Αφηρημένο

Το γονίδιο TP53 έχει βρεθεί να μεταλλαχθεί σε 50% όλων των καρκίνων. Η πρωτεΐνη ρ53, ένα προϊόν της ΤΡ53 γονιδίου, είναι μια πρωτεΐνη σε πολλούς τομείς. Αποτελείται από ένα πεδίο σύνδεσης πυρήνα DNA (DBD), η οποία είναι υπεύθυνη για τη δέσμευση και την μεταγραφή των κατάντη γονιδίων στόχων του. Οι μεταλλάξεις στο ρ53 πρωτεΐνη είναι υπεύθυνοι για τη δημιουργία καρκινικές συνθήκες και βρέθηκε να συμβαίνει σε μία υψηλή συχνότητα στην περιοχή DBD του ρ53. Ορισμένες από αυτές τις μεταλλάξεις είναι επίσης γνωστό ότι είναι ευαίσθητα στη θερμοκρασία (

ts

) στη φύση. Είναι γνωστό ότι εμφανίζουν μερική ή ισχυρή σύνδεση με το DNA στο εύρος θερμοκρασίας (298 έως 306 Κ). Ότι, σε 310 K και πάνω δείχνουν πλήρη απώλεια στη δέσμευση. Έχουμε αναλύσει τις αλλαγές στην πρόσδεση και διαμορφωτική συμπεριφορά στους 300 K και 310 K για τρεις από τις

ts

-mutants

δηλαδή

., V143A, R249S και R175H. έχουν QM-MM προσομοιώσεις έχουν πραγματοποιηθεί για τον άγριο τύπο και το προαναφερόμενο

ts

-mutants για 30 ns καθένα. Η βέλτιστη εκτίμηση της ελεύθερης ενέργειας της πρόσδεσης για ένα συγκεκριμένο αριθμό δεσμών υδρογόνου διεπαφής υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέγιστη πιθανότητα μέθοδο όπως περιγράφεται από Chodera et. al (2007). Αυτή η παράμετρος έχει παρατηρηθεί να είναι σε θέση να μιμούνται την συγγένεια δέσμευσης του ρ53

ts

-mutants στους 300 Κ και 310 Κ Έτσι η αντιστοιχία μεταξύ MM-GBSA ελεύθερη ενέργεια της πρόσδεσης και δεσμών υδρογόνου που σχηματίζονται από τη διασύνδεση υπολειμμάτων μεταξύ ρ53 και DNA αποκάλυψε την εξαρτημένη θερμοκρασία φύση αυτών των μεταλλάξεων. Ο ρόλος της κύριας αλυσίδας δίεδρα παρήχθη δια της διεξαγωγής ανάλυση δίεδρο κύριο συστατικό (PCA). Αυτή η ανάλυση, δείχνει ότι οι διαμορφωτικές μεταβολές στην κύρια δίεδρα αλυσίδας (

φ

και

ψ

) του p53

ts

-mutants μπορεί να προκάλεσε μείωση στη συνολική σταθερότητα της πρωτεΐνης. Η έκθεση διαλύτης από τις πλευρικές αλυσίδες των υπολειμμάτων διεπαφής βρέθηκαν να παρεμποδίζουν την πρόσδεση του ρ53 στο DNA. Περιοχή διαλύτη προσιτή επιφάνεια (ΣΑΣΑ) αποδείχθηκε επίσης να είναι μια κρίσιμη ιδιότητα να διακρίνει τα συμμορφωτών που λαμβάνονται σε 300 K και 310 K για τα τρία

ts

-mutants από τον άγριο τύπο σε 300 Κ

Παράθεση: Koulgi S, Achalere Α, Sonavane U, Joshi Ε (2015) Διερεύνηση DNA Binding και διαμορφωτικά διακύμανση της θερμοκρασίας μεταλλάξεων με ευαίσθητο Καρκίνο p53 Χρησιμοποιώντας QM-MM προσομοιώσεις. PLoS ONE 10 (11): e0143065. doi: 10.1371 /journal.pone.0143065

Επιμέλεια: Freddie Salsbury Jr, Πανεπιστημίου Wake Forest, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 24, Ιούλη του 2015? Αποδεκτές: 30η Οκτωβρίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 18 του Νοέμ του 2015

Copyright: © 2015 Koulgi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού και υποστήριξη αρχείων πληροφοριών του

χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα

Εισαγωγή

Το μονοπάτι p53 παίζει καθοριστικό ρόλο για την αποτελεσματική καταστολή του όγκου που ενεργοποιεί τα γονίδια ως απάντηση σε κυτταρικό στρες [1, 2]. Μεταλλάξεις στο p53, ωστόσο, δυσχεραίνει αυτή την οδό από συμβιβασμούς λειτουργική δραστηριότητα p53 [3]. Σε σχεδόν το 50% των ανθρώπινων καρκίνων, οι μεταλλάξεις που παρατηρήθηκαν στην πρωτεΐνη p53 [4, 5], [6]. Η πλειονότητα των μεταλλάξεων αυτών βρίσκονται στην αλληλουχία ειδικό τομέα πυρήνα δέσμευσης DNA (DBD) του p53 [7-10]. Αυτές οι μεταλλάξεις είναι γνωστό ότι επηρεάζουν τη θερμοδυναμική σταθερότητα της DBD και το σύνολο της πρωτεΐνης, καθώς και. Η κρυσταλλική δομή του ρ53 αποκαλύπτει ότι ένας μεγάλος

β

σάντουιτς παρέχει ένα ικρίωμα για μια διατηρημένη περιοχή DBD. Αυτή η περιοχή DBD αποτελείται από ένα μοτίβο βρόχου φύλλων-έλικα και δύο μεγάλες θηλιές δεμένοι με ένα ιόν ψευδαργύρου (Εικόνα 1Α) [11]. Η δραστικότητα δέσμευσης του DNA του ρ53 περιλαμβάνει την σύνδεση των ιόντων ψευδαργύρου, η οποία είναι γνωστό ότι σχηματίζει ένα σύμπλοκο τετραεδρική συντονισμό με CYS 176, CYS 238, CYS 242 και 179 υπολείμματα HIS της πρωτεΐνης. Το ιόν ψευδαργύρου έχει ένα σημαντικό ρόλο στη σταθεροποίηση των βρόχων που συνδέονται με τετραεδρική σύμπλεγμα του και τη σωστή σύνδεση του ρ53 στη μικρή αύλακα του ειδικού ϋΝΑ σε ακέραια κύτταρα [12, 13]. Αν και τα περισσότερα από τα υπολείμματα στο DNA τομέα της ρ53 δέσμευσης είναι ιδιαίτερα ευαίσθητοι σε μεταλλάξεις, υπάρχουν επτά καυτά σημεία όπου οι μεταλλάξεις συμβαίνουν σε πολύ υψηλή συχνότητα [14-19]. Η κατανόηση της δομικής και λειτουργικής συνέπεια αυτών των μεταλλάξεων έχει μεγάλο ενδιαφέρον σε μελέτες για τον καρκίνο [14], [20].

