Αφηρημένο

γκαλεκτίνη-4 (Gal-4) είναι ένα μέλος της οικογένειας γκαλεκτίνη της γλυκάνης δεσμευτικές πρωτεΐνες που δείχνει μια σημαντικά υψηλότερη έκφραση στην κυστική όγκων του ανθρώπινου παγκρέατος και σε παγκρεατικά αδενοκαρκινώματα σύγκριση με το φυσιολογικό πάγκρεας. Ωστόσο, η υποθετική λειτουργία του Gal-4 στην πρόοδο του όγκου του καρκίνου του παγκρέατος είναι ακόμη ατελώς κατανοητός. Σε αυτή τη μελέτη, ο ρόλος του Gal-4 στην πρόοδο του καρκίνου διερευνήθηκε, χρησιμοποιώντας ένα σύνολο που ορίζεται παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, Pa-Tu-8988S (Patù-S) και Pa-Tu-8988T (Patù-T), ως μοντέλο . Αυτές οι δύο κυτταρικές σειρές που προέρχονται από την ίδια μετάσταση στο ήπαρ ενός ανθρώπινου πρωτογενούς παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα, αλλά διαφέρουν ως προς τα χαρακτηριστικά της ανάπτυξής τους και μεταστατική ικανότητα. Έχουμε αποδείξει ότι Gal-4 έκφραση είναι υψηλή σε Patù-S, η οποία δείχνει φτωχές μεταναστευτικές ιδιότητες, ενώ πολύ χαμηλότερα επίπεδα Gal-4 που παρατηρείται στην άκρως μεταστατική κυτταρική γραμμή Patù-T. Σε Patu-S, Gal-4 βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα, αλλά είναι επίσης εκκρίνεται και συσσωρεύεται στη μεμβράνη σε θέσεις επαφής με γειτονικά κύτταρα. Επιπλέον, δείχνουμε ότι Gal-4 αναστέλλει το σχηματισμό μετάστασης καθυστερώντας μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος

in vitro

χρησιμοποιώντας δοκιμασία μηδέν, και

in vivo

χρησιμοποιώντας zebrafish (

Danio rerio

) ως πειραματικό μοντέλο. Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι Gal-4 μπορεί να δράσει στην κυτταρική επιφάνεια του Patù-S ως μόριο προσκόλλησης για την πρόληψη της απελευθέρωσης των καρκινικών κυττάρων, αλλά έχει επιπλέον μια κυτοσολική λειτουργία με αναστολή της μετανάστευσης μέσω ενός ακόμη άγνωστου μηχανισμού.

Παράθεση: Belo AI, van der Sar AM, Tefsen Β, van Die I (2013) γκαλεκτίνη-4 μειώνει τη μετανάστευση και την μετάσταση σχηματισμό κυττάρων καρκίνου του παγκρέατος. PLoS ONE 8 (6): e65957. doi: 10.1371 /journal.pone.0065957

Επιμέλεια: Roger Chammas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, Βραζιλία

Ελήφθη: 14 Φλεβάρη του 2013? Αποδεκτές: 29 Απρ 2013? Δημοσιεύθηκε: 18 Ιουνίου 2013

Copyright: © 2013 Belo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από Fundação para a Επιστημών e Tecnologia (FCT), Λισαβόνα, Πορτογαλία, μέσω ερευνητικών επιχορηγήσεων SFRH /BD /44820/2008 απονέμεται σε ΑΙΒ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια από τις κύριες αιτίες θανάτου από καρκίνο στον δυτικό κόσμο. Κλινικά αποτελεσματικών στρατηγικών για την έγκαιρη διάγνωση της νόσου δεν είναι ακόμα διαθέσιμα. Η συχνότητα εμφάνισης καρκίνου του παγκρέατος και θνησιμότητας σε ασθενείς με αυτόν τον τύπο καρκίνου έχει σχεδόν μειωθεί κατά τα τελευταία 50 χρόνια [1], [2], [3], [4]. Ως εκ τούτου περαιτέρω κατανόηση των μηχανισμών της έναρξης, προόδου και της μετάστασης του καρκίνου του παγκρέατος είναι δικαιολογημένη.

γαλεκτίνες είναι πρωτεΐνες που μπορούν να εκφραστούν με παρεκκλίνοντα στον καρκίνο και έχουν ενοχοποιηθεί σε πρόοδο του καρκίνου [5], [6]. Αποτελούνται από μια οικογένεια γαλακτοζίτη δέσμευσης διαλυτού λεκτίνες που έχουν ταξινομηθεί σε τρεις υποομάδες βάσει της δομής και τον αριθμό των τομέων υδατάνθρακα αναγνώρισης τους: πρωτότυπο (γαλεκτίνες-1, -2, -5, -7, -10, -11 , -13, και -14), χίμαιρα τύπου (γαλεκτίνη-3), και διαδοχική επανάληψη τύπου (γαλεκτίνες-4, -6, -8, -9, και -12) [που επισκοπείται στο [7]]. Λειτουργούν σε μια ευρεία ποικιλία των βιολογικών διεργασιών τόσο ενδο- και εξωκυτταρικά. Γαλεκτίνης-γλυκοπρωτεΐνη πλέγματα παίξει σημαντικούς ρόλους στη ρύθμιση της κυτταρικής λειτουργίας, όπως και προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου, κυττάρου-εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) αλληλεπιδράσεις, κυτταρική ανάπτυξη [8], η οργάνωση των τομέων της μεμβράνης σε σχηματισμό λιπιδικών σχεδιών [9], [10] , [11], η μετανάστευση λευκοκυττάρων [επανεξετάζονται από [12]] και η ρύθμιση της ενδοκυτταρικής σηματοδότησης [13], [14], [15].

Η έκφραση της γαλεκτίνες διαμορφώνεται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των μεμονωμένων κυττάρων και μπορεί να μεταβληθεί υπό διαφορετικές φυσιολογικές ή παθολογικές συνθήκες. Γαλεκτίνες συχνά υπερεκφράζονται σε καρκινικά κύτταρα και τον καρκίνο που σχετίζεται με στρωματικά κύτταρα, ειδικά σε εκείνες τις τύπους κυττάρων που κανονικά δεν εκφράζουν το συγκεκριμένο γαλεκτίνη [16]. Σε εξέλιξης του καρκίνου, οι γαλεκτίνες εμπλέκονται στην διαφοροποίηση, προσκόλληση, η μετανάστευση, η αγγειογένεση, κακοήθη μετασχηματισμό, την απόπτωση και την ανθεκτικότητα του καρκίνου των ναρκωτικών [επισκοπείται στο [5], [17], [18], [19], [20], [21] [22]]. Επιπλέον, υπάρχουν αρκετές αναφορές που έχουν συνδέσει αυτές τις πρωτεΐνες στην εισβολή και μετάσταση σε διάφορους τύπους καρκίνων [16], [23], [24], [25], [26], [27], [28].

