Αφηρημένο

Η πρωτεΐνη φωσφατάσης τυροσίνης που εντοπίζεται στο μιτοχόνδριο 1 (PTPMT1) είναι μια διπλή φωσφατάση εξειδίκευση εντοπίζεται αποκλειστικά στα μιτοχόνδρια, και έχει πρόσφατα έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα κρίσιμο συστατικό στην καρδιολιπίνη βιοσυνθετική οδό. Η ρύθμιση προς τα κάτω του PTPMT1 σε παγκρεατικά βήτα κύτταρα έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει την κυτταρική ΑΤΡ επίπεδα και της ινσουλίνης στην παραγωγή, ωστόσο, η γενικευμένη ρόλος του PTPMT1 σε καρκινικά κύτταρα δεν έχει χαρακτηριστεί. Εδώ αναφέρουμε ότι προς τα κάτω ρύθμιση δραστικότητας PTPMT1 είναι επαρκής για να επάγει απόπτωση των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, η φίμωση PTPMT1 μειώνει τα επίπεδα καρδιολιπίνη σε καρκινικά κύτταρα, ενώ επιλεκτικά την αύξηση των επιπέδων ΑΤΡ σε γλυκολυτικά μέσα ενημέρωσης. Επιπλέον, σχεδόν θανατηφόρες μειορρύθμιση του PTPMT1 συνεργεί με χαμηλές δόσεις πακλιταξέλης για την προώθηση του θανάτου των καρκινικών κυττάρων. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η αναστολή της PTPMT1 προκαλεί μεταβολικές κρίση στα καρκινικά κύτταρα που επάγει τον κυτταρικό θάνατο, και μπορεί να είναι ένας μηχανισμός με τον οποίο μπορούν να ευαισθητοποιηθούν τα καρκινικά κύτταρα με το παρόν διαθέσιμες θεραπείες

Παράθεση:. Niemi NM, Λάνιγκ NJ, Westrate LM, MacKeigan JP (2013) Ελάττωση του μιτοχονδριακού φωσφατάση PTPMT1 επαρκεί για να προωθήσει Cancer Cell Death. PLoS ONE 8 (1): e53803. doi: 10.1371 /journal.pone.0053803

Επιμέλεια: Ντχιάνι Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 21, 2012? Αποδεκτές: 5 Δεκεμβρίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 10 Ιανουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Niemi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τον αριθμό βραβείο R01CA138651 από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου στην JP MacKeigan. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα μιτοχόνδρια, πιο γνωστό ως «εργοστάσιο παραγωγής ηλεκτρικού ρεύματος του κυττάρου,« περιέχουν πρωτεΐνες με εκτεταμένη μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, συμπεριλαμβανομένων των φωσφορυλίωση και ακετυλίωση. Αυτές οι τροποποιήσεις με τη σειρά τους να επηρεάσουν την μεταβολική ικανότητα, τη δυναμική και τη συνολική ομοιόσταση του οργανιδίου [1], [2], [3], [4]. Ο εντοπισμός των πολυάριθμων κινασών και φωσφατασών εντός των μιτοχονδρίων υποδηλώνει ότι η φωσφορυλίωση είναι ένα ενεργά ρυθμιζόμενη διαδικασία που παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη λειτουργία των μιτοχονδρίων πρωτεΐνη [5], [6]. Παρά την ευρεία κατάλογος των γεγονότων φωσφορυλίωσης, καθώς επίσης και ένζυμα τα οποία μπορεί να καταλύει τα γεγονότα αυτά, η συνολική ρύθμιση της μιτοχονδριακής διεργασιών με φωσφορυλίωση, και πώς αυτά τα γεγονότα επηρεάζουν την κυτταρική μοίρα, παραμένει ασαφής.

PTPMT1 είναι μια διπλή φωσφατάση ειδικότητας εντοπισμένη ειδικά και αποκλειστικά για τα μιτοχόνδρια [7]. Είναι αγκυρώνεται εντός της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης με τον τομέα φωσφατάση του εκτεθειμένο στην μήτρα, τοποθετώντας το εγγύς προς πολυάριθμα ένζυμα που είναι υπεύθυνα για την παραγωγή και το μεταβολισμό της ενέργειας. Είναι ενδιαφέρον, ωστόσο, η αρχική

in vitro

μελέτες με χρήση ανασυνδυασμένου PTPMT1 έδειξε ότι το ένζυμο αυτό έχει μια σαφή προτίμηση για λιπιδίων υποστρώματα πάνω από πρωτεϊνικά υποστρώματα [8], γεγονός που υποδηλώνει ότι PTPMT1 θα μπορούσαν να επηρεάσουν άμεσα το διαμέρισμα των λιπιδίων του μιτοχονδρίου. Μια πρόσφατη μελέτη επιβεβαίωσε αυτό, καταδεικνύουν ότι λειτουργεί ως PTPMT1 φωσφορικό φωσφατιδυλογλυκερόλη θηλαστικού (PGP) λιπίδιο φωσφατάση, καταλύοντας το προτελευταίο βήμα του μονοπατιού καρδιολιπίνη βιοσυνθετικής [9]. Σημαντικά, καρδιολιπίνη συντίθεται και χρησιμοποιείται αποκλειστικά εντός του μιτοχονδρίου, και οι άλλες κρίσιμες συνθετικά ένζυμα αυτής της οδού είναι γνωστό ότι αγκυρώνεται στην εσωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη [10]. Αυτό τοποθετεί PTPMT1 ειδικά και επιλεκτικά στη θέση του καρδιολιπίνη βιοσύνθεσης, και προτείνει ότι η διαφοροποίηση αυτή των λιπιδίων θα μπορούσε να είναι μια κρίσιμη λειτουργία της παρούσας φωσφατάση.

