Αφηρημένο

Τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να αποκτήσουν την ικανότητα τους να εισβάλει και να μεταστάσεις από υποβάλλονται σε επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβασης ( EMT). Αξιοποίηση αυτό το μηχανισμό της κυτταρικής πλαστικότητα, κακοήθη κύτταρα μπορεί να αναδιαμορφώσει κυτταροσκελετού της ακτίνης τους και ρυθμίζουν προς τα κάτω τις πρωτεΐνες που απαιτούνται για τις επαφές κυττάρου-κυττάρου. Οι μηχανισμοί του κυτταροσκελετική αναδιοργάνωση με αποτέλεσμα μεσεγχυματικά μορφολογία και αυξημένη επιθετική πιθανότητα είναι ελάχιστα κατανοητές. έχουν ακτίνη πυρήνων formins έχουν ενοχοποιηθεί ως βασικούς παράγοντες EMT. Εδώ, αναλύσαμε τα οποία formins μεταβάλλεται σε πλακώδες σχετίζονται EMT καρκίνωμα. FHOD1, μια κακώς μελετηθεί formin, φαίνεται να ρυθμίζεται προς τα πάνω σημαντικά κατά την EMT. Σε ανθρώπινους ιστούς FHOD1 ήταν κυρίως εκφράζεται σε μεσεγχυματικά κύτταρα, με μικρή έκφραση σε επιθήλια. Ωστόσο, τα δείγματα από το στόμα πλακωδών κυττάρων καρκίνους αποδειχθεί συνεπής προς τα πάνω ρύθμιση FHOD1 στο μεσεγχυματικώς μετασχηματισμένα κύτταρα στην επεμβατική άκρη. Αυτό αυξητική ρύθμιση επιβεβαιώθηκε σε μια στοματική πλακώδες καρκίνωμα μοντέλο, όπου η έκφραση FHOD1 ήταν αξιοσημείωτα αυξημένο μετά ΕΜΤ σε ΡΙ3Κ σηματοδότησης εξαρτώμενο τρόπο. Στα κύτταρα ΕΜΤ FHOD1 συνέβαλαν στην άτρακτο σχήματος μορφολογία και μεσεγχυματικά F-ακτίνης οργάνωση. Επιπλέον, λειτουργικές δοκιμασίες έδειξαν ότι FHOD1 συμβάλλει στην κυτταρική μετανάστευση και εισβολή. Τέλος, η εξάντληση FHOD1 μείωσε την ικανότητα των καρκινικών κυττάρων ΕΜΤ να σχηματίσουν invadopodia και να υποβαθμίσει εξωκυτταρική μήτρα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι FHOD1 συμμετέχει σε αλλαγές κυτταροσκελετού σε EMT. Επιπλέον, δείχνουμε ότι FHOD1 προς τα πάνω ρύθμιση εμφανίζεται κατά τη διάρκεια των καρκινικών κυττάρων EMT

in vivo

, γεγονός που δείχνει ότι FHOD1 μπορεί να συμβάλει στην πρόοδο του όγκου

Παράθεση:. Gardberg Μ, Kaipio K, L Lehtinen, Mikkonen Ρ, Heuser VD, Talvinen Κ, et al. (2013) FHOD1, ένα formin ρυθμίζεται προς τα πάνω σε επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση, Συμμετέχει στη μετανάστευση Cancer Cell και εισβολή. PLoS ONE 8 (9): e74923. doi: 10.1371 /journal.pone.0074923

Επιμέλεια: Πόντου Aspenstrom, του Ινστιτούτου Καρολίνσκα, στη Σουηδία

Ελήφθη: 15 Απριλίου του 2013? Δεκτές: 7, Αυγούστου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 26 Σεπτέμβρη 2013

Copyright: © 2013 Gardberg et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από τη χρηματοδότηση από την Ακαδημία της Φινλανδίας, Finska Läkaresällskapet, Sigrid Ίδρυμα Juselius, K Ίδρυμα Albin Johansson, η φινλανδική Καρκίνο Οργανώσεις και το Πανεπιστήμιο Turku Νοσοκομείο Κονδυλίων Έρευνας. Η Μαρία Gardberg είναι ένα Ph.D. φοιτητής που υποστηρίζεται από την Εθνική Graduate School of Clinical Investigation. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η κυτταροσκελετού της ακτίνης είναι μια ιδιαίτερα πλαστική κατασκευή με δυνατότητα να αναδιαμορφώσει γρήγορα από πολλούς εξω και ενδοκυτταρική συνθήματα. Σε επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), επιθηλιακά κύτταρα διίστανται κυττάρου-κυττάρου διασταυρώσεις τους, και αναδιαμορφώνει κυτταροσκελετού τους για να σχηματίσουν ένα σχήμα ατράκτου κύτταρο με άφθονο ίνες στρες. Το γεγονός ότι ΕΜΤ επιτρέπει στα κύτταρα να είναι κινητικό χρησιμοποιείται από επιθηλιακούς καρκίνους για την επίτευξη διεισδυτικότητα. EMT μπορεί να προκληθεί τόσο από περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως η υποξία, καθώς και από εξωκυτταρικά μόρια σηματοδότησης όπως ΤΟΡ-β. Up-ρύθμιση των παραγόντων μεταγραφής ΕΜΤ, συμπεριλαμβανομένων σαλιγκάρι, Slug, ZEB1 και ZEB2, οδηγεί στην EMT που ορίζει προς τα κάτω ρύθμιση της Ε-καδερίνης [1], [2]. Αν και η δραματική αύξηση των ινών F-ακτίνης και το άγχος και μοιάζουν με ινοβλάστες μορφολογία είναι όλα τα χαρακτηριστικά της EMT, η ακτίνη που εμπλέκονται φύτρα σε αυτό το κυτταροσκελετού αναδιαμόρφωση έχουν κακώς χαρακτηρίζεται.

