Αφηρημένο

Στόχος

5-φθοριοουρακίλη (5-FU) έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως ως φάρμακο πρώτης γραμμής για καρκίνο του παχέος εντέρου θεραπεία (CRC), αλλά περιορίζεται από την αντίσταση των ναρκωτικών και σοβαρή τοξικότητα . Οι χημειο-ευαισθητοποιητές που αυξάνουν την αποτελεσματικότητά του και να ξεπεράσει τον περιορισμό του χρειάζονται επειγόντως. Gypenosides (GYP), τα κύρια συστατικά από το

Gynostemma pentaphyllum

(Thunb.) Makino, έχει δείξει δυναμικό ακίνητο αντι-όγκου με μικρή παρενέργεια. Εδώ, θα διερευνηθούν προσεκτικά την χημειο-ευαισθητοποίηση των GYP να ενισχύουν την αντικαρκινική δράση της 5-Fu

in vitro

και

in vivo

.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2, 5-diphenyltertrazolium τετραζόλιο δοκιμασίας και δοκιμή σχηματισμού αποικίας αποκαλύπτουν ότι GYP θα μπορούσε να ενισχύσει σημαντικά την 5-FU που προκαλούνται SW-480, sw- 620 και Caco2 κύτταρα απώλεια βιωσιμότητας. ανάλυση CalcuSyn δείχνει ότι GYP δρα συνεργικά με 5-FU. χρώση αννεξίνης V-PE /7-AAD δείχνει 5-FU + GYP θα μπορούσε να προκαλέσει SW-480 απόπτωση των κυττάρων. Οι ενεργοποιήσεις της κασπάσης 3, κασπάσης 9 και πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) συμμετείχαν στη διαδικασία. GYP βρέθηκε επίσης να ρυθμίζουν 5-FU-προκάλεσε έκφραση φωσφο-ρ53 και έτσι αυξάνουν 5-FU επαγόμενη /σύλληψη G1 φάση G0. GYP επίπεδο αυξημένα ενδοκυτταρικά ROS, σημαντικά ενισχυμένη 5-FU ενεργοποιείται απάντηση βλάβες στο DNA, όπως αποδεικνύεται με κυτταρομετρία ροής, κομήτης δοκιμασία και την έκφραση της Ser139-ιστόνης H2A.X. Αναστολή της ROS και p53 αντιστραφεί αντίστοιχα τον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από 5-FU + GYP, προτείνοντας οι κύριοι συντελεστές των ROS και ρ53 στη διαδικασία. Επιπλέον, 5-FU και GYP σε συνδυασμό επιδεικνύει πολύ ανώτερη όγκο του όγκου και η αναστολή βάρους σε CT-26 μοντέλο ποντικού ξενομοσχεύματος σε σύγκριση με 5-FU ή GYP μόνο. Ανάλυση ανοσοϊστοχημείας προτείνει τη συνδυασμούς σημαντικά κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των όγκων. Προκαταρκτικά τοξικολογικά αποτελέσματα δείχνουν ότι η θεραπεία με 5-FU + GYP είναι σχετικά ασφαλής.

Συμπεράσματα

Ως πιθανός χημειο-ευαισθητοποιητής, GYP εμφανίζει μια θαυμάσια συνεργιστική δράση με 5-FU να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και την ανάπτυξη του όγκου. Με τη χρήση της 5-FU και GYP σε συνδυασμό θα ήταν μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική στρατηγική για την θεραπεία CRC

Παράθεση:. Κονγκ L, Wang Χ, Ζανγκ K, Yuan W, Yang Q, Fan J, et al. (2015) Gypenosides συνεργιστικά Ενισχύει το Anti-Tumor Επίδραση της 5-φθοριοουρακίλη για τον Καρκίνο του παχέος In Vitro και Ιη Vivo: Ένας ρόλος του οξειδωτικού στρες, που διαμεσολαβείται από βλάβες στο DNA και p53 ενεργοποίησης. PLoS ONE 10 (9): e0137888. doi: 10.1371 /journal.pone.0137888

Επιμέλεια: Wei-Guo Zhu, το Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Κέντρο Επιστημών Υγείας, ΚΙΝΑ

Ελήφθη: 27 Ιούνη 2015? Αποδεκτές: 24 του Αύγ 2015? Δημοσιεύθηκε: 14 Σεπτεμβρίου 2015

Copyright: © 2015 Κονγκ et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τρίτη πιο συχνή κακοήθης καρκίνος και η τέταρτη κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο, που αντιπροσωπεύουν περίπου 1,2 εκατομμύρια νέες περιπτώσεις και 600 000 θανάτους ετησίως [1]. Η χειρουργική εκτομή, που ακολουθείται από χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία, παραμένει η μόνη καθιερωμένη θεραπευτική αγωγή για CRC, αλλά περιορίζεται από την αντίσταση στο φάρμακο και σοβαρής τοξικότητας [2].

