Αφηρημένο

Προηγούμενες μελέτες από την ομάδα μας έχουν δείξει ότι τα επίπεδα έκφρασης των Orc6 ήταν ιδιαίτερα αυξημένα σε παχέος δείγματα ασθενή με καρκίνο και η επαγωγή Orc6 συνδέθηκε με 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) θεραπεία. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν η διερεύνηση της μοριακής και κυτταρικής επιπτώσεις της Orc6 στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιούμε HCT116 (wt-p53) και HCT116 (null-p53) καρκίνο του κόλου κυτταρικές σειρές σαν ένα σύστημα μοντέλο για τη διερεύνηση των επιπτώσεων των Orc6 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, χημειοευαισθησία και οδών που εμπλέκονται με Orc6. Δείξαμε ότι ο προς τα κάτω ρύθμιση του Orc6 ευαισθητοποιεί κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου σε αμφότερους τους 5-FU και σισπλατίνη (cis-pt) θεραπεία. Μειωμένη έκφραση Orc6 σε κύτταρα HCT-116 (wt-p53) με παρεμβολή RNA προκάλεσε διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1. Η παρατεταμένη αναστολή της έκφρασης Orc6 οδήγησε σε πολυπύρηνα κύτταρα σε HCT-116 (wt-p53) κυτταρική γραμμή. Ανάλυση ανοσοκηλίδος Western έδειξαν ότι κάτω ρύθμιση του Orc6 επαγόμενη έκφραση ρ21 σε κύτταρα HCT-116 (wt-p53). Η επαγωγή του ρ21 επιτεύχθηκε με τη μεσολάβηση αυξημένο επίπεδο της φωσφορυλιωμένης ρ53 σε Ser-15. Αντίθετα, δεν υπάρχει καμία αυξημένη έκφραση του p21 σε κύτταρα HCT-116 (null-p53). Orc6 κάτω ρύθμιση αύξησε επίσης την έκφραση της βλάβης του DNA πρωτεΐνης επιδιόρθωσης GADD45β και μείωσε το επίπεδο έκφρασης του JNK1. Orc6 μπορεί να είναι ένας πιθανός νέος στόχος για τη μελλοντική καταπολέμηση του καρκίνου θεραπευτική ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Gavin EJ, Τραγούδι Β, Wang Υ, Xi Υ, Ju J (2008) Μείωση του Orc6 Έκφραση ευαισθητοποιεί τα Ανθρώπινα καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα σε 5-φθοριοουρακίλη και τη σισπλατίνη. PLoS ONE 3 (12): E4054. doi: 10.1371 /journal.pone.0004054

Επιμέλεια: Μιχαήλ Β Blagosklonny, Ordway Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26 του Νοέμβρη 2008? Δεκτές: 1 του Δεκεμβρίου του 2008? Δημοσιεύθηκε: 29, Δεκεμβρίου, 2008

Copyright: © 2008 Gavin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από ταμείο εκκίνησης καρκίνο γονιδιωματική εργαστήριο Mitchell Ινστιτούτο καρκίνου στο (J. Ju) και ΝΙΗ CA114043 (J. Ju). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Orc6 είναι ένα από τα έξι αναγνώριση προέλευσης σύμπλοκο πρωτεϊνών σε ανθρώπινα κύτταρα. Λειτουργεί ως η αρχική πλατφόρμα συναρμολόγησης που απαιτείται για την αντιγραφή του DNA. Οι ρόλοι των Orc6 στην αντιγραφή του DNA έχουν διερευνηθεί εκτενώς σε ζυμομύκητες και Drosophila [1], [2], [3], [4], [5], [6]. Αλλά υπάρχουν περιορισμένες πληροφορίες σχετικά με τον καρκίνο του ανθρώπου [7], [8]. Έχει αναφερθεί ότι εκτός από τη λειτουργία του ως πρωτεΐνη αντιγραφής του DNA ενάρξεως, παίζει επίσης καθοριστικό ρόλο στην μεταγραφική γονιδιακή σίγηση και σχηματισμός ετεροχρωματίνης [8]. Ωστόσο, δεν είναι σαφές κατά τη διάρκεια της συγκρότημα συναρμολόγησης έναρξη κατά την οποία το βήμα ότι Orc6 συμμετέχει [9]. Έχει αποδειχθεί κομψά με Prasanth

et al.