Formins είναι πολύ συντηρημένες ακτίνης πυρήνων πρωτεΐνες που είναι παρουσιάσει σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Η 2 (FH2) τομέα formin ομολογία είναι το καθοριστικό στοιχείο για formins. Οι πλευρικές περιοχές διαφέρουν σημαντικά μεταξύ των επιμέρους πρωτεϊνών formin, πιθανώς οδηγώντας σε διαφορετικά κυτταρικών λειτουργιών και των ρυθμιστικών μηχανισμών. Formins καταλύουν την πυρήνωση ακτίνης στο αγκαθωτό τέλος των νημάτων ακτίνης. Κατά τη διάρκεια της επιμήκυνσης οι διμερισμένου formins συνδέονται με την διαμονή του νήματος, προστατεύοντας έτσι από την αποκοπή των μορίων [3]. Η δραστηριότητα της formins ρυθμίζεται από Rho ΟΤΡάσες, μοριακοί διακόπτες που αναδιαμορφώσει τον κυτταρικό σκελετό σε διαφορετικά κυτταρικά διαμερίσματα, ελέγχοντας διάταξης ινών στρες, σχηματισμός εστιακών προσκόλληση και τη λειτουργία της κινητικότητας σε καρκινικά κύτταρα [4], [5].

Ως ρυθμιστές της οργάνωσης των κυττάρων, την κυκλοφορία και την ανάπτυξη, formins είναι καλοί υποψήφιοι για την αναζήτηση ακτίνης διοργανωτές που επιτρέπουν τις βαθιές αλλαγές κυτταροσκελετού σε EMT. Ωστόσο, ο ρόλος του formins σε EMT δεν είναι γνωστός λεπτομερώς. Με τη χρήση ενός από του στόματος μοντέλο EMT καρκίνο εκ πλακωδών κυττάρων (SCC), δείχνουμε εδώ ότι FHOD1, ένα κυρίως μεσεγχυματικώς εξέφρασε formin, ειδικά ρυθμισμένη προς τα πάνω κατά τη διάρκεια της EMT. Σε περαιτέρω μελέτες, δείχνουμε ότι FHOD1 εκφράζεται επίσης

in vivo

στο μεταναστευτικό μέτωπο του SCC και ότι απαιτείται για τη διατήρηση της μορφολογίας μεσεγχυματικών, αποτελεσματική μετανάστευση και εισβολή.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικές σειρές

Στοματική πλακώδες καρκίνωμα (SCC) κυτταρική σειρά UT-SCC-43A προήλθε από μια πρωταρχική ούλων όγκου ενός 75-year-old Καυκάσου θηλυκό. Ο όγκος ανέβηκε ως Τ

4Ν

1Μ

0, και ήταν ιστολογικά βαθμού 2 SCC [6]. UT-SCC-43Β προήλθε από ένα επαναλαμβανόμενο όγκου από τον ίδιο ασθενή μετά την ακτινοθεραπεία και τη χειρουργική επέμβαση. Η κυτταρική γραμμή 43A-ΣΕΛ έχει δημιουργηθεί με επιμόλυνση 43Α κύτταρα με πλήρους μήκους αιμοσυγκολλητίνη-tagged cDNA του ποντικού σαλιγκάρι. Οι τρεις κυτταρικές γραμμές αποδείχθηκε νωρίτερα, και έχουν προηγουμένως βρεθεί να παρουσιάζουν αλλαγές στην επιθηλιακή πρόγραμμα διαφοροποίησης των κυττάρων μέσω διαφορετικών μηχανισμών καταστολής E-cadherin [7]. Πριν από την ίδρυση των δύο πρωτογενείς κυτταρικές σειρές UT-SCC-43Α και UT-SCC-43B για την έρευνα, η έγκριση της Μεικτής Επιτροπής Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου του Turku και του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Turku αποκτήθηκε, καθώς και την έγγραφη συναίνεση του δότη [ ,,,0],7]. Το ενδοθήλιο κυτταρική σειρά τελομεράση απαθανάτισε ανθρώπινη μικροαγγειακή (TIME) και ανθρώπινα δερματικά μικροαγγειακή ενδοθηλιακή κυτταρική γραμμή (HMEC) ήταν μια ευγενική προσφορά από MSc Johannes Keuschnigg (Πανεπιστήμιο του Turku, Τούρκου, Φινλανδία? Κυτταρικές σειρές αρχικά από την ATCC). Άλλες κυτταρικές σειρές αγοράστηκαν από την ATCC και συντηρούνται σύμφωνα με τις οδηγίες του διανομέα.

Transcriptomic δεδομένων μικροσυστοιχιών και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR-

Η γονιδιακή έκφραση αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το Illumina HumanHT-12 v4 Έκφραση BeadChip στο φινλανδικό μικροσυστοιχιών και αλληλουχίας Κέντρο, Turku Center for Biotechnology. Ολικό RNA εξήχθη από καλλιεργημένα κύτταρα με τη χρήση RNeasy Mini Kit (Qiagen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και υποβάλλονται σε επεξεργασία σε cDNA με το κιτ σύνθεσης cDNA (Applied Biosystems, Foster City, CA). Τα δεδομένα πίνακα που βασίζεται σε κυτταρικές σειρές έχει φορτωθεί σε ArrayExpress (ένταξη αριθμό E-mtab-1420).

TaqMan qRT-PCR πραγματοποιήθηκε με ένα όργανο Applied Biosystems 7900HT (φινλανδική μικροσυστοιχιών και αλληλουχίας Κέντρο). Ανιχνευτές και εκκινητές ήταν από Ολιγομερές, Ελσίνκι, Φινλανδία. Η ποσοτικοποίηση εκτελέστηκε με διαχειριστή RQ 1.2 λογισμικό χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΔΔCT (Applied Biosystems). Τρία όμοια δείγματα μελετήθηκαν για την ανίχνευση της έκφρασης του mRNA στόχου και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένα ενδογενές ελέγχου. Οι ποσότητες εκφράστηκαν ως Ν-πλάσια διαφορά σε σχέση με την κυτταρική γραμμή UT-SCC-43Α. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του Student

t-test

και του Pearson συντελεστής συσχέτισης, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Γονίδιο ειδικούς εκκινητές ήταν: DIAPH1 (προς τα εμπρός 5-cagtcaggggcagcattc-3 ‘, αντίστροφη 3′-cactgttcttggacaccttgg-5′), FHOD1 (εμπρός 5’-cctcagctgacacctccag-3 ‘, αντίστροφη 3′-cagcgcaacctgcttctc-5′), FHOD3 (προς τα εμπρός 5’-ggccaggttggaaaggtc-3 ‘, αντίστροφη 3′-tctgctgccagtgactcttg-5’), FMNL3 (προς τα εμπρός 5-ccatcgaggacatcatcaca-3 ‘, αντίστροφη 3′-ccgagagggtctcagtgg-5’).