σε αυτή τη μελέτη έχουμε επικεντρωθεί στο ρόλο της γαλεκτίνης-4 (Gal-4) στη μετάσταση του καρκίνου του παγκρέατος κυττάρων. σχηματισμού μετάστασης είναι μια διαδικασία πολλών σταδίων στην οποία πρωτογενή κύτταρα όγκου εισβάλλουν γειτονικούς ιστούς, μεταναστεύουν μέσω του αγγειακού συστήματος για να εξαγγειώνονται τελικά στο περιαγγειακή ιστό και πολλαπλασιάζονται σε δευτερογενείς όγκους. Gal-4 είναι ένα 323-αμινοξέων (36 kDa) πρωτεΐνη η οποία εκφράζεται κυρίως στο αυλού επιθήλια της γαστρεντερικής οδού, από τη γλώσσα στο παχύ έντερο. Gal-4 έκφραση δεν ανιχνεύεται σε υγιή πάγκρεας, αλλά ενισχύεται σημαντικά στην κυστική όγκων του ανθρώπινου παγκρέατος και του παγκρέατος αδενοκαρκινωμάτων σε σύγκριση με δείγματα φυσιολογικού ιστού, ενώ η έκφρασή του είναι χαμηλή σε νευροενδοκρινείς όγκους του παγκρέατος [26], [27], [29 ], [30], [31]. Η λειτουργία του Gal-4 στην πρόοδο του όγκου και τη μετάσταση του καρκίνου του παγκρέατος, ωστόσο, παραμένει ασαφής. Σε αυτή τη μελέτη ο υποθετικός ρόλος του Gal-4 στην πρόοδο του καρκίνου διερευνήθηκε, χρησιμοποιώντας ένα σύνολο που ορίζεται παγκρεατικών κυτταρικών σειρών. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Gal-4 είναι υψηλότερη εκφράζεται στα περισσότερα διαφοροποιημένα κύτταρα παγκρεατικού όγκου σε σύγκριση με παγκρεατικά κύτταρα που αποδεικνύουν μεταστατικό δυνατότητες. Επιπλέον, Gal-4 επηρεάζει τον σχηματισμό μεταστάσεων καθυστερώντας τη μετανάστευση και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος

in vitro

σε δοκιμασία το μηδέν και

in vivo

στο zebrafish έμβρυα ως πειραματικό μοντέλο.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Roy

– /-? μάργαρο

– /- Casper

Danio rerio

(zebrafish) αντιμετωπίστηκαν σε συμμόρφωση με τους τοπικούς κανονισμούς καλής μεταχείρισης των ζώων και συντηρούνται σύμφωνα με τυποποιημένα πρωτόκολλα (zfin.org). Η αναπαραγωγή των ενήλικων ψαριών εγκρίθηκε από την τοπική επιτροπή καλής διαβίωσης των ζώων (επιτροπή αδειοδότησης ζωικά πειραματικά, ΔΕΚ) του ιατρικού κέντρου του Πανεπιστημίου VU. Όλα τα πρωτόκολλα τηρούνται οι διεθνείς κατευθυντήριες γραμμές που καθορίζονται από την οδηγία για την προστασία των ζώων της ΕΕ 86/609 /ΕΟΚ, η οποία επιτρέπει έμβρυα zebrafish να χρησιμοποιηθούν μέχρι τη στιγμή της ελεύθερης διαβίωσης (περίπου 5-7 ημέρες μετά τη γονιμοποίηση). Επειδή τα έμβρυα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη πληρούνται τα κριτήρια αυτά, κανένα πιστοποιητικό Δεκέμβριο απαιτείται για τη μελέτη αυτή.

Τα αντισώματα, αντιδραστήρια και ρυθμιστικά

αίγας αντι-ανθρώπινης γκαλεκτίνη-4 (BD Biosciences, Βέλγιο) ήταν χρησιμοποιείται για την ανίχνευση της Gal-4 και αντι-τουμπουλίνης (Cedarlane, Καναδάς) χρησιμοποιήθηκε ως ένα ενδογενές ελέγχου. Δευτερογενή αντισώματα (ABS) που χρησιμοποιήθηκαν ήταν Οδύσσεια IRDye 680 Donkey Anti-Goat (0,5 mg)? IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (LI-COR Biosciences, USA)? αντι-κατσίκα κουνελιού Alexa Fluor 488? αντι-κατσίκας κονίκλου Alexa Fluor 647 (Molecular Probes, Invitrogen, USA). TO-PRO®-3 ιωδίδιο με πολύ-κόκκινος φθορισμός από το Live Technologies (Invitrogen, USA) χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης νεκρών κυττάρων

Η ανασυνδυασμένη Hgal-4 πρωτεΐνη αγοράστηκε από την BD Biosciences.? LiCor ρυθμιστικό αποκλεισμού αποκτήθηκε από την LI-COR Βιοεπιστήμες, USA? λακτόζη ελήφθη από την Sigma (USA) και κόκκινη φθορίζουσα χρώση κυττάρων CM-με Dil από Vybrant, Invitrogen (USA). siRNA ελέγχου (αγωνίζομαι Α) και για GAL4 siRNA (10 μΜ) αγοράστηκε από Santa Cruz Biotecknology (ΗΠΑ). Σιγαστήρα προ-σχεδιασμένες siRNA έναντι Gal-4 (20 μΜ) και Ambion®

Silencer®

αρνητικού ελέγχου # 1 siRNA (20 μΜ) αγοράστηκε από Ambion (ΗΠΑ). Lipofectamine RNAiMax και Opti-MEM αντιδραστήρια επιμόλυνσης ελήφθησαν από την Invitrogen (ΗΠΑ).

