Αφηρημένο

ποσοστά επιβίωσης για τους ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος είναι εξαιρετικά κακή λόγω ασυμπτωματική πρόοδο της σε προχωρημένο και μεταστατικό στάδιο για το οποίο τρέχουσες θεραπείες παραμένουν σε μεγάλο βαθμό αναποτελεσματική. Ως εκ τούτου, οι νέοι θεραπευτικοί παράγοντες και οι προσεγγίσεις θεραπείας που επιθυμείται να βελτιωθεί η κλινική έκβαση. Σε αυτή τη μελέτη, προσδιορίσαμε τις επιδράσεις της Honokiol, ένα βιολογικά ενεργό συστατικό της ανατολίτικης φαρμακευτικών βοτάνων

Magnolia officinalis /grandiflora

, σε δύο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές, MiaPaCa και PANC1, μεμονωμένα και σε συνδυασμό με το πρότυπο χημειοθεραπευτικό φάρμακο , γεμσιταβίνη. Honokiol ασκείται ανασταλτικά αποτελέσματα ανάπτυξης επί αμφοτέρων των παγκρεατικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών προκαλώντας διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε G

1 φάση και επαγωγή απόπτωσης. Στο μοριακό επίπεδο, Honokiol μειώθηκε σημαντικά την έκφραση των κυκλινών (D1 και Ε) και εξαρτώμενες από κυκλίνη κινάσες (Cdk2 και Cdk4), και προκάλεσε αύξηση των Cdk αναστολείς ρ21 και ρ27. Επιπλέον, η θεραπεία Honokiol οδήγησε σε αύξηση του Βαχ /Bcl-2 και Bax /Bcl-xL αναλογίες να ευνοήσει την απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος. Οι μεταβολές αυτές συνοδεύονται από βελτιωμένη κυτταροπλασματική συσσώρευση του ΝΡ-κΒ με ταυτόχρονη μείωση σε πυρηνικό κλάσμα και μειωμένη μεταγραφική δραστικότητα του ΝΡ-κΒ αποκρινόμενο υποκινητή. Αυτό συσχετίστηκε με μειωμένη φωσφορυλίωση του αναστολέα της άλφα κάπα Β (ΙκΒ-α) που προκαλεί τη σταθεροποίηση του και έτσι αυξημένα κυτταρικά επίπεδα. Σημαντικά, Honokiol ενίσχυσε επίσης τις κυτταροτοξικές επιδράσεις της γεμσιταβίνης, εν μέρει, με τον περιορισμό της gemcitabine επαγόμενη πυρηνική συσσώρευση του ΝΡ-κΒ στα επεξεργασμένα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Συνολικά, τα ευρήματα αυτά αποδεικνύουν, για πρώτη φορά, η δράση αναστολής αναπτύξεως της Honokiol στον καρκίνο του παγκρέατος και υποδεικνύουν πιθανή χρησιμότητα του ως νέου φυσικού παράγοντα σε πρόληψη και θεραπεία

Παράθεση:. Arora S, Bhardwaj Α, Srivastava SK, Singh S, McClellan S, Wang Β, et al. (2011) Honokiol συλλήψεις Cycle Cell, προκαλεί απόπτωση, και ενισχύει την κυτταροτοξική δράση του γεμσιταβίνη σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 6 (6): e21573. doi: 10.1371 /journal.pone.0021573

Επιμέλεια: Ντχιάνι Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 11, 2011? Αποδεκτές: 2 Ιουνίου, 2011? Δημοσιεύθηκε: 24 Ιουνίου του 2011