5-φθοριοουρακίλη (5-FU), ένα ανάλογο της ουρακίλης , είναι το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο χημειοθεραπευτικό φάρμακο για συμπαγείς όγκους θεραπεία, ιδιαίτερα για καρκίνο του παχέος εντέρου [3]. Σε κύτταρα όγκων, 5-Fu μετατρέπεται σε φθοροδεοξυουριδίνη μονοφωσφορική (FdUMP) να ασκεί κυτταροτοξική δράση του. FdUMP μπορεί λανθασμένη ενσωματώσει στο DNA ή RNA, αναστέλλει δραστηριότητες της θυμιδυλικής συνθετάσης (TS), τελικά προκαλούν κυτταρικό απόπτωση [4]. Παρ ‘όλα αυτά, το συνολικό ποσοστό ανταπόκρισης με μονοθεραπεία 5-Fu ως θεραπεία πρώτης γραμμής για CRC είναι αρκετά περιορισμένη (approximately10-20%) [5]. Περαιτέρω αύξηση της δοσολογίας θα παράγουν αντίσταση στο φάρμακο και αναπόφευκτες παρενέργειες περιορίζει έτσι το θεραπευτικό του αποτέλεσμα. Πρόσφατα, συνδυασμός ή πολλαπλών συστατικών (και όχι μονό-παράγοντα) θεραπεία, στην οποία δύο ή περισσότερα είδη από τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται ταυτόχρονα, είναι μια αποδεδειγμένη θεραπεία για τον καρκίνο [6,7]. 5-FU σε συνδυασμό με νέα κυτταροτοξικά φάρμακα όπως η οξαλιπλατίνη, η ρεσβερατρόλη και ιρινοτεκάνη έχουν όχι μόνο βελτίωσε τις ποσοστά ανταπόκρισης 40-50%, αλλά επίσης μείωσε την ανεπιθύμητη αντίδραση αυτών των φαρμάκων [8-10], υποδηλώνοντας ότι η 5-FU έχει ευνοϊκό προφίλ ασφάλειας και μπορεί να είναι κατάλληλες για τη θεραπεία συνδυασμού με άλλα φάρμακα. Παρά τις βελτιώσεις αυτές, οι νέες θεραπευτικές στρατηγικές και νέες χημειο-ευαισθητοποιητές χρειάζονται επειγόντως.

Gypenosides (GYP), τα κύρια συστατικά αποσπάσματα από

Gynostemma pentaphyllum

(Thunb.) Makino, υπάρχει κυρίως ως dammarane -τύπου γλυκοζίτες τριτερπενίου (Σχήμα 1Α) και έχει χρησιμοποιηθεί ως μια παραδοσιακή λαϊκή λαϊκή ιατρική στην Ασία για αιώνες για τη θεραπεία του καρκίνου [11-13], υπερλιποπρωτεϊναιμία [14], ηπατίτιδα [15], και των καρδιαγγειακών παθήσεων [16]. Πειραματική μελέτη ανέφερε ότι GYP θα μπορούσε να προκαλέσει απόπτωση σε ανθρώπινα ορθοκολικού καρκίνου 205 κύτταρα μέσω μιτοχόνδρια εξαρτώμενη οδό και την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 [17]. προηγούμενες έρευνες μας δείχνουν επίσης ότι GYP ανέστειλε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου SW-480 και SW-620 κύτταρα πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση σε μια δόση και το χρόνο που εξαρτάται από τον τρόπο [18,19]. Παρά αυτές τις ισχείς, GYP ήταν σχετικά λιγότερο τοξική στα ανθρώπινα κανονικά κύτταρα [20], που δείχνει πιθανή εφαρμογή στη θεραπεία του καρκίνου. Ωστόσο, δεν υπάρχει καμία πληροφορία σχετικά με την επίδραση χημειο-ευαισθητοποίηση των GYP μέχρι τώρα. Και αν GYP μπορεί να γίνει ένας καλός χημειο-ευαισθητοποιητής για να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας στην κλινική δεν είναι σαφής. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε χρησιμοποιήσει το ανθρώπινο ορθοκολικού καρκίνου SW-480, SW-620, τα κύτταρα Caco2 και το μοντέλο CT-26 ξενομοσχεύματος ποντικού να διερευνηθεί η πιθανή χημειο-ευαισθητοποίηση επίδραση της GYP να ενισχύσουν το αποτέλεσμα κατά του όγκου της 5-FU

in vitro

και

in vivo

. Για το καλύτερο της γνώσης μας, η παρούσα μελέτη είναι η πρώτη

in vitro

και

in vivo

προκλινική έρευνα που αξιολογεί την επίδραση χημειο-ευαισθητοποίηση των GYP και την αντικαρκινική δράση της χρησιμοποιώντας 5 -FU και GYP σε συνδυασμό. Τα ευρήματα αυτά μπορεί να παρέχει μια νέα θεραπευτική στρατηγική για την επίτευξη συνέργεια αντι-καρκίνου.

(Α) δομή σκελετού Χημική dammarane της Gypenosides. βιωσιμότητας (Β) των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ στις 48 ώρες μετά την αγωγή με 5-FU σε, SW-620 και Caco2 κύτταρα SW-480. (C-F) Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ σε 24 και 48 ώρες μετά την 5-FU /ή τη θεραπεία GYP σε, SW-620 και Caco2 κύτταρα SW-480. δείκτης συνδυασμού αξίας (CI) αναλύθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό CalcuSyn. CI & lt? 1 δείχνει μια συνεργική δράση. σχηματισμός (G) Colony κυττάρων SW-480 και Caco2 μετά από 5-FU και /ή θεραπεία GYP. Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SD του τριπλούν και

σ

* & lt? 0.05,

σ

** & lt? 0,01 έναντι του ελέγχου?

σ

##

& lt? 0,01 έναντι 5-FU ή GYP μόνη ομάδα.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά και αντιδραστήρια

Gypenosides (GYP) παρασχέθηκε ευγενώς από Ankang Φαρμακευτική Ινστιτούτο του Πανεπιστήμιο του Πεκίνου (Shaanxi, Κίνα) και διαλύθηκε σε 80% αιθανόλη (EtOH) σε μία τελική συγκέντρωση αποθήκευση 100 mg /ml. 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) αγοράστηκε από Sigam-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA) και διαλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), επίσης σε μία τελική συγκέντρωση αποθήκευση 100 mg /ml. GYP και διάλυμα 5-Fu αποστειρώθηκαν μέσω φίλτρου 0,22 μm για χρήση σε επόμενα πειράματα και αποθηκεύονται σε -20 ° C.

