Αφηρημένο

Το zoledronic acid, ένας πολύ ισχυρός που περιέχουν άζωτο διφωσφονικά χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία της παθολογική απώλεια οστού, απεκκρίνεται μη μεταβολισμένη μέσω των νεφρών, αν δεν συνδέεται με το οστό. Σε ασθενείς με καρκίνο που λαμβάνουν υψηλές δόσεις της ένωσης νεφρικής απέκκρισης μπορεί να συσχετισθεί με οξεία σωληναριακή νέκρωση. Το ζήτημα του πώς το zoledronic acid εσωτερικεύεται μέσω των νεφρικών σωληναρίων κύτταρα δεν έχει απαντηθεί μέχρι τώρα. Στην παρούσα εργασία, χρησιμοποιώντας ένα πρωτογενές σωληνωτό σύστημα καλλιέργειας κυττάρων του ανθρώπου, η οδός της κυτταρικής πρόσληψης του ζολεδρονικού οξέος (με φθορισμό /ραδιοεπισημασμένο) και την κυτταροτοξικότητα του ερευνήθηκαν. Προηγούμενες μελέτες στο εργαστήριο μας έχουν δείξει ότι αυτό το πρωταρχικό μοντέλο καλλιέργειας κυττάρων μιμείται με συνέπεια τα φυσιολογικά χαρακτηριστικά της μοριακής απορρόφησης /μεταφοράς του επιθηλίου

in vivo

. Το ζολεδρονικό οξύ βρέθηκε να παραλαμβάνεται από σωληνοειδή κύτταρα μέσω ρευστής φάσης ενδοκύτωση (από κορυφής και βασεοπλευρική πλευρά), όπως αποδεικνύεται από την συν-εντοπισμό της με δεξτράνη. Κυτταρική πρόσληψη και η προκύπτουσα ενδοκυτταρική επίπεδο ήταν διπλάσια από την κορυφαία πλευρά σε σύγκριση με την βασεοπλευρική πλευρά. Επιπλέον, το επίπεδο ενδοκυτταρικής ζολεδρονικό οξύ βρέθηκε να είναι ανεξάρτητα από την χορηγηθείσα συγκέντρωση και όχι κορέσιμη. Τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα ωστόσο, παρατηρήθηκαν μόνο σε υψηλότερες δόσεις χορήγησης ή /και μετά μεγαλύτερους χρόνους επώασης. Παρά το γεγονός ότι το ζολεδρονικό οξύ λαμβάνεται από σωληνοειδή κύτταρα, καμία καθαρή σωληναριακής μεταφοράς θα μπορούσε να μετρηθεί. Το συμπέρασμα είναι ότι στην υγρή φάση-ενδοκύτωση του zoledronic acid και κυτταρική συσσώρευση σε υψηλές δόσεις μπορεί να είναι υπεύθυνη για την οξεία σωληναριακή νέκρωση παρατηρήθηκε σε ορισμένους ασθενείς με καρκίνο που λαμβάνουν υψηλές δόσεις της ένωσης

Παράθεση:. Verhulst Α, Sun S, McKenna CE, D’Haese PC (2015) ενδοκυτταρική πρόσληψη του zoledronic acid από σωληνοειδή κύτταρα μπορεί να εξηγήσει νεφρική τα αποτελέσματά της σε ασθενείς με καρκίνο που λαμβάνουν υψηλές δόσεις της ένωσης. PLoS ONE 10 (3): e0121861. doi: 10.1371 /journal.pone.0121861

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Franziska Theilig, Ανατομία, Ελβετία

Ελήφθη: 28 Αύγ 2014? Αποδεκτές: 16, Φεβρουαρίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 10 του Μάρτη, 2015

Copyright: © 2015 Verhulst et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. AV είναι ένας μεταδιδακτορικός συνεργάτης του Ταμείου Επιστημονικής Έρευνας Φλάνδρα (www.fwo.be). PD έλαβε επιχορήγηση για έρευνα από τη Novartis. Τα μέλη του προσωπικού της Novartis είχε διαβάσει το χειρόγραφο και έδωσε την άδεια για τη δημοσίευση των στοιχείων, αλλά δεν είχε καμία πρόσθετη ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, η συλλογή και ανάλυση δεδομένων και την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Το έργο αυτό ήταν χρηματοδοτείται από μια ερευνητική επιχορήγηση από τη Novartis. SS είναι ο Chief Operating Officer της BioVinc LLC αρχής γενομένης από την 1η Ιανουαρίου, 2014. CMK είναι το ιδρυτικό μέλος και πρόεδρος του επιστημονικού συμβουλίου του BioVinc LLC και κατέχει μια US8431714 δίπλωμα ευρεσιτεχνίας Β2 άδεια να BioVinc, LLC. US8431714 Β2 άδεια να BioVinc, LLC. Δεν υπάρχουν περαιτέρω διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει προσήλωση μας σε όλα τα PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς

Εισαγωγή

Το zoledronic acid ή ζολεδρονάτη (Zometa?. Novartis Pharma AG , Βασιλεία, Ελβετία) είναι μια τρίτης γενιάς, ιδιαίτερα ισχυρός άζωτο (Ν) που περιέχει διφωσφονικό που έχει δείξει ευεργετικά αποτελέσματα στη θεραπεία της υπερασβεστιαιμίας της κακοήθειας και σκελετικές μεταστάσεις σε ασθενείς με πολλαπλό μυέλωμα, του πνεύμονα, του μαστού, του προστάτη και του καρκίνου του [1- 3].

