑΕ (P & lt? 0,05) και φωσφορυλιωμένου ERK μειώθηκε σημαντικά με 1 nmol /L Ec-LDP-Hr-Α.Ε. θεραπεία (τα δεδομένα δεν φαίνονται, Ρ & lt? 0,05). Τα επίπεδα της ολικής ΑΚΤ, ERK, JNK p38MAPK και δεν επηρεάστηκαν από την επεξεργασία των Ec-LDP-Hr-ΑΕ, και τα δεδομένα πυκνότητας υποστήριξαν αυτό το συμπέρασμα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).
Η έκφραση της απόπτωσης των σχετικών μόρια (π.χ. κασπάσης 3, κασπάσης 7 και PARP) οδών και κλειδί μόρια στο EGFR /HER2 σηματοδότηση (π.χ. φωσφορυλιωμένου-EGFR, -HER2, -ERK, -p38MAPK, -JNK, -Akt) προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.
Η
In vivo
αποτελεσματικότητα ενεργοποιημένο πρωτεϊνών σύντηξης
In vivo
αντικαρκινική δράση των ενεργοποιημένο πρωτεΐνες σύντηξης αξιολογήθηκε σε μία KYSE150 ξενομοσχεύματα γυμνό μοντέλο ποντικού. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α, LDM κατέστειλε την ανάπτυξη του KYSE150 ξενομοσχευμάτων κατά 61,4% στη μέγιστη ανεκτή δόση (0,05 mg /kg), και η πρωτεΐνη σύντηξης διπλής ειδικότητας Ec-LDP-Hr-AE στη δόση των 0,3 mg /kg ανέστειλε τη αύξηση των KYSE150 ξενομοσχευμάτων κατά 88%, η οποία έδειξε στατιστικά σημαντικές διαφορές (Ρ & lt? 0,05) σε σύγκριση με LDM επεξεργασμένο ομάδας σε 0,05 mg /kg. Δεν θάνατοι των ζώων βρέθηκαν στις θεραπευόμενες ομάδες, και οι καμπύλες του σωματικού βάρους έδειξε ότι τα ζώα καλά ανεκτή με τη χορηγηθείσα δόση του Ec-LDP-Hr-ΑΕ (Σχ. 6Β).
Γυμνά ποντίκια (η = 7) που φέρει ανθρώπινο καρκίνωμα του οισοφάγου ξενομοσχεύματα KYSE150 υποβλήθηκαν σε αγωγή με LDM ή Ec-LDP-Hr-AE την ημέρα 11 και την ημέρα 21 μετά τον εμβολιασμό του όγκου με ένεση στην φλέβα της ουράς. Οι μέσοι όγκοι των όγκων (Α) και τα μέσα βάρη σώματος των ποντικών (Β) σε κάθε ομάδα παρουσιάζεται. Ec-LDP-Hr-AE στη δόση των 0,3 mg /kg ανέστειλε την ανάπτυξη των KYSE150 ξενομοσχευμάτων κατά 88%, η οποία έδειξε στατιστικά σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με ομάδα που υπέστη αγωγή LDM στη μέγιστη ανεκτή δόση (0,05 mg /kg) (Ρ & lt? 0,05 ).
η
Συζήτηση
χειρουργική επέμβαση, ακτινοθεραπεία και η χημειοθεραπεία είναι ακόμα ο στυλοβάτης της θεραπείας για τον καρκίνο του οισοφάγου, αλλά πρόσφατα, μια σειρά από στοχευμένες θεραπείες μελετώνται με στόχο τη βελτίωση της ανταπόκρισης ρυθμού και της επιβίωσης σε ασθενείς με καρκίνο του οισοφάγου [6], [16], [17]. Όπως είναι γνωστό, η υπερέκφραση του EGFR και HER2 έχει παρατηρηθεί σε πάνω από 30% του οισοφάγου καρκινώματα, και η υπερέκφραση των συσχετίζεται με μειωμένη επιβίωση, αυξημένο κίνδυνο υποτροπής, απομακρυσμένη μετάσταση, και την αντίσταση σε ακτινοθεραπεία [18]. Ως εκ τούτου, έχουν εξεταστεί οι επιπτώσεις ορισμένων μονοειδικών αντισωμάτων και αναστολείς της τυροσινικής κινάσης που μπλοκάρουν EGFR ή τη λειτουργία του HER2, όπως cetuximab, trastuzumab, gefitinib και erlotinib σε οισοφαγικό καρκίνωμα, αλλά η αποτελεσματικότητα είναι περιορισμένη μέχρι στιγμής [19] – [22] . Διαφορετικό από τα