3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2, 5-diphenyltertrazolium τετραζολίου (ΜΤΤ), Hoechst 33342, ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ), RNase Α, η Ν-ακετυλοκυστεϊνη (NAC), και pifithrin-α αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich. Αντιδραστήριο νεξίνη Γκουάβα ελήφθη από την Millipore Corporation (Billerica, ΜΑ, USA). 2 ‘, 7’-διχλωρο-διοξεικό (DCFH-DA) ήταν από την Molecular Probes Inc. (Eugene, OR, USA). Η ασπαρτική αμινοτρανσφεράση (AST), αμινοτρανσφεράση της αλανίνης (ALT), άζωτο ουρίας αίματος (BUN) και κρεατινίνη ορού (Cr) κιτ δοκιμασίας δόθηκαν από Nanjing Jiancheng Εμβιομηχανική Ινστιτούτο (Nanjing, Κίνα).

Οι κυτταρικές σειρές

το ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου SW-480, SW-620, κύτταρα Caco2 και ανθρώπινη φυσιολογική ομφάλιου φλέβας ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC ελήφθησαν από την Τράπεζα κυττάρων της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640, L-15 μέσο (Sigam-Aldrich) ή τροποποιημένο μέσο Eagle του Dulbecco (DMEM, Gibco, Life Technologies, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS, Hyclone, USA), 100 U /ml πενικιλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, και 1 mM γλουταμίνη. Οι καλλιέργειες διατηρήθηκαν στους 37 ° C με υγρασία και 5% CO

2.

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Κυτταρική βιωσιμότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ΜΤΤ δοκιμασία και δοκιμασία σχηματισμού αποικίας. Για τη δοκιμασία ΜΤΤ, τα κύτταρα (1 χ 10

5 κύτταρα /ml) σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων (Corning Inc., ΝΥ, USA) για όλη τη νύχτα και την έκθεση σε 5-FU (1, 5, 10, 50, 100 , 300 μg /ml), GYP (70, 85, 100 μg /ml) ή 5-FU + GYP για 24 και 48 ώρες (έλεγχος διαλύτη έκθεση σε 80% αιθανόλη και DMSO ταυτόχρονα). Μετά τη θεραπεία, η κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίστηκε με την προσθήκη 10 μΙ διαλύματος ΜΤΤ (5 mg /ml σε PBS) σε κάθε φρεάτιο που ακολουθείται από επώαση για 4 ώρες στους 37 ° C με 5% CO

2. Το μίγμα ΜΤΤ απομακρύνθηκε και 150 μΐ DMSO προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Τα δείγματα αναδεύονται σε έναν αναδευτήρα για 15 λεπτά, και η απορρόφηση στα 570 nm καταγράφηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικρο-πλάκας (Bio-Tek, ELX800, USA). Η βιωσιμότητα των κυττάρων υπολογίστηκε ως εξής: α. (1-μέση απορρόφηση ομάδα που έλαβε αγωγή /μέσος όρος απορρόφησης της ομάδας ελέγχου) χ 100%

δοκιμή σχηματισμός αποικιών διεξήχθη για να αξιολογηθεί η μακροχρόνια πολλαπλασιαστικό δυναμικό SW-480 ή κύτταρα Caco2 ακόλουθες 5-FU και /ή θεραπεία GYP. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων σε πυκνότητα 1000 κύτταρα /φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν για 7-10 ημέρες στους 37 ° C με 5% CO

2. Το μέσο αλλάχθηκε κάθε 3 ημέρες έως ότου σχηματιστεί ορατές αποικίες. Στη συνέχεια, οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη στους 4 ° C για 15 λεπτά και χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας Giemsa για 30 λεπτά. Τα δείγματα πλύθηκαν με PBS και ξηραίνεται σε θερμοκρασία δωματίου. Ο αριθμός των αποικιών βάφονται που περιείχαν 50 κύτταρα με το χέρι μετρήθηκαν. δυναμικό Ο πολλαπλασιασμός υπολογίστηκε ως εξής: α. σχετικό ρυθμό σχηματισμού αποικίας (%) = αριθμός αποικιών στη θεραπεία ομάδα /αριθμός αποικιών στην ομάδα ελέγχου χ 100%

Αξιολόγηση για δείκτη συνδυασμού

Μετά την ανίχνευση τα ενιαία και συνδυασμός ανασταλτικά αποτελέσματα της 5-FU και GYP, ο δείκτης συνδυασμού (CI) υπολογίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο των Chou και Talalay [21] χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα λογισμικού CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, UK). Η τιμή του CI είναι ένα ποσοτικό μέτρο του βαθμού αλληλεπίδρασης μεταξύ των φαρμάκων. CI & lt? 1, υποδεικνύει συνέργεια? CI = 1, σημαίνει πρόσθετο εφέ? CI & gt? 1, δηλώνει ο ανταγωνισμός.

Προσδιορισμός της κυτταρικής απόπτωσης

κυττάρων απόπτωση ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας γκουάβα νεξίνη δοκιμασία, η οποία χρησιμοποιεί αννεξίνη V-PE για την ανίχνευση της φωσφατιδυλσερίνης στην εξωτερική μεμβράνη των αποπτωτικών κυττάρων [22] . SW-480 κύτταρα (2 χ 10

5 κύτταρα /ml) σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 5-FU ή /και GYP για 24 ώρες, στη συνέχεια τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν με PBS. Μετά από αυτό 100 μΐ κυττάρων από κάθε δείγμα εναιωρήθηκε σε ένα μίγμα από 100 μΙ αννεξίνης V-ΡΕ και ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης 7-AAD, επωάζονται στους 37 ° C για 20 λεπτά στο σκοτάδι και υποβάλλονται σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (Millipore, USA) αμέσως . Ιστογράμματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό FCS Express V3.

Hoechst 33342 χρώση

Hoechst χρώση 33342 χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσετε τις αλλαγές των πυρήνων μορφολογία της SW-480 κύτταρα μετά από 5-Fu, GYP ή 5- επεξεργασία Fu + GYP. Εν συντομία, μετά από επώαση για 24 και 48 ώρες, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 10 mM Hoechst 33342 στους 37 ° C στο σκοτάδι για 15 λεπτά, στη συνέχεια πλένονται τρεις φορές με PBS και παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού με φίλτρα πρότυπο διέγερσης (Nikon, Ιαπωνία) .