N-περιέχον διφωσφονικά, περιλαμβανομένου ζολεδρονικό οξύ, όλα δείχνουν μια υψηλή συγγένεια για το οστική υδροξυαπατίτη (ΗΑΡ). Συνεπώς αυτά τα φάρμακα, όταν κυκλοφορεί εις το διαμέρισμα αίματος, ταχέως προσδένονται σε οστικό ιστό, (± 60% της χορηγούμενης δόσης του ζολεδρονικού οξέος διατηρείται στο οστό) [4] και πιθανώς απελευθερώνονται από αυτό κατά τη διάρκεια της διαδικασίας της οστικής απορρόφησης. Μόλις προσροφάται στην οστική, οι Ν-περιέχουν διφωσφονικά εσωτερικεύεται μέσω ενδοκυττάρωσης υγρό φάση με την οστεοκλαστών όπου πιστεύεται ότι αναστέλλουν συνθάση διφωσφορικού φαρνεσυλίου, ο ισοπρενοειδή βιοσυνθετικό ένζυμο στο μονοπάτι βιοσύνθεσης της χοληστερόλης [5]. Η διακοπή μίας οδού υποκατάστημα της βιοσύνθεσης της χοληστερόλης οδού δηλ ισοπρενυλίωση τότε ως αποτέλεσμα την φαρμακολογική δράση του Ν-περιέχουν διφωσφονικά [6]. Ισοπρενυλίωση περιλαμβάνει ομοιοπολική σύνδεση διφωσφορικού φαρνεσυλίου ή γερανυλογερανυλο διφωσφορικής στο καρβοξυ-τελικό άκρο των ρυθμιστικών πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων των μικρών GTPases Ras, Rac, Rho και Cdc42. Η τελευταία τρία, καθώς και πολλές άλλες, οι γερανυλγερανυλιωμένες και να παίξει ένα ρόλο περιορισμού του ρυθμού στο επανορροφητική δραστηριότητα των οστεοκλαστών [7-9].

Το zoledronic acid δεν συνδέεται με το οστό απεκκρίνεται, μη μεταβολισμένη από ο νεφρός, κυρίως εντός των πρώτων ωρών μετά τη χορήγηση [4? 10]. Οι ασθενείς με καρκίνο συχνά λαμβάνουν μηνιαία δόση των 4 mg ζολεδρονικού οξέος εγχέεται ενδοφλεβίως σε 100 ml υγρού σε 15 λεπτά. Σε μερικούς από αυτούς τους ασθενείς η νεφρική απέκκριση της υψηλής κυκλοφορούντων ποσών μπορεί να συσχετισθεί με οξεία σωληναριακή νέκρωση, η οποία χαρακτηρίζεται από σωληνοειδή εκφυλισμό των κυττάρων, η απώλεια των συνοριακών πινέλο, και την απόπτωση [11]. υπάρχει σχέση μεταξύ των επιπέδων κορυφής του ζολεδρονικού οξέος στο αίμα και νεφρική τοξικότητα επειδή η νεφρική βλάβη μειώνεται όταν η δόση μειώνεται ή ο χρόνος έγχυσης παρατείνεται [1]. Επιπλέον, το γεγονός ότι η νεφρική τοξικότητα δεν παρατηρείται σε μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες που λαμβάνουν μόνο μια ετήσια δόση των 5 mg zoledronic κατά τη διάρκεια της θεραπείας της οστεοπόρωσης είναι σύμφωνη με αυτήν [12].

Δεν είναι ακόμη κατανοητό από τα οποία οδού ζολεδρονικό οξύ παραλαμβάνεται από τα νεφρικά σωληνοειδή κύτταρα. Από την άλλη πλευρά, είναι γνωστό ότι ο βαθμός με τον οποίο το ζολεδρονικό οξύ και άλλα Ν-περιέχουν διφωσφονικά έχουν ληφθεί από διαφορετικούς τύπους κυττάρων είναι ανάλογη με την ικανότητά τους για την ενδοκυττάρωση ρευστό φάσης [13-15]. Επιπλέον, είναι επίσης πιθανό ότι το ζολεδρονικό οξύ χρησιμοποιεί οδούς διακυτταρική μεταφορά οργανικό ανιόν που εμπλέκονται στη νεφρική απέκκριση πολλά άλλα φάρμακα [16-18].

Ένα σύστημα κυτταρικής καλλιέργειας πρωτογενών κυττάρων ανθρώπινου νεφρού σωληνοειδή έχει αναπτυχθεί στο εργαστήριο μας. Η in vitro μοντέλο χαρακτηρίστηκε εκτεταμένα τόσο σε φυσιολογικές και παθοφυσιολογικές επίπεδο και αποδεικτικά στοιχεία που παρουσιάζονται για τις καλλιέργειες αυτές να μιμηθεί με συνέπεια τα πιο σημαντικά φυσιολογικά χαρακτηριστικά του μοριακού πρόσληψης /μεταφορά από το σωληνοειδές επιθήλιο

in vivo

[19-23 ]. Όπως περιγράφηκε προηγουμένως, αυτές οι καλλιέργειες δείχνουν τόσο υγρής φάσης και υποδοχέα με τη μεσολάβηση ενδοκυτταρική πρόσληψη των μορίων [22? 24]. Επιπλέον διαθέτουν την πλήρη δυναμικότητα της ελεγχόμενης μεταφοράς των μορίων, τόσο από ανιονικά και κατιονικά μόρια μεταφορέα κατά μήκος του επιθηλίου [18], δεδομένου ότι εκφράζουν μια μεγάλη παλέτα των μεταφορέων στο mRNA και επίπεδο πρωτεΐνης. Στο λειτουργικό επίπεδο, τα πρωτογενή ανθρώπινα σωληνοειδή κυτταρικών μονοστοιβάδων διατηρούν την αναγκαία μηχανήματα να μεσολαβήσει η καθαρή έκκριση των πρωτοτυπικού υποστρωμάτων, δηλαδή το οργανικό κατιόν, παρα-αμινο ιππουρικό οξύ (ΡΑΗ), και το οργανικό ανιόν κρεατινίνης.

για να κατανοήσουμε καλύτερα την παρατηρούμενη νεφρική τοξικότητα του zoledronic acid, ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει πιθανές οδούς πρόσληψης και φαρμακολογική αντιμετώπιση του zoledronic acid από επιθηλιακά κύτταρα σωληνοειδή χρησιμοποιώντας την ανωτέρω περιγραφείσα πρωταρχικό μοντέλο καλλιέργειας κυττάρων του ανθρώπου.