Τη δυναμική του Orc6 εντοπισμού κατά τη διάρκεια ολόκληρου του κυτταρικού κύκλου, συμπεριλαμβανομένης της αντιγραφής του DNA, χρωμόσωμα regregation, και κυτοκίνηση. Προτείνουν επίσης Orc6 μπορεί να λειτουργούν σε σηματοδότηση προς έλεγχο του κυτταρικού κύκλου [8]. Το ενδιαφέρον μας στην Orc6 προήλθε από προηγούμενες μελέτες μας με μια ολοκληρωμένη ανάλυση της γονιδιωματικής αποκάλυψε ότι Orc6 συνδέεται με 5-FU συνδέονται αντίσταση στον καρκίνο του παχέος εντέρου ανθρώπινες κυτταρικές σειρές [10]. παρακολούθηση μελέτη μας χρησιμοποιώντας παχέος δείγματα ασθενών επιβεβαίωσε περαιτέρω ότι η έκφραση του Orc6 είναι ιδιαίτερα αυξημένα σε ανθρώπινους ιστούς παχέος όγκου σε σύγκριση με δείγματα φυσιολογικού αντιστοιχισμένο [11]. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την κλινική σημασία των Orc6 οδηγεί σε υπόθεση μας ότι Orc6 μπορεί να είναι ένας βασικός παράγοντας που εμπλέκεται σε καρκίνο του παχέος εντέρου. αυξημένα επίπεδα της μπορεί επίσης να είναι μια σημαντική συμβολή στο χημειοαντίσταση. ρ53 είναι ένα από τα πιο συχνά μεταβάλλονται καταστολείς όγκων σε καρκίνο του παχέος εντέρου και λόγω κρίσιμη λειτουργία του στον έλεγχο του κύκλου [12], [13]. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιούμε ένα ζευγάρι καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές είτε με άγριου τύπου ρ53 ή null p53 ως πρότυπο σύστημα μας.

Σε αυτή τη μελέτη, παρέχουμε πειραματικές αποδείξεις ότι η μείωση της έκφρασης Orc6 από παρεμβολή RNA μπορεί να ευαισθητοποιήσει του παχέος εντέρου καρκινικές κυτταρικές γραμμές σε δύο από τις σημαντικότερες χημειοθεραπευτικών παραγόντων 5-FU και θεραπεία σισπλατίνη. Η μείωση της έκφρασης Orc6 από siRNA knock-down προκάλεσε τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου και μειώθηκε κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε κύτταρα HCT-116 (wt-p53). Αντίθετα, αυτή η επίδραση ήταν σημαντικά μειωμένη σε κύτταρα HCT-116 (null-p53). Αλλοίωση του ελέγχου του κυτταρικού κύκλου από μειωμένη Orc6 έκφραση οφείλεται στην επαγωγή του ρ21, ένα σημαντικό γονίδιο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου. Η επαγωγή της p21 ήταν λόγω της αυξημένης το επίπεδο των phosphorylatd του p53 σε ser-15 ενεργοποιείται από knock-down της έκφρασης Orc6. Orc6 μπορεί να είναι ένας πιθανός νέος στόχος για νέα αντι όγκου θεραπευτική ανάπτυξη.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Η μείωση της έκφρασης Orc6 σε κύτταρα HCT-116 (wt-p53) αναστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό