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

SW-480 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24-φρεατίων και έκθεση σε 5-FU, GYP ή 5-FU + GYP για 24 και 48 ώρες. Στη συνέχεια τα κατεργασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν και απορρίπτονται ως εξής βήματα: πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS, μονιμοποιήθηκαν με 70% παγωμένη αιθανόλη στους -20 ° C επί μία νύκτα, πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS, επωάστηκαν με 100 mg /ml RNase Α για 30 λεπτά στους 37 ° C, μετά από αυτό χρωματίστηκαν με 50 mg /ml ΡΙ στο σκοτάδι για 30 λεπτά και υποβλήθηκε σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Για κάθε πείραμα, τα κύτταρα 5000 καταγράφηκαν. Τα ληφθέντα αποτελέσματα αναλύθηκαν με το λογισμικό Cell Quest.

Αξιολόγηση της βλάβης του DNA

παρενθέτει ΡΙ στο DNA και το μέγεθος των θραυσμάτων DNA εμφανίζεται ως hypoploid ιστόγραμμα του DNA [23]. Κύτταρα σε πλάκες 24 φρεατίων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-FU, GYP ή 5-FU + GYP για 24 και 48 ώρες, στη συνέχεια χρωματίστηκαν με 5 μg /ml ΡΙ, διαπερατά με ψύξη-ρίψη και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Τα ιστογράμματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό FCS Express V3.

Comet δοκιμασία, μια ευαίσθητη και ταχεία τεχνική για την ανίχνευση της βλάβης του DNA σε μεμονωμένα κύτταρα, διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24].

Μέτρηση της ενδοκυτταρικής ROS παραγωγή

Η μεταβολή της ενδοκυτταρικής επίπεδο ROS μετρήθηκε χρησιμοποιώντας την οξειδωτική μετατροπή της ευαίσθητης φθορίζοντα ανιχνευτή 2 ‘, 7′-διχλωρο-διοξεικό (DCFH-DA) να φθορίζουν 2′, 7’-διχλωρο (DCF ). DCFH-DA διαχέεται εύκολα μέσω της κυτταρικής μεμβράνης και υδρολύεται ενζυματικά από ενδοκυτταρικές εστεράσες για να σχηματίσει μη φθορίζουσα DCFH, το οποίο στη συνέχεια ταχέως οξειδώνεται για να σχηματίσει εξαιρετικά φθορίζουσα DCF παρουσία ROS, και η ένταση φθορισμού είναι ανάλογη με την παραγωγή ROS. Τα κύτταρα επωάστηκαν με 5-FU, GYP ή 5-FU + GYP για 6 και 12 ώρες, στη συνέχεια χρωματίστηκαν με 10 μΜ DCFH-DA στους 37 ° C στο σκοτάδι για 30 λεπτά. Μετά από πλύση με PBS τρεις φορές, τα κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού, αμέσως (Nikon, Ιαπωνία).

NAC (5 mM) χρησιμοποιήθηκε ως ένας καθαριστής ROS προστίθεται στο μέσο καλλιέργειας συγχρόνως με 5-FU και /ή GYP προσθήκη. Η παραγωγή ROS, βλάβη του DNA και την κυτταρική απόπτωση αναλύθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω.

Pifithrin-α (10 μΜ) χρησιμοποιήθηκε ως αναστολέας της p53 ώστε να μειώνει την έκφραση του p53 σε μέσο καλλιέργειας όταν τα κύτταρα επωάστηκαν με 5 -FU ή /και GYP. Η βιωσιμότητα των κυττάρων, την παραγωγή ROS και βλάβη του DNA αναλύθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω.

κηλίδωση Western ανάλυση

κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Πρωτεΐνες (60 μα) υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου 5 έως 13,5%, και τα πηκτώματα μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Millipore, ΜΑ, USA) που επωάστηκαν με σχετικών αντισωμάτων. Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα αντισώματα: Phospho-ρ53 (Ser15), Phospho-cdk2 (Thr160), Κασπάση 3, κασπάση 9, Bcl-2, Ser139-Histone H2A.X, Διασπασμένη PARP-, β-ακτίνη (Cell Signaling Technology, Danvers , MA, USA) και κυκλίνης Ε (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Η έκφραση β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως ζώνη αναφοράς. Ο ρυθμός έκφρασης πρωτεΐνης ποσοτικοποιείται με Ποσότητα Ένα λογισμικό.

μοντέλο όγκου ξενομοσχεύματος

Τα μυϊκά ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα CT-26 ελήφθη από το κινητό Resource Center, Ινστιτούτο Βασικών Ιατρικών Επιστημών (Πεκίνο, Κίνα), και η κατάσταση του πολιτισμού ήταν ίδια με SW-480 κύτταρα. Τα ποντίκια BALB /c (θηλυκό, 18-20 g σωματικού βάρους) χορηγήθηκαν από το Πειραματικό Κέντρο Ζώων του τέταρτου Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο (Xi’an, Κίνα). Είχαν στεγάζεται σε ένα κλιματιζόμενο δωμάτιο στους 23 ± 2 ° C, με ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό και διατηρήθηκαν σε ένα κύκλο φωτός-σκότους 12 h. Αφού τροφοδοτηθεί στις εγκαταστάσεις μας για 1 εβδομάδα, αναμένουμε τρία ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν ως κανονικό έλεγχο, όλες οι άλλες εμβολιάσθηκαν με 0,1 ml από κύτταρα CT-26 (1 χ 10