Η

Από το ήμισυ των ανθρώπινων καρκίνων σχετίζονται με μεταλλάξεις στο p53, το μέλλον του καρκίνου θεραπευτική οι στρατηγικές που απευθύνονται για τα φάρμακα που σταθεροποιούν τον τομέα μεταλλαγμένο p53 πυρήνα [10]. Ωστόσο, πολλές πειραματικές έρευνες για hot spot μεταλλάξεις έχουν αποκαλύψει θερμοκρασία εξάρτησή τους συγγένεια δέσμευσης του DNA [21-23]. Κατά τις δύο τελευταίες δεκαετίες έχουν εκτεταμένες πειραματικές προσπάθειες έχουν επικεντρωθεί να κατανοήσουν την ευαίσθητη στην θερμοκρασία (

ts

) φύση των διαφόρων μεταλλάξεων ρ53 και διαμορφωτικό μηχανισμό τους [21-24] [25, 26]. Η πρώτη λεπτομερής πειραματική έρευνα στο

ts

-ρ53 μεταλλάξεις που αναφέρθηκαν από τους Zhang et. al. και Friedlander et. al. έχουν εξηγήσει δεσμευτική σε 310 Κ [21, 22] DNA τους. Παρατήρησαν ότι στους 298 Κ ο

ts

-mutants δείχνει την ικανότητα που παίρνει καταστραφεί ανεπανόρθωτα τη θέρμανση σε 310 Κ [22] δεσμευτική. Με αυτά τα πειράματα ήταν εμφανές ότι οι μεταλλάκτες hot spot ρ53 V143A, R248Q, R249S, R273H εκτός R175H ήταν σε θέση να συνδέονται με το DNA σε υπο-φυσιολογική περιοχή θερμοκρασίας (298-306 Κ) και χάνουν δεσμευτική τους εντελώς στους 310 K. Η σύνδεση σταθερότητα και διαμορφωτική μέλη των εν λόγω

ts

-ρ53 μεταλλάξεις έχουν επίσης μελετηθεί με τη δέσμευση των μονοκλωνικών αντισωμάτων, όπως PAB 1620 και PAB 1801 [21, 22]. Ομοίως, ένα από τα έργα του Bullock et. al. έδειξαν ότι η χρήση της διαφορικής θερμιδομετρίας σάρωσης ή φασματοσκοπία οδηγεί σε μη αναστρέψιμη μετουσίωση της περιοχής πυρήνα ρ53 μετάλλαξη με αλλαγή της θερμοκρασίας [23]. Πειράματα σε μεταλλάξεις p53 σε διάφορες περιοχές θερμοκρασίας έχουν βρεθεί να ανακτήσει κάποιο επίπεδο μετενεργοποίησης όταν εκφράζεται σε χαμηλές θερμοκρασίες [21, 24]. Με βάση την θερμοκρασία εξαρτώμενη ποσοτικών αναδίπλωση των υπολειμμάτων ρ53 και μελέτες δέσμευσης DNA, έχουν μεταλλάξεις ρ53 έχουν ταξινομηθεί σε διαφορετικές κατηγορίες. [25] Εκτεταμένες εργασίες Shiraishi et. al. έδειξε την θερμοκρασία εξαρτώμενη από ενδο-μοριακό μηχανισμό του περίπου 2000 μεταλλακτών παρερμηνεύσιμη. Περιελάμβανε επίσης τη μελέτη μετενεργοποίηση σε 303 K και 310 K [26]. έχουν μερικώς ανενεργό εξαρτώνται από τη θερμοκρασία μεταλλάγματα ρ53 έχουν αναφερθεί να εκτελεί μηχανισμός επανενεργοποίηση από αμιφοστίνης σε ζύμη [27]. Πρόσφατα πειράματα σε καρκινικά κύτταρα του μαστού lobular έχουν αποκαλύψει ευαίσθητα στη θερμοκρασία λειτουργική δραστηριότητα των μεταλλαγμένων p53 και εκεί ρόλο στην κλωνική εξελικτική πορεία [28].

Παρά τις βαθιές πειραματική παρατήρηση σχετικά με τη δραστηριότητα δέσμευσης του DNA των

ts

έχουν -mutants της p53 πολύ λίγες θεωρητικές και υπολογιστικές μελέτες έχουν επικεντρωθεί να κατανοήσουμε αυτό το φαινόμενο. Μοριακής δυναμικής προσομοίωσης είναι μια τρέχουσα κατάσταση της μεθόδου τέχνης για να διερευνήσει τις περιπλοκές στη δομή-λειτουργικές σχέσεις των βιο-μορίων. Συμπληρώνει επίσης τις πειραματικές παρατηρήσεις, δίνοντας διορατικότητα αλληλεπιδράσεις ατομικό επίπεδο. Στο πρόσφατο παρελθόν, λίγες ανάλυση έχουν αναφερθεί χρησιμοποιώντας προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής για τη διερεύνηση ευαίσθητα στη θερμοκρασία συμπεριφορά των μεταλλάξεων του καρκίνου του p53. Μαύρισμα και τους συναδέλφους ανέλυσε την παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη της DBD σε 310 K με βάση DBD συσχέτιση σταθερότητα με τη δομή ακολουθίας και μοριακά επαφές σε αυτές [29]. Μια ολοκληρωμένη συσχέτιση σταθερότητα προτάθηκε επίσης βασίζεται σε κλινικά και λειτουργικά δεδομένα [29]. Πρόσφατα η φαινοτυπική επίδραση των μη συνώνυμες πολυμορφισμών μονού νουκλεοτιδίου σε ΤΡ53 γονίδιο έχει μελετηθεί χρησιμοποιώντας προσομοιώσεις MD για μεταλλαγμένο και WT πρωτεΐνες p53 [30]. Από την άλλη πλευρά προσομοιώσεις MD στις R248Q μετάλλαγμα έχουν αποκαλύψει την ευαίσθητη θερμοκρασία φύση αυτού του μεταλλαγμένου στο DNA δεσμευτική αλληλεπίδραση και δυναμική συμπεριφορά του [31]. Ωστόσο, υπάρχει ανάγκη να εξετάσει βαθύτερα, ώστε να εντοπίσω τη δομή λειτουργικές σχέσεις των