Κύτταρα και συνθήκες καλλιέργειας

Ο καρκίνος του παγκρέατος κυτταρικές σειρές Pa-Tu-8988S (Patù-S) και Pa-Tu -8988T (patu-T) αγοράστηκαν από την DSMZ (Γερμανία). Άλλες παγκρέατος κυτταρικές γραμμές ήταν ένα είδος δώρο από τον καθηγητή Δρ Richardson (Πανεπιστήμιο Leiden, Ολλανδία) [32]. Οι κυτταρικές γραμμές AsPC1, BxPC3, MIAPaCa και Panc01 καλλιεργήθηκαν σε RPMI (GIBCO, Invitrogen), με 10% FCS (Lanza, Βέλγιο) και 1:100 Pen /Strep (GIBCO, Invitrogen) στους 37 ° C + 5% CO

2. Οι κυτταρικές γραμμές Capan-I και Capan-ΙΙ καλλιεργήθηκαν με 15% FCS. Patu-S, Patù-Τ και PaTu8902 καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ υψηλής γλυκόζης (GIBCO, Invitrogen), με 10% FCS και 1:100 Pen /Strep στους 37 ° C + 5% CO

2.

cDNA Σύνθεση και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε από όλες τις κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. mRNA στη συνέχεια μεταγράφεται σε cDNA με χρήση του κιτ Reverse Transcription System (Promega, USA), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33]. cDNA από φυσιολογικό ανθρώπινο παγκρεατικού πόρου επιθηλιακά-όπως hTERT-HPNE κυτταρική γραμμή [34] ήταν ένα είδος δώρου από τον Dr. Ε Giovannetti (Τμήμα Ιατρικής Ογκολογίας, VUmc Κέντρο Καρκίνου Άμστερνταμ, Κάτω Χώρες). Real time αντιδράσεις (RT) PCR πραγματοποιήθηκαν με τη μέθοδο SYBR Green σε ένα σύστημα ανίχνευσης ακολουθίας ΑΒΙ 7900HT (Applied Biosystems, USA) όπως περιγράφεται προηγουμένως [35]. Όλα τα ολιγονουκλεοτίδια σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας Primer Express 2.0 (Applied Biosystems, USA), το λογισμικό του υπολογιστή, και συντίθεται από την Invitrogen Technology Ζωής (USA). Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν ως ακολούθως: 2 λεπτά στους 50 ° C, ακολουθούμενο από 10 min στους 95 ° C και 40 κύκλους 15 sec στους 95 ° C και 1 λεπτό στους 60 ° C. Τα δεδομένα εκφράζονται ως σχετική αφθονία mRNA που λαμβάνεται από τις τιμές CT από το στόχο σε σχέση με το ενδογενές γονίδιο αναφοράς

GAPDH

.

Κατασκευή patu-Τ κύτταρα που εκφράζουν Gal-4

Για την κατασκευή patu-Τ κύτταρα που εκφράζουν ανασυνδυασμένο (Hgal-4) γονίδιο Gal-4, το ανθρώπινο γαλεκτίνης-4 κλωνοποιήθηκε με εισαγωγή cDNA του Hgal-4 γονιδίου στο φορέα pRRL-οΡΡΤ-CMV-X2-PRE-sin IRES-eGFP (ένα είδος δώρου από τον Dr. α Horrevoets, VU Medical Center, Άμστερνταμ, Κάτω Χώρες). Το σύνολο του Hgal-4 ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF) ελήφθη με ενίσχυση RT-PCR, εισάγοντας sites NsiI /EcoRI περιορισμού για εισαγωγή και μια ακολουθία COSAC πριν από το ORF (Fwd: catatgcatcaccATGGCCTATGTCCCCGC? Rev: gaattcgatTTAGATCTGGACATAGGACAAGG). Η Hgal-4 ένθετο κλωνοποιήθηκε χρησιμοποιώντας την θέση EcoRI του φορέα, τοποθετώντας έτσι την Hgal-4 γονίδιο κάτω από ένα ιδιοσυστατικό ενεργό υποκινητή CMV. Το προκύπτον lenti-ιικό κατασκεύασμα πολλαπλασιάστηκε σε

Escherichia coli

BL21 (DE3) και καθαρίστηκε με κιτ spin-στήλη πλασμιδίου απομόνωση (Qiagen, Germany). Lenti-ιική παραγωγή και μόλυνση του Patù-Τ κυττάρων με το ιικό κατασκεύασμα, με αποτέλεσμα στην κυτταρική σειρά Patù-T /Gal-4, διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36]. Μια κυτταρική γραμμή (Patù-Τ /μακέτα) κατασκευάστηκε με εισαγωγή του κενού φορέα.

Gal-4 Knock Down (KD) σε Patù-S κύτταρα

RNA-μεσολάβηση παρέμβαση ήταν χρησιμοποιούνται για τη μείωση της Gal-4 έκφραση σε κύτταρα Patù-S. Για βέλτιστη αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης σε κύτταρα Patù-S, και οι δύο Gal-4-στόχο siRNA (40 ηΜ τελική συγκέντρωση) από την Santa Cruz Biotechnology και σιγαστήρας προσχεδιασμένα siRNA (10 ηΜ τελική συγκέντρωση) χρησιμοποιείται ταυτόχρονα για την αναστολή της Gal-4 έκφρασης (PaTu- S /Gal-4-KD). Ένα αρνητικό μάρτυρα (αγωνίζομαι Α μαζί με siRNA αρνητικού ελέγχου 1 #) συμπεριλήφθηκε στα πειράματα (Patù-S /mock-KD). Οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές Invitrogen για αντίστροφη επιμόλυνση σε μια πλάκα 24 φρεατίων χρησιμοποιώντας 1 μΙ Lipofectamine RNAiMax και 100 μΐ μέσου Opti-ΜΕΜ. Για να μειωθεί Gal-4 έκφραση σε κύτταρα Patù-S, siRNA εισήχθη δύο φορές με μεσοδιάστημα 4 ημέρες και τα κύτταρα μεταμοσχεύθηκαν σε 24 ώρες, το zebrafish εμβρύου μετά τη δεύτερη διαμόλυνση. επίπεδα Gal-4 mRNA μετρήθηκαν σε διάφορα χρονικά σημεία κατά τη διάρκεια αυτής πειραμάτων χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR.