FHOD1 αντισώματα

Ένα κουνέλι FHOD1 πολύκλωνο αντίσωμα μονοειδικού αντι-ανθρώπινου παρήχθη από το πρόγραμμα Atlas ανθρώπινη πρωτεΐνη (HPA) [8], και είναι σήμερα διαθέσιμα για το κοινό (HPA024468, Atlas αντισώματα, Στοκχόλμη, Σουηδία). Περαιτέρω χαρακτηρισμός αντισώματος περιγράφεται στην ενότητα Αποτελέσματα. Σε μερικά πειράματα, χρησιμοποιήθηκε μια άλλη πολυκλωνικό FHOD1 αντίσωμα (Millipore, Bedford, ΜΑ, USA). Η αντιδραστικότητα των δύο αντισωμάτων ήταν όμοια σε κηλίδωση Western και ανοσοκηλιδώσεις.

Western και Northern blotting των ανθρώπινων κυτταρικών σειρών

Οι κυτταρικές γραμμές MDA-MB-231 (κύτταρα καρκίνου του μαστού), WM164 (μελάνωμα κύτταρα), Α431 (κύτταρα πλακώδες καρκίνωμα), U138MG (κύτταρα γλοιοβλαστώματος), HUVEC (ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας), HMEC (ανθρώπινα δερματικά μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα), χρόνος, UT-SCC-43Α, UT-SCC-43Β και 43Α -SNA συλλέχθηκαν και λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης. Για κάθε πείραμα, τα δείγματα κανονικοποιήθηκαν προς τη συγκέντρωση πρωτεΐνης και ίσες ποσότητες υλικού σε Laemmli ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε φίλτρα νιτροκυτταρίνης. Για ανοσοκηλίδωση το αντίσωμα αντι-ΗΡΑ FHOD1 επωάστηκε όλη τη νύχτα στους 1:2000 αραίωση σε BSA /TBS /Tween 0,1%, ακολουθούμενη από δευτερεύον αντίσωμα [HRP-συζευγμένο χοίρων αντι-κουνελιού (Dako, Glostrup, Denmark)]. Οι δεσμευμένες πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια. Στο διαγωνισμό πεπτίδιο πειραματιστεί το αντίσωμα επωάστηκε πρώτα με 100-πλάσια μοριακή περίσσεια πρωτεΐνης σύντηξης GST-FHOD1 που περιέχει τα αντιγονικά επιτόπια για 1 ώρα, ή με GST ως μάρτυρας. Πρωτεΐνη φόρτωση ελέγχθηκε με ανοσοστύπωμα με ένα α-τουμπουλίνης αντίσωμα (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Επιθηλιακά /μεσεγχυματικά transdifferentation ελέγχθηκε με ανοσοστύπωμα με αντι-Ε-καδερίνης και αντι αντισώματα Ν-καντερίνης (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

ανάλυση κηλίδος Northern διεξήχθη όπως περιγράφεται [9]. Η αλληλουχία του ανιχνευτή περιλαμβάνεται το μεγαλύτερο μέρος του επιτόπου αντισώματος (NCBI RNA REFSEQ κλώνου GenBank NM_013241.2, βάσεις 1517-1810).

Η αναστολή της ΜΑΡΚ /ΕΚΚ και PI3K μονοπάτια σηματοδότησης

UT- κύτταρα SCC-43Β απλώθηκαν σε πλήρες μέσο και καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες πριν από μέσο αντικαταστάθηκε με μέσο χωρίς ορό και επωάστηκαν για όλη τη νύχτα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν για 4 ημέρες σε 10 μΜ ΜΕΚ 1/2 αναστολέας U0126 (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ, USA) ή αναστολέα ΡΙ3 κινάσης LY294002 (Tocris Bioscience, Bristol, UK) σε μέσο άνευ ορού 1% για U0126 και 10 % ορό μέσο για LY 294002. τα κύτταρα μάρτυρες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον ίδιο όγκο του οχήματος. Μετά την επώαση, η αποτελεσματικότητα της ΜΑΡΚ αναστολής οδού ελέγχθηκε με ανοσοκηλίδωση όπως περιγράφεται παραπάνω με 1:1000 αραιώσεις πολυκλωνικών αντι-φωσφο-ρ44 /42 ΜΑΡΚ (Thr202 /Tyr204) (ρ-ERK 1/2) (Cell Signaling Technology) και πολυκλωνικά αντι-ERK 2 (ΜΑΡΚ 2) αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). αναστολή ΡΙ3Κ οδός ελέγχθηκε με ανοσοστύπωμα με μονοκλωνικό αντι-Φωσφο-Ακί (Ser473) (p-Akt), μονοκλωνικό αντι-Akt (PAN) (και τα δύο από την Cell Signaling Technology).

γονιδιακή σίγηση

έκφραση FHOD1 ήταν παροδικά γκρέμισε MDA-MB-231, το χρόνο και τα κύτταρα UT-SCC-43B χρησιμοποιώντας το

SMART

πισίνα siRNA (Dharmacon Έρευνας, Boulder, CA). Μη στόχευση πισίνα siRNA (Dharmacon) χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με Dharmafect 1 (Dharmacon) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. επίπεδα FHOD1 εξετάστηκαν σε προϊόντα λύσης κυττάρου 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με ανοσοαποτύπωση.

Στο silico

transcriptomics ανάλυση

Η βάση δεδομένων GeneSapiens χρησιμοποιήθηκε για να μελετηθεί η έκφραση FHOD1 mRNA σε όλα τα ανθρώπινα φυσιολογικούς ιστούς [10]. Τα δείγματα που περιλαμβάνονται σε αυτή την βάση δεδομένων έχουν αναλυθεί στην πλατφόρμα Affymetrix και λόγω της μοναδικής κανονικοποίηση και την ποιότητα των δεδομένων επαληθεύσεων, προφίλ γονιδιακής έκφρασης που συλλέγονται από διάφορες μελέτες μπορούν να συνδυαστούν για να δημιουργήσουν μια γενική εικόνα του προφίλ έκφρασης σε ανθρώπινους ιστούς.