τα αυξημένα επίπεδα του Orc6 σε δείγματα ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου μας οδήγησε στην διερεύνηση των ρόλων των Orc6 στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου και την ευαισθησία του φαρμάκου. Χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση knock-down siRNA, επιβεβαιώσαμε πρώτα ότι τα επίπεδα πρωτεΐνης Orc6 ήταν μειωμένη με χρήση ανάλυση ανοσοκηλίδος Western τόσο HCT (wt-p53) κύτταρα (Σχήμα 1Α, λωρίδα 1, μη ειδική siRNA ελέγχου? Λωρίδα 2, siRNA κατά Orc6) και HCT-116 (null-p53) κύτταρα (Σχήμα 1Α, λωρίδα 3, μη ειδική siRNA ελέγχου? διαδρομή 4, siRNA κατά Orc6). Η έκφραση της πρωτεΐνης Orc6 μειώθηκε κατά περισσότερο από 5 φορές σε HCT (wt-p53) και κύτταρα HCT-116 (null-p53).

α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος (Α). Αυξημένη πολυπυρήνωση κατόπιν αποσιώπηση του Orc6 σε κύτταρα με siRNA HCT-116 (wt-p53). Αριστερό πάνελ, το φως της εικόνας? Δεξιό πίνακα, DAPI πυρηνική χρώση (Β).

Η

Έχει αποδειχθεί στο παρελθόν ότι knock-down Orc6 στα κύτταρα HeLa που προκαλείται polypoidy [8]. Τα αποτελέσματά μας επιβεβαίωσε αυτή σε καρκινικά κύτταρα κόλου, μετά από επανειλημμένες διαμόλυνση κάθε 3 ημέρες, τα κύτταρα με μειωμένη έκφραση Orc6 HCT-116 (wt-p53) έγιναν πολυπύρηνα (Σχήμα 1Β). Αυτός ο πληθυσμός αυξήθηκε με τον χρόνο. Χρωματίνης βάφτηκε με 4 ‘, 6’-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) για να δείξει πολυπύρηνα κύτταρα μετά από παρατεταμένη Orc6 knockdown με siRNA (αριστερό πάνελ, σκέδαση φωτός κύτταρο εικόνα? Δεξιό πάνελ, ϋΑΡΙ πυρηνική χρώση εικόνα στο Σχήμα 1Β). ρυθμού πολλαπλασιασμού των κυττάρων μειώθηκε κατά 50% (ανοικτή ράβδος) με Orc6 knock-down (Σχήμα 2). Ωστόσο, η μείωση της έκφρασης σε κύτταρα Orc6 μειωμένη σε πολλαπλασιασμό των κυττάρων HCT-116 (null-p53) μόνο κατά 23% (διακεκομμένη γραμμή). Για να διερευνηθεί η επίδραση της μειωμένης Orc6 στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, HCT-116 (wt-p53) και HCT-116 (null-p53) κύτταρα πρώτη επιμολυσμένα με 100 nM Orc6 siRNA. Τα επιμολυσμένα κύτταρα εκτέθηκαν σε 10 μΜ 5-FU για 12 ώρες. Παρατηρήσαμε ότι 12 ώρες αργότερα, και οι δύο (wt-p53) κύτταρα HCT-116 και τα κύτταρα ελέγχου με μειωμένη κύτταρα που εκφράζουν Orc6 ήταν σε θέση να παραμένουν σε μεγάλο βαθμό στην φάση G1 του κυτταρικού κύκλου χωρίς επανεισόδου (Σχήμα 3Α). Αντίθετα, HCT-116 (null-p53) και κύτταρα ελέγχου Orc6 μειωμένη κύτταρα επανα-τέθηκε σε φάση S του κυτταρικού κύκλου, παρά την βλάβη του DNA από την 5-FU και μείωση Orc6 (Σχήμα 3Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ο έλεγχος του κυτταρικού κύκλου μετά από βλάβη του DNA ανάλογα με την παρουσία του άγριου τύπου ρ53.