Western-Λεκιάζοντας

Τα κύτταρα λύθηκαν σε 0 ° C σε ρυθμιστικό ΤΕΑ λύσης (Triton Χ- 100, NaCl, MgCl, CaCl

2, ΤΕΑ ρΗ8.2) που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με μετρήσεις Α280 και BCA προσδιορισμό χρησιμοποιώντας το Protein Assay Kit του Pierce (USA). Οι πρωτεΐνες των κυτταρικών προϊόντων λύσης (75 μg) και μέσο καλλιέργειας (25 μΐ) διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE σε ένα πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 12.5% ​​σε ένα ασυνεχές σύστημα ρυθμιστικού διαλύματος και οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Whatman Protran, Sigma). Μετά από ολονύκτια αποκλεισμό σε 1:01 LiCor ρυθμιστικό διάλυμα μπλοκαρίσματος σε PBST /1% BSA (PBS με 0,05% Tween 20, 1% BSA), τα στυπώματα επωάστηκαν για 60 min σε RT με κατσίκα αντι-Hgal-4 (0.1 μg /ml ). Mouse αντί-τουμπουλίνης (1:2000 αραίωση) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης (κυτταρολύματα) και ανίχνευση των κυτταρικών υπολειμμάτων (μέσο καλλιέργειας). Δευτερογενής ΦΑ IRDye 680 αντι-κατσίκας και IRDye 800CW αντι-κουνελιού IgG χρησιμοποιήθηκαν σε 1:15000 αραιώσεις (0,07 μg /ml), σε PBST /1% BSA για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (RT) στο σκοτάδι. Ανάλυση στυπώματος Western εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας LI-COR συστήματα Odyssey σαρωτή και λογισμικού.

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Προσδιορισμός

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων σε περίπου 1 × 10

4 και 1 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο και επωάστηκαν όλη τη νύκτα για προσκόλληση των κυττάρων στην πλάκα. [

3Η] θυμιδίνη (1 μΟί /φρεάτιο? Amersham Biosciences, USA) προστέθηκε και τα κύτταρα επωάστηκαν για άλλες 24 ώρες στους 37 ° C + 5% CO

2. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και [

3Η] θυμιδίνης αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα υγρό σπινθηρισμού MicroBeta

2 Μετρητής Plate 2450 (Perkin Elmer, USA).

μικροσκοπία ανοσοφθορισμού

patu-S , patu-T /mock και Patù-T /Gal-4 κύτταρα που αναπτύσσονται σε γυάλινες καλυπτρίδες για 24 ώρες πλύθηκαν 3 φορές με PBS, σταθεροποιήθηκαν για 30 λεπτά σε 4% παραφορμαλδεΰδη και κατέστησαν διαπερατά σε 0.1% Triton- Χ-100 /PBS για 5 min. Μη ειδική σύνδεση παρεμποδίστηκε με απόσβεση 10 λεπτά με PBS /γλυκίνη (0,15Μ) που ακολουθείται από 30 λεπτά με PBS /0.2% ζελατίνη /BSA 0.5% (PBSG). Τα κύτταρα επωάστηκαν με πολυκλωνικό αντίσωμα κατσίκας αντι-Hgal-4 σε PBSG (αραίωση 0,2 μg /ml) για 1 ώρα και στη συνέχεια πλένονται με PBS. Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε μετά από 1 ώρα επώαση σε θερμοκρασία δωματίου με 5 μg /ml του δευτερεύοντος Abs (αντι-κατσίκας Alexa Fluor 488 ή αντι-κατσίκας Alexa Fluor 647). Οι πυρήνες βάφτηκαν με HOECHST (1 μg /ml σε PBS) κατά τη διάρκεια του σταδίου της επώασης με δευτερογενή Ab. Η ακτίνη ανιχνεύθηκε με χρώση phalloidin (1:5000 σε PBS, 15 λεπτά). Μετά από ένα τελικό στάδιο πλύσης σε PBS και ενσωμάτωση με τη χρήση Mowiol (Kuraray ΡονβΙ, Γερμανία) διάφορα κύτταρα κάθε κατάσταση οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο Leica M6000 Β με τον αντικειμενικό φακό HCX PL APO 40,0 × 0,85 DRY. Εικόνες ελήφθησαν με DFC350FXR2-095903305 κάμερα και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό LASAF (Leica Microsystems, Germany).

Κυτταρομετρία Ροής

Για την ανίχνευση της ενδογενούς Gal-4, τα κύτταρα πρώτα μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, που ακολουθείται από κυτταρική διαπερατότητα σε ΡΒΑ /0.5% σαπωνίνη για 15 λεπτά στους 4 ° C. Για την ανίχνευση της πρόσδεσης του ανασυνδυασμένου ανθρώπινου Gal-4 (rec Hgal-4) στην επιφάνεια του κυττάρου, οι διαδικασίες διεξήχθησαν σύμφωνα με Patnaik,

κ.ά.

[37]. Εν ολίγοις, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε ισορροπημένο διάλυμα άλατος κρύο Hank (HBSS, Sigma, USA) με 500 mM λακτόζης. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέγονται και επωάζονται σε κρύο HBSS με 2% BSA για 1 ώρα στους 4 ° C με ήπια ανάδευση. Μετά από αυτό, τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με HBSS /BSA με 2 mM β-μερκαπτοαιθανόλη (Gibco, Invitrogen), και στη συνέχεια επωάστηκαν για μία ώρα στους 4 ° C σε HBSS /BSA /1 mM β-μερκαπτοαιθανόλη με την απουσία ή την παρουσία του rec Hgal-4 (5 μg /ml) για την ανίχνευση ενδογενούς επιφάνεια δεσμευμένο Gal-4 ή στα επιφανειακά δεσμευμένο rec Hgal-4, αντίστοιχα. Για να εκτιμηθεί εάν Gal-4 δέσμευση είναι εξαρτώμενη από υδατάνθρακα, οι δοκιμασίες πρόσδεσης διεξήχθησαν με την παρουσία 500 mM λακτόζης. Ως προς το επιφανειακό και κυτοσολικές ανάλυση, τα κύτταρα βάφτηκαν με αντι-Gal-4 Ab (2 μg /ml) σε PBS με 0,5% BSA και 0,02% αζίδιο (ΡΒΑ) που περιέχει 10% FCS (Sigma, USA), για 30 λεπτά σε 4 ° C. Για τη δευτεροβάθμια χρώση, Alexa488 ή Alexa647 επισημασμένο Abs χρησιμοποιήθηκαν (5 μg /ml και η επώαση για 30 λεπτά στους 4 ° C). Ένδειξη νεκρό κύτταρο TO-PRO®-3 ιωδίδιο (1 nM) προστέθηκε μόλις προηγουμένως να ρέει μετρήσεις cytrometry. Η κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός FACScan ή κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur και το λογισμικό Summit. Τα νεκρά κύτταρα που ορίζεται ως υψηλή προς-PRO®-3 χρώση αποκλείστηκαν από την ανάλυση.