Υλικά και Μέθοδοι

Πρωτογενή ανθρώπινα σωληνοειδούς νεφρού κυτταρικές καλλιέργειες

ανθρώπινο σωληνοειδή επιθηλιακά κύτταρα απομονώθηκαν από φυσιολογικό ανθρώπινο νεφρικό ιστό που έγιναν διαθέσιμες μέσω νεφρεκτομή πραγματοποιείται σε ογκολογικές ενδείξεις. Η χρήση αυτού του ιστού με σκοπό την καλλιέργεια κυττάρων εγκρίθηκε (P2013 /268) από την επιτροπή δεοντολογίας του νοσοκομείου Erasme (Βρυξέλλες, Βέλγιο) που συμμετέχουν στη συλλογή των ιστών. λήφθηκε γραπτή συγκατάθεση. Μακροσκοπικά φυσιολογικό ιστό συλλέχθηκε και υποβάλλονται σε επεξεργασία σε ένα αποστειρωμένο τρόπο. Φλοιό και εξωτερική λωρίδα του εξωτερικού μυελού αποκόπηκαν, decapsulated και κομμένα σε τεμάχια περίπου 1 mm

3. Εν συνεχεία τα θραύσματα ιστού υπέστησαν πέψη σε διάλυμα κολλαγενάσης D (Roche, Ottweiler, Γερμανία) κατά τη διάρκεια 2 ώρες στους 37 ° C, υπό έντονη ανάδευση, και κοσκινίζεται μέσω ενός κόσκινου 120μm. Το προκύπτον κυτταρικό εναιώρημα φορτώθηκε στην κορυφή μιας ασυνεχούς ΡθγοοΙΙ (GE Healthcare, Diegem, Belgium) κλίση με πυκνότητες 1,04 και 1,07 g /ml. Μετά από φυγοκέντρηση (25 λεπτά, 1620 RCF), κύτταρα από τον κόμβο αναρροφήθηκαν προσεκτικά, πλένονται και τίθενται σε καλλιέργεια όπως ένα μικτό πληθυσμό του εγγύς σωληναρίου, άπω σωληνοειδούς και συλλέγοντας τα κύτταρα αγωγού. Σωληνοειδή κύτταρα αναπτύχθηκαν μέχρι συρροής (10 έως 14 ημέρες) σε διαπερατά, στηρίγματα φίλτρου πολυανθρακικού (Costar, Corning, ΝΥ, USA) σε πυκνότητα 50.000 κύτταρα /φίλτρο, σε μια-ΜΕΜ (Life Technologies, Gent, Βέλγιο) τροποποιήθηκε σύμφωνα να Gibson d’Ambrosio [25] που έχει συμπληρωθεί με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS). Οι κυτταρικές καλλιέργειες αναπτύσσονται σε 6,5 χιλιοστά διαπερατά (0.4μm μέγεθος πόρων) στηρίγματα φίλτρου (Costar) επιτρέπεται να πολώσει και να έχουν μια διαχωρίστηκε κορυφαίων και βασεοπλευρικών διαμέρισμα.

Προκειμένου να αποφευχθεί η χρήση του διαρρέοντος (μη συρροή) καλλιέργειες, συμβολή των κυτταρικών καλλιεργειών εκτιμήθηκε με μέτρηση της διεπιθηλιακής αντίστασης (TER) των μονοστοιβάδων. Οι μονοστιβάδες δεν χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω πειράματα, εάν η διεπιθηλιακής αντίστασης της μονοστιβάδας, διορθωμένο για την αντίσταση του φίλτρου, ήταν μικρότερη από 55 Ω.cm

2 (& gt? 2xSD κάτω από το μέσο TER κατά την έναρξη των πειραμάτων). TER μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα επιθηλιακό voltohmmeter εξοπλισμένο με ένα ηλεκτρόδιο stx2 (World Precision Instruments, Hitchin, UK). FCS-περιέχον μέσο αντικαταστάθηκε με μέσο χωρίς ορό ή διάλυμα Krebs πριν από τα πειράματα που περιγράφονται στις παραγράφους που ακολουθούν

Μετρήσεις της βιωσιμότητας των κυττάρων /ακεραιότητα μονοστιβάδα

TER μετρήθηκε πριν και μετά από μια 2h περίοδο επώασης με διαφορετικές συγκεντρώσεις ζολεδρονικό οξύ (0, 0.1, 1, 10 και 100 μΜ). Η βιωσιμότητα των κυττάρων στη συνέχεια αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία με βάση ΜΤΤ (Easy για σας, Biomedica Gruppe, Βιέννη, Αυστρία), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η βιωσιμότητα των κυττάρων καταγράφηκε επίσης 4, 24 και 48 ώρες μετά την περίοδο επώασης 2 ώρες με διάφορες δόσεις ζολεδρονικό οξύ (0, 1, 5 και 100 μΜ) και μετά από 4, 24 και επώαση 48h με ζολεδρονικό οξύ (0, 1, 5 και 100 μΜ). Πειράματα μέτρησης ακεραιότητα /μονοστιβάδα κυτταρικής βιωσιμότητας διεξήχθησαν σε μονοστιβάδες που προέρχονται από 4 διαφορετικά δείγματα νεφρών. Για κάθε πείραμα /χρησιμοποιήθηκαν τουλάχιστον 4 μονοστιβάδες κατάσταση.

Πρόσληψη σημασμένο με φθορισμό zoledronic acid σε καλλιέργειες νεφρικών κυττάρων πρωτογενών ανθρώπινων σωληνοειδή

Το zoledronic acid ήταν σημασμένο με φθορισμό με 5-καρβοξυ-[5-FAM ] ή Alexa Fluor 647 [AF647]. 5-FAM και AF647 ελήφθησαν από την Invitrogen. Φθορισμού επισήμανση διεξήχθη με σταθερό σύζευξη του ηλεκτριμιδυλ εστέρα του φθοροφόρου στο άζωτο ιμιδαζόλης του ζολεδρονικού οξέος μέσω της στρατηγικής συνδετήρα, όπως περιγράφεται προηγουμένως από McKenna [26? 27]. Το σημασμένο ζολεδρονικό οξύ καθαρίστηκε με HPLC και χαρακτηρίσθηκε με UV, φθορισμός,

1 και

31Ρ NMR και με MS όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26? 27] και στη συνέχεια διαλύθηκε σε PBS

Συρρέουσες μονοστοιβάδες. πρωτογενών κυττάρων νεφρού του ανθρώπου σωληνοειδή επωάστηκαν είτε στο κορυφαίο ή βασεοπλευρική πλευρά με 5-FAM /AF647 επισημασμένο ζολεδρονικό οξύ (50μΜ) για 1 ώρα σε είτε 37 ή 4 ° C. Οι μονοστιβάδες στη συνέχεια φορμόλη σταθερό και αντίθετα με Hoechst 33258. Αυτό το πείραμα πραγματοποιήθηκε σε μονοστρώματα που προέρχονται από δύο διαφορετικά δείγματα νεφρών.