Ανοσοϊστοχημεία

φυσιολογικούς ιστούς συλλέχθηκαν, σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν ανοσοϊστοχημικά όπως περιγράφεται [9]. Η συλλογή των φυσιολογικών ιστών για τη μελέτη αυτή εγκρίθηκε από τη Μικτή Επιτροπή Ηθικής του Πανεπιστημίου του Turku και του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Turku, καθώς και τη γραπτή συγκατάθεση των δωρητών. Οι 10 τομές παραφίνης από του στόματος δείγματα SCC συλλέχθηκαν από το αρχείο του ιστού του Τμήματος Παθολογίας Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Turku με την έγκριση της Μικτής Επιτροπής Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου του Turku και του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Turku. Σύμφωνα με τη φινλανδική νομοθεσία (νόμος σχετικά με τη χρήση των δειγμάτων ιστού για την έρευνα, [11, 20 §]), η άδεια για τη χρήση δειγμάτων που συλλέχθηκαν για διαγνωστικούς σκοπούς, χορηγείται από τις τοπικές θεσμικές αρχές σε περιπτώσεις, όπου δεν περιλαμβάνονται πληροφορίες για τον ασθενή. Ως εκ τούτου, οι ασθενείς δεν έχουν συναινέσει, αλλά η άδεια έχει χορηγηθεί από την τοπική επιτροπή δεοντολογίας και ιατρικός διευθυντής του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Turku. Το αντίσωμα ΗΡΑ FHOD1 χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:250. Ατομική ιστούς και τύπους κυττάρων αξιολογήθηκαν με βαθμολόγηση της έντασης χρώσης με την ταξινόμηση από 0 (καμία χρώση) έως +++ (ισχυρή χρώση).

ανοσοφθορισμού μικροσκοπία και ποσοτικοποίηση των F-ακτίνης

UT -SCC-43Α και UT-SCC-43Β κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί ζελατίνη επικαλυμμένα καλυπτρίδες, και μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά. Τα κύτταρα περατά με ψυχρή ακετόνη για 4 λεπτά. Μετά από 30 λεπτά σε 1% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) σε PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν για 1 ώρα με το αντίσωμα FHOD1 (1: 250), που ακολουθείται από ένα δευτερογενές αντίσωμα, Alexa 568-συζευγμένη κατσίκας αντι-κουνελιού (1:500 , Molecular Probes, Eugene, OR, USA). F-ακτίνης οπτικοποιήθηκε με Alexa 488-συζευγμένη φαλλοειδίνη (Molecular Probes). Τα μέσα στερέωσης που περιέχονται DAPI για χρώση των πυρήνων (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Invadopodia έγιναν ορατές με χρώση ανοσοφθορισμού με αντι-cortactin 1:200 (Millipore). κύτταρα του πλάσματος προσδιορίστηκαν με αντι-CD138 mAb (Ventana Medical Systems, Tucson, Αριζόνα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Alexa Fluor 568 αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού χρησιμοποιήθηκε ως δευτερεύον αντίσωμα (Molecular Probes). Τα κύτταρα απεικονίστηκαν με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού ή Zeiss LSM 510 Meta συνεστιακό μικροσκόπιο (Carl Zeiss, 63 αντικειμενικός × Σχέδιο Αχρωματικός, Göttingen, Germany). Εικόνα J 1.42q λογισμικού (ΝΙΗ, USA) χρησιμοποιήθηκε σε αναλύσεις εικόνα. Ποσοτικοποίηση της F-ακτίνης σε κύτταρα UT-SCC-43Β, αναλύθηκε κατά Alexa χρώση 488-συζευγμένο φαλλοειδίνη από ομοεστιακό εικόνες των 20 κυττάρων από κάθε πείραμα. Οι μέσες εντάσεις φθορισμού μετρήθηκαν από κυτταρόπλασμα του κυττάρου. Η σημασία του πειράματος υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας μαθητές ανεξάρτητα δείγματα

t-test

.

Η επούλωση των τραυμάτων και αναλύσεις εισβολή

Η μετανάστευση των κυττάρων UT-SCC-43B θεραπεία με FHOD1 ή μη-στόχευσης siRNAs μελετήθηκε επί 24 φρεατίων πλάκες ζελατίνη με λεπτό υμένιο. Μια πληγή δημιουργήθηκε με το χέρι ξύσιμο του μονοστοιβάδα των κυττάρων με ένα ρύγχος πιπέτας 10 μΙ. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, και προστέθηκε διηθείται μέσο. Μια εικόνα των κυττάρων που μεταναστεύουν εντός του τραύματος ελήφθη σε διαστήματα 10 λεπτών για 24 ώρες. λογισμικό ImageJ χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της περιοχής του τραύματος σε διαστήματα 1 h. Τα τραύματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας επαναλαμβανόμενη ανάλυση μετρήσεων της διακύμανσης (rmANOVA). Ώρα πραγματοποιήθηκε ως επαναλαμβανόμενη δράση και την ομάδα ως σταθερό αποτέλεσμα. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με χρήση του συστήματος SAS για Windows, έκδοση 9.2 (SAS Institute Inc, Cary, NC, USA). Η επίδραση της FHOD1 φίμωση για τα χωροκατακτητικά ικανότητα των κυττάρων UT-SCC-43B μελετήθηκε με τη χρήση του συστήματος απεικόνισης σε πραγματικό χρόνο IncuCyte (Έσσεν BioScience, Ann Arbor, Michigan, USA). κύτταρα UT-SCC-43Β επεξεργάστηκε με FHOD1 siRNA ή μη-κωδικοποιητικές siRNA και μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου απλώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων (πλάκα ImageLock, Essen BioScience, ΜΙ) επικαλυμμένα με Παράγοντα 50 μΙ 10% Growth Μειωμένη Matrigel (BD Biosciences) μετά το οποίο τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν ο /η στους + 37 ° C. Μια πληγή ήταν γδαρμένο σε όλη κάθε φρεάτιο (Πληγή τσάι, Essen BioScience) και το μέσο ανάπτυξης απομακρύνθηκε. Τα κύτταρα στη συνέχεια καλύπτεται προσεκτικά με 50 μλ 25% Matrigel σε κανονικό μέσο ανάπτυξης και επωάζονται σε 37 ° C για 2-3 ώρες ώστε να επιτραπεί σχηματισμού γέλης, μετά από την οποία 100 μΙ μέσου ανάπτυξης προστέθηκε προσεκτικά σε κάθε φρεάτιο. Το ποσοστό της εισβολής (κλείσιμο της πληγής μέσω της μήτρας) παρακολουθήθηκε ώρα με το λογισμικό απεικόνισης Incucyte (Έσσεν BioScience) για 72 ώρες. αποδοτικότητα εισβολή προσδιορίσθηκε ως ποσοστό της σχετικής συμβολής τραύματος σε σύγκριση με την αντίστοιχη αρνητικό μάρτυρα (ως 100%).