In vitro

Δοκιμασία Μετανάστευσης ( «μηδέν» Δέλτα)

Το μηδέν-δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως από τους Liang et al. [38]. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν προς συρροή σε πλάκα 24-φρεατίων. Η μονοστιβάδα κυττάρων αποξέστηκε σε μια ευθεία γραμμή με ένα ρύγχος πιπέτας 200 μΐ (Sarstedt, Γερμανία). Φωτογραφίες του μηδέν ελήφθησαν κάτω από το ιμβερτοποιημένο Leica DMI μικροσκόπιο σε 0 h, 12 h, 24 h και 48 h για mock κύτταρα Patù-Τ /Gal-4 και Patù-Τ /. Οι φωτογραφίες σε κάθε χρονικό σημείο ελήφθησαν με Leica DFC420 κάμερα. πλάτος Gap σε 0 h ορίστηκε σε 100%. ανάλυση πλάτος Gap διεξήχθη με PhotoshopCS4 χρησιμοποιώντας το αναλυτικό εργαλείο χάρακα. Οι μετρήσεις ελήφθησαν σε πολλαπλές θέσεις ορίζονται (& gt? 5) κατά μήκος του μηδέν. Κάθε αρχή δόθηκε κατά μέσο όρο όλων των μετρήσεων. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων

In vivo

Μετάσταση Δοκιμασία

Roy

– /-?. μάργαρο

– /- Casper Danio rerio

(zebrafish) διεκπεραιώθηκαν σύμφωνα με τους τοπικούς κανονισμούς φροντίδα των ζώων και τυποποιημένα πρωτόκολλα των Κάτω Χωρών. Τα ψάρια κρατήθηκαν στους 28 ° C σε ενυδρεία με τους κύκλους ημέρας /νύχτας φωτός (10 ώρες σκοτάδι έναντι 14 περιόδους ώρες φωτός). Τα αναπτυσσόμενα έμβρυα διατηρήθηκαν σε νερό αυγού (60 μg /ml στιγμιαία ωκεανός βλέπε άλατα) στους 28 ° C πριν από τη μεταμόσχευση και στους 35 ° C μετά την μεταμόσχευση.

μεταμόσχευση κυττάρων του καρκίνου πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με Marques

et al

[39]. Βασικά, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε συρροή, σε επεξεργασία με θρυψίνη (GIBCO, Invitrogen) και φυγοκεντρήθηκαν 5 λεπτά, στις 1500 rpm. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν σε PBS που περιείχε CM-με Dil σε μια τελική συγκέντρωση 4 ng /μl, για 4 λεπτά στους 37 ° C και 15 λεπτά στους 4 ° C. Στη συνέχεια, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και τα κυτταρικά ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε 100% FCS για ανάκτηση 5 λεπτά και πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Τέλος, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε PBS για μεταμόσχευση σε zebrafish έμβρυα 2 ημέρες μετά την γονιμοποίηση (dpf). Τα έμβρυα αποχορειώνονται και αναισθητοποιήθηκαν με τρικαϊνης (MS-222, Sigma-Aldrich, USA). Χρησιμοποιώντας ένα χειροκίνητο εγχυτήρα (Eppendorf, Γερμανία? Injectman Νί2), το κυτταρικό εναιώρημα φορτώθηκε σε ένα τριχοειδές ένεση (15 μm εσωτερικό και ο εξωτερικός 18 μm διαμέτρου). Στη συνέχεια, περίπου 100 κόκκινο φθορίζον κύτταρα εγχύθηκαν εντός του κρόκου σακί των αποχορειώνονται εμβρύων. Μετά την ένεση, τα έμβρυα αφέθηκαν να ανανήψουν από τη μεταμόσχευση για 1 ώρα σε RT. Μετά την περίοδο αυτή (2 ώρες μετά τη μεταμόσχευση (ΗΡΤ)), τα έμβρυα εξετάστηκαν για την παρουσία φθοριζόντων κυττάρων. Έμβρυα που περιέχουν φθορίζοντα κύτταρα έξω από την περιοχή μεταμόσχευση σε 2 ΗΡΤ θεωρήθηκαν διαρροής και αποκλείονται από περαιτέρω ανάλυση. Ο αριθμός των εμβρύων που ζωντανός σε αυτό το στάδιο ορίστηκε ως 100% για κάθε κατάσταση ξεχωριστά. Όλα τα άλλα έμβρυα επωάζονται στους 35 ° C για τις ακόλουθες 3 ημέρες.

Imaging, Επιλογή και την τοποθέτηση των μεταμοσχευμένων έμβρυα ψαριού zebra

Στις 1, 2 και 3 ημέρες μετά τη μεταμόσχευση (DPT), το έμβρυα αναισθητοποιήθηκαν με τρικαϊνης και τοποθετείται πλευρικά επί μεθυλκυτταρίνης 3%. Τα έμβρυα εξετάστηκαν κάτω από ένα στερεοφωνικό DSR φθορισμού Leica MZ16FA μικροσκόπιο. Fluorescent καρκινικά κύτταρα έξω από την περιοχή της εμφύτευσης μετρήθηκαν σε κάθε έμβρυο. Τα έμβρυα που παρουσίασαν περισσότερο από 5 τα καρκινικά κύτταρα εκτός του κρόκου θεωρήθηκαν ως θετικά για μετάσταση και τέθηκαν κατά μέρος διαχωρίζεται από το υπόλοιπο των μεταμοσχευμένων εμβρύων. Ποσοστό μετάστασης ορίστηκε ως ο αριθμός των εμβρύων που περιέχουν περισσότερο από 5 κύτταρα εκτός του κρόκου ανά ημέρα σε σχέση με την ημέρα μηδέν. Το συνολικό ποσοστό μετάσταση έχει οριστεί ως το συνολικό αριθμό των εμβρύων με μετάσταση μετά από 3 ημέρες σε σχέση με την ημέρα μηδέν.