7 κύτταρα /ml) μέσα στην περιοχή αριστερά oxter και τυχαία διαιρέθηκαν σε 6 ομάδες με 6-8 ζώα σε κάθε ομάδα. Η θεραπεία άρχισε την ημέρα μετά από CT-26 κύτταρα εμφύτευση (ημέρα 1). Ομάδα μου δόθηκε αντίστροφη όσμωση νερό μέσω πλύση στομάχου καθημερινή και τακτική φυσιολογικό ορό με ενδοπεριτοναϊκή ένεση κάθε δεύτερη ημέρα με την ομάδα ελέγχου? Ομάδα II εγχύθηκε με 5 mg /kg 5-FU ενδοπεριτοναϊκώς κάθε δεύτερη ημέρα? Ομάδα III έλαβε 25 mg /kg GYP μέσω πλύσης στομάχου κάθε ημέρα? Ομάδα IV έλαβε 50 mg /kg GYP μέσω πλύση στομάχου κάθε μέρα? Ομάδα V δόθηκε 5 mg /ml 5-FU + 25 mg /ml GYP και Ομάδα VI δόθηκε 5 mg /kg 5-FU + 50 mg /kg GYP. Οι μεγάλες (α) και μικρή (β) διάμετροι των όγκων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας καλίμπρες ολίσθησης κάθε μέρα μετά την Ημέρα 6 για υπολογίζονται όγκου του όγκου ως τον τύπο: ab

2/2. Το σωματικό βάρος μετρήθηκε επίσης.

Τα ποντίκια παρατηρήθηκαν καθημερινά για κλινικά σημεία και θυσιάστηκαν για την δέκατη ένατη ημέρα. δείγματα όγκου ζυγίσθηκαν και σταθεροποιήθηκαν με 10% φορμαλίνη για τουλάχιστον 24 ώρες, με ενσωματωμένο παραφίνη, στη συνέχεια χρωματίζονται με χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης και ανοσοϊστοχημεία. Ο ρυθμός αναστολής υπολογίστηκε ως εξής: (1- μέσος όρος του βάρους του όγκου της ομάδας αγωγής /μέσο βάρος όγκου της ομάδας ελέγχου) χ 100%. Εν τω μεταξύ, η σπλήνα αποκόπηκαν και ζυγίστηκαν για υπολογίζονται τα ευρετήρια σπλήνα ως εξής: σπλήνα βάρος /βάρος σώματος χ 100%. Τα επίπεδα της AST, ALT, BUN και Cr στον ορό ανιχνεύτηκαν επίσης.

Τα πειράματα χρησιμοποιώντας ποντίκια διεξήχθησαν σύμφωνα με το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου και εγκρίθηκαν από το Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και χρήση πανεπιστημίου της Shaanxi Normal University (Xi’an, Κίνα).

η ανοσοϊστοχημεία

δοκιμασία

η ανοσοϊστοχημεία έγινε στις 7 μm τομές των δειγμάτων σε παραφίνη ενσωματωμένα χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντι-PCNA αντίσωμα (Abcam, Cambridge, UK). Εν συντομία, μετά αποπαραφινώσεως και ενυδάτωση, οι τομές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ανάκτηση αντιγόνου θερμότητα μεσολάβηση χρησιμοποιώντας 10 mM κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ 6.0) για 15 λεπτά και κατέστησαν διαπερατά με 0,2% Triton Χ-100 για 15 λεπτά. Στη συνέχεια, η ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποσβέστηκε με διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου 3% επί 10 λεπτά. Η μη ειδική δέσμευση αποτράπηκε με επώαση με 5% φυσιολογικό ορό κατσίκας για 15 λεπτά. Μετά από αυτό, οι τομές επωάστηκαν με αντίσωμα αντι-ΡΟΝΑ (1: 8000 αραιώσεις) όλη τη νύκτα στους 4 ° C σε ένα υγρό θάλαμο. Η σύνδεση αντισώματος ανιχνεύθηκε με τη χρησιμοποίηση χρένου δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση στους 37 ° C για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, οι τομές ορατές με διάλυμα διαμινοβενζιδίνης, βάφτηκαν αντίθετα ελαφρά με αιματοξυλίνη, αφυδατώθηκαν με αιθανόλη και παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φωτός (Nikon, Ιαπωνία).

Στατιστική ανάλυση

SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago ) χρησιμοποιήθηκε για στατιστική ανάλυση. Οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD) από τα τρία δείγματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Στατιστικές συγκρίσεις έγιναν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA),

σ

* & lt? 0.05 θεωρήθηκε σημαντική διαφορά,

σ

** & lt? 0,01 και

σ

##

& lt? 0.01 θεωρήθηκαν ότι είναι εξαιρετικά σημαντική διαφορά.

Αποτελέσματα

GYP ενισχύει συνεργικά 5-FU-επαγόμενη αναστολή κυτταρικής βιωσιμότητας

Το σχήμα 1Β δείχνει την κυτταροτοξικότητα της 5-FU επί SW -480, SW-620 και Caco2 κύτταρα για τη θεραπεία 48 ώρες αντίστοιχα. κύτταρα Caco2 εκτελείται πιο ευαίσθητα από SW-480 και SW-620 κυττάρων σε 5-FU θεραπεία (η τιμή IC50 υπολογίστηκε ως 31,75 μg /ml για Caco2 και 257.23, 366.40 μg /ml για SW-480, SW-620 κύτταρα). Όταν η συγκέντρωση υπερβαίνει τα 50 μg /ml, SW-480 και SW-620 κυττάρων δείχνουν κάπως αντίσταση σε θεραπεία 5-FU. Ωστόσο, GYP ανέστειλε SW-480, SW-620 και Caco2 κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε ένα δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο (η τιμή IC50 υπολογίστηκε ως 99.59, 107.53 και 112.22 μg /ml για, SW-620 και Caco2 κύτταρα SW-480 μετά από επώαση για 24 ώρες, το Σχ 1Γ-1Ε). Όταν συν-κατεργασμένα κύτταρα με GYP (70, 85, 100 μg /ml) και 5-FU (5, 10 μg /ml) ταυτόχρονα, η συνδυασμένη θεραπεία, ακόμη και στις χαμηλές δόσεις που εμφανίζονται πολύ υψηλότερη αντι-πολλαπλασιαστική δραστηριότητα επί SW-480 , SW-620 και Caco2 κύτταρα από εκείνη της απλής θεραπείας. Για παράδειγμα, η θεραπεία της SW-480 κυττάρων με 5 μg /ml 5-FU ή μόνο του για 24 ώρες 70 μg /ml GYP ανέστειλε την κυτταρική βιωσιμότητα κατά 14,6 ± 2,67% (