ts

-mutants. Ως μια προσπάθεια το παρόν έγγραφο παρουσιάζει τη μελέτη προσομοίωσης QM-MM για εξαρτώνται από τη θερμοκρασία μεταλλάξεις p53. Το σύμπλοκο ψευδαργύρου συντονισμός είναι πολύ σημαντική για τη δέσμευση της ρ53 DNA όπως εξηγήθηκε προηγουμένως [12, 13]. Είναι δύσκολο να διατηρηθεί αυτό το περίπλοκο συντονισμό στην κλασική προσομοιώσεις MD. Ως εκ τούτου, σε πολλές από τις προηγούμενες μελέτες προσομοίωσης p53, διαφορετικές στρατηγικές όπως η εικονική άτομο, κολλημένοι και τροποποιημένη προσέγγιση πεδίο δυνάμεων έχουν χρησιμοποιηθεί για τη διατήρηση της σύμπλεγμα ψευδαργύρου συντονισμού [32-34]. Ομοίως, στην παρούσα μελέτη έγινε προσπάθεια να διατηρηθεί αυτή η πολύπλοκη από τη θεραπεία με την κβαντομηχανική (QM) και όχι από την εφαρμογή τυχόν αναγκαστική περιορισμούς. Εκτέλεση QM για ένα τόσο σημαντικό λειτουργικό τμήμα της πρωτεΐνης θα βοηθήσει στην μιμούνται την πραγματική βιολογική συμπεριφορά [35]. Η χρήση της προσέγγισης QM-MM για να διατηρήσει το συγκρότημα ψευδαργύρου συντονισμό ενσωματώθηκε σε μία από τις προηγούμενες μελέτες μας στις μεταλλάξεις p53 [36]. Ως εκ τούτου, διατηρώντας το σύμπλεγμα ψευδαργύρου συντονισμό ήταν η μόνη πρόθεση να εισαγάγει την κβαντική θεραπεία.

Ο στόχος της παρούσας εργασίας είναι να δώσει μια εικόνα για τις διαμορφωτική παραλλαγές και το DNA ιδιότητες του

ts

-ρ53 παραλλαγές. Τρία γνωστά

ts

-mutants

δηλαδή

., V143A, R249S και R175H έχουν μελετηθεί χρησιμοποιώντας QM-MM προσομοιώσεις. Ο ευαίσθητος χαρακτήρας της θερμοκρασίας έχει μελετηθεί σε δύο θερμοκρασίες

δηλαδή

., 300 K (θερμοκρασία δωματίου) και 310 K (φυσιολογική θερμοκρασία).

V143A, R249S και R175H είναι διαρθρωτικές μεταλλάξεις και είναι γνωστά να στρεβλώσουν την διαμορφωτική σταθερότητα της p53-DBD. V143A έγκειται στο

β

-sandwich περιοχή του βρόχου-φύλλου-έλικα μοτίβο του p53-DBD που είναι υπεύθυνη για το μεγαλύτερο δέσμευσης DNA αύλακα (Σχήμα 1Β). Αυτή η

ts

μεταλλαγμένου είναι γνωστό για τη δημιουργία κοιλοτήτων στο υδρόφοβο πυρήνα, που σχηματίζεται λόγω της

β

-sandwich. Επίσης αποσταθεροποιεί δραστικά τον πυρήνα τομέα p53 από τη διαφορά των 4 kcal /mole [14]. V143A είναι ένα

ts

μεταλλαγμένου συνδέεται καλύτερα από τον άγριο τύπο ρ53 σε 300 K. Ωστόσο, αυτή η ικανότητα δέσμευσης είναι εντελώς απούσα στα 310 Κ [21].

R249S βρίσκεται στο DNA δεσμευτική επιφάνεια, η πλευρική αλυσίδα της αργινίνης 249 εμπλέκεται στην σταθεροποίηση της L3 θηλιά η οποία αποτελεί μέρος του ανήλικου-αύλακα δέσμευσης DNA τομέα (Σχήμα 1Β). Αυτό αργινίνη για να πάρει αντικαθίσταται από σερίνη οδηγεί σε μια μη-φυσική διαμόρφωση του L3 θηλιά που επηρεάζει περαιτέρω δέσμευσης DNA. R249S

ts

μεταλλαγμένου είναι γνωστό ότι εμφανίζουν μερική πρόσδεσης στο DNA σε 300 Κ ενώ η ίδια είναι πλήρως καταργηθεί σε 310 Κ [22].

R175H βρίσκεται κοντά στο ψευδαργύρου τετραεδρική συγκρότημα ιόντων , η οποία είναι υπεύθυνη για την πρόσδεση σε συνδυασμό με δύο μεγάλες θηλιές L2 και L3 (Σχήμα 1Β) μικρής αύλακας. Υποτίθεται ότι αυτή η

ts

μεταλλαγμένου διαταράσσει την περιοχή σύνδεσης ψευδαργύρου. Ελάχιστη ποσότητα δομικές μελέτες είναι διαθέσιμα για αυτό το

ts

μεταλλαγμένου. εξαρτάται από τη θερμοκρασία φύση του δείχνει ότι σε 300 K υπάρχει μειωμένη σύνδεση με το DNA που αργότερα χάνεται σε 310 K. Το βάθος κατανόηση της εξαρτάται από τη θερμοκρασία φύση αυτών των μεταλλάξεων απαιτεί εκτεταμένες διαμορφωτική ανάλυση. Ως εκ τούτου, αυτό το χαρτί ασχολείται με τα διαρθρωτικά ταμεία και το DNA παραλλαγές δέσμευσης που συμβαίνουν σε αυτές τις τρεις

ts

-mutants

δηλαδή

., V143A, R249S και R175H.