Στατιστικά

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM. Η στατιστική ανάλυση που εφαρμόζεται στα ποσοτικά δεδομένα RT-PCR ήταν μονόδρομη ANOVA χρησιμοποιώντας Dunnett t-tests. Για όλα τα άλλα στοιχεία, στατιστικής ανάλυσης που χρησιμοποιήθηκε ήταν μονόδρομος Tukey t-τεστ ANOVA του.

In vivo

δοκιμασίες μετάσταση αναλύθηκαν στατιστικά χρησιμοποιώντας ζεύγη δειγμάτων Τ-τεστ. Τα δεδομένα θεωρήθηκαν σημαντικές εάν

σ

≤0.05.

Αποτελέσματα

mRNA έκφραση του Gal-4 στο πάγκρεας αδενοκαρκίνωμα Γραμμές κυττάρων

Για να διερευνήσουν διαφορική έκφραση της Gal-4, τα επίπεδα του mRNA προσδιορίσθηκαν σε εννέα διαφορετικούς ανθρώπινους παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας Real Time (RT) PCR (Σχήμα 1). Ως έλεγχος για την έκφραση σε φυσιολογικό ιστό παγκρεατικού πόρου, Gal-4 mRNA επίπεδα προσδιορίστηκαν σε μια αθανατοποιημένη κυτταρική σειρά που προέρχεται από φυσιολογικό ανθρώπινο επιθηλιακό παγκρεατικού πόρου (hTERT-HPNE). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Gal-4 mRNA επίπεδα στην κανονική παγκρεατική κυτταρική γραμμή αγωγού δεν ήταν ανιχνεύσιμα. Gal-4 mRNA επίπεδα εμφάνισε μια σχετική χαμηλή αφθονία σε οκτώ από τις καρκινικές κυτταρικές σειρές εννέα, χρησιμοποιώντας το

GAPDH

ως γονίδιο αναφοράς νοικοκυριό. Μία κυτταρική γραμμή, Pa-Tu-8988S (Patù-S), όμως, έδειξε μια περισσότερο από 10 φορές αυξημένη έκφραση σε σύγκριση με τις άλλες κυτταρικές σειρές.

Gal-4 mRNA έκφραση του φυσιολογικού ανθρώπινου παγκρεατικού πόρου epithelial- σαν κυτταρική γραμμή (hTERT-HPNE) και 9 διαφορετικές ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του παγκρέατος αναλύθηκε με ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου και απεικονίζονται καθώς η σχετική ποσότητα του Gal-4 μεταγραφών (± SEM) σε σύγκριση με την έκφραση του ενδογενούς γονιδίου αναφοράς

GAPDH

. (*** P≤0.001 έναντι όλων των άλλων κυτταρικών σειρών, χρησιμοποιώντας μια μονόδρομη ANOVA με Dunnett μετα δύο όψεων t τεστ).

Η

Είναι ενδιαφέρον ότι, patu-S προέρχονται από την ίδια μετάσταση στο ήπαρ ενός ανθρώπινου πρωτογενούς παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα ως μία από τις χαμηλές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν Gal-4, Pa-Tu-8988T (Patù-Τ) [40]. Αυτές οι δύο κυτταρικές σειρές που περιγράφονται να περιέχει απέναντι μεταναστευτικά και μεταστατικής ικανότητας. Patu-S και Patù-T εμφανίζουν πολύ χαμηλό και υψηλό μεταστατικό χωρητικότητα, αντίστοιχα, και τα δύο

in vitro

και

in vivo

χρησιμοποιώντας zebrafish ως πρότυπο σύστημα [39]. Επιπλέον, έχει δειχθεί προηγουμένως ότι οι περισσότερες από τις κυτταρικές γραμμές που απεικονίζονται στην Εικόνα 1 έχουν αυξημένη

in vitro

ικανότητα μετανάστευση, σε σύγκριση με Patù-S [32], [41]. Αυτά τα δεδομένα μας οδήγησε να εξετάσει τη δυνατότητα ώστε η έκφραση της Gal-4 μπορεί να περιορίσει τη μεταναστευτική ή /και μεταστατικό ικανότητα αυτών των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων. Λόγω της κοινής τους καταγωγής, η χαμηλή μεταναστευτικών κυτταρική σειρά Patù-S και η μεταστατική κυτταρική γραμμή Patù-Τ αντιπροσωπεύουν ένα πολύ ελκυστικό σύστημα μοντέλο για τη μελέτη της υποτιθέμενο ρόλο του Gal-4 σε μετάσταση.