σ

˂ 0,05

vs

έλεγχος) και 13,8 ± 2,80% (

σ

˂ 0,05

vs

έλεγχο), αντίστοιχα. Παρ ‘όλα αυτά, η θεραπεία της SW-480 κυττάρων με 5 μg /ml 5-FU + 70 μg /ml GYP για 24 ώρες σημαντική ανέστειλε κυτταρική βιωσιμότητα με 53,29 ± 1,02% (

σ

˂ 0,01

vs

έλεγχος και 5-FU μόνο). Όταν ο χρόνος επώασης αυξήθηκε σε 48 ώρες, η αναστολή βιωσιμότητα κυττάρου των 5 μg /ml 5-FU ήταν 32,37 ± 3,22% (

σ

˂ 0,01

vs

έλεγχος), 70 μg /ml GYP ήταν 24,87 ± 1,83% (

σ

˂ 0,01

vs

ελέγχου), 5 μg /ml 5-FU + 70 μg /ml GYP ήταν 72.11 ± 1.53% (

p

˂ 0,01

vs

ελέγχου και 5-FU μόνο).

Για να επικυρώσετε περαιτέρω τη συνεργική χαρακτηριστικό του 5-FU και GYP, τις επιπτώσεις της αναστολής κυτταρικής βιωσιμότητας του ενιαίου και συνδυασμένη θεραπεία αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό CalcuSyn. Η τιμή CI για 5-FU + θεραπεία GYP SW-480 κύτταρα ήταν 0,68 ± 0,05, SW-620 κύτταρα ήταν 0.65 ± 0.10 και τα κύτταρα Caco2 ήταν 0,72 ± 0,07 σύμφωνα με τις εφαρμοζόμενες δόσεις (σχήμα 1Γ-1Ε). Για SW-480 κύτταρα, ο συνδυασμός 5-FU (5 μg /ml) και GYP (70 μg /ml) έδειξαν τον καλύτερο συνεργιστική ικανότητα αναστολής (οι τιμές CI ήταν 0,63 και 0,68 για 24 και 48 ώρες), το οποίο επελέγη για περαιτέρω μηχανιστικών μελετών. Επιπλέον, 5-FU και GYP σε συνδυασμό παρουσίασαν πολύ ασθενέστερη τοξικότητας προς ανθρώπινη φυσιολογική ομφαλικής φλέβας ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC (Σχήμα 1 F).

δοκιμασία σχηματισμού αποικιών έγινε για την επαλήθευση των πολλαπλασιαστικού δυναμικού των κυττάρων SW-480 και Caco2 μετά από 5-Fu και /ή θεραπεία GYP. Σχήμα 1G έδειξε ότι η 5-Fu, GYP, 5-FU + GYP όλα αναστέλλουν μακροπρόθεσμη πολλαπλασιαστικού δυναμικού των κυττάρων Caco2 SW-480 ή, σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα ομάδα (

ρ

& lt? 0,01 vs ελέγχου), και το πιο σημαντικό ένα με λιγότερες σχηματισμό άνω και κάτω τελείες παρατηρήθηκαν σε 5-FU ομάδα + GYP (

σ

& lt? 0.01 vs 5-FU ή GYP μόνο).

ανταπόκριση αποπτωτικά προκαλείται από 5- Fu και /ή GYP

Όπως φαίνεται στο Σχ 2Α, στο μη επεξεργασμένο έλεγχο, 93,35 ± 0,84% ήταν βιώσιμα, 0.2 ± 0.06% του πληθυσμού των κυττάρων ήταν στο πρώιμο στάδιο της απόπτωσης (κάτω δεξιά) και 2,75 ± 1,32% κυτταρικός πληθυσμός ήταν στο όψιμο στάδιο της απόπτωσης (επάνω δεξιά). Σε 5-Fu ομάδα θεραπείας, ο πληθυσμός αποπτωτικό κυτταρικό (κάτω δεξιά και πάνω δεξιά) ήταν 3,65 ± 0,81%. Στην ομάδα θεραπείας GYP, 20,6 ± 1,63% κυττάρων ήταν στο στάδιο της απόπτωσης (

σ

& lt? 0,01

vs

ελέγχου). Ενώ στην 5-FU ομάδα + GYP, 42.15 ± 0.67% κυττάρων ήταν στην αποπτωτική στάδιο (

σ

& lt? 0,01

vs

ελέγχου και 5-FU μόνο).

(Α) Cell απόπτωση ανιχνεύθηκε με Annexin V-ΡΕ /7-AAD δοκιμασία μετά από 5-FU ή /και θεραπεία GYP για 24 ώρες σε SW-480 κύτταρα. (Β) Το επίπεδο έκφρασης της κασπάσης 3, κασπάσης 9, Bcl-2 και διασπάται-ΡΑΚΡ σε SW-480 κύτταρα ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western. (Γ) Η πυρηνική συμπύκνωση και την κυτταρική αλλαγή της μορφολογίας στη ΝΔ-480 κύτταρα μετά από 5-FU συν-επεξεργασία με GYP παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας Hoechst χρώση 33342. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν ανεξάρτητα ανά πειραματικό σημείο, και αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα φάνηκαν. Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SD του τριπλούν και

σ

* & lt? 0.05,

σ

** & lt? 0,01 έναντι του ελέγχου.

Η

κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε με την ανάλυση της πιθανός μηχανισμός εργάστηκε σε 5-FU και GYP προκάλεσε την απόπτωση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, 5-FU + GYP ενισχυθεί σε μεγάλο βαθμό κασπάσης 3, κασπάσης 9 και PARP διάσπαση και ρυθμισμένα προς τα κάτω την έκφραση των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 σε SW-480 κύτταρα (