διαταραχές στην ομοιόσταση καρδιολιπίνης έχουν προηγουμένως συνδεθεί με την απόπτωση. Καρδιολιπίνης εντός της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης έχει αποδειχθεί ότι συνδέονται με το κυτόχρωμα c, και έχει προταθεί ότι η οξείδωση των λιπιδίων του παρόντος απαιτείται για την πλήρη απελευθέρωση του κυτοχρώματος c και επακόλουθη μιτοχονδριακής εξαρτώμενη απόπτωση [11]. Επιπλέον, καρδιολιπίνη έχει εμπλακεί στη στόχευση των πολυάριθμων προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών στα μιτοχόνδρια, συμπεριλαμβανομένης tBID, ένα BH3-μόνο πρωτεΐνη είναι γνωστό ότι επάγουν την απελευθέρωση κυτοχρώματος c μέσω της προώθησης της μιτοχονδριακής διαπερατότητας της εξωτερικής μεμβράνης [12]. Ως ένα μπλοκ στην απόπτωση θεωρείται ότι είναι το σήμα κατατεθέν του καρκίνου [13], απορύθμιση της καρδιολιπίνη μπορεί να επηρεάσει την ογκογόνο δυναμικό των κυττάρων επηρεάζοντας την ικανότητά τους να υποβληθούν σε κυτταρικό θάνατο. Επιπλέον, μεταβολές στην καρδιολιπίνη βιοσυνθετική οδό έχουν επίσης συνδεθεί με την απόπτωση. Μεσολάβηση RNAi knockdown του καρδιολιπίνη συνθάσης (CLS1? Όνομα γονίδιο

CRLS1

). Είναι αρκετή για να απελευθερώσει το κυτόχρωμα c από την εσωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη, και ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα σε αποπτωτικό ερεθίσματα [14]

Παρά εντυπωσιακή ομολογία μεταξύ PTPMT1 και ενός άλλου λιπιδίου φωσφατάση, ΡΤΕΝ, εντός καταλυτικές περιοχές τους [8], μια προσέγγιση χημικής διαλογής εντόπισε ένωση, αλεξιδίνη διυδροχλωρικό, που είναι ειδικό για PTPMT1

in vitro

[15]. Αλεξιδίνη διϋδροχλωρική είναι μια bisbiguanide ένωση εντοπίστηκαν αρχικά για αντι-βακτηριακή ιδιότητες, αλλά έχει ενδιαφέρον έχει επίσης αναγνωριστεί ως ένα επαγωγέα μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και απόπτωση [16]. Όπως PTPMT1 εντοπίζεται ειδικά στο μιτοχόνδρια, αλεξιδίνη διυδροχλωρική θα μπορούσε να είναι διαμόρφωσης μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και μετέπειτα προ-αποπτωτικών επηρεάζει μέσω της αναστολής της δραστικότητας PTPMT1 φωσφατάσης.

Η προτεινόμενη ρόλος του καρδιολιπίνη στην κανονική αποπτωτική διαδικασία, σε συνδυασμό με το εύρωστη κυτταρικού θανάτου που επάγει φαινότυπο αλεξιδίνης διϋδροχλωρικής μας οδήγησε να υποθέσουμε ότι η ρύθμιση προς τα κάτω της γονιδιακής έκφρασης PTPMT1 θα επάγουν αποπτωτικό κυτταρικό μοίρα σε καρκινικά κύτταρα. Για να διερευνηθεί αυτή η υπόθεση, χρησιμοποιήσαμε RNAi για knockdown PTPMT1 και τον προσδιορισμό της κυτταρικής συνέπεια της απώλειας αυτής της συγκεκριμένης γονιδιακού προϊόντος. Επιπρόσθετα, ερευνήσαμε τις επιδράσεις της PTPMT1 στόχευσης ένωση, αλεξιδίνη διυδροχλωρικό, στην ικανότητά του να επάγει τόσο κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα, καθώς και να ευαισθητοποιήσει αυτά τα κύτταρα να χημειοθεραπευτικά σε δόσεις υποθανατηφόρες. Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι μεσολάβηση RNAi αποσιώπηση του PTPMT1 είναι επαρκής για να επάγει θάνατο των καρκινικών κυττάρων. Αυτός ο φαινότυπος κυτταρικού θανάτου συνδέεται με εντυπωσιακές αλλαγές του μεταβολισμού, συμπεριλαμβανομένου ενός σημαντικού μειορύθμιση της καρδιολιπίνης κατά την απώλεια του PTPMT1, καθώς και μια αύξηση στα επίπεδα του ΑΤΡ επιλεκτικά σε μέσα που περιέχουν γλυκόζη. Τα δεδομένα αυτά φωτίζουν ένα ρόλο για PTPMT1 ως κρίσιμο γονίδιο επιβίωσης στα καρκινικά κύτταρα, και προτείνουν ότι η στόχευση αυτής της φωσφατάση θα μπορούσε να είναι ένας αποτελεσματικός τρόπος για την ευαισθητοποίηση των καρκινικών κυττάρων με τα σημερινά διαθέσιμα χημειοθεραπευτικά.

Αποτελέσματα

RNAi μεσολάβηση εξόντωση PTPMT1 Προκαλεί

κυτταρικού θανάτου

για να εξεταστούν τα αποτελέσματα της να χτυπήσει κάτω PTPMT1 στην κυτταρική μοίρα, χρησιμοποιήσαμε δύο μοναδικές αλληλουχίες siRNA που στοχεύει μη-επικαλυπτόμενες περιοχές του ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης PTPMT1. Κάθε ένα από αυτά siRNAs παρέχει ισχυρή knockdown του PTPMT1 mRNA μεταγραφήματος 30 ώρες μετά την επιμόλυνση, τόσο με PTPMT1 siRNAs δίνει πάνω από 98% σε σχέση με το knockdown GAPDH (Σχήμα 1Α). Για να προσδιορίσετε αν αυτά τα siRNA διαταράσσουν την αποτελεσματική έκφραση της πρωτεΐνης PTPMT1, προσδιορίσαμε την ικανότητα του κάθε siRNA για να χτυπήσει κάτω υπερεκφράζεται, FLAG-tagged πρωτεΐνης (Εικόνα 1Β, επάνω πλαίσιο), καθώς και ενδογενείς PTPMT1 (Εικόνα 1Β, μεσαίο πλαίσιο). Αυτά τα πειράματα αποδεικνύουν σαφώς αποσιώπηση της έκφρασης πρωτεΐνης PTPMT1 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με κάθε siRNA.