μονοκλωνικά αντισώματα και αναστολείς κινάσης τυροσίνης, οι ανοσοτοξίνες θεωρούνται να είναι άκρως αποτελεσματική για τη θεραπεία του καρκίνου με το πλεονέκτημα της εξειδίκευσης των αντισωμάτων ή προσδεμάτων και την κυτταροτοξικότητα των τοξινών [23]. Ωστόσο, δεδομένα κλινικών μελετών σχετικά με τις ανοσοτοξίνες έχουν δείξει αντιφατικά αποτελέσματα. Αρκετές ανοσοτοξίνες ήταν πολύ αποτελεσματική ενάντια αιματολογικές κακοήθειες. Για παράδειγμα, στη μελέτη φάσης ΙΙΙ σε ασθενείς με δερματικό Τ-κυτταρικό λέμφωμα (CTCL), το 30% των 71 ασθενών που έλαβαν θεραπεία με denileukin diftitox (DAB
389IL2, Ontak) είχε μια αντικειμενική ανταπόκριση, συμπεριλαμβανομένων 10% πλήρη ύφεση. Και σε μια δοκιμή φάσης Ι σε 31 ασθενείς με λευχαιμία εκ τριχωτών κυττάρων, BL22 που προκαλείται 19 πλήρεις απαντήσεις (61%) και 5 μερική ανταπόκριση (19%) [24], [25]. Αλλά για συμπαγείς όγκους, ανοσοτοξίνες έδειξε περιορισμένη αντικαρκινική αποτελεσματικότητα. Οι λόγοι για ανεπιτυχή θεραπεία στερεών όγκων περιλαμβάνονται φτωχή διείσδυση σε όγκους και τις σοβαρές ανοσολογικές αποκρίσεις [26] – [28]. Vallera και οι συνάδελφοι έχουν αναπτύξει νέες διειδικά μόρια συντήκοντας δύο διακριτές συνδέτες στόχευσης σε ένα ενιαίο τοξίνη, με σκοπό να βελτιωθεί η επιλεκτικότητα και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι διειδικά μόρια έδειξαν είτε ενισχυμένη δραστηριότητα κατά του όγκου ή ευρύτερο φάσμα δραστικότητας από ό, τι τα μόρια μονοειδικό [15 ], [29], [30] – [34]. Η πρωτεΐνη σύντηξης Ec-LDP-Hr-ΑΕ που κατασκευάστηκε στο παρελθόν είναι ένα μόριο διπλής ειδίκευσης που απευθύνονται τόσο EGFR και HER2. Ec-LDP-Hr-ΑΕ απασχολεί δύο ολιγοπεπτιδίων για τη σύνδεση υποδοχέα και την επακόλουθη ενδοκυτταρική μεταφορά ενός ενεδιύνιο αντιβιοτικό lidamycin για θανάτωση των κυττάρων. Σε αυτή τη μελέτη, η αντικαρκινική δραστικότητα του Ec-LDP-Hr-AE για καρκίνο του οισοφάγου ερευνήθηκε, διότι παρατηρήθηκε συν-overexpresssion του EGFR και HER2 στην πλειοψηφία των οισοφάγου πλακωδών καρκινωμάτων.
Η πρόσδεση με αντίστοιχους υποδοχείς είναι η προϋπόθεση για Ec-LDP-Hr-ΑΕ να ασκήσει όγκου των κυττάρων-επιλεκτική κυτταροτοξική αποτελέσματά της. Ως εκ τούτου, η ικανότητα σύνδεσης Ec-LDP-Hr πρωτεΐνης σε κύτταρα ESCC αξιολογήθηκε με τη χρήση μίας ανιχνεύσεως ανοσοφθορισμού κυτταρομετρία ροής με βάση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Ec-LDP-Hr πρωτεΐνης ήταν ικανό να συνδέεται με κύτταρα ESCC με υψηλή συγγένεια. Ωστόσο, Ec-LDP-Hr απέτυχε να δείξει δραστικότητα δέσμευσης για EGFR και αρνητικά κύτταρα ΝΙΗ 3Τ3 HER2. Σε δοκιμασία τη βιωσιμότητα των κυττάρων, η διπλής εξειδίκευσης και πρωτεΐνη σύντηξης ενεδιύνιο-ενεργοποιημένο Ec-LDP-Hr-ΑΕ έδειξε εξαιρετικά ισχυρά αποτελέσματα δολοφονία σε καρκίνο του οισοφάγου κύτταρα με IC
50 τιμές σε πολύ χαμηλά επίπεδα (& lt? 10