Η

Επίδραση των Orc6 για χημειοευαισθησία με 5-FU και cis-pt

για τη διερεύνηση της δυνητικό αντίκτυπο των Orc6 επί χημειοευαισθησία σε μερικά από τα πρώτης γραμμής χημειοθεραπευτικές ενώσεις όπως 5-FU και cis-pt σε καρκίνο του παχέος εντέρου, τα κύτταρα HCT-116 (wt-p53) χρησιμοποιήθηκαν ως πρότυπο σύστημα μας χρησιμοποιώντας κύτταρα διαμολυσμένα με Oligofectamine μόνο, μη ειδική siRNA, και Orc6 ειδικές siRNA. Τα κύτταρα στη συνέχεια επεξεργάστηκε με 5-FU ή σισπλατίνη με σειριακή αραίωση. Μετά από 72 ώρες, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε με WST-1 προσδιορισμό. Το Σχήμα 4Α έδειξε ότι η HCT-116 (wt-p53) κυττάρων με έκφραση μειωμένη Orc6 ήταν 5 φορές πιο ευαίσθητα σε θεραπεία 5-FU σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου βασίζεται σε IC

50 τιμή. HCT-116 (wt-p53) κυττάρων με μειωμένη έκφραση Orc6 ήταν επίσης περισσότερο ευαίσθητα σε θεραπεία σισπλατίνη, συγκριτικά με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 4Β). Η επίδραση αυτή ήταν σε μεγάλο βαθμό λείπει από τα κύτταρα (τα δεδομένα δεν δείχνουν).