Για να ελέγξετε για το γεγονός ότι το σήμα του zoledronic acid όντως εντοπίστηκε στο εσωτερικό των κυττάρων, η κυτταρική μεμβράνη των εγγύς σωληνοειδή κύτταρα ονομάστηκε μετά από επώαση με ζολεδρονικό οξύ και fomalin στερέωσης. Για το σκοπό αυτό οι μονοστιβάδες επωάστηκαν για 20 λεπτά με κανονικό ορό γαϊδάρου (20%), και για 2 ώρες με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού σε ανθρώπινη αμινοπεπτιδάση λευκίνης, ένα ειδικό δείκτη εγγύς σωληνοειδές κύτταρο [19? 28? 29]. Στη συνέχεια ένα δεύτερο αντίσωμα AF488 σημασμένο με γαϊδάρου αντι-ποντικού (τεχνολογίες ζωής, Gent, Βέλγιο) χρησιμοποιήθηκε και μονοστιβάδες αντίθετα με Hoechst 33258.

φθορισμού σήματα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία (Perkin Elmer, Zaventem, Βέλγιο) και εφαρμογή του λογισμικού Volocity (Perkin Elmer).

Αναγνώριση του zoledronic περιέχει οξύ ενδοκυτταρικά κυστίδια

για να διερευνηθεί κατά πόσο η κυτταρική πρόσληψη του zoledronic acid πραγματοποιήθηκε από ενδοκύτωση ή /και του υποδοχέα υγρό φάσης ενδοκυττάρωση, συρρέουσες μονοστοιβάδες συν-επωάστηκαν με AF647 σημασμένο ζολεδρονικό οξύ (50 μΜ) και ΡΙΤΟ-επισημασμένο δεξτράνη ή FITC-επισημασμένο λευκωματίνη, είτε στην κορυφαία ή βασεοπλευρική πλευρά σε 37 ° C για 1 ώρα. FITC- επισημασμένο δεξτράνη και FITC-επισημασμένο λευκωματίνη είναι εγκατεστημένοι δείκτες υγρής φάσης και ενδοκύτωσης με υποδοχέα, αντίστοιχα [14? 30? 31]. Αυτό το πείραμα διεξήχθη επί μονοστιβάδων που προέρχονται από δύο διαφορετικά δείγματα νεφρού.

Επιπλέον, συρρέουσες μονοστιβάδες κυττάρων νεφρού του ανθρώπου σωληνοειδή επωάστηκαν με κυτοχαλασίνη Β (45 min, 30 μΜ) πριν την έκθεση των κυττάρων σε AF647 σημασμένο ζολεδρονικό οξύ, ή FITC-επισημασμένο δεξτράνη ή FITC-επισημασμένο λευκωματίνη. Κυτοχαλασίνη Β, ένα κύτταρο διαπερατό μυκοτοξίνη που αναστέλλει ισχυρώς τον σχηματισμό δικτύου από νημάτια ακτίνης, γενικά αναγνωρίζεται ως ένας αναστολέας της ενδοκυτώσεως. Ωστόσο, κυτοχαλασίνη Β δεν επηρεάζει [32-34] την πρόσληψη του FITC-δεξτράνης με ενδοκύττωση υγρό φάση.

φθορισμού σήματα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία (Perkin Elmer, Zaventem, Βέλγιο) και την εφαρμογή του λογισμικού Volocity ( Perkin Elmer).

Μέτρηση ενδοκυτταρικά επίπεδα του ραδιοσημασμένου

zoledronic acid

Η ενδοκυτταρική συγκέντρωση του zoledronic acid ποσοτικά μετά τη δημιουργία σταθερών συνθηκών. Συνθήκες σταθερής κατάστασης ελήφθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Simmons, 1990), με την προσθήκη των ίδιων συγκεντρώσεις (5 μΜ) του ζολεδρονικού οξέος σε προθερμασμένο ρυθμιστικό Krebs τόσο στην κορυφαία και βασεοπλευρική πλευρά των καλλιεργειών πολωμένων κυττάρων. Μετά από 1 ώρα επώασης,

14C επισημασμένου ζολεδρονικό οξύ (ειδική δραστικότητα 2,04 GBq /mmol, παρέχεται από τη Novartis Pharma AG, Basel) προστέθηκε σε μία συγκέντρωση 1 μΟί /ml στο μέσο κυτταρικής καλλιέργειας, είτε στο κορυφαίο ή βασεοπλευρικό πλευρά της μονοστιβάδας. Μετά από μία επιπλέον περίοδο επώασης 1 ώρας τα διαπερατά υποστρώματα αποκόπηκαν και ο αριθμός των διασπάσεων ανά λεπτό μετρήθηκε σε μετρητή σπινθηρισμού. Τα ενδοκυτταρικά επίπεδα του zoledronic acid παρουσιάζονται ως pmoles /cm

2. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε 4 φορές σε μονοστιβάδες που προέρχονται από 4 διαφορετικά δείγματα νεφρών. Για κάθε πείραμα /χρησιμοποιήθηκαν τουλάχιστον 5 μονοστιβάδες κατάσταση.

Σύγκριση των ενδοκυττάριων ραδιοσημασμένου ζολεδρονικού επίπεδα οξέος σε ενδοκυτταρικά ραδιοσημασμένου επίπεδα μαννιτόλη

Την μονοστοιβάδες 1 νεφρού (5 μονοστιβάδες /condition), ενδοκυτταρικά επίπεδα του ζολεδρονικού οξέος σε σύγκριση με εκείνες του μαννιτόλη, ένα μόριο το οποίο δεν εσωτερικοποιείται από σωληνοειδή κύτταρα [18? 35]. Cellular συσσώρευση μαννιτόλης ερευνήθηκε με την εκτέλεση ενός πειράματος πανομοιότυπη με εκείνη που περιγράφηκε για το ζολεδρονικό οξύ σε παράλληλες μονοστιβάδες του ίδιου νεφρού.

3Η-επισημασμένη μαννιτόλη ελήφθη από την Perkin Elmer (ειδική δραστικότητα 432,9 GBq /mmol).