(Α) ανάλυση Ποσοτική RT-PCR των επιπέδων mRNA PTPMT1 σε κύτταρα HeLa μετά knockdown με δύο μη-επικαλυπτόμενα PTPMT1-specfic siRNAs ή ένα μη-στόχευσης ελέγχου. κύτταρα (Β) HeLa επιμολύνθηκαν με δύο PTPMT1 siRNAs ή όργανα ελέγχου μη στόχευσης για 48 ώρες. Σε ένα πείραμα, PTPMT1 υπερεκφράστηκε (με FLAG-tag) για 20 ώρες (συνολικός χρόνος siRNA διαμόλυνση 48 hr) και η έκφραση ανιχνεύθηκε με ένα αντίσωμα FLAG (άνω πλαίσιο). siRNA γκρεμίσουμε προσδιορίζεται επίσης για την ενδογενή PTPMT1 (μεσαίο πάνελ). Τουμπουλίνης (κάτω πίνακας) επιδεικνύει ίση φόρτωση των προϊόντων λύσης πρωτεΐνης σε όλες τις λωρίδες. κύτταρα (Ο-Ε) HeLa διαμολύνθηκαν με έλεγχο ή PTPMT1 siRNAs και συλλέγονται μετά από αναγραφόμενους χρόνους, κατά την οποία ο κυτταρικός θάνατος αποτιμήθηκε με εξαίρεση ιωδιούχου προπιδίου. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση από τρία πειράματα. Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας t δοκιμασία ενός μαθητή? * – P & lt? 0,05? ** – P & lt? 0,01? *** – P & lt? 0.001. κύτταρα (F) HeLa διαμολύνθηκαν με έλεγχο ή PTPMT1 siRNAs και δοκιμάστηκαν γιά βιωσιμότητα σε πραγματικό χρόνο (& gt? 120 ώρες). χρησιμοποιώντας το σύστημα xCELLigence

Η

Είναι ενδιαφέρον ότι, και οι δύο από αυτές τις αλληλουχίες siRNA προκαλούν κυτταρικό θάνατο μετά 72 ώρες knockdown, η οποία έγινε πιο εμφανή στις 96 και 120 ώρες μετά την knockdown (Σχήματα 1C-E, F). Για τον προσδιορισμό του ποσοστού των κυττάρων που υφίστανται κυτταρικό θάνατο, πραγματοποιήσαμε ανάλυση FACS ιωδιούχου προπιδίου θετικών κυττάρων σε 72, 96, και 120 ώρες μετά την siRNA knockdown σε κύτταρα επιμολυσμένα με είτε PTPMT1 siRNA ή όργανα ελέγχου μη-στόχευσης. Όπως ήταν αναμενόμενο, τα κύτταρα επιμολυσμένα με ένα μη-στόχευσης siRNA ελέγχου έδειξαν μικρή κυτταρικό θάνατο κατά τη διάρκεια της περιόδου 120 ώρα παρακολουθείται με 10.8% θάνατο μέγιστη κυτταρική δει κατά τη διάρκεια αυτού του χρονικού πλαισίου (το οποίο είναι μόνο ελαφρώς υψηλότερη από basally κατεργασία κύτταρα HeLa (p = 0,2 -0.9, ns)). Αντιθέτως, είτε siRNA που στοχεύει PTPMT1 προκάλεσε ισχυρή κυτταρικό θάνατο, ιδιαίτερα εμφανής στις 96 ώρες (PTPMT1 siRNA # 1 ρ & lt? 0,001? PTPMT1 siRNA # 2 ρ & lt? 0,05) και 120 ώρες (PTPMT1 siRNA # 1 ρ & lt? 0,01? PTPMT1 siRNA # 2 p & lt?. 0.001), το οποίο αποδείχθηκε σημαντική και για τις δύο μη επεξεργασμένα κύτταρα (0 προϋπόθεση ώρα, Σχήματα 1C-Ε) και του χρόνου-συμφωνημένα μη στόχευση των ελέγχων

Για να προσδιορίσετε πιο ακριβή κινητική αυτού του κυτταρικού θανάτου, που παρακολουθείται σε πραγματικό χρόνο κυτταρική βιωσιμότητα μετά την επιμόλυνση των κυττάρων HeLa είτε με ένα μη-στόχευσης ελέγχου siRNA (μπλε) ή μία από τις δύο μοναδικές ακολουθίες PTPMT1 siRNA (PTPMT1-1, πράσινο? PTPMT1-2, πορτοκάλι) (Σχήμα 1 F). Ανακεφαλαιώνοντας τα δεδομένα κυτταρικού θανάτου ιωδιούχο προπίδιο, αμφότερες οι αλληλουχίες siRNA άρχισε να επιβραδύνει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό περίπου 72 ώρες μετά την επιμόλυνση και προωθείται σημαντική κυτταρική αποκόλληση (ενδεικτική του κυτταρικού θανάτου) στις 96 και 120 ώρες μετά την επιμόλυνση. Αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι η έκφραση της PTPMT1 απαιτείται για την κυτταρική βιωσιμότητα σε κύτταρα HeLa, και προτείνει ότι PTPMT1 μπορεί να απαιτούνται για τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων.

PTPMT1 Νοκ ντάουν Προκαλεί Bax /Bak Εξαρτημένων απόπτωση

Προηγούμενη εκθέσεις έχουν συνδέσει προς τα κάτω ρύθμιση της καρδιολιπίνης επίπεδα με την απελευθέρωση κυτοχρώματος c και ευαισθητοποίηση σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα καθώς και καρδιομυοκύτταρα [14]? [17]. Έτσι, υποθέσαμε ότι φαινότυπος κυτταρικό θάνατο φαίνεται σε απόκριση προς PTPMT1 knockdown ήταν μια εγγενής, ή μιτοχονδριακό εξαρτώμενη, αποπτωτική απόκριση. Για να καθοριστεί εάν PTPMT1 knockdown προκαλεί απόπτωση, προσδιορίσαμε κασπάσης-3 διάσπασης, καθώς και τη διάσπαση του καλά χαρακτηρισμένο υπόστρωμα της, PARP. Τα σχήματα 2Α και Β δείχνουν ότι στις 96 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα επιμολυσμένα με ένα siRNA μη στόχευση δεν δείχνουν εμπλουτισμό σε είτε κασπάσης-3 ή PARP διάσπαση. Ωστόσο, η επιμόλυνση με είτε PTPMT1 στόχευση siRNA προκάλεσε μια ισχυρή εμπλουτισμού τόσο κασπάσης-3 (Σχήματα 2C και D) και η διάσπαση PARP (Σχήματα 2Ε και F). Σημαντικά, τόσο κασπάσης-3 διάσπαση και PARP τροχιά διάσπασης στενά σε αυτά τα πειράματα, με έμφαση στην αποπτωτικό φαινότυπο μετά PTPMT1 knockdown.