Copyright: © 2011 Arora et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την υποστήριξη επιχορήγηση από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας /Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (ΝΙΗ /NCI) (CA137513) και USAMCI. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια από τις πιο θανατηφόρες κακοήθειες στις Ηνωμένες Πολιτείες με ποσοστό θνησιμότητας αυξάνεται κάθε επόμενο έτος [1], [2]. Σύμφωνα με την εκτίμηση της American Cancer Society, 43140 Αμερικανοί είχαν διαγνωστεί με καρκίνο του παγκρέατος το 2010 και 36.800 έχασαν τη ζωή τους, τη σήμανση αυτή την κακοήθεια ως η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο [2]. Λόγω ασυμπτωματική πρόοδο της, ο καρκίνος του παγκρέατος έχει διαγνωστεί σε ένα στάδιο κατά το οποίο έχει ήδη κάνει μετάσταση ή τοπικά προχωρημένο [3]. Θεραπευτικές προσεγγίσεις κατά την προχωρημένη νόσο έχουν αποτύχει σε μεγάλο βαθμό και περίπου & gt? 80% των ασθενών που διαγιγνώσκονται με αυτή την κακοήθεια εξακολουθούν να πεθαίνουν μέσα σε 2-8 μήνες [4]. Η γεμσιταβίνη, ένα πρότυπο FDA εγκεκριμένο φάρμακο για παγκρεατικό θεραπεία του καρκίνου, έχει αναφερθεί ότι είναι ελάχιστα αποτελεσματική ότι βελτιώνει την επιβίωση του ασθενούς από δυο εβδομάδες μόνο [3], [5]. Συνεπώς, είναι υψίστης σημασίας για την ανάπτυξη εναλλακτικών θεραπευτικών αγωγών και στρατηγικές για την αποτελεσματική διαχείριση του καρκίνου του παγκρέατος.

Αρκετές νέες στρατηγικές, που στοχεύουν προαγωγής ανάπτυξης οδούς μόνη της και σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη, έχουν δοκιμαστεί σε καρκίνο του παγκρέατος να βελτίωση του θεραπευτικού αποτελέσματος [6]. Επιπλέον, αρκετές πρόσφατες μελέτες έχουν ταυτοποιήσει απορρυθμισμένη στοιχεία σηματοδότηση, όπως Ras, Akt, ΝΡ-κΒ, miRNAs, κλπ, που δεν προωθούν μόνο την πρόοδο του καρκίνου, αλλά και προσδίδουν χημειοαντίσταση στον καρκίνο του παγκρέατος [7] – [9]. Επαγωγή των αποτελεσμάτων αυτών οδών επιβίωσης από την ενεργοποίηση μεταλλάξεις γονιδίων, απώλεια ανασταλτικής οδών ή /και ενίσχυση μέσω αυτοκρινούς και παρακρινείς μηχανισμούς σηματοδότησης [3], [10]. Στην πραγματικότητα, έχει τώρα αποδειχθεί ότι η στόχευση ορισμένων από αυτούς τους κόμβους σηματοδότησης μπορεί να είναι χρήσιμες στην αναστολή της ανάπτυξης και της εξέλιξης του όγκου, καθώς και για την αποκατάσταση της ευαισθησίας των κυττάρων των όγκων στην κυτταροτοξική φάρμακα [3], [9], [10] .

φυσικά προϊόντα έχουν στο επίκεντρο της χημειοθεραπείας του καρκίνου για αρκετές δεκαετίες και στην πραγματικότητα, πάνω από το 60% των σημερινών αντικαρκινικά φάρμακα έχουν την καταγωγή τους από φυσικές πηγές [11]. Σε αρκετές πρόσφατες μελέτες, έχουν νέα φυτικής προέλευσης ενώσεις έχουν ταυτοποιηθεί να δρουν ως παράγοντες κατά του όγκου μέσω της διαφοροποίησης των βιολογικών οδών [12]. Honokiol, ένα βιολογικά ενεργό biphenolic ένωση που απομονώνεται από τα