Εντοπισμός της Gal- 4 σε patu-S και Patù-Τ κύτταρα

Η έκφραση και ο εντοπισμός των Gal-4 πρωτεΐνης σε Patù-S και Patù-Τ κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής, Ανοσοκυτοχημεία (ICC) και κηλίδωση Western (WB) (σχήματα 2-4). Για τον προσδιορισμό της ενδογενούς Gal-4 του Patù-S και Patù-Τ κύτταρα, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και κατέστησαν διαπερατά, που ακολουθείται από κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας αντι-Gal-4 αντισώματα (Ab), και φθορισμού δευτερογενούς Abs. Τα αποτελέσματα δείχνουν μια σαφή διαφορά στην πρόσδεση Gal-4 Ab μεταξύ Patù-S και Patù-T. κύτταρα Patu-S δείχνουν μια ισχυρή χρώση με αντι-Gal-4 Abs, ενώ Gal-4 χρώση σε Patù-Τ κύτταρα δεν είναι καθόλου ανιχνεύσιμη (Εικόνα 2Α). Για να εκτιμηθεί η παρουσία γλυκάνης προσδεμάτων στην εξωτερική κυτταρική επιφάνεια που θα μπορούσε να αναγνωρισθεί από Gal-4, τα κύτταρα πρώτα αυστηρά πλύθηκε με 500 mM λακτόζης προς απομάκρυνση δεσμεύεται γαλεκτίνες ενδογενούς επιφάνεια. Στη συνέχεια, εξωγενείς rec. πρωτεΐνη Hgal-4 (5 μg /ml) προστέθηκαν στα κύτταρα και Gal-4 δεσμευτικός προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας αντι-Gal-4 Abs. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ακόμα ένα σημαντικό επίπεδο χρώσης Gal-4 παρατηρήθηκε στην επιφάνεια των κυττάρων Patù-S, αλλά όχι Patù-Τ κύτταρα, μετά από πλύση με λακτόζη (Σχήμα 2Β), υποδεικνύοντας την παρουσία ισχυρώς δεσμευμένο ενδογενούς Gal-4 στην επιφάνεια των κυττάρων Patù-S. Μετά την προσθήκη του rec Hgal-4 στα κύτταρα, η χρώση κυτταρικής επιφάνειας Gal-4 αυξήθηκε σημαντικά, υποδεικνύοντας ότι τα κύτταρα Patù-S μπορούν να δεσμεύουν υψηλά επίπεδα Gal-4 στην επιφάνειά τους. Αντίθετα, πολύ χαμηλότερα επίπεδα από rec Hgal-4 συνδέεται με την κυτταρική επιφάνεια του Patù-Τ κυττάρων. Για να διερευνηθεί αν το rec Hgal-4 συνδέεται προς τα κύτταρα σε έναν υδατάνθρακα-εξαρτώμενο τρόπο, Patù-T και Patù-S κύτταρα επωάστηκαν με rec Hgal-4 με την παρουσία λακτόζης. Παρουσία 500 mM λακτόζης την πρόσδεση Hgal-4 και στις δύο κυτταρικές σειρές αναστάλθηκε, υποδεικνύοντας ότι η Gal-4 σύνδεση προς την επιφάνεια του κυττάρου είναι γλυκάνη-εξαρτώμενη. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι τα υψηλά επίπεδα Gal-4 είναι παρούσες σε κύτταρα Patù-S, ενώ Gal-4 είναι δύσκολα ανιχνεύσιμη σε Patù-Τ κύτταρα. Επιπλέον, τα κύτταρα Patù-S μπορεί να δεσμεύσει πολύ υψηλότερα επίπεδα από Gal-4 στην εξωτερική επιφάνεια τους από ό Patù-Τ κυττάρων, υποδεικνύοντας ότι εκφράζουν περισσότερο Gal-4-συνδεσμικά δέσμευσης υδατάνθρακα.

Ανίχνευση της ενδογενούς Gal- 4, και Gal-4 συνδετήρες, σε Patù-S και Patù-κύτταρα Τ με κυτταρομετρία ροής. Ένα ιστόγραμμα ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος απεικονίζεται για κάθε συνθήκη τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα. Α) Dot οικόπεδα της Gal-4 χρώση διαπερατά κύτταρα Patù-S και Patù-T. Gal-4 ανιχνεύθηκε σε 4 ° C με αντι-Hgal-4 Abs σε σταθερά διαπερατά κύτταρα. Δευτερογενή χρώση Abs χωρίς αντι-Hgal-4 Abs χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόντο αυτοφθορισμό. Β) παρουσία ενδογενών δεσμευμένου Gal-4 στην επιφάνεια του Patù-S και Patù-Τ μετά την έκπλυση των κυττάρων με 500 mM λακτόζης πριν από τη χρώση Gal-4. Η παρουσία του Gal-4 δημιουργήθηκε με ανάλυση FACS χρησιμοποιώντας αντι-Hgal-4 Abs στους 4 ° C. Η ενδογενής Gal-4 συνδέεται προς την επιφάνεια φαίνεται από μια μαύρη γραμμή. Γ) Η παρουσία θέσεων συνδέσεως Gal-4 επί Patù-S και Patù-Τ κυττάρων προσδιορίστηκε μετά από πλύση των κυττάρων με 500 mM λακτόζης πριν από τη χρώση Gal-4. Η δέσμευση της εξωτερικά προστίθεται ανασυνδυασμένο (REC) Hgal-4 (5 μg /ml, μαύρη γραμμή) ερευνήθηκε. Η δέσμευση του rec Hgal-4 στην επιφάνεια θα μπορούσε να ανασταλεί με την προσθήκη λακτόζης (σκοτεινό πεδίο). χρώση φόντο με δευτερογενή Abs απεικονίζεται ως ανοιχτό γκρι πεδία στη Β και Γ

Η

Φωτογραφίες αντιπροσωπευτική ανάλυση ICC του κυτταρικού εντοπισμού της Gal-4 στα κύτταρα Patù-S. Gal-4 ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας Alexa-επισημασμένο αντι-Gal-4 Abs (πράσινο), ακτίνη χρωματίστηκε χρησιμοποιώντας Φαλλοϊδίνη (κόκκινο) και πυρήνας χρώση λαμβάνονται χρησιμοποιώντας HOESCHS (μπλε)? το τρίτο πάνελ δείχνει τη συγχώνευση των διαφόρων χρώσεις. Bar = 25 μm.

Η

Α) Πρωτεΐνες από ολόκληρων κυττάρων εκχυλίσματα (75 ug ολικής πρωτεΐνης) και μέσο καλλιέργειας (4 ημέρες καλλιέργειας, 25 ul) της Patù-S (PS), Patù-T (ΡΤ), Patù-T /Gal-4 (PT /Gal-4) και Patù-T /mock (PT /M) διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE. Μετά την μεταφορά των πρωτεϊνών σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, οι κηλίδες χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας αντι-Hgal-4 για την ανίχνευση του Gal-4 και αντι-τουμπουλίνης ποντικού ως έλεγχο για την παρουσία της ενδοκυτταρικής πρωτεΐνης. Β) Οι φωτογραφίες του αντιπροσωπευτική ανάλυση ICC του κυτταρικού εντοπισμού της Gal-4 στο Patù-Τ /Gal-4 και Patù-Τ /mock κύτταρα. Gal-4 ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας Alexa-επισημασμένο αντι-Gal-4 Abs (πράσινο), ακτίνη χρωματίστηκε χρησιμοποιώντας Φαλλοϊδίνη (κόκκινο) και πυρήνας χρώση λαμβάνονται χρησιμοποιώντας HOESCHS (μπλε)? το τρίτο πάνελ δείχνει τη συγχώνευση των διαφόρων χρώσεις. Bar = 25 μm.