Μέθοδοι

προετοιμασίας συστήματος

Οι συντεταγμένες για το εναρκτήριο δομή επιλέχθηκαν από την αλυσίδα Β και ολόκληρη δίκλωνο DNA του ΠΣΠ ID 1TSR [11]. Κάθε μετάλλαξη του καρκίνου παρασκευάστηκε από την εξέταση αυτή τη δομή ως αναφορά τη χρήση του

xleap

ενότητα της AmberTools 1.5 [37]. Το ιόν ψευδαργύρου ήταν παρόν σε ένα τετραεδρική σύμπλοκο συντονισμού με CYS 176, CYS 238, CYS 242 και 179. Η απόσταση HIS δεσμός και πληροφορίες γωνία για την τετραεδρική συγκρότημα ελήφθησαν από την εργασία που αναφέρεται από τους Lu et al. κατά το έτος 2007 [32]. Ολόκληρο το συγκρότημα p53-DNA-Zinc αρχικά εξουδετερώνεται με προσθήκη ιόντων Na + ακολουθούμενη από ρητή επιδιαλύτωση χρησιμοποιώντας το μοντέλο TIP3P νερό [37]. Η επιδιαλύτωση διεξήχθη μέσα σε ένα οκτάεδρο, η ελάχιστη απόσταση μεταξύ της διαλυμένης ουσίας (σύμπλοκο p53-DNA) και του άκρου του κουτιού προσομοίωσης ήταν 12

a

. Η τοπολογία και συντεταγμένες για όλες τις παραλλαγές p53 δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το πεδίο ισχύος Amber FF03 [37]. Το μέγεθος του συστήματος για κάθε μία από τις παραλλαγές p53 ήταν περίπου 63300 άτομα.

QM-MM προσομοιώσεις

Σε κάθε μία από τις διαλυμένες συστήματος p53-DNA, το σύμπλοκο ψευδαργύρου συντονισμό διατηρήθηκε στο μη συνδεδεμένη μορφή, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της κβαντικής μηχανικής (QM). Το υπόλοιπο σύστημα προσομοίωσης είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με τη χρήση μοριακής μηχανικής προσέγγισης (ΜΜ). Ως εκ τούτου, κάθε ελαχιστοποίηση, αναδιατάσσουν τη θερμοκρασία, την εξισορρόπηση και την παραγωγή πρωτόκολλα τρέξιμο ήταν QM-MM προσομοιώσεις. Η μέθοδος PM3 [38] επιλέχθηκε για την περιοχή QM ότι, το πεδίο ισχύος Amber FF03 εφαρμόστηκε στην περιοχή MM [37]. Η συνολική επιβάρυνση της περιοχής QM θεωρήθηκε +2 απόδοση στο φορτίο του ιόντος ψευδαργύρου. Τα ομόλογα που περιέχουν άτομα υδρογόνου στην περιοχή QM και ΜΜ περιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο SHAKE [39]. Η κανονική σύνολο, NVT εφαρμόστηκε, όπου ο αριθμός των ατόμων, ο όγκος κουτί και η θερμοκρασία του κάθε συστήματος διατηρήθηκαν καθ ‘όλη τη προσομοίωση [40]. Η διεπαφή QM-ΜΜ υποβλήθηκε σε επεξεργασία σύμφωνα με την προσέγγιση άτομο σύνδεσμο με τις προκαθορισμένες προεπιλεγμένες παραμέτρους [41-43]. Οι προσομοιώσεις εκτελέστηκαν σε ένα στάδιο χρόνο 2 fs χρησιμοποιώντας δυναμική Langevin και συχνότητα σύγκρουσης των 0,1 ps

-1 [40]. Ο Περιοδικός οριακή συνθήκη (PBC) εφαρμόστηκε για να εκτελέσει τις συνεχείς δυναμικής όγκου. Η μέθοδος Σωματιδίων Mesh Ewald (ΜΜΕ) χρησιμοποιήθηκε με μη συνδεδεμένο cut-off της 12ης

a

. Η ελαχιστοποίηση πραγματοποιήθηκε σε δύο στάδια. Αρχικά, ο διαλύτης ελαχιστοποιείται χρησιμοποιώντας τη μέθοδο απότομης καθόδου για 20.000 βήματα. Ακολουθούμενη από το p53-DNA-Zn συγκρότημα που κυκλοφόρησε για την ελαχιστοποίηση στα επόμενα 50000 βήματα. Το πρωτόκολλο προσομοίωσης ήταν ίδια για όλες τις p53-παραλλαγές μέχρι αυτό το βήμα. Ωστόσο, καθώς οι προσομοιώσεις έγιναν σε δύο διαφορετικές θερμοκρασίες

δηλαδή

., 300 Κ και 310 Κ, η θερμοκρασία αναδιατάσσουν διεξήχθη για 40 ps κάθε να αποκτήσουν αυτές τις θερμοκρασίες, αντίστοιχα. Μια εξισορρόπηση για 2 ns και μια παραγωγή τρέξει για 30 ns καθένα, εκτελέστηκε για όλες τις παραλλαγές της ρ53 στους 300 Κ και 310 Κ Η συσκευασία προσομοίωση Amber 10 χρησιμοποιήθηκε για όλες τις προσομοιώσεις. Συνολικά έξι προσομοιώσεις QM-ΜΜ διεξήχθησαν περιλαμβάνει την άγριου τύπου ρ53 σε 310 Κ, V143A στους 300 Κ και 310 Κ, R249S στα 310 Κ και R175H στους 300 Κ και 310 Κ Τα δεδομένα για WT και R249S σε λήφθηκε 300 Κ από την προηγούμενη εργασία μας [36].

Αυτές οι προσομοιώσεις αναλύθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας διαφορετικές ενότητες της AmberTools 1.5 [44]. Η μονάδα cpptraj και MMGBSA του AmberTools 1.5 χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό δεσμού υδρογόνου και ελεύθερων παραμέτρων ενέργειας για προσομοιώσεις. Ένα εργαλείο που ονομάζεται GeoPCA, χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει δίεδρο PCA [45]. PCA είναι μια πολυπαραγοντική στατιστική τεχνική η οποία αντιπροσωπεύει ένα σύνολο συσχετιζόμενων μεταβλητών, όπως ορθογώνια κύρια συστατικά. Αυτά τα κύρια συστατικά βοηθούν στην ανάλυση της μεταβλητότητας παρούσα σε οποιαδήποτε δεδομένη δεδομένα. PCA αποδεικνύεται ότι είναι ένα πολύ χρήσιμο εργαλείο για τη διερεύνηση των διαφόρων τύπων τοπικές κινήσεις οι οποίες είναι υπεύθυνες για την διαμορφωτικές αλλαγές στις προσομοιωμένο πρωτεΐνες. Περαιτέρω, ο διαλύτης προσβάσιμη περιοχή επιφάνειας (ΣΑΣΑ) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα NACCESS [46].