-10 mol /ΜΕΓΆΛΟ). Για τα κύτταρα KYSE150, που εκφράζουν τόσο EGFR και HER2, Ec-LDP-Hr-AE ήταν η πιο κυτταροτοξική σε καρκίνο του οισοφάγου κύτταρα κατά τη σύγκριση με LDM και δύο μονοειδικό πρωτεϊνών σύντηξης (Ec-LDP-ΑΕ και LDP-Hr-AE). Βελτιωμένη δραστικότητα της πρωτεΐνης σύντηξης διπλής ειδικότητας μπορεί να εξηγηθεί από το εν λόγω Ec-LDP-Hr-AE δεσμεύεται τόσο EGFR και HER2, και το έκανε λιγότερο πιθανό να διαχωριστεί από την επιφάνεια του κυττάρου, αυξάνοντας έτσι τις πιθανότητες για εσωτερικοποίηση του κυτοτοξική χαρακτηριστική ομάδα της και ασκώντας κύτταρο σκοτώνοντας αποτελέσματα. Ωστόσο, η διπλής εξειδίκευσης πρωτεΐνη Ec-LDP-Hr-ΑΕ δεν ήταν πάντα πιο ισχυρό από τους ομολόγους μονοδυναμικοί και LDM και τα αποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης έδειξε ότι οι διαφορές στο IC
50 τιμές LDM, Ec-LDP-Hr-Α.Ε. , Ec-LDP-ΑΕ και LDP-Hr-ΑΕ για την ΕΚ-1, ECa109 και EC9706 κύτταρα δεν ήταν στατιστικά σημαντικές. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η κυτταροτοξικότητα της ενεργοποιημένο πρωτεϊνών σύντηξης να ESCC κύτταρα δεν συσχετιζόταν καλά με το EGFR και τα επίπεδα έκφρασης HER2. Για παράδειγμα, το IC
50 αξία των Ec-LDP-Hr-ΑΕ για EC9706 κύτταρα με χαμηλή έκφραση HER2 ήταν 5,12 × 10
-12 mol /L, ενώ IC
50 τιμή για KYSE150 κύτταρα με υψηλή EGFR και το επίπεδο HER2 ήταν 6,10 × 10
-11 mol /L. Τα παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν και μεταξύ της δραστικότητας των μονοειδικών πρωτεΐνες σύντηξης και τα /επίπεδα HER2 EGFR. Αυτό το φαινόμενο έχει παρατηρηθεί σε άλλες μελέτες σχετικά με τη στοχευμένη φάρμακα, όπως η λαπατινίμπη [35], [36]. Ως αποτέλεσμα, περαιτέρω μελέτες επικεντρώνονται στην αποκάλυψη των μοριακών μηχανισμών της ευαισθησίας στην Ec-LDP-Hr-ΑΕ είναι σαφώς απαραίτητη, και αυτό μπορεί να παράσχει χρήσιμα στοιχεία για την επιλογή των ασθενών που θα επωφεληθούν από EGFR /πράκτορες HER2-διπλής ειδικότητας.
για τον προσδιορισμό των μηχανισμών των διειδικών Ec-LDP-Hr-AE παρουσίασαν κυτταροτοξικότητα σε καρκίνο του οισοφάγου κύτταρα, η χρώση ΡΙ, χρώση Hoechst, και αννεξίνης V-FITC /μελέτες χρώση ΡΙ διεξήχθησαν για να εξετάσει διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης. Τα αποτελέσματα από την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου έδειξε ότι Ec-LDP-Hr-AE προκάλεσε σημαντική G2-M σύλληψης, στην οποία τα κύτταρα φάσης G2-M φτάσει στην κορυφή με 0,1 nmol /L αγωγή Ec-LDP-HR-AE. Το αποτέλεσμα αυτό ήταν πιθανώς λόγω των αποπτωτικών και νεκρών κυττάρων αυξήθηκε μετά από θεραπεία με 0,5 nmol /L και 1 nmol /L Ec-LDP-Hr-ΑΕ. Ως εκ τούτου, η G2-M σύλληψη ήταν λιγότερο σημαντική από εκείνη των 0,1 nmol θεραπείας /L Ec-LDP-Hr-ΑΕ. Ec-LDP-Hr-AE επίσης επαγόμενη απόπτωση σε EC9706 και KYSE150 κυττάρων σε μία δόση-εξαρτώμενο τρόπο, και η απόπτωση που επάγεται από Ec-LDP-Hr-AE μπορεί να σχετίζεται με μιτοχονδριακές μονοπάτια, επειδή κασπάσης-3 και κασπάσης-7 δραστηριότητες καθώς επίσης και τη διάσπαση PARP αυξήθηκε σημαντικά όπως φαίνεται από την ανάλυση κηλίδος Western.
You must be logged into post a comment.