Μέτρηση της εξωκυτταρικής μήτρας και αποικοδόμησης invadopodia ποσοτικοποίηση

Για να αναλυθεί η επίδραση των FHOD1 knockdown στην εξωκυττάρια μήτρα (ECM) αποικοδόμηση και invadopodia σχηματισμό κυττάρων UT-SCC-43Β, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μη-κωδικοποίησης siRNA και FHOD1 siRNA όπως περιγράφηκε παραπάνω και επιστρώθηκαν σε γυάλινα πλακίδια 8 φρεατίων προ-επικαλυμμένες με Cy3-επισημασμένο ζελατίνη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (QCM Ζελατίνη Invadopodia Δοκιμασία (Κόκκινο), Millipore). Μετά από 24 ώρες επώασης στους 37 ° C, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν για μικροσκοπία ανοσοφθορισμού με αντι-cortactin ή φαλλοειδίνη. Η υποβάθμιση ECM ήταν ορατή ως σκοτεινή εστίες στερείται φθορισμού. Οι εικόνες ελήφθησαν με ένα μικροσκόπιο φθορισμού Ολύμπου ΒΧ60 (Olympus μικροσκόπια, Essex, Ηνωμένο Βασίλειο). κοιλότητες υποβάθμιση που παράγεται από τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν και περιοχές απορρόφησης ανά κύτταρο (px) μετρήθηκαν με το λογισμικό ImageJ. Για κάθε ομάδα, ο μέσος αποδόμηση των 100 κυττάρων από οκτώ φρεάτια συγκρίθηκε. Για να αξιολογηθεί σχηματισμός invadopodia, τα κύτταρα ελέγχθηκαν για ακτίνη πλούσια comet- ή δακτυλίου-όπως προεξοχές με θετική χρώση cortactin στην κοιλιακή επιφάνεια. Το ποσοστό των κυττάρων που περιέχουν invadopodia μετρήθηκε από 10 διαφορετικά πεδία σε κάθε ομάδα. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων δοκιμάστηκαν για σημαντικότητα με ANOVA (Tukey post hoc) και στα δύο πειράματα.

ρύθμιση Μεταγραφική της formins κατά τη διάρκεια του καρκίνου που σχετίζονται με EMT

Χρησιμοποιήσαμε

Αποτελέσματα

τρεις μοντέλο κυτταρικές σειρές για την αξιολόγηση μεταβολές στην έκφραση formin κατά την διάρκεια καρκινο-συναφές EMT. UT-SCC-43A είναι ένα από του στόματος κυτταρική γραμμή SCC από πρωτοπαθή όγκο και UT-SCC-43B είναι μια γραμμή από τον ίδιο όγκο επαναλαμβανόμενες μετά από χειρουργική επέμβαση και ακτινοθεραπεία. Το επαναλαμβανόμενο όγκος έχει υποστεί μια αυθόρμητη EMT, όπως αποδεικνύεται από πολλές δείκτες [7]. Η τρίτη κυτταρική γραμμή, 43Α-ΣΕΛ, ιδρύθηκε από την επιμόλυνση UT-SCC-43Α κυττάρων με Σαλιγκάρι να προκαλέσει EMT.

Transcriptomic ανάλυση αποκάλυψε ότι τα μεσεγχυματικά κυτταρικές σειρές UT-SCC-43Β και 43Α-ΣΕΛ έχουν 35 up-ρυθμιζόμενα γονίδια (logFC ≥2, p≤0.001) και 153 κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια (logFC ≤ -2, p≤0.001) στο κοινό (Σχήμα 1 Α? λίστες γονίδιο που παρουσιάζονται στον πίνακα S1). Σε UT-SCC43B και 43Α-SNA, με έδρα ΕΜΤ-δείκτες όπως Ν-καδερίνης, βιμεντίνη και κολλαγόνα ρυθμίστηκαν προς τα πάνω (Σχήμα 1 Β), ενώ τα επιθηλιακά δείκτες όπως Ε-καδερίνης, κεράτινες, ιντεγκρίνες και λαμινίνες ήταν ταυτόχρονα υποβαθμίσουν τα ρυθμίζεται υποδεικνύοντας ότι οι transcriptomic αλλαγές συνάδουν με EMT.

Α) μικροσυστοιχιών transcriptomic προφίλ του UT-SCC-43A, UT-SCC-43Β και τα κύτταρα 43Α-σΕΛ. Οι μεταγραφές μεταβληθεί σημαντικά σε κύτταρα UT-SCC-43B σε σύγκριση με τα κύτταρα UT-SCC-43Α που δείχνει το μπλε κύκλο και μεταγραφές μεταβληθεί σε κύτταρα 43Α-ΣΕΛ σε σύγκριση με το UT-SCC-43A υποδεικνύονται από τον πράσινο κύκλο. Ο αριθμός των γονιδίων που μεταβάλλονται σε αμφότερες τις συγκρίσεις παρουσιάζεται στην περιοχή επικάλυψης. Ο αριθμός των γονιδίων που ρυθμίζεται προς τα πάνω εμφανίζεται στο πάνω και στο κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια στο κάτω μέρος. Β) μεταβολές επίπεδο του mRNA για επιλεγμένες επιθηλιακά (επάνω) και γονίδια μεσεγχυματικά (κάτω). Απεικονίζεται γονίδια κωδικοποιούν πρωτεΐνες εξής: Cdh1 = E-cadherin, CLDN3 = κλαουδίνης 3, CLDN 7 = κλαουδίνης 7, KRT5 = κερατίνη 5, KRT6B = κερατίνη 6β, CDH2 = Ν-καδερίνη, VIM = βιμεντίνης. Γ) τα επίπεδα mRNA για formins με σημαντικές αλλαγές και στις δύο UT-SCC-43Β και 43Α-ΣΕΛ κύτταρα τα οποία στη συνέχεια επιβεβαιώθηκε με RT-PCR. Δ) τα επίπεδα mRNA για formins επιβεβαιώθηκε με RT-PCR.