ρ

& lt? 0,01 ή

σ

& lt? 0,05

vs έλεγχο

)

μορφολογικές αλλαγές που προκαλούνται από 5-FU και GYP σε SW-480 κύτταρα

Σχήμα 2C. δείχνει τις μορφολογικές αλλαγές μετά από 5-FU ή /και θεραπεία GYP χρησιμοποιώντας Hoechst 33342 χρώσης. Ελαφρώς μπλε και ομοιογενή κύτταρα παρατηρήθηκαν στην ομάδα ελέγχου? 5-Fu κύτταρα ή GYP αντιμετωπίζονται έδειξε ελαφρά αύξηση της Hoechst χρώση 33342? ενώ στην ομάδα 5-FU + GYP, τα κύτταρα που ασκείται εντυπωσιακά αλλαγές: συμπυκνωμένη χρωματίνη, κατακερματισμένη στικτή μπλε πυρηνικό φθορισμό. Επιπλέον, οι εικόνες φάση αποκάλυψαν ότι τα κύτταρα σε 5-FU ομάδα θεραπείας + GYP ήταν συρρικνωμένο σε ανώμαλη γύρο τύπο, και οι αριθμοί των κυττάρων ήταν επίσης μειωμένη ευδιάκριτα.

Επιδράσεις της 5-FU ή /και GYP στο κελί

διανομή κύκλος

η κυτταρομετρία ροής αναλύει στο Σχήμα 3Α δείχνει ότι σε σύγκριση με τον έλεγχο (G0 /G1-φάση, 33,8 ± 1,06%? S-φάση, 28.25 ± 0.59%, και G2 /M φάση, 37.94 ± 0.65 %), υπήρξε μια συσσώρευση του πληθυσμού κυττάρων σε G0 /G1 φάσης (51.56 ± 1.08%,

σ

& lt? 0,01

vs

ελέγχου) και S-φάσης (36,6 ± 0,91% ,

σ

˂ 0,05

vs

ελέγχου) μετά από θεραπεία 5-FU. GYP που προκαλείται από τη συσσώρευση του πληθυσμού κυττάρων σε G0 /G1 φάσης (45.97 ± 1.06%,

σ

& lt? 0,01

vs

ελέγχου). Στην ομάδα θεραπείας + GYP 5-FU, υπήρχαν περισσότερα κύτταρα στο G0 /G1 φάσης (56,58 ± 0,57%,

ρ

& lt? 0,01

vs

ελέγχου) και S-φάση (38.78 ± 0.46%,

σ

& lt? 0,05

vs

ελέγχου). Μια παρόμοια τάση βρέθηκε επίσης μετά από 5-Fu, GYP ή 5-FU θεραπεία + GYP για 48 ώρες.

(Α) κατανομή κυτταρικού κύκλου μετά από 5-FU και θεραπεία GYP. (Β) Η έκφραση της φωσφο-ρ53, φωσφο-cdk2 και κυκλίνη Ε μετά από 5-FU και /ή θεραπεία GYP σε SW-480 κύτταρα ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν ανεξάρτητα ανά πειραματικό σημείο, και αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα φάνηκαν. Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SD του τριπλούν και

σ

* & lt? 0.05,

σ

** & lt? 0.01 έναντι ελέγχου.

Η

Η έκφραση φωσφο-ρ53, φωσφο-cdk2 και κυκλίνη Ε σε SW-480 κύτταρα μετά από 5-FU ή /και θεραπεία GYP ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western. Όπως φαίνεται στο Σχ 3Β, 5-FU + GYP αύξησε σημαντικά την έκφραση του φωσφο-ρ53, αλλά μείωσε την έκφραση της κυκλίνης Ε και φωσφο-cdk2 (

ρ

& lt? 0,01 ή

p

& lt? 0,05

vs έλεγχο

) μετά από 24 και 48 ώρες επώασης

ανταπόκριση βλάβες στο DNA που προκαλούνται από 5-Fu, GYP και 5-FU + GYP

Όπως περιγράφεται στο. οι μέθοδοι, ανάλυση κυτταρομετρίας ροής διεξήχθη για να διερευνηθεί η αποτελεσματικότητα της θεραπείας 5-FU + GYP για κατάτμηση του DNA σε SW-480 κύτταρα. Το σχήμα 4Α δείχνει ότι το επίπεδο του κατακερματισμού του DNA στην ομάδα ελέγχου ήταν 4,66 ± 1,55%. Μετά την αγωγή με 5-FU, GYP ή 5-FU + GYP για 24 ώρες, υπήρχε μία αυξανόμενη τάση (8,2 ± 0,48%, 15.4 ± 2.74%, και 45,15 ± 1,63%, αντίστοιχα) στα επίπεδα κατακερματισμού του DNA. Ο βαθμός κατακερματισμού του DNA στο 5-FU ομάδα που αντιμετωπίστηκε + GYP ήταν σημαντικά αυξημένα (

σ

& lt? 0,01

vs

ελέγχου και 5-FU μόνο). Ένα παρόμοιο φαινόμενο βρέθηκε μετά από 48 ώρες επώασης και ο κατακερματισμός του DNA αυξήθηκε σε 64,65 ± 3,62% (

σ

& lt? 0,01

vs

ελέγχου και 5-FU μόνο) μετά από 5-FU + θεραπεία GYP όταν η κατάτμηση του DNA στον έλεγχο, 5-Fu, και μόνη ομάδα GYP ήταν 4,2 ± 0,81%, 20,85 ± 2,70% και 24,80 ± 1,96%, αντίστοιχα.