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Επιπτώσεις στο DNA πρόσδεση της p53

ts

-mutants

Η ικανότητα δέσμευσης του DNA όλων των παραλλαγών ρ53 εκτιμήθηκαν με υπολογισμό της μεταβολής ελεύθερης ενέργειας της πρόσδεσης και ο αριθμός των δεσμών υδρογόνου (hbonds) που σχηματίζεται από τα υπολείμματα διεπαφή μεταξύ του ρ53 και του DNA. Οι ελεύθερες τιμές ενέργειας υπολογίζονται χρησιμοποιώντας τη μονάδα MMPBSA της AmberTools 1.5 [44]. Η μεταβολή στην ελεύθερη ενέργεια υπολογίζεται ως εξής: (1) (2) ΔΕ

αερίου

, (

com

,

rec

,

lig

) είναι η μοριακή μηχανική ενέργεια και ΔG

sol

(

com

,

rec

,

lig

) είναι η ενέργεια ενυδάτωσης υπολογίζεται από γενικευμένων Born (GB) μοντέλο ενυδάτωσης για το συγκρότημα, υποδοχέα και συνδέτη, αντίστοιχα. Αυτοί οι δύο όροι συμβάλλουν στην ενθαλπία μέρος του υπολογισμού ελεύθερης ενέργειας. Η tΔ S

(

com

,

rec

,

lig

) όρος δείχνει την εντροπικό συμβολή για τον υπολογισμό της ελεύθερης ενέργειας. υπολογισμός της εντροπίας είναι βαριά υπολογιστική ισχύ, παραλείφθηκε δωρεάν ενεργειακών υπολογισμών. Κατά συνέπεια, η ακόλουθη εξίσωση χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία, (3) Ωστόσο, η MM-GBSA ελεύθερη ενέργεια με και χωρίς τη συνεισφορά εντροπική υπολογίστηκε για τα τελευταία 10 ns των προσομοιώσεων (S1 και S2 Σχ). Οι ελεύθερες τιμές ενέργειας που παρατηρήθηκαν παρόμοια τάση και στις δύο περιπτώσεις. Ως εκ τούτου, tΔ S

(

com

,

rec

,

lig

), η οποία αποδίδει στο τμήμα εντροπία της ελεύθερης ενέργειας δεν έχει συμπεριληφθεί στις ελεύθερες όρους ενέργειας υπολογιστεί. Αυτές οι ελεύθερες τιμές ενέργειας περαιτέρω βελτιστοποιηθεί για να ληφθεί μία βέλτιστη εκτίμηση της ελεύθερης ενέργειας για συγκεκριμένο αριθμό hbonds μεταξύ ρ53 και DNA χρησιμοποιώντας το μέγιστο μέθοδο πιθανότητα [47]. Η εξίσωση που χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό της βέλτιστης εκτίμησης της ελεύθερης ενέργειας είχε ως εξής, (4) (5) είναι η βέλτιστη εκτίμηση της ΔΔ

G

δεσμεύουν

(

opt

ΔΔ

G

δεσμεύουν

) για τον αριθμό k των hbonds διασύνδεση μεταξύ των p53 και του DNA [47]. Ότι,

x

n

είναι η Δ Δ G

δεσμεύουν

για τον αριθμό στιγμιότυπο n και

δ

2

x

k

είναι το μέτρο της αβεβαιότητας που παρατηρείται στις ελεύθερες τιμές ενέργειας

x

n

με τον αριθμό k των διεπαφής hbonds (εξίσωση 5).

Ο αριθμός των hbonds υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μονάδα cpptraj της AmberTools 1.5 [44]. Το cut-off για την εξ αποστάσεως ομολόγων δότη-δέκτη και τη γωνία θεωρήθηκε 3

a

και 135 ° αντίστοιχα. Οι hbonds σχηματίζεται από τα οκτώ υπολείμματα διεπαφή

δηλαδή

., LYS 120, SER 241, ARG 248, ARG 273, ALA 276, CYS 277, ARG 280 και ARG 283 με το DNA θεωρήθηκαν ως οι hbonds διεπαφή για όλες οι παραλλαγές ρ53. Επίσης, σε μία από τις προηγούμενες δουλειές μας, ένα παρόμοιο είδος προσέγγισης χρησιμοποιήθηκε βασίζεται στην MM-GBSA ελεύθερη ενέργεια της πρόσδεσης και τις hbonds σχηματίζονται μεταξύ ρ53 και DNA. Η σύγκριση αυτή είχε αποκαλύψει τη διαφορά στο DNA ιδιότητα του άγριου τύπου, ο καρκίνος και διάσωση μεταλλάκτες της ρ53 [36] δεσμευτική. Ομοίως, η ανάλυση που πραγματοποιήθηκε σε αυτό το έγγραφο αντιπροσωπεύει τη βέλτιστη εκτίμηση του MM-GBSA ελεύθερη ενέργεια πρόσδεσης (

opt

ΔΔ

G

δεσμεύουν

) ειδικά για τους δεσμούς υδρογόνου που σχηματίζονται από το υπολείμματα μεσόφασης.

opt

ΔΔ

G

δεσμεύουν

υπολογίστηκε για τον άγριου τύπου (WT) και όλα τα τρία

ts

-mutants του p53 σε 300 K και 310 K. Το σύνολο 30 ns τροχιά θεωρήθηκε για την ανάλυση αυτή. Η σύγκριση του

ts

-mutants με WT στους 300 Κ και 310 Κ έχει παρασταθεί στην Εικόνα 2. Το σχήμα 2Α και 2Δ απεικονίζει τα αποτελέσματα για V143A και WT στους 300 Κ και 310 Κ, αντίστοιχα. Παρατηρήθηκε ότι σε 300 Κ, οι ελεύθερες τιμές ενέργειας ήταν χαμηλότερες για V143A σε σύγκριση με WT, γεγονός που υποδηλώνει καλύτερη σύνδεση σε V143A (Σχήμα 2Α). Από την άλλη πλευρά παρατηρήθηκε να αποδυναμώσει σε 310 Κ (Εικ 2Δ). Σχήμα 2Β και 2Ε δείχνει την ελεύθερη ενέργεια πρόσδεσης του R249S και WT στους 300 Κ και 310 Κ, αντίστοιχα. Παρατηρήθηκε σαφώς ότι σε αμφότερες τις θερμοκρασίες οι ελεύθερες τιμές ενέργειας για R249S ήταν υψηλότερες από εκείνη του WT. Σχήμα 2C και 2F δείχνει τη σύγκριση μεταξύ R175H και WT σε 300 K και 310 K αντίστοιχα. Εδώ, πάλι R175H είχαν υψηλότερα δωρεάν τιμές ενέργειας από ό, τι WT σε αμφότερες τις θερμοκρασίες.