Η

Η κυτταρική εντόπιση του Gal-4 περαιτέρω μελετήθηκε χρησιμοποιώντας ICC. Τα αποτελέσματα δείχνουν υψηλή ένταση φθορισμού σε όλο το κυτταρόπλασμα των κυττάρων Patù-S (Σχήμα 3), υποδεικνύοντας ότι οι περισσότεροι Gal-4 εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα. Υψηλή φθορισμός παρατηρήθηκε στο κυτταροπλασματικής μεμβράνης σε μεμονωμένα κύτταρα και μεταξύ των κυττάρων, ιδιαίτερα σε περιοχές επαφής μεταξύ γειτονικών κυττάρων (επαφές κυττάρου-κυττάρου), ενώ σχεδόν καθόλου φθορισμός ανιχνεύθηκε στον πυρήνα. Gal-4 δεν είναι ομοιογενώς κατανεμημένα στο κυτταρόπλασμα, που δείχνει κάποιες περιοχές με υψηλότερα επίπεδα φθορισμού από τους άλλους, αν και δεν υπάρχουν σαφείς ενδείξεις των συγκεκριμένων οργανιδίων που εμπλέκονται στην συσσώρευση Gal-4. Σε Patu-Τ-κύτταρα, δεν Gal-4 θα μπορούσε να ανιχνευθεί με τη μέθοδο αυτή, για την ίδρυση της κυτταρομετρίας ροής δεδομένων που δείχνει ότι τα επίπεδα Gal-4 στο Patù-Τ κύτταρα είναι πολύ χαμηλή.

Η υπερέκφραση του Gal-4 σε Patù -T κύτταρα

Για να αξιολογηθεί μια υποθετική συμμετοχή των Gal-4 στη μετανάστευση, Gal-4 υπερεκφράστηκε σε Patù-Τ κύτταρα με την εισαγωγή ενός ιικού φορέα που περιέχει την Hgal-4 γονίδιο που κατευθύνεται από έναν προαγωγό CMV (patu -Τ /Gal-4). Ως μάρτυρας, ο ιικός φορέας χωρίς ένθετο μετήχθη σε Patù-T (Patù-T /mock). έκφραση της πρωτεΐνης και ο εντοπισμός του Gal-4 σε ανεπεξέργαστα Patù-T και Patù-S κύτταρα, Patù-Τ /Gal-4 και Patù-Τ /παρωδία αναλύθηκε με western blot (WB), ICC και κυτταρομετρία ροής.

Για να προσδιοριστεί το επίπεδο της Gal-4 έκφραση στις γραμμές, κύτταρα κυττάρου και μέσου συλλέχθηκαν μετά από 4 ημέρες καλλιέργειας. Πρωτεΐνες που υπάρχουν στο κύτταρο εκχυλίσματα και μέσον διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Μετά από χρώση των κηλίδων με τη χρήση αντι-Gal-4 Abs, ζώνες στα 36 kDa που αντιστοιχεί στη φαινομενική μάζα του Gal-4 παρατηρήθηκαν σε Patù-T /Gal-4 εκχύλισμα κυττάρου και μέσου, σε παρόμοιες ποσότητες όπως παρατηρήθηκε σε patu-S εκχύλισμα κυττάρου και μέσου, αντιστοίχως (Σχήμα 4Α). Όπως αναμενόταν, Patù-T /mock δεν έδειξε ανιχνεύσιμη ζώνες στα 36 kDa. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι Gal-4 εκφράζεται σε Patù-T /Gal-4 σε παρόμοια επίπεδα σε σύγκριση με τα κύτταρα Patù-S. Επιπλέον, οι παρόμοιες ποσότητες Gal-4 που εκκρίνεται από Patù-S και Patù-Τ /Gal-4 κύτταρα.

Χρησιμοποιώντας ΔΠΔ, αποδείξαμε ότι η ενδοκυτταρική κατανομή των Gal-4 εντός της PaTuT /Gal-4 κυττάρων είναι παρόμοια με την κατανομή σε κύτταρα Patù-S, ενώ δεν Gal-4 ανιχνεύθηκε σε PaTuT /mock κυττάρων (Σχήμα 4Β). Η κατανομή των Gal-4 σε αυτά τα κύτταρα στο κυτταρόπλασμα είναι παρόμοια με τη διανομή σε κύτταρα Patù-S. Gal-4 είναι παρόν σε όλη την κυτταρική, εκτός από τον πυρήνα, παρόμοιες όπως παρατηρείται για Patù-S. Ωστόσο, λαμβάνοντας υπόψη ότι η Gal-4 είναι παρούσα στη μεμβράνη των κυττάρων Patù-S στο πλάσμα, σχεδόν καθόλου Gal-4 ανιχνεύεται στη μεμβράνη των κυττάρων διαπερατά Patù-T /Gal-4. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι Patù-T /Gal-4 εκφράζει και εκκρίνει Gal-4 σε παρόμοιες ποσότητες, όπως τα κύτταρα Patù-S.

Επιπλέον, προσδιορίσαμε αν ενδογενή, και /ή να προστεθεί ανασυνδυασμένη Gal- 4 δεσμευμένο στην κυτταρική επιφάνεια του Patù-T /Gal-4 με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας αντι-Gal-4 Abs. Η πρόσδεση του αντι-Gal-4 Abs στην κυτταρική επιφάνεια δεν διέφεραν μεταξύ Patù-T /Gal-4 και Patù-T /Mock (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως εκ τούτου, η ικανότητα της Gal-4 κύτταρα Patù-Τ /να δεσμεύσει Gal-4 εξωκυττάρια είναι αμετάβλητο σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο κυτταρική σειρά Patù-T.

Η υπερέκφραση του Gal-4 Μειώνει την Μετανάστευση Χωρητικότητα του Patù-T κύτταρα

Για να εξεταστεί εάν Gal-4 επηρεάζει την μεταναστευτική συμπεριφορά των Patù-Τ κύτταρα, μια δοκιμασία αρχή έγινε με τη χρήση Patù-T και Patù-Τ /Gal-4 κύτταρα (Σχήμα 5Α-Β).

Μια γρατσουνιά (επούλωση των πληγών) δοκιμασία πραγματοποιήθηκε με Patù-T, Patù-Τ /Gal-4 και Patù-Τ /mock κύτταρα. Patu-T /mock και Patù-T /Gal-4 κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα δίσκο των 24 φρεατίων και γδαρμένο στην επιφάνεια με ένα 200-μΙ ρύγχος πιπέτας. Οι σχετικές τιμές ορίστηκαν σε 100% του πλάτους διακένου κατά το χρόνο της μηδέν.