Η

κάτω από το ρεύμα πορείες που πραγματοποιούνται από Orc6

σηματοδότησης

Για να αρχίσουμε να καταλαβαίνουμε το ρεύμα προς τα κάτω μονοπάτια σηματοδότησης HCT116 (null-p53) δυνητικά εμπλέκονται με Orc6, μια ανάλυση γονιδιακής έκφρασης υψηλής απόδοσης χρησιμοποιήθηκε για να ποσοτικοποιήσει τις αλλαγές γονιδιακή έκφραση μεταξύ των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με Orc6 συγκεκριμένες siRNA και μη-ειδικής ελέγχου siRNA HCT-116 (wt-p53). Έκφραση και ανάλυση GeneOntology έδειξε ότι ένας αριθμός γονιδίων επηρεάστηκαν από Orc6 αναστολής (Data, S1). Με βάση τα αποτελέσματά μας, ένας αριθμός γνωστών γονίδια ελέγχου κυτταρικού κύκλου επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση ανοσοκηλίδος Western. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η έκφραση της ρ21 ήταν σημαντικά επάγεται σε κύτταρα HCT-116 (wt-p53) μετά Orc6 knock-down (Σχήμα 5, λωρίδα 1, μη ειδική έλεγχος ολίγο? λωρίδα 2, siRNA της Orc6). Επιβεβαιώσαμε επίσης ότι η έκφραση των πρωτεϊνών επιδιόρθωσης βλάβης του DNA Gadd45β επίσης επάγεται από τη μείωση της έκφρασης Orc6 σε κύτταρα HCT-116 (wt-p53) (Σχήμα 5, λωρίδα 1, μη ειδική ελέγχου siRNA? Λωρίδα 2, Orc6 ειδικές siRNA). Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι Gadd45β παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη διακοπή του κυτταρικού κύκλου, την επιδιόρθωση του DNA, την έμφυτη ανοσία, διατήρηση της σταθερότητας γονιδιώματος και την απόπτωση [7], [14], [15], [16]. Η λειτουργία του Gadd45β μεσολαβείται μέσω αλληλεπιδράσεων με άλλες πρωτεΐνες όπως cdc2 διαταράσσοντας την αλληλεπίδραση μεταξύ ccd2 και κυκλίνης Β1 σε πυροδότηση G2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου υπό γενοτοξικό στρες [17], [18]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι Gadd45β είναι τουλάχιστον, εν μέρει, υπεύθυνη για το ελάττωμα αντιγραφής του DNA που προκαλούνται από μειωμένη έκφραση Orc6 σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Η έκφραση του επιπέδου JNK1 μειώθηκε με μειωμένη έκφραση Orc6 (Σχήμα 5). Έχει αποδειχθεί ότι οι ρόλοι της JNK1 ήταν αρκετά πολύπλοκη λόγω λόγω του ρόλου της στις δύο αποπτωτικών και επιβίωσης μονοπατιών σηματοδότησης [19], [20]. Οι ινοβλάστες με knockouts JNK είναι πιο ευαίσθητα σε TNF-επαγόμενη απόπτωση [21]. Ποντίκι ινοβλάστες εμβρύου που στερούνται ΜΚΚ7 (ανάντη ενεργοποιητής της JNK) υποβάλλονται σε κυτταρική γήρανση και G2 /M ανάπτυξης σύλληψη, την περαιτέρω στήριξη διαπίστωσή μας ότι η μειωμένη έκφραση της JNK1 μπορεί να είναι ένας από τους παράγοντες που συμβάλλουν για την G2 /M σύλληψη προκλήθηκε από knock-down της Orc6 έκφρασης [22]. Οι αλλαγές αυτές ήταν σε μεγάλο βαθμό απούσα από τα κύτταρα HCT-116 (null-p53) (τα δεδομένα δεν δείχνουν). Αυτό είναι σύμφωνο με προηγούμενες μελέτες που αναφέρθηκαν p53 παίζει ρόλο κλειδί στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου σε απόκριση προς βλάβη DNA. Με την επαγωγή της έκφρασης p21, αναμένουμε ότι η μετέπειτα έκφραση της ρ53 μπορεί να αυξηθεί επειδή ρ21 είναι μια γνωστή του κυτταρικού κύκλου γονίδιο ελέγχου σημείο ελέγχου που προκαλείται από ρ53. Ωστόσο, το συνολικό κυτταρικό επίπεδο της πρωτεΐνης ρ53 δεν άλλαξε με την knock-down της έκφρασης p53 (Σχήμα 6Α, λωρίδα 1 και 2). Η επαγωγή του ρ21 ήταν απούσα σε κύτταρα HCT-116 (null-p53) με Orc6 knock-down (Σχήμα 6Α, λωρίδα 3, ελέγχου? Λωρίδα 4, siRNA της Orc6). Αυτό δείχνει ότι η επαγωγή της έκφρασης p21 πρέπει να είναι ρ53 εξαρτώμενη παρά την απουσία στο επίπεδο έκφρασης p53. Παρά το γεγονός ότι το συνολικό επίπεδο ρ53 δεν αυξήθηκε σε κύτταρα HCT-116 (wt-p53), εμείς εικάζουν ότι το επίπεδο του p53 στον πυρηνικό κλάσμα μπορεί να αυξηθεί λόγω των γνωστών συμβάν ρ53 μετατόπισης. Με το διαχωρισμό πυρήνες και κυτταρόπλασμα, αποδείξαμε ότι το επίπεδο της συνολικής πρωτεΐνης p53 στους πυρήνες δεν ήταν αυξημένος σε κύτταρα με μειωμένη έκφραση Orc6 αντιμετωπίζονται από Orc6 ειδικό siRNA (Σχήμα 6Α) HCT-116 (wt-p53). Αντ ‘αυτού, το επίπεδο της φωσφορυλιωμένης ρ53 σε Ser-15 αυξήθηκε στο πυρηνικό κλάσμα κυττάρων με μειωμένη έκφραση Orc6 (Σχήμα 6Β) HCT-116 (wt-p53). Αυτό είναι εξαιρετικά συνεπής με ένα καλά τεκμηριωμένο μηχανισμό της ρ53 σε απόκριση προς βλάβη DNA (14). Φωσφορυλιωμένη p53 σε ser-15 υπολείμματος μπορεί να μειώσει την αλληλεπίδρασή του με το αρνητικός ρυθμιστής, το ογκοπρωτείνης MDM2.