Η

Από τα formin μέλη της οικογένειας 13 που περιλαμβάνονται στον πίνακα (DAAM1, DAAM2, DIAPH1, DIAPH2, DIAPH3, FHOD1, FHOD3, FMN1, FMN2, FMNL1, FMNL2, FMNL3, INF 2), δύο ήταν σταθερά πάνω ρυθμισμένα και τέσσερις κάτω-ρυθμίζονται κατά τη διάρκεια της EMT. Η πιο σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση παρατηρήθηκε με FHOD1, η οποία αυξήθηκε κατά 2,3 φορές σε UT-SCC-43Β και 3,2-φορές σε 43Α-SNA σε σύγκριση με UT-SCC-43Α (Σχήμα 1 C). Οι σημαντικές διαφορές μεταγραφική περαιτέρω επαληθεύεται από qRT-PCR, η οποία κατέδειξε προς τα πάνω ρύθμιση formins FHOD1 και FMNL3 και προς τα κάτω ρύθμιση των FHOD3 και DIAPH1 στα δύο κύτταρα UT-SCC-43Β και 43Α-ΣΕΛ (Σχήμα 1 D).

χαρακτηρισμός της ανθρώπινης FHOD1 και πρότυπο έκφρασης της

Όπως FHOD1 ήταν η πιο up-ρυθμίζονται formin στο EMT, αποφασίσαμε να μελετήσουμε περαιτέρω αυτή κακώς χαρακτηρίζεται πρωτεΐνη. Το προφίλ έκφρασης του ανθρώπινου FHOD1 δεν είναι γνωστή, κυρίως λόγω της έλλειψης κατάλληλων αντισωμάτων. Πήραμε πλεονέκτημα ενός αντισώματος FHOD1 που έθεσε το έργο Ανθρώπινη Πρωτεΐνη Atlas. Στη Δυτική κηλίδωση, το αντίσωμα αντιδρά με πολλά ανθρώπινα ενδοθηλιακά και καρκινικές κυτταρικές σειρές. Μια μόνη ζώνη του 145 kDa, η οποία είναι ελαφρώς μεγαλύτερο από το προβλεπόμενο 127 kDa, ανιχνεύθηκε σε όλες τις εξετασθείσες κυτταρικές γραμμές (σχήμα S1 Α). Μια παρόμοια ζώνη παρατηρήθηκε επίσης με ένα άλλο αντίσωμα FHOD1. Η μεγάλη αντιδραστικότητα είναι σύμφωνη με προηγούμενα ευρήματα που αποδεικνύουν την έκφραση FHOD1 στις περισσότερες αθανατοποιημένες κυτταρικές γραμμές [11].

Για να ελέγξετε περαιτέρω την ειδικότητα του αντισώματος ΗΡΑ, η αντιδραστικότητα μπλοκαρίστηκε με αντιγονικό θραύσμα GST-FHOD1 ή GST . Όπως θεωρείται FHOD1 να είναι ένα ενδοθηλιακό formin [12], χρησιμοποιήσαμε προϊόντα λύσης από τρία ενδοθηλιακών κυτταρικών σειρών: HMEC, χρόνο και HUVEC. Η επώαση με το GST-FHOD1-πεπτιδίου καταργηθεί ουσιαστικά ανίχνευση των 145 kDa ζώνες σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα S1 Β), ενώ η επώαση με GST δεν είχε καμία επίδραση. Τέλος, επιβεβαίωσε την ειδικότητα με την επιμόλυνση MDA-MB-231 κυττάρων με FHOD1 μικρό παρεμβαλλόμενο (SI) RNA ή με μη-στόχευσης ελέγχου siRNA. Μετά τη θεραπεία FHOD1 siRNA, η αντιδραστικότητα του αντισώματος μειώθηκε σημαντικά ενώ η αντιδραστικότητα σε κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA ελέγχου ήταν ανεπηρέαστη (Σχήμα S1 C).

Η μεταγραφή FHOD1 σε κυτταρικές γραμμές αναλύθηκε με κηλίδωση Northern. Η ανάλυση αποκάλυψε ένα απλό αντίγραφο 4,0 kb σε όλες τις πέντε κυτταρικές σειρές, που ταιριάζουν το αποτέλεσμα από την ανάλυση κηλίδος Western (Σχήμα S1 D).

Για να διερευνήσουν συστηματικά ποια ιστούς και τύπους κυττάρων εκφράζουν FHOD1, ανοσοϊστοχημική χρώση με τη χρήση του ΗΡΑ FHOD1 αντίσωμα πραγματοποιήθηκε σε 26 διαφορετικούς ανθρώπινους ιστούς. Σε σχεδόν όλα τα δείγματα τριχοειδή ενδοθηλιακά κύτταρα ήταν ανοσοδραστικό, αν και με μεταβαλλόμενη ένταση χρώσης. Η πιο εντατική χρώση FHOD1 παρατηρήθηκε στα μικρά αιμοφόρα αγγεία του σπλήνα (Σχήμα 2 Α), του ενδομητρίου (Σχήμα 2 Β), των ωοθηκών (Εικόνα 2 C) και σε περιτοναϊκή αγγεία κάτω από το mesothelium. Στους περισσότερους ιστούς και τύπους κυττάρων, τα παρεγχυματικά κύτταρα έδειξαν μικρή ή καθόλου αντιδραστικότητα FHOD1. Για παράδειγμα, στον εγκέφαλο, ούτε τα νευρικά κύτταρα ούτε νευρογλοιακά κύτταρα εξέφρασαν FHOD1 (Σχήμα 2 D). Τα ενδοθηλιακά κύτταρα στον εγκεφαλικό τριχοειδή, από την άλλη πλευρά, εκφραζόμενη FHOD1. Ένα μικρό υποσύνολο των λεμφοκυττάρων στους λεμφαδένες (Σχήμα 2 Ε), σπλήνα, μυελό των οστών (Εικόνα 2 F) και εντερικό βλεννογόνο (Σχήμα 2 G) βάφονται έντονα. Στον πνεύμονα, η μέτρια έκφραση παρατηρήθηκε σε κυψελιδικά μακροφάγα (Σχήμα 2 Η). Τα αποτελέσματα της ανοσοϊστοχημική ανάλυση παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Μετά κηλίδωση με λεμφοκυττάρων υπότυπο-ειδικούς δείκτες αποκάλυψε ότι το υποσύνολο των λεμφοκυττάρων που εκφράζονται FHOD1 αποτελούνταν από CD138-θετικών κυττάρων πλάσματος (Σχήματα 2 Ι και J).