Magnolia officinalis /grandiflora,

έχει λάβει σημαντική προσοχή λόγω της ισχυρής αντι-νεοπλασματικές και αντι-αγγειογενετική ιδιότητες [13], [14]. Έχει απέδωσε ελπιδοφόρα δεδομένα πάνω στο δέρμα, του παχέος εντέρου, του πνεύμονα και του μαστού [13], [15] – [17]. Η εντυπωσιακή πτυχή της Honokiol ως αντι-νεοπλασματική φάρμακο είναι το δυναμικό της να αναστέλλει πυρηνικού παράγοντα κάπα Β (ΝΡ-κΒ), η οποία σχετίζεται με την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και χημειοαντίσταση [9], [10], [18]. Το ΝΡ-κΒ ενεργοποιείται ιδιοσυστατικά σε μια ποικιλία αιματολογικών και στερεές κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παγκρέατος και ελέγχει την έκφραση μιας σειράς γονιδίων που εμπλέκονται σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση μέσω άμεσων και έμμεσων μηχανισμών [18] – [20]. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε, για πρώτη φορά, τα αποτελέσματα της Honokiol κατά του καρκίνου του παγκρέατος. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η Honokiol αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυτταρικών γραμμών ανθρώπινου παγκρεατικού, MiaPaCa και PANC1, προκαλώντας διακοπή του κυτταρικού κύκλου και η επαγωγή της απόπτωσης. Επιπλέον, η μελέτη μας παρέχει αποδείξεις για έναν ρόλο της Honokiol σε χημειοευαισθητοποιητικός τα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα να κυτταροτοξικά αποτελέσματα γεμκιταβίνης.

Αποτελέσματα

Ανάπτυξη ανασταλτική επίδραση της Honokiol σε ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

Δύο ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές δηλαδή. MiaPaCa και PANC1 χρησιμοποιήθηκαν ως ένα σύστημα μοντέλου για τη διερεύνηση της επίδρασης των Honokiol επί παγκρεατικού ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων. Κύτταρα κατεργασμένα με Honokiol (10-60 μΜ) έδειξαν μεταβολές στη μορφολογία σε σύγκριση με όχημα (DMSO) κύτταρα κατεργασμένα. Με την αύξηση της συγκέντρωσης του Honokiol, τα κύτταρα έγιναν στρογγυλά, συρρικνωμένο και αποκολλήθηκαν από το υπόστρωμα (Σχήμα 1Α), σε συνέπεια με μορφολογικές αλλαγές που σχετίζονται με την απόπτωση. Στη συνέχεια, μπορούμε ποσοτικοποιηθεί τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα του Honokiol μετρώντας τοις εκατό βιωσιμότητα χρησιμοποιώντας δοκιμασία WST-1. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι Honokiol προκάλεσε τη δόση και χρονικά εξαρτώμενη μείωση στην ανάπτυξη τόσο των παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές με IC

50 αξίες της ~43.25, 31.08 και 18.54 μΜ (κατά MiaPaCa), και ~47.44, 34.17 και 21.86 μΜ (κατά PANC1) μετά από 24, 48 και 72 θεραπείες h, αντίστοιχα (Εικόνα 1Β). Μαζί, αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι Honokiol έχει ανασταλτικές επιδράσεις επί της ανάπτυξης καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος.

(Α) και MiaPaCa PANC1 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 6 φρεατίων (1 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) και αφέθηκαν να επιτύχουν το 70-80% συρροή πριν από την Honokiol (10-60 μΜ) αγωγή για 48 ώρες. Μετά την αγωγή, σημαντική αλλαγή στην κυτταρική μορφολογία παρατηρήθηκε τόσο των κυτταρικών τύπων, όπως εξετάζεται με μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. Κύτταρα έγινε στρογγυλό, συρρικνωμένο και αποσπάται από την επιφάνεια των κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Αντιπροσωπευτικά μικρογραφήματα είναι από ένα από τα τυχαία οπτικά πεδία (μεγέθυνση 200Χ) των κυττάρων σε επεξεργασία με 20, 40 ή 60 μΜ Honokiol. (Β) MiaPaCa και PANC1 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 96 κυψελίδες πλακών μικροτίτλου διαλύματος (1 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με Honokiol (10-60 μΜ) στους 70-80% συρροή. Ποσοστό βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με WST-1 προσδιορισμό μετά από 24, 48 και 72 ώρες. Μία τιμή OD κυττάρων ελέγχου (αγωγή με ίσο όγκο DMSO, τελική συγκέντρωση, & lt? 0,1%) ελήφθη ως 100% βιωσιμότητα. Honokiol ανέστειλε την κυτταρική βιωσιμότητα σε μια δόση και χρονικά εξαρτώμενο τρόπο τόσο για τους κυτταρικούς τύπους που υποδηλώνει δράση κατά των όγκων του Honokiol. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD? (N = 3).