Η

(Α) Western ανοσοαποτύπωση ανάλυση της p53 και της έκφρασης p21 μετά Orc6 νοκ ντάουν από siRNA τόσο HCT-116 (wt-p53) κύτταρα (διαδρομή 1, μη ειδική ελέγχου? λωρίδα 2, ειδικές siRNA για Orc6) και HCT-116 (null-p53) κύτταρα (διαδρομή 3, μη-ειδική ελέγχου? διαδρομή 4, τα ειδικά siRNA για Orc6) . (Β) Western immunoblot ανάλυση της φωσφορυλιωμένης ρ53 έκφρασης στα Ser-15 τόσο κυτταροπλασματικό και πυρηνικό κλάσμα σε κύτταρα ελέγχου (λωρίδα 1, κυτταροπλασματική? Λωρίδα 2, πυρηνική) HCT-116 (wt-p53) και HCT-116 (wt-p53 ) κύτταρα κατεργασμένα με siRNA κατά Orc6 (διαδρομή 3, κυτταροπλασματική? λωρίδα 4, πυρηνική). Τα συνολικά επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης ρ53 χρησιμοποιήθηκαν ως πρωτεΐνη ελέγχου στο πυρηνικό κλάσματα και α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για κυτταροπλασματικά κλάσματα.

Η

Φαίνεται ότι απάντηση βλάβη του DNA που προκαλείται από ένα μειωμένο επίπεδο Orc6 προκαλείται μέσω p53 οδού που εξαρτάται έλεγχο του κυτταρικού κύκλου. Είμαστε εικάζουν ότι το υψηλό επίπεδο των Orc6 στον καρκίνο του παχέος εντέρου μπορεί να συμβάλει στην γονιδιώματος αστάθεια και ίσως με συσσωρευμένη miss-βολής της αντιγραφής του DNA με διαγραφές p53 /μεταλλάξεις σε πάνω από το 50% των όγκων παχέος εντέρου. Απώλεια της p53 σε όγκους παχέος εντέρου συμβάλλει περαιτέρω στην γονιδιώματος αστάθεια και συσσωρευμένη μεταλλάξεις. Μελλοντικές μελέτες θα χρειαστούν για την πλήρη κατανόηση των μοριακών και κυτταρικών μηχανισμός Orc6 στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Παρά τον ουσιαστικό της ρόλο στην αρχική πλατφόρμα συναρμολόγησης που απαιτούνται για την αντιγραφή του DNA, Orc6 μπορεί να έχει ένα δυναμικό ως νέος στόχος για την αντικαρκινική θεραπευτική ανάπτυξη. Η κατάσταση ίσως παρόμοια με 26S πρωτεασώματος ως στόχος για το bortezomib φαρμάκου αντισώματος. Αρχικά θεωρήθηκε ότι η στόχευση 26S πρωτεασώματος δεν είναι μια καλή στρατηγική λόγω πανταχού παρούσα ρόλο του στην πρωτεϊνική αποδόμηση [23]. Πιο πρόσφατη έκθεση από Chen

et al.

Υποδηλώνει ότι Orc6 είναι περιττή στη δραστηριότητα πρόσδεσης DNA των Orcs στη ζύμη. Αυτό υποστηρίζει περαιτέρω την αντίληψή μας ότι η στόχευση Orc6 σε καρκίνο του παχέος εντέρου είναι μια εφικτή στρατηγική για τη μελλοντική θεραπευτική ανάπτυξη [24].

Εν κατακλείδι, αποδείξαμε, στην παρούσα μελέτη, ότι η προς τα κάτω ρύθμιση των Orc6 σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου ευαισθητοποιήσει κύτταρα σε 5-FU και σισπλατίνη θεραπεία. Μαζί με προηγούμενες μελέτες μας ότι Orc6 ήταν ιδιαίτερα υπερεκφράζεται σε ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο, πιστεύουμε ότι Orc6 μπορεί να έχει δυναμικό ως νέο αντικαρκινικό στόχο για μελλοντική αντινεοπλασματική θεραπευτική ανάπτυξη.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου, HCT-116 (wt-p53) και HCT-116 (null-p53) κύτταρα ήταν ένα δώρο από τον καθηγητή Bert Vogelstein (Πανεπιστήμιο Johns Hopkins, Βαλτιμόρη, MD) , και διατηρήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α (Gibco Laboratories). 5-FU και σισπλατίνη αγοράστηκαν από τη Sigma.