Η επίδραση της περίσσειας παρα-ammino ιππουρικό οξύ, οιστρόνη-3-θειϊκό άλας ή παμιδρονάτη επί ενδοκυτταρικής επίπεδα ραδιοεπισημασμένου

ζολεδρονικού οξέος

Η επίδραση των υποστρωμάτων μεταφορέα οργανικού ανιόντος (ΡΑΗ και οιστρόνη-3-θειϊκό άλας (Ε-3S), και ένα πρόσθετο που περιέχει Ν διφωσφονικό (pamidronate) σχετικά με την κυτταρική πρόσληψη του ζολεδρονικού οξέος ήταν ερευνήθηκε με συν-επώαση του 14C

επισημασμένου-ζολεδρονικό οξύ με μία περίσσεια ποσότητα από αυτά τα μόρια (50 μΜ) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18? 35]. το πείραμα διεξήχθη σε μονοστιβάδες που προέρχονται από 2 διαφορετικά δείγματα νεφρού με τουλάχιστον 5 μονοστιβάδες /κατάσταση.

μέτρηση διεπιθηλιακό μεταφοράς ραδιοεπισημασμένου ζολεδρονικού οξέος και σύγκριση με τη μεταφορά διεπιθηλιακό ραδιοσημασμένου μαννιτόλη

για να μετρηθεί η μεταφορά του zoledronic acid μέσω μονοστιβάδων του ανθρώπινου σωληνοειδή επιθηλιακά κύτταρα μια σταθερή κατάσταση δημιουργήθηκε με επώαση των μονοστιβάδων για 1 ώρα με 5 μΜ του μορίου σε προθερμασμένο ρυθμιστικό Krebs τόσο στην κορυφαία και βασεοπλευρική πλευρά. Κορυφαία στην βασεοπλευρική και βασοπλευρική να κορυφής ροές μετρήθηκαν στη συνέχεια σε διαφορετικές μονοστοιβάδες. Συνεπώς, η

14C-επισημασμένο μόριο προστέθηκε είτε στην κορυφαία ή βασεοπλευρική πλευρά των καλλιεργειών. Ένα δείγμα στην συνέχεια λαμβάνεται στην απέναντι πλευρά μετά από 1 ώρα επώασης (εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά). Το πείραμα πραγματοποιήθηκε 4 φορές σε μονοστιβάδες που προέρχονται από 4 διαφορετικά δείγματα νεφρών. Για κάθε πείραμα τουλάχιστον 5 μονοστοιβάδες /χρησιμοποιήθηκαν κατάσταση.

Μεταφορές του ζολεδρονικού οξέος σε σύγκριση με εκείνη της μαννιτόλης σε μονοστιβάδες που προέρχονται από 2 νεφρούς (για κάθε πείραμα τουλάχιστον 5 μονοστιβάδες /κατάστασης). Κορυφαία στην βασεοπλευρική και βασοπλευρική να κορυφής ροές μαννιτόλη μετρήθηκαν με την εκτέλεση ενός πειράματος πανομοιότυπη με εκείνη που περιγράφηκε για το ζολεδρονικό οξύ σε παράλληλες μονοστιβάδες του ίδιου νεφρού.

3Η-μαννιτόλη ήταν από την Perkin Elmer (ειδική δραστηριότητα 432,9 GBq /mmol).

Επίδραση των χορηγούμενων συγκέντρωση στις ενδοκυτταρικά επίπεδα και τη μεταφορά των επιθηλίων του zoledronic acid

Η επίδραση της χορηγούμενης συγκέντρωσης ζολεδρονικού οξέος σε ενδοκυτταρικά επίπεδα και μεταφορά transepithelial της ένωσης διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας την σταθερή κατάσταση set-up, όπως περιγράφεται στις σχετικές παραγράφους παραπάνω. Το ζολεδρονικό οξύ χορηγήθηκε στις ακόλουθες συγκεντρώσεις 0,25, 1, 5, 25 και 100 μΜ. Αυτό το πείραμα εκτελέστηκε δύο φορές σε μονοστιβάδες originiating από 2 διαφορετικά δείγματα νεφρού και για κάθε πείραμα τουλάχιστον 5 μονοστιβάδες /κατάστασης).

Στατιστικά

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση στατιστικών IBM SPSS 20. Τα στοιχεία αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μη παραμετρικές στατιστικές (Mann-Whitney U test) με Bonferroni διόρθωση για πολλαπλές συγκρίσεις.

Αποτελέσματα

τα επιθηλιακά ακεραιότητα και κυτταρική βιωσιμότητα

Η επώαση των μονοστοιβάδων για 2 ώρες με διαφορετικές συγκεντρώσεις του ζολεδρονικού οξέος (0,1 έως 100 μΜ) δεν έχουν άμεση επίδραση σε επιθηλιακά ακεραιότητα (Εικ. 1Α) ή την κυτταρική βιωσιμότητα (Εικ. 1Β). Διατήρηση της επιθηλιακής ακεραιότητας είναι ζωτικής σημασίας για τη μελέτη διακυτταρική μεταφορά των συγκεκριμένων ενώσεων, όπως με πάρα διαρροές μονοστιβάδες κάποιος δεν θα είναι σε θέση να ποσοτικοποιηθεί η διακυτταρική μεταφορά, δεδομένου ότι θα πρέπει να καλυφθεί από την πολύ υψηλότερη παρακυτταρική μεταφορά.

(Α) και βιωσιμότητας (αξιολογείται με μέτρηση της παραγωγής ΜΤΤ) (Β) του συρρέουσες μονοστοιβάδες πρωτογενών ανθρώπινων σωληνοειδή κύτταρα. TER μετρήθηκε πριν και μετά από μια περίοδο επώασης 2 ώρα με ζολεδρονικό οξύ (0 έως 100 μΜ), μετά την οποία μετρήθηκε η βιωσιμότητα. Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή ± SD 4 πειραμάτων, που διεξήχθησαν σε κυτταρικές καλλιέργειες που προέρχονται από 4 διαφορετικά δείγματα νεφρών. Κατά τη διάρκεια καθενός από τα τέσσερα πειράματα τουλάχιστον /χρησιμοποιήθηκαν 4 μονοστιβάδες συνθήκες. (C και D) Επίδραση της επώασης ζολεδρονικού οξέος στη βιωσιμότητα των συρρέουσες μονοστοιβάδες πρωτογενών ανθρώπινων σωληνοειδή κύτταρα επί μακροπρόθεσμα. Συρρέουσες μονοστοιβάδες πρωτογενών ανθρώπινων σωληνοειδή κύτταρα επωάστηκαν με διαφορετικές (0 έως 100 μΜ) συγκεντρώσεις του ζολεδρονικού οξέος για 2 ώρες και η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε 4, 24 και 48 ώρες αργότερα (C). Συρρέουσες μονοστοιβάδες πρωτογενών ανθρώπινων σωληνοειδή κύτταρα επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις του ζολεδρονικού οξέος για 4, 24 ή 48 ώρες μετά τον οποίο μετρήθηκε η κυτταρική βιωσιμότητα (D). Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή ± SD 2 πειραμάτων, που διεξήχθησαν σε κυτταρικές καλλιέργειες που προέρχονται από 2 διαφορετικά δείγματα νεφρών. Κατά τη διάρκεια κάθε μία από τις 2 πειράματα χρησιμοποιήθηκαν τουλάχιστον 4 μονοστοιβάδες /κατάστασης. * Ρ & lt?. 0.05 vs 0 μΜ