Η

Honokiol προκαλεί G

1 φάση διακοπή του κυτταρικού κύκλου και διεγείρει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος

Καταστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων μπορεί να προκληθεί είτε από τη σύλληψη της προόδου του κυτταρικού κύκλου ή λόγω της επαγωγής της απόπτωσης ή αμφοτέρων [12]. Τα δεδομένα μας σχετικά με την κατανομή του κυτταρικού κύκλου έδειξαν ότι η θεραπεία με Honokiol οδήγησε σε εμπλουτισμό των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων σε G

1 φάση με ταυτόχρονη μείωση του αριθμού των κυττάρων σε φάση S (πολλαπλασιαστική κλάσμα) (Σχήμα 2). Παρατηρήσαμε μια μείωση ~1.28, 2,16 και 2,46 πτυχώσεις (σε MiaPaCa) και ~1.08, 1,53 και 1,93 πτυχώσεις (σε PANC1) σε αριθμό κυττάρων σε S-φάση στα 20, 40 και 60 μΜ δόσεις Honokiol, αντίστοιχα (Σχήμα 2 ). Σε προσδιορισμούς απόπτωσης, τα δεδομένα μας έδειξαν μια σημαντική αύξηση αποπτωτικό δείκτη (ΡΕ αννεξίνης V θετική /7ΑΑΌ αρνητικά κύτταρα) σε μία δοσο-εξαρτώμενο τρόπο μετά από 24 ώρες θεραπείας Honokiol (Σχήμα 3). Στα 20, 40 και 60 μΜ συγκεντρώσεις Honokiol, παρατηρήσαμε ~1.25, 2,04 και 3,96 πτυχώσεις αύξηση αποπτωτικών δεικτών MiaPaCa και ~1.34, 1,98 και 3,32 πτυχώσεις αυξάνουν σε αποπτωτικά δείκτες κυττάρων PANC1, αντίστοιχα. Συνολικά, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι Honokiol έχει τόσο κυτταροστατικά και κυτταροτοξικές ιδιότητες κατά του καρκίνου του παγκρέατος κυττάρων.

MiaPaCa και Panc1cells (1 × 10

6 κύτταρα /φρεάτιο) συγχρονίστηκαν με καλλιέργεια σε μέσο ελεύθερο ορού για 72 ώρες , που ακολουθείται από επώαση σε μέσο που περιέχει ορό επί 24 ώρες και εν συνεχεία αγωγή με είτε Honokiol (20, 40 ή 60 μΜ) ή DMSO (έλεγχος) επί 24 ώρες. Κατανομή των κυττάρων σε διάφορα στάδια του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) χρώση ακολουθούμενη από κυτταρομετρία ροής. Ενισχυμένη συσσώρευση κυττάρων MiaPaCa και PANC1 στο G

1 φάση του κυτταρικού κύκλου παρατηρήθηκε μετά από αγωγή με Honokiol με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (όπως υποδεικνύεται από ιστογράμματα ροής) με ταυτόχρονη μείωση σε κύτταρα S-φάσης.