Η

Οι παρατηρήσεις αυτές λαμβάνονται από τον υπολογισμό του

opt

ΔΔ

G

δεσμεύονται

βάσει του δεσμού υδρογόνου, δείχνει ότι όλα τα τρία

ts

-mutants χάνουν συγγένεια πρόσδεσης τους σε 310 Κ σε σύγκριση με WT. Ωστόσο, V143A δείχνει βελτιωμένη σύνδεση από WT στους 300 Κ η οποία έχει επίσης αναφερθεί από πειράματα σε

ts

-ρ53 μεταλλάκτες

δηλαδή

., Friedlander et. al (1996), Bullock et. al (1997, 2000) και Zhang et. al. (1994) [22], [23], [25], [21]. Αυτές οι πειραματικές μελέτες δείχνουν επίσης ότι R249S και R175H συνδέονται ασθενώς στους 300 Κ, αλλά η δραστηριότητα είναι εντελώς χαθεί στα 310 Κ Έτσι τα αποτελέσματα που προέκυψαν για R249S και R175H από τη μελέτη προσομοιώσεις αναφέρονται σε αυτό το έγγραφο, συμφωνούν με τις παρατηρήσεις που αναφέρονται σε αυτές τις πειραματικές μελέτες [22], [23], [25], [21].

για να προσθέσετε υποστήριξη για αυτές τις παρατηρήσεις σε οικόπεδο MM-GBSA προέρχεται ΔΔ

G

δεσμεύουν

ενάντια στο χρόνο έχει παρασχεθεί στα συμπληρωματικά στοιχεία που S3 Εικ. Μια σύγκριση της θερμοκρασίας από αυτά

ts

-mutants έχει επίσης παρέχονται στα συμπληρωματικά στοιχεία που S4 Εικ. Τα αποτελέσματα αυτά συμπληρώνουν επίσης τα παραπάνω πειραματικά ευρήματα που αναφέρθηκαν στο

ts

-mutants της p53.

opt

ΔΔ

G

δεσμεύουν

είναι η στατιστικώς προκύπτουσα παράμετρος θα μπορούσε να αποδειχθεί πιο σημαντικό με το μεγάλο αριθμό των παρατηρήσεων. Ως εκ τούτου, ένα πανομοιότυπο προσομοίωσης για WT στους 300 Κ εκτελέστηκε για 30 ns και στιγμιότυπα συνελήφθησαν κάθε 10 ps που αυξάνει τα σημεία δεδομένων έως 6000 στιγμιότυπα. S5 σχήμα δείχνει τη σύγκριση για

opt

ΔΔ

G

δεσμεύουν

για WT στους 300 K με 3000 (Run1) και 6000 (Run1 + Run2) στιγμιότυπα αντίστοιχα.

ευαίσθητα στη θερμοκρασία μεταλλάξεις σταθερότητα και την κύρια αλυσίδα δίεδρα

το

ts

-mutants της ρ53 είναι γνωστό ότι προκαλούν απώλεια σύνδεσης DNA, καθώς και διαρθρωτικές στρεβλώσεις της DBD p53. Προκειμένου να παρέχει μια εικόνα για τις διαρθρωτικές αλλαγές που θα οφείλεται στις μεταλλάξεις οι κύριες δίεδρα αλυσίδα

φ

και

ψ

υποβλήθηκαν σε Ανάλυση Κύριων Συνιστωσών (PCA). PCA αποδεικνύεται ότι είναι ένα πολύ χρήσιμο εργαλείο για τη διερεύνηση των διαφόρων τύπων τοπικές κινήσεις οι οποίες είναι υπεύθυνες για την διαμορφωτικές αλλαγές στις προσομοιωμένο πρωτεΐνες. Τα κύρια δίεδρα αλυσίδας (

φ

και

ψ

) χρησιμοποιήθηκαν ως αντίδραση συντονίζει και το PCA έγινε χρησιμοποιώντας GeoPCA [45]. Το βασικό συστατικό 1 (PC1) και 2 (PC2) υπολογίστηκαν για τα μεταλλαγμένα και άγριου τύπου. Τα οικόπεδα για PC2 κατά PC1 έχουν παρασχεθεί στα συμπληρωματικά στοιχεία από S6-S9 Σχ. S6 και S7 σχήματα δείχνει την κατανομή των διαμορφομερών βασίζεται σε PC1 και PC2 του

φ

δίεδρα στους 300 K και 310 K αντίστοιχα. Ομοίως, S8 και S9 σχήματα δείχνουν την κατανομή των διαμορφομερών βασίζεται σε PC1 και PC2 του

ψ

δίεδρα στους 300 K και 310 K αντίστοιχα. Η διακύμανση που παρατηρείται σε PC1 και PC2 τόσο για

φ

και

έχουν ψ

γωνίες σε όλες τις περιπτώσεις που έχει δοθεί στο S10 Εικ. Θα μπορούσε να θεωρηθεί ότι και οι δύο

φ

και

ψ

γωνίες έδειξαν μεγαλύτερη διακύμανση στις τιμές PC2 σε αμφότερες τις θερμοκρασίες.