Η

Μέτρηση της κυτταρικής βιωσιμότητας σε 4 ώρες, 24 ώρες και 48 ώρες μετά από μια επώαση 2 ωρών με διαφορετικές συγκεντρώσεις του ζολεδρονικού οξέος (0 έως 100 μΜ), αποκάλυψε μια σημαντικά μειωμένη βιωσιμότητα για την υψηλότερη συγκέντρωση ζολεδρονικό οξύ (100 μΜ), 48 ώρες μετά την επώαση (ρ & lt? 0,0005) (σχήμα 1Γ).. Όταν τα κύτταρα επωάστηκαν για 4 ώρες, 24 ώρες ή 48 ώρες με τις ίδιες συγκεντρώσεις του ζολεδρονικού οξέος, μια σημαντική, εξαρτώμενη από τη δόση μείωση στην βιωσιμότητα παρατηρήθηκε μετά 48h (Εικ. 1ϋ).

Κυτταρική πρόσληψη ζολεδρονικού οξέος

η επώαση των πρωτογενών ανθρώπινων σωληνοειδούς μονοστοιβάδες στους 37 ° C με φθορισμό (είτε 5 (6) -FAM ή AF647) σημασμένο ζολεδρονικό οξύ σε ακραία μεμβράνη οδήγησε σε μια διακριτή φυσαλιδώδη σήμα φθορισμού στο εσωτερικό των κυττάρων (Εικ. 2). Η ενδοκυτταρική εντόπιση της ένωσης περαιτέρω αποδεικνύεται από συν-ανοσοχρώση της εγγύς σωληνοειδούς μεμβράνης κυττάρου με λευκίνη αμινοπεπτιδάση (Εικ. 3). Καμία διαφορά θα μπορούσε να παρατηρηθεί στον εντοπισμό του σήματος φθορισμού όταν το σημασμένο με φθορισμό ζολεδρονικό οξύ χορηγήθηκε σε βασεοπλευρική αντί της κορυφαία πλευρά των μονοστοιβάδων. Επιπλέον, κανένα σήμα θα μπορούσε να παρατηρηθεί όταν τα κύτταρα επωάστηκαν στους 4 ° C (σχ. 2C-D).

μονόφυλλο Α και Β επωάστηκαν στους 37 ° C, Υποψ D στους 4 ° C.

η

για να διερευνηθεί με την οποία οδού ζολεδρονικό οξύ λαμβάνεται μέσα στα κύτταρα, κυτταρικές μονοστιβάδες συν-επωάστηκαν είτε με σημασμένο με FITC δεξτράνη (ιδρύθηκε δείκτης της ενδοκύττωσης φάση υγρού ή FITC σεσημασμένη λευκωματίνη (η οποία συστάθηκε δείκτη υποδοχέα ενδοκυττάρωση) και AF647 επισημασμένο ζολεδρονικό οξύ χορηγείται στην ακραία ή βασεοπλευρική πλευρά. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4 (πρόσληψη από κορυφαία πλευρά), το ζολεδρονικό οξύ και δεξτράνη είναι σαφώς συν-εντοπισμένη στα ενδοκυτταρικά κυστίδια που αποδεικνύουν την κυτταρική πρόσληψη από ρευστό ενδοκύτωση φάση. Μια παρόμοια εικόνα παρατηρήθηκε μετά από συν-επώαση με επισήμανση φθορισμού ζολεδρονικού οξέος και δεξτράνης στο βασεοπλευρική πλευρά. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5 (πρόσληψη από κορυφαία πλευρά), το ζολεδρονικό οξύ που περιέχει κυστίδια δεν συν-εντοπίζονται με κυστίδια που περιέχουν λευκωματίνη , εμπλέκοντας ότι το ζολεδρονικό οξύ δεν παραλαμβάνεται από ενδοκύτωσης με υποδοχέα η οποία αποδεικνύεται περαιτέρω από το γεγονός ότι, σε αντίθεση με το ζολεδρονικό οξύ, αλβουμίνη είναι σχεδόν δεν παραλαμβάνεται από την βασεοπλευρική πλευρά (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

τα βέλη δείχνουν σαφώς την συν-εντοπισμό του zoledronic acid (κόκκινο σήμα) και δεξτράνης (πράσινο σήμα) στις ίδιες κυστίδια, χρώση κίτρινο στη συγχωνευμένη εικόνα.

η

το zoledronic acid (κόκκινο σήμα) και αλβουμίνη (πράσινο σήμα) προφανώς δεν colocalized.

Η

Επιπλέον, τα αποτελέσματα που λαμβάνονται μετά από επώαση των κυττάρων με κυτοχαλασίνη Β περαιτέρω επιβεβαιώνει μια κοινή οδό πρόσληψης για το ζολεδρονικό οξύ και δεξτράνη. Ενώ κυτοχαλασίνη Β οδήγησαν σε σαφή αναστολή της προσλήψεως αλβουμίνης καμία επίδραση παρατηρήθηκε για δεξτράνης /ζολεδρονικό οξύ (Εικ. 6). Μετά την επώαση κυτοχαλασίνη Β η πράσινη σημασμένο λευκωματίνη βρίσκεται κατά μήκος της κυτταρικής μεμβράνης και όχι ως κυστίδια εντός των κυττάρων. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η δεξτράνη και ζολεδρονικό οξύ λαμβάνονται από ένα κοινό, την πρόσληψη διαδρομή, δηλαδή ενδοκυττάρωση ρευστό φάση ενώ λευκωματίνη παραλαμβάνεται από ένα διαφορετικό ενδοκυττάρωσης διαδικασία (μεσολάβηση υποδοχέα), αναστέλλεται από κυτοχαλασίνη Β