MiaPaCa και PANC1 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (1 χ 10

6 κύτταρα /φρεάτιο) και αφέθηκαν να επιτύχουν συρροή 70-80%. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με Honokiol (20, 40 ή 60 μΜ) ή DMSO (έλεγχος) για 24 ώρες και στη συνέχεια βάφονται με 7-AAD και ΡΕ αννεξίνης V που ακολουθείται από κυτταρομετρία ροής. Το κάτω αριστερά τεταρτημόρια κάθε πάνελ δείχνουν τα βιώσιμα κύτταρα (αρνητικός για τα δύο, ΡΕ αννεξίνης V και 7-AAD). Τα πάνω δεξιά τεταρτημόρια περιέχουν νεκρωτικό ή αργά αποπτωτικά κύτταρα (θετικά και για τις δύο, ΡΕ Annexin V και 7-AAD). Οι κάτω δεξιά τεταρτημόρια αντιπροσωπεύουν τις αρχές του αποπτωτικών κυττάρων (PE Αννεξίνη V θετική και 7-AAD αρνητικά). Τα δεδομένα δείχνουν μία δοσο-εξαρτώμενη αύξηση στον αριθμό αποπτωτικών κυττάρων σε αμφότερες κύτταρα MiaPaCa και PANC1 μετά τη θεραπεία με Honokiol σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου, υποδεικνύοντας apoptotis δυναμικό της Honokiol επαγωγής.

Η

Honokiol μεταβάλλει την έκφραση του κυτταρικού κύκλου και πρωτεϊνών που σχετίζονται με την επιβίωση

για να διερευνηθεί η μηχανιστική βάση των ανασταλτικών της ανάπτυξης επιδράσεις του Honokiol, εξετάσαμε έπειτα η επίδρασή του στην έκφραση των βασικών πρωτεϊνών που εμπλέκονται στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση. Τα δεδομένα μας αποκάλυψε μια δοσο-εξαρτώμενη μείωση στην έκφραση των κυκλινών (D1 και Ε) και εξαρτώμενες από κυκλίνη κινάσες (Cdk2 και Cdk4)? ενώ μια επαγόμενη έκφραση των αναστολέων εξαρτώμενης από κυκλίνη κινάσης (ρ21 και ρ27) παρατηρήθηκε μετά από αγωγή Honokiol τόσο MiaPaCa και PANC1 παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 4). Μεταξύ των πρωτεϊνών επιβίωση, παρατηρήσαμε μια εξαρτώμενη από τη δόση μείωση στα επίπεδα των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 και Bcl-xL, ενώ μια συνακόλουθη αύξηση στο επίπεδο του προ-αποπτωτική πρωτεΐνη παρατηρήθηκε Βαχ (Εικόνα 5Α) που οδηγεί σε μια αύξηση στην αναλογία του Βαχ /Bcl-2 (Σχήμα 5Β, άνω πάνελ) και Bax /Bcl-xL (Σχήμα 5Β, κάτω πάνελ). Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι Honokiol μεταβάλλει την έκφραση των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης για να προσδώσει ανασταλτική της ανάπτυξης δράση του.

παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (MiaPaCa και PANC1) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με είτε Honokiol (20, 40 ή 60 μΜ) ή DMSO (έλεγχος) επί 24 ώρες. Η συνολική πρωτεΐνη απομονώθηκε και υποβλήθηκε σε ανάλυση ανοσοστυπώματος για πρωτεΐνες κύκλο που σχετίζεται με διάφορες κυτταρικές (κυκλίνη D1, κυκλίνη Ε, CDK2, CDK4, ρ21 και ρ27). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Εντάσεις των ανοσοαντιδραστικές ζώνες ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία. Οι Κανονικοποιημένη πυκνομετρική τιμές υποδεικνύονται στην κορυφή των ζωνών που παρουσιάζουν μια δοσο-εξαρτώμενη μείωση στην έκφραση της κυκλίνης D1, κυκλίνη Ε, Cdk2 και CDK4 και αύξηση στην έκφραση των αναστολέων κυκλίνης? ρ21 και ρ27, μετά από έκθεση σε Honokiol, και στις δύο κυτταρικούς τύπους.