siRNA Επιμόλυνση

HCT-116 (wt-p53) και HCT-116 (null-p53) επιστρώθηκαν σε δίσκους 6-φρεατίων σε 1 × 10

5cells /καλά και επιμολυσμένα με Oligofectamine, μη ειδικό έλεγχο siRNA ή siRNA εναντίον Orc6 σε 100 ηΜ συγκέντρωση με βάση το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Invitrogen Inc.)

Απομόνωση RNA

Ολικό RNA απομονώθηκε από κυτταρικές γραμμές με χρήση του αντιδραστηρίου ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, San Diego, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή σε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με siRNA.

Western immunoblot ανάλυση

τα κύτταρα ξύστηκαν και λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA (Sigma). Ίσες ποσότητες των δειγμάτων πρωτεΐνης (50 μg) αναλύθηκαν με SDS-PAGE σε 12% γέλες με τη μέθοδο του Laemmli και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF) (Bio-Rad Laboratories). Οι μεμβράνες στη συνέχεια μπλοκαριστεί από 5% άπαχο γάλα σε ΤΒδ-Τ (Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και 0.5% Tween-20) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με αντι-orc6 μονοκλωνικό αντίσωμα αρουραίου (1:1000 αραίωση, Upstate Technology), αντι-α-τουμπουλίνης ποντικού (1:1000 αραίωση? Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), αντι-ρ53 ποντικού (1:1000 , Santa Cruz) που ακολουθείται από επώαση με ένα δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας (1:1,000 αραίωση, Bio-Rad, Hercules, CA). Οι πρωτεΐνες έγιναν ορατές με ένα σύστημα ανίχνευσης χημειοφωταύγειας χρησιμοποιώντας το υπόστρωμα Σούπερ Signal (Pierce, Rockford, IL)

σε πραγματικό χρόνο ανάλυση qRT-PCR

σύνθεση cDNA διεξήχθη με το κιτ σύνθεσης cDNA High Capacity (Applied Biosystems) χρησιμοποιώντας 1 μα ολικού RNA ως εκμαγείο. Το κύριο μίγμα PCR που περιέχει TaqMan 2 × καθολική PCR Master Mix (αριθ AmpErase UNG), 10 × TaqMan προϊόντα ποσοτικού προσδιορισμού και RT σε 25 μΙ όγκο υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ως ακολούθως: 95 ° C για 3 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 sec και 60 ° C για 35 δευτερόλεπτα (η = 3). Σήμα συλλέχθηκε στο ακραίο σημείο του κάθε κύκλο. Οι τιμές έκφρασης του γονιδίου του Orc6 από κάθε δείγμα υπολογίζεται από την κανονικοποίηση με GAPDH εσωτερικού ελέγχου και των σχετικών τιμών ποσοτικοποίηση χαράχθηκαν.

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής

HCT-116 (wt-p53) και HCT-116 (null-p53) επιστρώθηκαν σε δίσκους 6-φρεατίων σε 1 × 10

5cells /φρεάτιο και επιμολύνθηκαν με ειδικές Oligofectamine, μη ειδική ελέγχου siRNA ή Orc6 γονίδιο siRNA στα 100 ηΜ συγκέντρωση. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-FU (10 μΜ) 12 ώρες και τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψίνη, πλύθηκαν και σημάνθηκαν με ιωδιούχο προπίδιο, πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε τροποποιημένο ρυθμιστικό Krisham και διηθείται για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (BD FACS Caliber).

Υποστήριξη Πληροφορίες

δεδομένων S1.

GeneOntology. Γονιδιακή Έκφραση και ανάλυση GeneOntology των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων σε έλεγχο και Orc6 knock-down HCT116 (wt-p53) κύτταρα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0004054.s001

(2,77 MB ΔΕΘ)