κύτταρα (Α-Ρ) HeLa διαμολύνθηκαν με τον έλεγχο μη-στόχευσης siRNA (Α, D ), PTPMT1 siRNA # 1 (Β, Ε), ή siRNA PTPMT1 # 2 (C, F) για 96 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν για διασπασμένης κασπάσης-3 (άνω πάνελ) ή διασπασμένη PARP (κάτω πάνελ) υπό κάθε συνθήκη, με θετικότητα ενδείκνυται ως αύξηση του φθορισμού στο ιστόγραμμα FACS (κάτω δεξιά τεταρτημόριο). κύτταρα (G-I) HeLa διαμολύνθηκαν με τον έλεγχο, PTPMT1, και /ή ΒΑΧ /ΒΑΚ siRNAs για 96 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν για διασπασμένη κασπάση 3 (G, H) ή ιωδιούχο προπίδιο θετικότητα (Ι). Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση από τρία πειράματα. Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας t δοκιμασία ενός μαθητή? * – P & lt? 0,05? ** – P & lt? 0,01? *** – P & lt? 0.001

Η

Ενώ κασπάσης-3 είναι ένας δείκτης της αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, ενεργοποιείται σε απάντηση τόσο ενδογενείς και εξωγενείς αποπτωτικά ερεθίσματα.. Για να καθοριστεί εάν PTPMT1 knockdown επάγεται μιτοχονδριακής εξαρτώμενη απόπτωση, χρησιμοποιήσαμε siRNAs να knockdown διπλή των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών ΒΑΧ και ΒΑΚ, του οποίου η έκφραση είναι απαραίτητη για την κλασική, μιτοχονδριακή εξαρτώμενη απόπτωση [18]. Με την παρουσία ενός μη-στόχευσης ελέγχου κανονικοποιούνται για συγκέντρωση siRNA, PTPMT1 επαγόμενη κασπάσης-3 διάσπαση με παρόμοιες κινητικές όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Γ (Σχήμα 2G). Εντυπωσιακά, όμως, Bax /Bak διπλό νοκ ντάουν εξαλειφθεί εντελώς PTPMT1 μεσολάβηση αποπτωτική επαγωγή (Σχήμα 2Η). Για να εξασφαλιστεί ότι PTPMT1 knockdown δεν προκαλεί μη αποπτωτικό θάνατο των κυττάρων με την παρουσία του Βαχ /Bak knockdown, επαναλάβαμε τα πειράματα αυτά και προσδιορίστηκαν τα κύτταρα για ιωδιούχο προπίδιο θετικότητα. Σε συμφωνία με τα προηγούμενα δεδομένα μας, PTPMT1 siRNA προκαλεί αύξηση του ιωδιούχου προπιδίου θετικότητας επί μιας μη στόχευσης ελέγχου (Σχήμα 2i, μπλε μπάρες). Αυτή η αύξηση σε κυτταρικό θάνατο είναι εντελώς αποκλεισμένο από Bax /Bak νοκ ντάουν, το οποίο παρέχει σημαντική προστασία από την πρόσληψη ιωδιούχου προπιδίου δει στα PTPMT1 νοκ ντάουν κύτταρα (Εικόνα 2i, πράσινες γραμμές? P & lt? 0,01 για PTPMT1 siRNA # 1, σ & lt? 0,001 για PTPMT1 siRNA # 2). Αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι η έκφραση Bax /Bak απαιτείται για PTPMT1-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο, και υποδηλώνουν ότι PTPMT1 knockdown επάγει ένα ενδογενές, μιτοχονδριακό εξαρτώμενη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο που εξαρτάται από την απελευθέρωση κυτοχρώματος c.

PTPMT1 Knockdown Προκαλεί αποπτωτικά κυτταρικό θάνατο σε πολλές γραμμές Cancer Cell

Αν και τα δεδομένα μας έχει δείξει ότι δύο ανεξάρτητοι, μη-επικαλυπτόμενα PTPMT1 στοχευμένες siRNAs προωθήσει ένα αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα HeLa, την απενεργοποίηση του γονιδίου της PTPMT1 σε εμβρυϊκούς ινοβλάστες ποντικού ή αιμοποιητικών κυττάρων έχει μικρή επίδραση στην κυτταρική βιωσιμότητα. Υποθέσαμε ότι προς τα κάτω ρύθμιση σε μετασχηματισμένα κύτταρα θα μπορούσαν να έχουν μια εναλλακτική επίδραση στην κυτταρική μοίρα σε σχέση με αυτά τα μη-μετασχηματισμένα, πρωτογενή κύτταρα. Για να καθοριστεί εάν η απώλεια του PTPMT1 επάγει κυτταρικό θάνατο σε μόνο ένα υποπίνακα κυτταρικών σειρών (όπως Hélas), ή έχει παρόμοιες επιδράσεις σε άλλα μετασχηματισμένα κύτταρα, επιλέξαμε ένα πάνελ καρκινικών κυτταρικών γραμμών που είναι ιδιαίτερα δεκτικά siRNA διαμόλυνση (όλα & gt ? 95% επιμολυνθούν, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτές οι κυτταρικές γραμμές καλύπτουν ένα ευρύ φάσμα τύπων όγκων (σαρκώματα και καρκινώματα)? ιστοί προέλευσης (οστό, εγκέφαλος, πνεύμονες, και νεφρό)? και ογκογενετικότητας

in vivo

. Παρόμοια με προηγούμενα πειράματα μας, αυτές οι κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν με ένα μη-στόχευσης siRNA ή PTPMT1 siRNA # 1 ή # 2. 120 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για απόπτωση μέσω αννεξίνης V θετικότητα (άξονας γ Σχήματα 3A-C) και ιωδιούχο προπίδιο θετικότητα (χ-άξονας, τα Σχήματα 3Α-Γ). Όπως φαίνεται στις Εικόνες 3Β και C, η επιμόλυνση των δύο PTPMT1 siRNAs προκάλεσε ισχυρή αυξήθηκε σε Annexin V και χρώση ΡΙ, υποδεικνύοντας ότι αυτά τα siRNAs προκαλούν αυτές οι κυτταρικές γραμμές για να υποστούν απόπτωση. Στις περισσότερες κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, αυτό ήταν μια ισχυρή απάντηση, με μέση 3.8- και 3.9- φορές αύξηση στον κυτταρικό θάνατο που συμβαίνουν σε 6 από τους 8 κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν με PTPMT1 siRNA # 1 ή siRNA # 2, αντιστοίχως (Σχήμα 3D). Βρήκαμε ότι 786-0 κύτταρα, νεφρικό κυτταρικές γραμμές καρκινώματος, δεν επηρεάστηκαν σημαντικά από PTPMT1 knockdown είτε με siRNA (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι PTPMT1 knockdown προκαλεί κυτταρικό θάνατο σε αυτό το υποσύνολο των καρκινικών κυτταρικών σειρών, υποδηλώνοντας έκφραση του είναι κρίσιμη για την επιβίωση αυτών των κυτταρικών γραμμών.