παραφίνη-ενσωματωμένες φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς βάφτηκαν με FHOD1 αντίσωμα. Α) Στην σπλήνα, τα ενδοθηλιακά κύτταρα που επενδύουν τα αιμοφόρα αγγεία δείχνουν εντατική ανοσοαντιδραστικότητα FHOD1. Β) του ενδομητρίου στρώμα και αδένες εκφράζουν λίγο FHOD1. Ενδοθηλιακά κύτταρα στα τοιχώματα των αιμοφόρων αγγείων είναι χρωματισμένο έντονα (αιχμές βελών). Γ) Στην ωοθήκη, ωοκύτταρα (o) και τα κύτταρα θυλακίου (αστερίσκος) εκφράζουν λίγο FHOD1. D) στον εγκέφαλο, ούτε νευρώνες ούτε νευρογλοιακά κύτταρα δείχνουν χρώση FHOD1. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα σε λεπτά τριχοειδή αγγεία (βέλη) λεκέ ασθενώς. Ε) Σε λεμφαδένες, τα περισσότερα λεμφοκύτταρα λεκέ ασθενώς. Περιστασιακή χρώση έντονα κύτταρα έχουν μορφολογία των κυττάρων του πλάσματος (ανοικτά βέλη). ΣΤ) στο μυελό των οστών, ερυθροποιητική κύτταρα δεν εκφράζουν FHOD1. Μυελοποιητικές κύτταρα και μεγακαρυοκύτταρα (Μ) λεκέ ασθενώς. Περιστασιακή μικρά κύτταρα που εκφράζουν FHOD1 έντονα (ανοιχτά βέλη) είναι κύτταρα πλάσματος. Ζ) Στο βλεννογόνο του κόλου, επιθηλιακά κύτταρα δείχνουν μόνο ασθενή χρώση FHOD1. στρωματικά κύτταρα του πλάσματος (ανοικτά βέλη) εκφράζουν FHOD1 έντονα. H) κυψελιδικού επιθηλίου στους λεκέδες πνεύμονα ασθενώς για FHOD1, ενώ κυψελιδικά μακροφάγα (MP) δείχνουν μέτρια χρώση FHOD1. I, J) Διπλή χρώση ανοσοφθορισμού των FHOD1-θετικών φλεγμονωδών κυττάρων επιδεικνύει ότι τα ίδια κύτταρα εκφράζουν CD138 (αιχμές βελών). Η μορφολογία των κυττάρων και CD138 αναφέρουν ότι είναι τα κύτταρα του πλάσματος. Σε Α-Η μπάρα κλίμακας = 100 μm.

Η

Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι FHOD1 εκφράζεται σε πολλούς ιστούς, αλλά μόνο σε περιορισμένο τύπους κυττάρων. Αξίζει να σημειωθεί ότι όλοι οι χρώση ισχυρώς τύποι κυττάρων είναι μεσεγχυματικής προέλευσης. Αυτό ταιριάζει με το

in silico

προφίλ mRNA που λαμβάνεται από μια αναζήτηση της βάσης δεδομένων GeneSapiens [10] (Εικόνα S2). Η χαμηλή έκφραση πανταχού παρούσα FHOD1 σε όλους τους φυσιολογικούς ιστούς μπορούσε να αποδοθεί στην έκφραση στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Υψηλότερες έκφραση μπορεί να δει σε ιστούς όπου παρεγχυματικά κύτταρα χρωματίζονται επίσης σε ανοσοϊστοχημεία,

δηλ.

Σκελετικών μυών, του μαστού και των ωοθηκών. Αν και το επίπεδο του mRNA σε δείγματα mesothelial ιστού είναι σχετικά υψηλό, μεσοθηλιακά κύτταρα δεν χρωματίζονται με το αντίσωμα FHOD1. Τα υψηλά επίπεδα του mRNA είναι πιθανόν να οφείλεται στην άφθονη ενδοθήλιο στα τριχοειδή κάτω από το mesothelium. Στην εν λόγω σκάφη, ανοσοϊστοχημική χρώση FHOD1 ήταν ισχυρή.

EMT οδηγεί σε PI3K μονοπάτι που εξαρτάται από FHOD1 ρύθμιση προς τα άνω και μορφολογικές αλλοιώσεις

Αν και οι ανοσοϊστοχημικές αποτελέσματα και

silico

mRNA προφίλ προτεινόμενες ελάχιστη έκφραση FHOD1 σε επιθηλιακά τύπους κυττάρων, τα αποτελέσματα μας transcriptomics και GeneSapiens βιοπληροφορικής έρευνα καρκινωμάτων (δεν φαίνονται) έδειξαν μέτρια επίπεδα του mRNA σε ορισμένους καρκίνους. Για παράδειγμα, η μέση κανονικοποιημένη τιμή έκφραση του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα ήταν 850 σε σύγκριση με 400 στο αναπνευστικό σύστημα, και η αξία της στοματικής SCC ήταν 800 σε σύγκριση με 100 σε κανονικό δέρμα (οι τιμές για στοματικό βλεννογόνο δεν ήταν διαθέσιμη). Για να διερευνήσουν κατά πόσον η ρύθμιση προς τα πάνω της FHOD1 συμβαίνει στην κλινική του στόματος SCC, επιλέξαμε τυχαία δέκα προφορική δείγματα SCC για ανοσοϊστοχημική ανάλυση. Όπως EMT πιστεύεται ότι συμβαίνει

in vivo

στην επεμβατική άκρη των επιθηλιακών καρκίνων, δεν θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί μικροσυστοιχίες ιστού. Βρήκαμε καμία αντιδραστικότητα στην μη νεοπλασματικά στρωματοποιημένο πλακώδες επιθήλιο του βλεννογόνου του στόματος σε οποιαδήποτε από τις περιπτώσεις, ενώ μέτρια έως ισχυρή χρώση FHOD1 παρατηρήθηκε με συνέπεια στους επεμβατική SCC κυττάρων με ένα μεσεγχυματικά ατρακτοειδή μορφολογία (Σχήμα 3 Α). Είναι ενδιαφέρον, FHOD1 ανοσοαντιδραστικότητα ήταν ήπια ή απούσα στα καλά διαφοροποιημένες περιοχές του διηθητικού καρκίνου, υποδεικνύοντας ότι το μεγαλύτερο μέρος του όγκου που αποτελείται από κυτταρικές περιοχές με επιθηλιακή διαφοροποίηση εκφράζει λίγο FHOD1.