Το

φ

δίεδρα έδειξε αλλάζουν σε PC2 με αύξηση της θερμοκρασίας για WT και όλες οι τρεις ρ53 μεταλλάκτες. Ωστόσο, για

ψ

δίεδρα εκτός από την WT και τα τρία

ts

μεταλλάξεις δεν παρουσίασαν σημαντική διαφοροποίηση σε σχέση με τη θερμοκρασία. Για να παρατηρήσουμε τις συνέπειες αυτής της αλλαγής στο

φ

και

ψ

δίεδρα για τη συνολική σταθερότητα της πρωτεΐνης, η Δ

G

πρωτεΐνης

σχεδιάστηκε έναντι των τιμών PC2 για WT και κάθε ένα από τα ρ53

ts

-mutants (Σχήματα 3 και 4). Σύκα 3 και 4 εξηγήσει την κατανομή του πληθυσμού των διαμορφομερών με βάση PC2 του

φ

και

ψ

γωνίες σ.σ.μ. την ελεύθερη ενέργεια της συνολικής πρωτεΐνης (Δ G

πρωτεΐνη

) αντίστοιχα. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε στιγμιότυπα σταματούν σε κάθε 10 ps για τα τελευταία 10 ns της προσομοίωσης. Σχήμα 3Α και 3D δείχνει την κατανομή των WT και V143A στους 300 K και 310 K αντίστοιχα. Η κατανομή του πληθυσμού των V143A παραστάσεις συμπίπτουν με την WT σε αμφότερες τις θερμοκρασίες. WT και V143A επίτευξη του cis διαμόρφωση σε 300 Κ που παρασύρει περαιτέρω σταδιακά προς την trans περιοχή σε 310 K. Ωστόσο, το Δ G

πρωτεΐνη

τιμές αυξήθηκαν σε 310 K και για τους δύο, σε σύγκριση με 300 Κ Εικ 3Β και 3Ε περιγράφει την κατανομή για R249S και WT στους 300 Κ και 310 Κ, αντίστοιχα. Στα 300 K, WT επιτυγχάνει τα cis και R249S είναι διάσπαρτα στην trans περιοχή με την υψηλότερη ελεύθερη τιμές της ενέργειας. Σε 310 Κ, R249S τείνει να καταλαμβάνουν το cis μορφή με ελεύθερη ενέργεια μεγαλύτερη από WT στους 310 Κ και αυτο σε 300 Κ Σχ 3C και 3F αντανακλά τη συμπεριφορά των R175H σε σύγκριση με WT στους 300 Κ και 310 Κ, αντίστοιχα. Ο πληθυσμός φαίνεται να είναι διάσπαρτα σε μεγάλο βαθμό κατά μήκος όλο το φάσμα της

φ

με δωρεάν ενέργεια τιμές υψηλότερες από ό, τι WT σε αμφότερες τις θερμοκρασίες.

Η

Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι για V143A την διαμορφώσεων τείνουν να συμπληρώσετε την ίδια περιοχή με παρόμοια ελεύθερη ενέργεια αξίες όπως φαίνεται στο WT στους 300 Κ και 310 Κ Έτσι, συνάγοντας παρόμοιες διαμορφώσεις που έχει αποκτηθεί από

φ

γωνίες σε V143A και WT σε αμφότερες τις θερμοκρασίες. Ωστόσο, για R249S το

φ

γωνίες θα μπορούσε να δείξει με επιτυχία τα γεωμετρικά απέναντι διαμορφώσεων που λαμβάνονται σε 300 K και 310 K σε σύγκριση με WT και αυτο. Όπου, στα 310 Κ οι ελεύθερες τιμές ενέργειας ήταν υψηλότερη από εκείνη του WT με διαφορά 1.000 kcal /mole. Η ακαμψία που αποκτήθηκε από τις

φ

γωνίες R249S σε 310 K μπορεί να οδηγήσει στην αύξηση της ελεύθερης ενέργειας που συνάγει την απώλεια της σταθερότητας. R175H έδειξε καμία ιδιαίτερη κυρίαρχη διάπλασης που αποκτήθηκε από τις

φ

γωνίες καθώς ο πληθυσμός φάνηκε να εξαπλωθεί πλήρως. Ωστόσο, τόσο σε θερμοκρασίες R175H φάνηκε να είναι λιγότερο σταθερή από ό, τι WT από την άποψη της ελεύθερης ενέργειας του μορίου ρ53. Ως εκ τούτου, το σχήμα 3 συνάγει το συμπέρασμα ότι αύξηση της θερμοκρασίας προκαλεί αλλοίωση στο

φ

γωνίες για WT, V143A, R249S και R175H η οποία με τη σειρά της μειώνει τη σταθερότητά τους.

Σχήμα 4Α και 4D δείχνουν το

ψ

γωνίες διανομής WT και V143A στους 300 K και 310 K κατά της Δ G

πρωτεΐνη

. Οι διαμορφώσεις στις δύο WT και V143A φαίνεται να είναι διάσπαρτα και εκτείνονται σε παρόμοια επίπεδα ελεύθερης ενέργειας. Ωστόσο, σε 310 Κ η WT τείνει να συμπληρώσετε το cis περιοχή, ενώ V143A εξακολουθεί να είναι διάσπαρτα. Τα επίπεδα της ελεύθερης ενέργειας σε 310 Κ ήταν παρόμοιες τόσο για V143A και WT και υψηλότερα από ό, τι παρατηρήθηκε σε 300 Κ Σχήμα 4Β και 4Ε μιλάει για τη διαμορφωτική κατανομή των WT και R249S σε 300 K και 310 K αντίστοιχα. Στα 300 K, ο πληθυσμός διαδόθηκε σε όλο το φάσμα της

ψ

αλλά οι ελεύθερες τιμές ενέργειας είναι υψηλότερες σε σύγκριση με WT. Σε 310 Κ, η διάσπαρτα συμπεριφορά των R249S διατηρήθηκε σε ακόμη υψηλότερα επίπεδα της ελεύθερης ενέργειας σε σύγκριση με τον εαυτό και WT. Σχήμα 4C και 4F περιγράφει την κατανομή του πληθυσμού για R175H στους 300 Κ και 310 Κ, αντίστοιχα. Στα 300 K, τα διαμορφομερή για R175H έχουν εξαπλωθεί σε όλο το εύρος από -180 ° έως 180 ° και σε υψηλότερο επίπεδο ελεύθερης ενέργειας σε σύγκριση με WT. Σε 310 Κ, τα διαμορφομερή τείνουν να συγκεντρώνονται στα cis και trans περιφέρειες για R175H αν και τα επίπεδα της ελεύθερης ενέργειας είναι υψηλότερη από εκείνη του WT. Συνολικά, για όλες τις τρεις μεταλλάξεις το

ψ

γωνίες οδήγησε σε διαμορφώσεις που αυξάνουν την ελεύθερη ενέργεια του μορίου ρ53 σε 310 K σε σύγκριση με WT και οι ίδιοι σε 300 Κ