(Α-Γ) Η κυτταρική γραμμή καρκινώματος πνεύμονα Η1299 και το οστεοσάρκωμα ΕΟΕ κυτταρική γραμμή επιμολύνθηκαν με μη στόχευσης (Α), PTPMT1 siRNA # 1 (Β) ή PTPMT1 siRNA # 2 (C). Μετά την επιμόλυνση αυτών των siRNAs για 120 ώρες, ο πληθυσμός των κυττάρων που υφίστανται κυτταρικό θάνατο και απόπτωση μετρήθηκε μέσω προπίδιο ιωδίδιο θετικότητα (γ-άξονας) και V θετικότητα αννεξίνη (χ-άξονας). (Δ) Ένα πάνελ υψηλής επιμολυνθούν κυτταρικές σειρές που προέρχονται από πολλούς τύπους ιστών (βλέπε παραπάνω έγχρωμες ετικέτες heatmap) διαμολύνθηκαν με μη στόχευση ή PTPMT1 siRNAs. Κυτταρικού θανάτου και της απόπτωσης προσδιορίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο και αννεξίνης V θετικότητα όπως στο (Α-Γ). Φορές αλλαγή στην απόπτωση προσδιορίστηκε με κανονικοποίηση θάνατο τοις εκατό των κυττάρων παρατηρήθηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο μη στοχεύουν σε 1, με την αλλαγή φορές αντανακλά την ποσότητα του κυτταρικού θανάτου πάνω από αυτό το όριο στα κύτταρα νοκ ντάουν PTPMT1. Ο θερμικός χάρτης δείχνει μια σειρά φορές αλλαγή από 1 (μαύρα τετράγωνα) έως 5+ (πέντε ή μεγαλύτερη φορές, κόκκινο τετράγωνο).

Η

Τιτλοποίηση της PTPMT1 Νοκ ντάουν Alters Επιδράσεις στην κυτταρική βιωσιμότητα

RNAi τιτλοδότηση έχει χρησιμοποιηθεί προηγουμένως για να καθορίσουν μια κατώφλι γονιδιακής έκφρασης που απαιτείται για την κυτταρική βιωσιμότητα [19]. Σε αυτά τα πειράματα, siRNA ολιγονουκλεοτίδια αραιώθηκαν και τιτλοδοτήθηκαν κάτω σε ένα χαμηλό επίπεδο νανομοριακή να κατανοήσει το σχετικό επίπεδο έκφρασης που ένα γονίδιο πρέπει να διατηρήσουν την επαγωγή ή αναστείλουν μια συγκεκριμένη κυτταρική μοίρα, όπως κυτταρικό θάνατο. Για να κατανοήσουμε πληρέστερα την κυτταρικό θάνατο siRNA που προκαλείται είχαμε δει στα κύτταρα knockdown PTPMT1, εμείς τιτλοποιείται κάθε PTPMT1 siRNA, καθώς και ένα μη-στόχευσης ελέγχου siRNA, και εξέτασε τις επιδράσεις αυτών των διαφορικών knockdowns στη βιωσιμότητα κυττάρων HeLa και πολλαπλασιασμό. Όπως ήταν αναμενόμενο, η τιτλοδότηση ενός ελέγχου μη-στόχευσης από 50 ηΜ κάτω έως 5 ηΜ είχε μικρή επίδραση στην βιωσιμότητα ή τον πολλαπλασιασμό ικανότητα των κυττάρων HeLa σε μια 120 ώρα χρονικό πλαίσιο (Σχήμα 4Α, Β? Σημεία ναυτικό μπλε δεδομένων). έκφραση PTPMT1 ήταν διαφορικά μειωτικά με τιτλοδότηση των δύο μοναδικών PTPMT1 siRNAs, με την αύξηση της αποτελεσματικότητας knockdown καθώς κάθε συγκέντρωση siRNA αυξήθηκε από 5 ηΜ έως 50 ηΜ (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Είναι ενδιαφέρον ότι η τιτλοδότηση κάθε PTPMT1 siRNA αλλάξει τα προφίλ πολλαπλασιασμού και της βιωσιμότητας των κυττάρων νοκ ντάουν PTPMT1? ενώ 25 έως 50 ηΜ PTPMT1 siRNA # 1 ή # 2 είναι επαρκής για να επάγει κυτταρική αποκόλληση, ενδεικτικές του κυτταρικού θανάτου, 5 έως 10 ηΜ της ίδιας siRNA φαίνεται να σταματήσει τον πολλαπλασιασμό χωρίς να προκαλεί κυτταρική αποκόλληση, όπως υποδεικνύεται από ένα ουδέτερο κλίση για την σε πραγματικό χρόνο οικόπεδα βιωσιμότητας (Εικόνα 4Α, Β).

(Α) κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν με απόκριση δόσης των μη στόχευσης (μπλε γραμμή), PTPMT1 # 1 (πράσινη γραμμή) ή PTPMT1 # 2 (πορτοκαλί line) siRNA πάνω από 120 ώρες. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 0, 5, 10, 25, ή 50 ηΜ του κάθε siRNA και σε πραγματικό χρόνο βιωσιμότητα παρακολουθούνται χρησιμοποιώντας xCELLigence. (Β) Μεταβολή στην κυτταρική αντίσταση, γεγονός που αντανακλά τις αλλαγές στον πολλαπλασιασμό (θετική κλίση) και /ή η βιωσιμότητα (αρνητική κλίση) σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο ή PTPMT1 siRNAs. Ένα χαμηλότερο ρυθμό μεταβολής της σύνθετης αντίστασης συνδέεται με μειωμένη κυτταρική προσκόλληση, ενδεικτική κυτταρικού θανάτου. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση από τρία πειράματα. Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας t δοκιμασία ενός μαθητή? * – P & lt? 0,05? ** – P & lt? 0,01? *** – P & lt? 0.001

Η

Νοκ ντάουν της PTPMT1 ευαισθητοποιεί καρκινικά κύτταρα να Υποθανατηφόρες Δόσεις πακλιταξέλη