Η

Η ποσοτικοποίηση της κυτταρικής πρόσληψης /ενδοκυτταρικά επίπεδα του zoledronic acid

Εικ. 7 δείχνει τα ενδοκυτταρικά επίπεδα

14C-σημασμένο-ζολεδρονικού οξέος σε πρωτογενείς καλλιέργειες κυττάρων που προέρχονται από 4 διαφορετικά δείγματα νεφρών. Και πάλι, αυτά τα πειράματα δείχνουν ότι το ζολεδρονικό οξύ λαμβάνεται τόσο από την κορυφαία και τη βασοπλευρική πλευρά και επιπλέον δείχνουν ότι τα ενδοκυτταρικά επίπεδα γίνει σημαντικά (p & lt? 0,0005) υψηλότερη όταν χορηγείται σε κορυφαία πλευρά (28,7 ± 11,8 pmoles /cm

2 ) σε σύγκριση με την βασεοπλευρική πλευρά (13,2 ± 5,9 pmoles /cm

2). Συγκριτικά, οι ενδοκυτταρικά επίπεδα μαννιτόλη ήταν μόνο 3,3 και 4,0 ± 1,0 pmoles /cm

2, όταν χορηγείται είτε στην κορυφαία ή βασεοπλευρική πλευρά, αντίστοιχα.

Αυτό το σχήμα δείχνει τα αποτελέσματα 4 πειραμάτων επί μονοστιβάδες που προέρχονται από 4 διαφορετικά δείγματα νεφρού (για κάθε πείραμα τουλάχιστον 5 μονοστιβάδες /κατάστασης). Ενδοκυτταρική συγκέντρωση υπολογίστηκε ως pmoles /cm

2

Η

Επίδραση των οργανικών υποστρωμάτων ανιόντων μεταφορέα και pamidronate για ενδοκυτταρικά επίπεδα του zoledronic acid

Μια περίσσεια οργανικού ανιόντος μεταφορέα υποστρώματα ΠΑΥ /E-3S χρησιμοποιήθηκε για να διερευνηθεί κατά πόσον η πρόσληψη ζολεδρονικό οξύ σε νεφρικά σωληνοειδή κύτταρα διαμεσολαβείται από οργανικό μεταφορείς ανιόν. Μία περίσσεια pamidronate, ένα άλλο που περιέχει Ν με διφωσφονικά, χρησιμοποιήθηκε προκειμένου να ελεγχθεί για μια κοινή οδός πρόσληψη των δύο δισφωσφονικού μορίων. Δεδομένου ότι τα ενδοκυτταρικά επίπεδα του ζολεδρονικού οξέος δεν άλλαξε με την παρουσία μιας περίσσειας του μεταφορέα οργανικού ανιόντος υποστρώματα ΡΑΗ και E-3S (Εικ. 8), ούτε είχε η χορήγηση pamidronate ασκήσει οποιαδήποτε επίδραση στα ενδοκυτταρικά επίπεδα του ζολεδρονικού οξέος (Εικ . 8) δεν επιχειρήματα ελήφθησαν για την πρόσληψη του zoledronic acid από οργανικό μεταφορείς ανιόντων ούτε για μια κοινή πορεία πρόσληψης των δύο διφωσφονικά.

Κάθε αριθμός αντιπροσωπεύει τα αποτελέσματα ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος σε κύτταρα που προέρχονται από το ένα νεφρό (τουλάχιστον 5 μονοστιβάδες /κατάστασης). Ενδοκυτταρική συγκέντρωση του zoledronic acid υπολογίστηκε ως pmoles /cm

2.

Η

τρανσεπιθηλιακές μεταφορά του zoledronic acid

επόμενο διερευνηθεί αν κυτταρική συσσώρευση του zoledronic acid πήγε μαζί με καθαρό διακυτταρική ζολεδρονικό ροές οξύ. Συλλιπάσματα κατευθύνεται είτε από την κορυφαία στην βασεοπλευρική πλευρά (Ja-bl) ή βασεοπλευρική στην κορυφαία πλευρά (JBL-α) μετρήθηκαν σε μονοστιβάδες που προέρχονται από 4 διαφορετικά δείγματα νεφρών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ροές προς τις δύο κατευθύνσεις για να είναι σχεδόν ίσα μεταξύ τους (Εικ. 9), γεγονός που υποδηλώνει ότι η μεταφορά ζολεδρονικό οξύ λαμβάνει χώρα δια της παρακυτταρικής οδού. Αυτό επιβεβαιώνεται και από το εύρημα ότι οι διεπιθηλιακό ροές του zoledronic acid δεν ήταν υψηλότερες από εκείνες των μαννιτόλη (Εικ. 10).

Αυτή η εικόνα δείχνει τα αποτελέσματα των 4 πειραμάτων πάνω σε μονοκυτταρική στοιβάδα που προέρχονται από 4 διαφορετικά δείγματα νεφρών ( για κάθε πείραμα τουλάχιστον 5 μονοστιβάδες /κατάστασης). Διεπιθηλιακό ροές προς τις δύο κατευθύνσεις δεν διέφεραν σημαντικά μεταξύ τους.

Η

Ο αριθμός αυτός αντιπροσωπεύει τα αποτελέσματα ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος σε κύτταρα που προέρχονται από το ένα νεφρό (τουλάχιστον 5 μονοστιβάδες /κατάστασης).

εξάρτηση από τη συγκέντρωση των σωληνωτών χειρισμό του zoledronic

οξέος

για να ελέγξετε την πιθανή επίδραση της συγκέντρωση του zoledronic acid στον τομέα των μεταφορών και τους πολιτισμούς ενδοκυτταρική συσσώρευση κυττάρων επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις της ένωσης που κυμαίνονται 0,25 – 100 μΜ (Εικ. 11). Αποτελέσματα στο Σχ. 10Α δείχνουν ότι ροών από την κορυφαία στην βασεοπλευρική πλευρά (Ja-bl) και από την βασεοπλευρική στην κορυφαία πλευρά (JBL-a) δεν διαφέρουν μεταξύ τους σε όλη την περιοχή συγκέντρωσης. Επιπλέον, το εύρημα ότι δεν οροπέδιο επιτευχθεί, παρέχει μια πρόσθετη ένδειξη ότι η μεταφορά γίνεται αποκλειστικά πραγματοποιηθεί από τον τρόπο παρακυτταρικού.