Σε περίπτωση WT τόσο η

φ

και

ψ

γωνίες παρουσίασαν μεταβολή με την αύξηση της θερμοκρασίας. V143A, R249S και R175H έδειξε αλλαγές στο

φ

διανομής γωνία με αύξηση των ελεύθερων τιμών της ενέργειας κατά 200 kcal /mole σε 310 K σε σύγκριση με 300 Κ Ωστόσο, στην περίπτωση των τριών

ts

-mutants

ψ

διανομής γωνία ήταν παρόμοια σε αμφότερες τις θερμοκρασίες αλλά οι ελεύθερες τιμές ενέργειας φαίνεται να είναι υψηλότερη από 200 kcal /mole σε 310 K. Αυτές οι κατανομές των διαμορφομερών βασίζεται στην ελεύθερη ενέργεια του μορίου ρ53 και PC2 από τους κύριους δίεδρα αλυσίδα υποδηλώνει ότι είτε

φ

ή

ψ

ή και τα δύο μπορεί να είναι υπεύθυνη για την αλλαγή στην σταθερότητά του. Ως εκ τούτου, η διαμορφωτική κατανομή με βάση την κύρια δίεδρα αλυσίδας και ελεύθερη ενέργεια της βοήθειας p53 μορίου να συμπεράνουμε ότι η θερμοκρασία μπορεί να προκαλέσει μεταβολή στη συνολική δομή του p53. Αυτή η προσαρμογή των διαφορετικών διαμορφώσεων σε υψηλότερη θερμοκρασία προκαλεί απώλεια της σταθερότητας στην V143A, R249S και R175H την άποψη της ελεύθερης ενέργειας.

Η επίδραση της θερμοκρασίας σχετικά με τα κατάλοιπα διασύνδεση των

ts

-mutants

DBD του ρ53 είναι γνωστό ότι έχει δύο διακριτές περιοχές που συμβάλλουν στη σύνδεση με το DNA

δηλαδή

., το μοτίβο βρόχος φύλλων-έλικα και loops 2, 3 με Ψευδάργυρο συντονισμό συγκρότημα. Αυτές οι δύο περιοχές αποτελείται από οκτώ σημαντικά υπολείμματα

δηλαδή

., LYS 120, SER 241, ARG 248, ARG 273, ALA 276, CYS 277, ARG 280 και ARG 283 που διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στη διαμόρφωση της p53-DNA αλληλεπιδράσεις. Προκειμένου να ελεγχθεί η επίδραση της θερμοκρασίας για τη συμμετοχή τους στη δραστηριότητα πρόσδεσης DNA, η περιοχή πλευρική αλυσίδα διαλύτη προσιτή επιφάνεια (ΣΑΣΑ) και δωρεάν συνδρομή ενέργειας σε δεσμευτικές υπολογίστηκαν για τα οκτώ αυτά τα υπολείμματα. Η ανάλυση αυτή έγινε για τα τελευταία 10 ns των προσομοιώσεων.

Διαλύτης έκθεσης των υπολειμμάτων interface.

Έχουν υπάρξει διάφορες μελέτες σχετικά με τα μοντέλα των διαφόρων συστημάτων πρωτεΐνης η οποία συζητά την έκθεση διαλύτη ως ένα από τους κρίσιμους παράγοντες για τη διατήρηση της σταθερότητας της πρωτεΐνης [25, 48, 49]. Ειδικά στην περίπτωση της ρ53 οποιαδήποτε μεταβολή της έκθεσης του διαλύτη είναι γνωστό ότι παίζει ένα σημαντικό ρόλο στον καθορισμό της σταθερότητας των μεταλλακτών του [25]. Ωστόσο, η έκθεση των θαμμένα κατάλοιπα τείνει να αποσταθεροποιήσει την πρωτεΐνη περισσότερο σε σύγκριση με εκείνα που βρίσκονται στην επιφάνεια της πρωτεΐνης. Προκειμένου να διερευνηθεί αυτά τα πειραματικά ευρήματα, η πλευρική αλυσίδα SASA για τα οκτώ υπολείμματα μεσόφασης υπολογίστηκαν.

Το σχήμα 5 περιγράφει τον μέσο πλευρικής αλυσίδας SASA για όλες τις οκτώ υπολείμματα μεσόφασης στους 300 Κ (Σχήμα 5Α) και 310 K (Σχήμα 5Β). Οι μπάρες σφάλματος σε αυτά τα δύο σχήματα δείχνουν τις τιμές σταθερής απόκλισης. Η συμπεριφορά των πλευρικής αλυσίδας SASA για κάθε ένα από τα οκτώ υπολείμματα μεσόφασης w.r.t χρόνος για όλες τις ρ53 παραλλαγές στα 300 και 310 Κ έχουν παρασχεθεί σε συμπληρωματικά στοιχεία (S11-S18 Σχ). Λαμβάνοντας υπόψη WT στους 300 Κ, όπως κοντά σε φυσική διαμόρφωση του p53, η σύγκριση των άλλων παραλλαγών p53 έχει συζητηθεί εδώ. Η διαφορά στις τιμές SASA έχουν αναφερθεί σε παρένθεση. Κάθε φορά που αυτή η διαφορά στη SASA ήταν μεγαλύτερη από την τυπική απόκλιση της παραλλαγής ρ53 θεωρήθηκε ότι είναι στατιστικά σημαντική. V143A είχε τέσσερα από τα οκτώ υπολείμματα

δηλαδή

., LYS 120, ARG 273, CYS 277 και ARG 280 με περισσότερο εκτεθειμένη (10-30

a

2) πλευρικές αλυσίδες σε 300 K και 310 K ό, τι WT στους 300 K. από αυτά τα τέσσερα εκτός από την ARG 273 οι τρεις υπόλοιποι έδειξαν στατιστικά σημαντική διαφορά SASA. Η έκθεση διαλύτης για ARG 248 σε 300 K ήταν μικρότερη από εκείνη του WT σε 300Κ (20

a

2), το οποίο βρέθηκε να αυξάνει σε 310 K. Ωστόσο, αυτή η αύξηση των SASA για ARG 248 σε 310 Κ συνοδεύτηκε από μεγάλη τυπική απόκλιση (περίπου 20

a

2). Τα υπόλοιπα τρία υπολείμματα

δηλαδή

., SER 241, ALA 276 και CYS 277 διέφεραν ελάχιστα (λιγότερο από 15

a

2) σε σύγκριση με WT στους 300 Κ R249S είχε έξι al. al. al.