Η παρατήρηση ότι η διαφορική νοκ ντάουν επίπεδα PTPMT1 αλλάξει καρκίνου μοίρα των κυττάρων εγείρει την πιθανότητα ότι. υποβέλτιστη knockdown του PTPMT1 (σε ένα επίπεδο που δεν επαρκεί για να επάγει απόπτωση) μπορεί να ευαισθητοποιήσουν καρκινικά κύτταρα σε χαμηλά επίπεδα των χημειοθεραπευτικών οποία διαφορετικά θα ήταν σχετικά αναποτελεσματική. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, επιμολύναμε 5 ηΜ του ελέγχου ή PTPMT1-ειδικά siRNAs σε κύτταρα HeLa επί 30 ώρες πριν από την έκθεση αυτών των κυττάρων σε χαμηλές συγκεντρώσεις (5 nm) του χημειοθεραπευτικού paclitaxel για επιπλέον 24 ώρες. Το Σχήμα 5 καταδεικνύει ότι η επιμόλυνση των κυττάρων HeLa με χαμηλά επίπεδα μη-στόχευσης siRNA δεν προάγει ευαισθητοποίηση σε χαμηλές δόσεις της πακλιταξέλης, με 5 ηΜ paclitaxel επάγει μία μείωση κατά 21% στην κυτταρική βιωσιμότητα μη στόχευση siRNA (Σχήμα 5Α). Επιμόλυνση των 5 ηΜ PTPMT1 ήταν αρκετή για να ευαισθητοποιήσει κύτταρα σε αγωγή με πακλιταξέλη: ενώ το 21% των κυττάρων ελέγχου υποβλήθηκαν σε κυτταρικό θάνατο με την παρουσία 5 ηΜ paclitaxel, 38% ή 57% των 5 κυττάρων ηΜ PTPMT1 siRNA επεξεργασμένο υπέστησαν σημαντικά περισσότερο κυτταρικό θάνατο κάτω από οι ίδιες συνθήκες (siRNAs 1 και 2, αντίστοιχα? ρ & lt? 0,01 για PTPMT1 siRNA # 1, ρ & lt? 0,001 για PTPMT1 siRNA # 2, τα σχήματα 5Β και C). Σημαντικά, 5 ηΜ του κάθε siRNA PTPMT1 στόχευσης δεν προκαλεί σημαντική κυτταρική τοξικότητα σε 72 ώρες (Σχήμα 5D, E), καταδεικνύοντας ότι ο θάνατος που προκαλείται από 5 ηΜ PTPMT1 siRNA σε συνδυασμό με 5 αγωγή με πακλιταξέλη nm είναι πιθανό μια συνεργιστική αλληλεπίδραση. Για την επιβεβαίωση αυτών των παρατηρήσεων, προσδιορίσαμε τον πληθυσμό κυττάρων που υφίστανται κυτταρικό θάνατο κατά την έκθεση πακλιταξέλη μετά από επώαση με 5 ηΜ PTPMT1 siRNA. Ενώ ούτε 0,1 ηΜ ούτε 1 ηΜ paclitaxel προκαλεί ιωδιούχο προπίδιο θετικότητα σε κύτταρα επιμολυσμένα με ένα μη-στόχευσης siRNA (Σχήμα 5F, μαύρες ράβδοι), και οι δύο από αυτές τις δόσεις του paclitaxel αυξήσει σημαντικά τον πληθυσμό των κυττάρων που υφίστανται κυτταρικό θάνατο μετά από επιμόλυνση με PTPMT1 siRNAs ( Σχήμα 5F, γκρι μπάρες). Συνολικά, αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι υπο-θανατηφόρος μεσολάβηση RNAi knockdown του PTPMT1 είναι επαρκής για να ευαισθητοποιήσει κύτταρα HeLa σε υπο-θανατηφόρες δόσεις του χημειοθεραπευτικού paclitaxel.

κύτταρα (Α-Γ) HeLa διαμολύνθηκαν με 5 ηΜ μη -targeting siRNA (Α), PTPMT1 siRNA # 1 (Β), ή siRNA PTPMT1 # 2 (C) για 30 ώρες πριν από την αγωγή με απόκριση δόσης υποθανατηφόρας paclitaxel (έως και 5 ηΜ) για 24 ώρες. Η βιωσιμότητα μετρήθηκε με τη χρήση κυττάρων Titer Glo. (D) Βιωσιμότητα των μη επεξεργασμένων κυττάρων HeLa επιμολυσμένα με κάθε siRNA σε 54 ώρες. (Ε, F) Ποσοτικοποίηση της βιωσιμότητας των κυττάρων HeLa (Ε) ή HeLa κυτταρικό θάνατο με εξαίρεση ιωδιούχου προπιδίου (F) με 5 ηΜ μη-στόχευσης ή PTPMT1 siRNA (54 ώρες σύνολο θεραπεία) και 5 αγωγή με πακλιταξέλη ηΜ (24 ώρες σύνολο θεραπεία) . Για κάθε πείραμα, οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση από τρία πειράματα. Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας t δοκιμασία ενός μαθητή? * – P & lt? 0,05? ** – P & lt? 0,01? . *** – P & lt? 0.001

Η

PTPMT1 Νοκ ντάουν επιφέρει σημαντικές μεταβολικές αλλαγές στα κύτταρα του καρκίνου