Α) Σε κανονική ή μη νεοπλασματικά στρωματοποιημένο πλακώδες επιθήλιο, κανένα FHOD1 μπορεί να ανιχνευθεί (κορυφή). Σε επεμβατική καρκινώματα πλακωδών κυττάρων, μέτρια έως ισχυρή ανοσοαντιδραστικότητα FHOD1 φαίνεται σε ατρακτοειδή κύτταρα στο μεταναστευτικό μέτωπο ότι στις μορφολογικές λόγους έχουν υποστεί EMT (κάτω? Λεπτομέρειες στο ένθετο). Στο μεγαλύτερο μέρος του όγκου, η οποία αποτελείται από κύτταρα με μια μορφολογία των επιθηλιακών, μόνο ασθενή ανοσοαντιδραστικότητα είναι παρούσα. μπαρ κλίμακας: 200 μm. Β) Ανάλυση κηλίδας Western των κυτταρικών σειρών δείχνουν ότι η επιθηλιακή κυτταρική σειρά SCC UT-SCC-43A δεν εκφράζουν ανιχνεύσιμα FHOD1, ενώ τόσο η αυθόρμητη EMT κυτταρική σειρά UT-SCC-43Β και το σαλιγκάρι που προκαλείται από EMT κυτταρική γραμμή 43Α-ΣΕΛ εκφράζουν FHOD1. UT-SCC-43A εκφράζει την επιθηλιακά δείκτη E-cadherin, αλλά δεν N-cadherin, ενώ UT-SCC43-Β και 43Α-ΣΕΛ εκφράζουν Ν-cadherin αλλά όχι E-cadherin. Γ) οργάνωση F-ακτίνη των UT-SCC-43Α (άνω φωτογραφία) είναι συνήθως επιθηλιακά, με submembraneous νήματα διακριτές κυττάρων και πενιχρά ίνες στρες. UT-SCC-43B παρουσιάζει τα χαρακτηριστικά των μεσεγχυματικών οργάνωσης (μεσαίο πάνελ). επαφές κυττάρου-κυττάρου είναι λίγες, τα κύτταρα είναι επιμήκη και περιέχουν lamellopodia, τΊΙοροάίβ και το άγχος ίνες. Το ένθετο (κάτω πάνελ) δείχνει ότι ένα κλάσμα του FHOD1 συνεντοπίζεται με ίνες στρες στα κύτταρα UT-SCC-43Β (αιχμές βελών). Πυρήνες χρωματίζονται με DAPI (μπλε). Δ) FHOD1 ρύθμιση προς τα πάνω σε κύτταρα UT-SCC-43B εξαρτάται σηματοδότησης ΡΙ3Κ. Η θεραπεία με ΜΕΚ 1/2 αναστολέα U0126 μειώνει την φωσφορυλίωση του ERK 1/2 αλλά δεν επηρεάζει την έκφραση FHOD1. Σε αντίθεση, ΡΙ3Κ LY294992 αναστολή από μειώνει σημαντικά την έκφραση FHOD1. Η μείωση του p-Akt δείχνει ότι η οδός αναστέλλεται αποτελεσματικά.

Η

Στη συνέχεια, μελετήσαμε εάν η έκφραση FHOD1 συσχετίστηκε με μορφολογικές και λειτουργικές μεταβολές στην EMT. Από τις τρεις προφορικές κυτταρικές σειρές SCC, ανιχνεύσιμη FHOD1 παρατηρήθηκε σε UT-SCC-43Β και 43Α-ΣΕΛ αλλά όχι σε UT-SCC-43Α, που δείχνει ότι και σε επίπεδο πρωτεΐνης, FHOD1 πάνω ρύθμιση εμφανίζεται στην EMT τόσο στην αυθόρμητη και σαλιγκάρι επαγόμενη μοντέλο (Σχήμα 3 Β). Όπως ήταν αναμενόμενο, UT-SCC-43A εξέφρασε E-cadherin, αλλά δεν N-cadherin, ενώ UT-SCC-43Β και 43Α-SNA εξέφρασε Ν-cadherin, αλλά καμία E-cadherin (Εικόνα 3 Β).

Η κυτταρικές σειρές έδειξε επίσης διακριτά μορφολογικά χαρακτηριστικά και την οργάνωση της ακτίνης του κυτταροσκελετού. κύτταρα UT-SCC-43A είχε ένα τυπικό επιθηλιακό φαινότυπο, όπως σχημάτισαν φύλλα κυττάρων με κύτταρο-προς-κύτταρο επαφές και σπάνιων ίνες στρες (σχήμα 3 C, άνω πίνακας). UT-SCC-43Β, από την άλλη πλευρά, απετελείτο από ελαφρώς επιμηκυμένο κυττάρων με πολλές filopodia και άφθονα ίνες στρες (σχήμα 3 C, μεσαίο πλαίσιο). Η κατανομή των FHOD1 ήταν εν μέρει στικτή και κυτταροπλασματική, αλλά επίσης σαφώς εντοπισμένο να τονίσω ίνες (Σχήμα 3 C, κάτω πίνακα).

Στην προφορική SCC, μονοπάτια σηματοδότησης συνήθως ενεργοποιείται σε EMT περιλαμβάνουν φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης-s- κινάσης (ΡΙ3Κ) και οδοί μιτογόνο ενεργοποιούμενης κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ /ΕΚΚ 1/2) [13]. Για να διερευνηθεί αν FHOD1 αυξητική ρύθμιση ήταν εξαρτάται από την ενεργοποίηση ενός από αυτά τα μονοπάτια σηματοδότησης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΡΙ3Κ και /αναστολείς ΜΕΚ1 2. Η αναστολή της ΜΕΚ1 /2 δεν επηρέασε την έκφραση FHOD1, αν και η οδός ήταν αναστέλλεται αποτελεσματικά. Σε αντίθεση, η αναστολή της ΡΙ3Κ μείωσε σημαντικά την έκφραση FHOD1 (Σχήμα 3 D). Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι η έκφραση FHOD1 στο UT-SCC-43B εξαρτάται από σηματοδότησης ΡΙ3Κ.

FHOD1 νοκ ντάουν καταστέλλει τη μορφολογία μεσεγχυματικά, τη μετανάστευση και την εισβολή στα κύτταρα UT-SCC-43B

Η λειτουργική σημασία της