Η επίδραση της συγκέντρωσης του zoledronic acid σε ενδοκυτταρικό επίπεδο φαίνεται στο σχήμα. 11Β. Και πάλι, η ενδοκυτταρική συσσώρευση δεν φτάσουν σε μια σταθερή κατά την ευρεία περιοχή συγκέντρωσης διερευνηθεί. Το τελευταίο εύρημα είναι ενδεικτικό για το γεγονός ότι η κυτταρική συσσώρευση του zoledronic acid δεν ρυθμίζεται από membraneous πρωτεϊνικά μόρια μεταφοράς, όπως αυτά θα εύλογα να κορεστεί στις υψηλές συγκεντρώσεις που εφαρμόζονται στο παρόν πείραμα.

(Α) και ενδοκυτταρική συγκέντρωση του zoledronic acid (Β). μεταφορών ζολεδρονικό οξύ και ενδοκυτταρική συσσώρευση μετρήθηκε σε συρρέουσες μονοστοιβάδες πρωτογενών ανθρώπινων σωληνοειδή κύτταρα χρησιμοποιώντας την σταθερή κατάσταση set-up. Ο αριθμός αυτός αντιπροσωπεύει τα αποτελέσματα ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος σε κύτταρα που προέρχονται από το ένα νεφρό (τουλάχιστον 5 μονοστιβάδες /κατάστασης).

Η

Συζήτηση

Το zoledronic acid είναι ένα πολύ γνωστό θεραπευτικό μέσο που χρησιμοποιείται να μειώσει την οστική απορρόφηση σε ασθενείς με οστεοπόρωση (Reid

et el

., 2002). Επιπλέον, η ένωση χρησιμοποιείται επίσης σε σχετικά υψηλότερες δόσεις σε ασθενείς με πολλαπλό μυέλωμα, του πνεύμονα, του μαστού, του προστάτη και του καρκίνου του [1-3]. Λόγω της υψηλής συγγένειας της προς υδροξυαπατίτη, η πλειοψηφία του χορηγούμενου ζολεδρονικού οξέος θεωρείται ότι συσσωρεύονται στο οστό. Το ζολεδρονικό οξύ που δεν συνδέονται προς το οστό απεκκρίνεται, μη μεταβολισμένη από τους νεφρούς, κυρίως εντός των πρώτων ωρών μετά τη χορήγηση [4? 10]. Δεδομένου ότι η χορήγηση υψηλών δόσεων του ζολεδρονικού οξέος μπορεί να συνδέεται με οξεία σωληναριακή νέκρωση σε έναν αριθμό ασθενών [11], το ζολεδρονικό οξύ πρόσληψης /συσσώρευση με σωληνοειδή κύτταρα πιθανώς λαμβάνει χώρα. Πράγματι, σημασμένα με φθορισμό risedronate, η οποία δομικά είναι παρόμοιο με το ζολεδρονικό οξύ, έχει ανιχνευθεί σε οστό αλλά και στην νεφρικό ιστό μετά από χορήγηση σε ποντικούς [14].

Χρησιμοποιώντας την προηγουμένως περιγραφείσα πρωτογενή καλλιέργεια ανθρώπινων κυττάρων σωληνοειδούς set-up , ερευνήθηκαν σημαντικές πτυχές του σωληνοειδούς χειρισμού ζολεδρονικού οξέος. Χρησιμοποιήθηκε ένα εύρος συγκέντρωσης ζολεδρονικού οξέος του 0,0, 0,25, 1,0, 5,0, 25 και 100 μΜ (που αντιστοιχούν σε 0, 67,5, 270, 1350, 6750 και 27.000 ng /ml). Δεδομένου ότι οι οξύ επίπεδα Cmax ορού ζολεδρονικού σε ασθενείς μετά από ενδοφλέβια έγχυση 15 λεπτών του 4mg ζολεδρονικού οξέος είναι περίπου 300ng /ml [10], οι χαμηλότερες συγκεντρώσεις που χρησιμοποιούνται στην πειραματική διάταξη μας έτσι τέλεια αντιστοιχούν στα επίπεδα του ορού σε ασθενείς ζολεδρονικό αγωγή οξύ. Με τη χρήση των υψηλότερων zoledronic συγκεντρώσεις (25 και 100 μΜ) ήμασταν σε θέση να αποδείξει ότι η πρόσληψη του zoledronic acid /μεταφοράς δεν ήταν κορεστός.

Θα μπορούσε σαφώς να δείξει ότι η πρόσληψη του zoledronic acid από σωληνοειδή κύτταρα πραγματοποιείται με ενδοκύττωση υγρό φάσης . Αυτό είναι σύμφωνο με την παρατήρηση της Roelofs et al. δείχνοντας ότι κυτταρική πρόσληψη του zoledronic acid και αναλογική ρισεδρονάτη της λαμβάνει κατά προτίμηση χώρα σε κυτταρικούς τύπους με υψηλή ενδοκυτταρική χωρητικότητα υγρού φάση, όπως οι οστεοκλάστες και τα μονοκύτταρα /μακροφάγα [13? 14].

Για να αποκλειστεί μια πιθανή επίδραση της η μεγάλη χρωμοφόρο για την πρόσληψη του επισημασμένου ζολεδρονικού οξέος, δύο διαφορετικές φθορίζουσες σημάνσεις επελέγησαν, η οποία έδειξε συνεπή αποτελέσματα δείχνοντας έτσι ότι η πρόσληψη του ζολεδρονικού οξέος από τα σωληνοειδή κύτταρα προσδιορίστηκε κυρίως από το μητρικό φάρμακο παρά συζευγμένων φθορίζουσες βαφές. Αυτό υποστηρίζεται περαιτέρω από το γεγονός ότι ραδιοεπισημασμένο ζολεδρονικό οξύ επίσης παραλαμβάνεται στα πρωτογενή ανθρώπινα σωληνοειδή κύτταρα. Ποσοτικοποίηση της πρόσληψης ραδιοσημασμένου ζολεδρονικού οξέος απεκάλυψε ένα σημαντικά υψηλότερο (± 2 φορές) πρόσληψη από την κορυφαία πλευρά σε σύγκριση με την βασεοπλευρική ένα.