Μετά που προσδιορίζονται ως μιτοχονδριακό φωσφατάση, η λειτουργία PTPMT1 συνδέθηκε με μιτοχονδριακό μεταβολισμό όταν ήταν δείξει ότι PTPMT1 knockdown προκαλεί μια ισχυρή αύξηση των κυτταρικών επιπέδων ΑΤΡ σε παγκρεατικά βήτα κύτταρα [7]. Πρόσφατα, PTPMT1 αναγνωρίστηκε ως βασικό φωσφατάση στη βιοσύνθεση της καρδιολιπίνη, ένα βασικό μιτοχονδριακό λιπιδίων συνδέονται τόσο μιτοχονδριακό μεταβολισμό και την απόπτωση. Είναι σημαντικό ότι, οι ελλείψεις σε κυτταρικό καρδιολιπίνη επίπεδα έχουν συνδεθεί με την απόπτωση [14], [20], μας οδηγεί να ερευνήσει εάν PTPMT1 knockdown σε καρκινικά κύτταρα μεταβάλλει αυτή την μιτοχονδριακή λιπιδίων. κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν με ένα μη-στόχευσης ή πισίνα του PTPMT1 siRNAs (siRNAs # 1 + # 2) επί 72 ώρες, οπότε κυτταρικά λιπίδια ήταν ραδιοεπισημασμένα, εκχυλίζεται, και να επιλυθεί μέσω χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας. Συνεπής με προηγουμένως δημοσιευμένα αποτελέσματα [9], εκτομή της έκφρασης PTPMT1 προκαλεί μια ισχυρή μείωση των επιπέδων καρδιολιπίνης σε σχέση με κύτταρα που εκφράζουν ένα μη-στόχευσης ελέγχου (77% μείωση, ρ & lt? 0.001, τα Σχήματα 6Α και Β). Αυτές οι αλλαγές στη μιτοχονδριακή λιπιδική σύνθεση απεδείχθη ότι μεταβάλλουν τη μεταβολική ικανότητα των κυττάρων, με την απώλεια της έκφρασης PTPMT1 με αποτέλεσμα την αύξηση των επιπέδων του ΑΤΡ που προκύπτουν από μια αντισταθμιστική στροφή προς αυξημένη γλυκόλυση [9]. Για να προσδιοριστεί εάν μιτοχονδριακό μεταβολισμό μεταβάλλεται σε κύτταρα knockdown PTPMT1, τα επίπεδα ΑΤΡ μετρήθηκαν σε κύτταρα που εκφράζουν είτε ένα μη-στόχευσης ή πισίνα PTPMT1 siRNA (siRNAs # 1 + # 2). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6C, τα κύτταρα knockdown PTPMT1 έχουν σημαντικά περισσότερο ΑΤΡ ανά κύτταρο από κύτταρα επιμολυσμένα με έναν έλεγχο μη-στόχευσης όταν αναπτύχθηκαν σε πρότυπο μέσο που περιέχει γλυκόζη (40,5% περισσότερο ΑΤΡ /κύτταρο, ρ & lt? 0.001). Για να προσδιορίσετε αν η αύξηση αυτή εξαρτάται από το μεταβολισμό της γλυκόζης, θα πραγματοποιηθεί επίσης αυτό το πείραμα στα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσα που περιέχουν μόνο πυροσταφυλικό ως πηγή άνθρακα, απαγορεύοντας την glycolyic πρόγραμμα να συμμετέχει. Σε αυτές τις συνθήκες, δεν υπάρχει σημαντική αλλαγή στα επίπεδα του ΑΤΡ στα κύτταρα knockdown PTPMT1 σχέση με τα κύτταρα ελέγχου (10% περισσότερο ΑΤΡ /κύτταρο, Σχήμα 6C, p = 0,178). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι PTPMT1 knockdown μειώνει τα επίπεδα καρδιολιπίνη σε κύτταρα HeLa, οδηγώντας σε μια παροδική αύξηση στα επίπεδα του ΑΤΡ ανεξάρτητη από μιτοχονδριακό μεταβολισμό, πιθανότατα λόγω της ενισχυμένης γλυκόλυση.

(Α, Β) κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν με μη-στόχευσης ή μια δεξαμενή PTPMT1 siRNAs (# 1 + # 2) για 72 ώρες. Τα κύτταρα επωάστηκαν με

32Ρ-ορθοφωσφορικό και ραδιοεπισημασμένα λιπίδια εκχυλίστηκαν και να επιλυθεί μέσω χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας. Καρδιολιπίνης εμφανίζεται ως το υψηλότερο σημείο απεικονίζεται στην TLC πλάκες (Α), και τα συνολικά επίπεδα καρδιολιπίνη ποσοτικοποιήθηκαν (Β). (Γ) Σύνολο ΑΤΡ /κύτταρο αναλύθηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με ένα μη-στόχευσης ή πισίνα PTPMT1 των siRNAs για 72 ώρες. ΑΤΡ /κύτταρο προσδιορίσθηκε σε κύτταρα που αναπτύσσονται σε τόσο υψηλές μέσα που περιέχουν γλυκόζη ή μέσα που περιέχουν μόνο πυροσταφυλικού. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση τουλάχιστον τριών πειραμάτων. Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας t δοκιμασία ενός μαθητή? * – P & lt? 0,05? ** – P & lt? 0,01? . *** – P & lt? 0.001

Η

αλεξιδίνη Dihydrochloride Αναστέλλει PTPMT1

in vitro

και επάγει την απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα

Μια πρόσφατη δημοσίευση εντόπισε η διυδροχλωρική ένωση αλεξιδίνη ως εκλεκτικός αναστολέας της PTPMT1

in vitro

[15]. Επιδιώξαμε να επικυρώσει αυτά τα δεδομένα χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένη PTPMT1. Ως μάρτυρας, δοκιμάσαμε επίσης την ικανότητα των αλεξιδίνης διυδροχλωρικής να αναστέλλουν MKP-3, μια διπλή φωσφατάση ειδικότητας με μικρή ομολογία προς PTPMT1. Σε συμφωνία με δεδομένα που παράγονται από Doughty-Shenton et al., Αλεξιδίνη διυδροχλωρική αναστέλλει τη δραστηριότητα φωσφατάσης της PTPMT1 με σημαντικά χαμηλότερη IC

50 σε σχέση με άλλες φωσφατάσες, συμπεριλαμβανομένων ΜΚΡ-3 (2,5 μΜ για PTPMT1 ν. 265 μΜ για ΜΚΡ-3 , Εικόνα 7Α). Πριν από την ταυτοποίηση του ως ειδικός αναστολέας της δραστηριότητας PTPMT1 φωσφατάσης, αλεξιδίνη διυδροχλωρικό είχε δειχθεί ότι διεγείρει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα [21]. Για να προσδιοριστεί εάν αλεξιδίνη διυδροχλωρίδιο επάγεται θάνατο κυττάρου σε πειραματικό μας σύστημα, πραγματοποιήσαμε ένα απλό πείραμα δόσης-απόκρισης στην οποία εκθέσαμε κύτταρα HeLa σε δύο φορές σειριακές αραιώσεις αλεξιδίνης διυδροχλωρικής για 24 ώρες. Συνεπής με την προηγούμενη έκθεση, αλεξιδίνη διυδροχλωρική προωθείται ισχυρή κυτταρικό θάνατο, με έναν ΕΚ

50 κοντά στο 2,8 μΜ (Εικόνα 6Β). Σημαντικά, αυτή η συγκέντρωση είναι κοντά στη συγκέντρωση που αναστέλλει ειδικά ανασυνδυασμένο PTPMT1

in vitro

, υποδηλώνοντας ότι η ειδική στόχευση αυτής της φωσφατάσης θα μπορούσε να είναι υπεύθυνη για αυτή την φαινότυπο κυτταρικό θάνατο.