(Α) κατάτμηση DNA ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ροή κυτταρομετρία μετά 5-FU, GYP και 5-FU + GYP θεραπεία σε SW-480 κυττάρων μετά από 24 και 48 ώρες. Ιστογράμματα έδειξε αριθμός κυτταρικών καναλιών (κάθετος άξονας) έναντι φθορισμού ΡΙ (οριζόντιος άξονας). (Β) Comet δοκιμασία διεξήχθη για την ανίχνευση της βλάβης του DNA μετά από 5-FU συν-θεραπεία με GYP. (Γ) Το επίπεδο έκφρασης του Ser139-ιστόνης H2A.X προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν ανεξάρτητα ανά πειραματικό σημείο, και αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα φάνηκαν. Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SD του τριπλούν και

σ

* & lt? 0.05,

σ

** & lt? 0,01 έναντι του ελέγχου?

σ

##

& lt? 0,01 έναντι 5-FU ή GYP μόνη ομάδα.

Η

Comet δοκιμασία και η έκφραση των γH2A.X πραγματοποιήθηκαν για την επαλήθευση ότι η βλάβη στο DNA επιδεινώθηκε από 5-FU σε συνδυασμό με GYP. Το σχήμα 4Β δείχνει ότι η 5-FU, GYP και 5-FU + GYP όλα επαγόμενη ποικίλους βαθμούς βλάβης του DNA σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου χωρίς θεραπεία, και το πιο σημαντικό ένα με περισσότερα κύτταρα παρήγαγε ένα μεγάλο ουρά του κομήτη παρατηρήθηκε σε 5-FU + ομάδα GYP. Σχήμα 4C δείχνει ότι η 5-FU σε συνδυασμό με GYP επιδεινώνεται η φωσφορυλίωση της γH2A.X.

ROS συσσώρευση μετά από 5-FU θεραπεία + GYP

Η ενδοκυτταρική ROS ανιχνεύθηκε με χρώση DCFH-DA σε 6 και 12 ώρες μετά από διαφορετικές επεξεργασίες. Όπως απεικονίζεται Σχήμα 5Α, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου σε 5-FU ομάδα + GYP έδειξε ισχυρή φθορισμού DCF σε 6 και 12 ώρες μετά τη θεραπεία, κελί στην ομάδα GYP έδειξαν κάποια ορατή φθορισμό DCF σε 6 ώρες και ελαφρώς ενισχυμένη σε 12 ώρες, ενώ χωρίς προφανή φθορισμός παρατηρήθηκε στην ομάδα της μονοθεραπείας 5-FU. Για την περαιτέρω επικύρωση του ρόλου του ROS στο φαινόμενο κατά του όγκου της 5-FU + GYP, NAC προστέθηκε σε μείωση του επιπέδου ROS, τότε βλάβης του DNA και την κυτταρική απόπτωση αναλύθηκαν. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η NAC συν-θεραπεία αποτελεσματική κατέστειλε την ενδοκυτταρική παραγωγή ROS με τον φθορισμό DCF εξαφανίστηκε (Σχήμα 5Β). Η βλάβη στο DNA που προκαλούνται από θεραπεία 5-FU + GYP μερικώς διασωθεί από NAC (

σ

& lt? 0,01

vs

έλεγχο, σχήμα 5C). 5-FU + GYP προκάλεσε κυτταρική απόπτωση επίσης εμποδίζεται σημαντικά από την NAC (

σ

& lt? 0,01

vs έλεγχο

, Σχήμα 5D).

(α) παραγωγή Ενδοκυτταρική ROS μετά από 5-Fu ή /και θεραπεία GYP ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας χρώση DCFH-DA. (Β-D) παραγωγή Ενδοκυτταρική ROS, κατακερματισμού του DNA και την κυτταρική απόπτωση σε SW-480 κύτταρα μετρήθηκαν μετά προστέθηκαν NAC σε μέσο καλλιέργειας συγχρόνως με 5-FU και GYP. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν ανεξάρτητα ανά πειραματικό σημείο, και αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα φάνηκαν. Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SD του τριπλούν και

σ

** & lt? 0,01 έναντι του ελέγχου?

σ

##

& lt? 0,01 έναντι 5-FU + GYP ομάδα.

Η

Ο ρόλος του p53 σε 5-FU θεραπεία + GYP

Η υπερβολική παραγωγή των ROS μπορούν να βλάψουν το DNA και προκαλούν δραστηριότητα p53 για την επαγωγή του κυτταρικού κύκλου σύλληψη και απόπτωση [26,27]. Τα αποτελέσματά μας βρέθηκαν φωσφορυλίωση ρ53 αυξήθηκε σημαντικά μετά από 5-FU θεραπεία + GYP (Σχήμα 3Β). Για την περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου της ρ53 σε 5-FU συν-κατεργασία με GYP επαγόμενη απόπτωση, pifithrin-α, έναν αναστολέα της ρ53, προστέθηκε για να μειώσει την έκφραση του p53, και στη συνέχεια ενδοκυτταρική επίπεδο ROS, βλάβη του DNA και την κυτταρική βιωσιμότητα ήταν εντοπιστεί. Σχήμα 6Α δείχνει ότι pifithrin-α αντιστραφεί σημαντικά την 5-FU + GYP-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο σε SW-480 κυττάρων με το κυτταρική βιωσιμότητα αυξήθηκε από 47.49 ± 2.1% έως 79,22 ± 0,63% (

ρ

& lt? 0.01

vs

ελέγχου). Ωστόσο, συν-θεραπεία με pifithrin-α δεν επηρεάζουν την ενδοκυτταρική συσσώρευση ROS και σοβαρές βλάβες στο DNA που προκαλούνται από 5-FU κατεργασία + GYP (Σχήμα 6Β και 6C).

(Α) Κυτταρική βιωσιμότητα, (Β) παραγωγή Ενδοκυτταρική ROS και (Γ) βλάβη του DNA ανιχνεύθηκαν μετά προστέθηκαν pifithrin-α σε μέσο καλλιέργειας συγχρόνως με 5-FU συν GYP. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν ανεξάρτητα ανά πειραματικό σημείο, και αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα φάνηκαν.