(Α) Recombinant PTPMT1 και MKP-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις αλεξιδίνης διϋδροχλωρικής

in vitro δοκιμασίες

φωσφατάση διεξήχθησαν, και τα προκύπτοντα αποτελέσματα επί ενζυματική δραστηριότητα μετριέται. Το IC

50 για κάθε ένζυμο υπολογίστηκε και εμφανίζεται χρησιμοποιώντας SigmaPlot. κύτταρα (Β) HeLa υποβλήθηκαν σε αγωγή με απόκριση δόσης αλεξιδίνης διυδροχλωρικής για 24 ώρες και προκύπτουσες μεταβολές στο βιωσιμότητα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας Κυττάρων Titer Glo. κύτταρα (C, D) HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αλεξιδίνη διυδροχλωρική για 24 ώρες πριν τη μέτρηση κυτταρικό θάνατο (Γ) με χρώση ιωδιούχου προπιδίου (C) ή επαγωγή απόπτωσης με χρώση αννεξίνης V (D). Για κάθε πείραμα, οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση από τρία πειράματα. Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας t δοκιμασία ενός μαθητή? * – P & lt? 0,05? ** – P & lt? 0,01? . *** – P & lt? 0.001

Η

Για να επιβεβαιωθεί ότι η αλεξιδίνη διυδροχλωρίδιο επάγουν αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο παρόμοιο με αυτό που είδαμε με PTPMT1 siRNA νοκ ντάουν, εκθέσαμε τα κύτταρα HeLa σε απάντηση δόση αλεξιδίνη διϋδροχλωρικής, καθορισμό όπου οι συγκεντρώσεις επάγουν κυτταρικό θάνατο (μέσω χρώση με ιωδιούχο προπίδιο) και αν αυτό κυτταρικού θανάτου ήταν αποπτωτικά (με προσδιορισμό αννεξίνης V θετικότητα). Αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι υπάρχει μία δραματική αύξηση του κυτταρικού θανάτου HeLa μεταξύ 2,5 και 5 μΜ αλεξιδίνη διϋδροχλωρίδιο θεραπεία (Σχήμα 7C), η οποία συμφωνεί με την αρχική καμπύλη απόκρισης δόσης μας. Είναι σημαντικό, αυτή η στροφή σε κυτταρικό θάνατο είναι αποπτωτικά, καθώς μια παρόμοια αύξηση στην Αννεξίνη V θετικά κύτταρα παρατηρείται με την ίδια απόκριση δόσης (Σχήμα 7D), και είναι στο χαμηλό εύρος micromolar, που στοχεύουν ειδικά δραστηριότητα PTPMT1 φωσφατάση

in vitro

. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η αποπτωτική φαινότυπο που επάγεται με αγωγή διϋδροχλωρική αλεξιδίνη μπορούσε να οφείλεται σε αναστολή της δράσης της PTPMT1 φωσφατάσης.

Υποθανατηφόρες Δόσεις αλεξιδίνης Διϋδροχλωρίδιο επαρκούν να ευαισθητοποιεί καρκινικά κύτταρα σε χαμηλό επίπεδα paclitaxel αλλά δεν είναι τελείως Εξαρτάται PTPMT1 Αναστολή

Τα στοιχεία μας υποδηλώνουν ότι η υπο-θανατηφόρες νοκ ντάουν της PTPMT1 μπορεί να ευαισθητοποιήσει κύτταρα στην υπο-θανατηφόρες δόσεις χημειοθεραπευτικών πρότεινε ότι υπο-θανατηφόρες δόσεις αλεξιδίνη διυδροχλωρικής θα μπορούσε επίσης να επαναευαισθητοποιήσουν κύτταρα σε χημειοθεραπευτικά. Χρησιμοποιώντας τις καμπύλες απόκρισης δόσης αναλύθηκαν στο σχήμα 6, έχουμε επεξεργασμένα κύτταρα HeLa με μια υπο-θανατηφόρο δόση είτε 0.5 μΜ ή 1 μΜ αλεξιδίνης διυδροχλωρικής για 24 ώρες. Σημαντικά, ούτε συγκέντρωση του φαρμάκου που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο σε αυτό το χρονικό πλαίσιο (Εικόνα 7Β-D). Στη συνέχεια εκτίθεται τα αλεξιδίνη κύτταρα κατεργασμένα διυδροχλωρικό, ή κύτταρα που κατεργάζονται με όχημα μόνον ελέγχου, σε απόκριση δόση πακλιταξέλης για επιπλέον 24 ώρες πριν από την δοκιμασία βιωσιμότητας. Και οι δύο δόσεις του αλεξιδίνης διυδροχλωρικής αρκούσαν για να ευαισθητοποιήσει κύτταρα σε ένα ευρύ φάσμα συγκεντρώσεων paclitaxel. Είναι ενδιαφέρον, 0,5 μΜ αλεξιδίνη διυδροχλωρίδιο δεν ήταν σε θέση να ευαισθητοποιεί σημαντικά τα κύτταρα που έλαβαν δόσεις πακλιταξέλης παρακάτω ΕΚ

50 της (δόσεις κυμαινόμενες από 0,01 έως 7,8 ηΜ, Σχήμα 8Α). Ωστόσο, σε υψηλότερες δόσεις, το σύνολο των οποίων πρέπει να υπερβαίνει το 15,6 ηΜ paclitaxel, αλεξιδίνη διϋδροχλωρίδιο προεπεξεργασία είναι σε θέση να ευαισθητοποιεί σημαντικά τα κύτταρα σε αγωγή paclitaxel (για 15,6 ηΜ δόση, ρ & lt? 0,05, για 31,25 έως 250 ηΜ paclitaxel, ρ & lt? 0,01, Σχήμα 8Α). Σε σύγκριση, 1 μΜ αλεξιδίνη διυδροχλωρίδιο ευαισθητοποιεί κύτταρα σε πακλιταξέλη σε όλες τις δόσεις που εξετάστηκαν (για 0,01 ηΜ δόση, ρ & lt? 0,05? Για όλες τις άλλες δόσεις, ρ & lt? 0.001, Σχήμα 8Β). Για την επιβεβαίωση αυτών των δεδομένων, προσδιορίσαμε το ποσοστό των κυττάρων που εκτίθενται σε υποθανατηφόρες επίπεδα αλεξιδίνης διϋδροχλωρίδιο (0.5 μΜ ή 1 μΜ) εν λεκέ θετικά για ιωδιούχο προπίδιο μετά τη θεραπεία με 1 ηΜ paclitaxel. Ενώ επεξεργασία των κυττάρων με ένα όχημα έχει μόνο ελάχιστες επιδράσεις με τα κύτταρα ελέγχου που εκτίθενται σε paclitaxel (8,0% ν. 8.6% κυτταρικό θάνατο, ρ = 0,24, ns, Εικόνα 8C), προ-επεξεργασία των κυττάρων είτε με 0.5 μΜ ή 1 μΜ αλεξιδίνη