Η

(Α) και MiaPaCa PANC1 κύτταρα επεξεργάστηκαν είτε με Honokiol (20, 40 ή 60 μΜ) ή DMSO (έλεγχος) για 24 h. Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη για Bcl-XL, Bcl-2 και Bax πρωτεΐνες που ακολουθείται από πυκνομετρία ανοσοαντιδραστικές ζώνες. Οι κανονικοποιημένες πυκνομετρικές τιμές που υποδεικνύονται στην κορυφή των ζωνών. (Β) διάγραμμα Bar στην οποία συνοψίζονται τα αποτελέσματα της θεραπείας Honokiol σε αναλογία Bax /Bcl-2 (άνω τμήμα) και η αναλογία Bax /Bcl-xL (κάτω πίνακας). Τα δεδομένα δείχνουν ότι Honokiol προκαλεί απόπτωση με προς τα πάνω ρύθμιση προ-αποπτωτικών Βαχ και προς τα κάτω ρύθμιση των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 και Bcl-xL.

Η

Honokiol εξασθενεί την συστατική ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σε ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

ΝΡ-κΒ είναι ουσιαστικά δραστική σε πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παγκρέατος [18] – [20] και έχει δειχθεί ότι η ενεργοποίηση αυτού του κόμβου σηματοδότησης διευκολύνει την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου [21] και αποπτωτικά αντίσταση [22 ]. Συνεπώς, διερευνήσαμε αν η θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος κυττάρων με Honokiol έχει επιπτώσεις στην ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Εξετάσαμε πρώτα την επίδραση της Honokiol στην μεταγραφική δραστικότητα του ΝΡ-κB- αποκρίνεται προαγωγό σε μία δοκιμασία λουσιφεράσης. Τα δεδομένα μας έδειξαν μια δοσοεξαρτώμενη μείωση στην μεταγραφική δραστικότητα του ΝΡ-κΒ (~1.40, 2,08 και 4,0 πτυχώσεις MiaPaCa, και ~1.29, 1,96 και 5,26 πτυχώσεις σε PANC1 κύτταρα) σε 20, 40 και 60 μΜ της θεραπείας Honokiol, αντίστοιχα (Σχήμα 6Α). Για να υποστηρίξει περαιτέρω αυτή την παρατήρηση, μελετήσαμε την επόμενη την κυτταρική εντόπιση (κυτταροπλασματική εναντίον των πυρηνικών) p65 υπομονάδας του NF-κΒ. δεδομένα ανοσοκηλίδος μας έδειξαν ότι Honokiol θεραπεία προκάλεσε μια αξιοσημείωτη και εξαρτώμενη από τη δόση μείωση στα επίπεδα ΝΡ-κΒ στον πυρηνικό κλάσμα των δύο παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα MiaPaCa και PANC1 με ταυτόχρονη αύξηση στο κυτταροπλασματικό κλάσμα (Σχήμα 6Β). Κυτταρική κατανομή του ΝΡ-κΒ ελέγχεται από σχετική έκφραση της βιολογικής ΙκΒ αναστολέα της, η οποία διατηρεί ΝΡ-κΒ απορροφάται σε κυτόπλασμα σε ανενεργό σύμπλοκο [23]. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε τα κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα των κυττάρων του καρκίνου του παγκρέατος Honokiol επεξεργασμένο για τον προσδιορισμό του επιπέδου ΙκΒ-α. Τα δεδομένα μας έδειξαν μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στο επίπεδο του ΙκΒ-α κατά Honokiol-αγωγή (Σχήμα 6Β). Αυτό συσχετίστηκε με μια συνακόλουθη μείωση στην φωσφορυλίωση ΙκΒ-α που δείχνει αυξημένη σταθεροποίηση της ΙκΒ-α μετά από έκθεση σε Honokiol. Συνολικά, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι Honokiol καταστέλλει συστατική ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα.

(Α) και MiaPaCa Panc1cells (0.5 × 10

6 κύτταρα /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκα 12 φρεατίων . Την επόμενη μέρα σε 60% συρροή, τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με ανταποκριτή λουσιφεράσης NF-κΒ και ΤΚ-λουσιφεράση της Renilla (έλεγχος) πλασμίδια. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Honokiol (20, 40, ή 60 μΜ) για την επόμενη 24 ώρες. λύματα πρωτεΐνης έγιναν και λουσιφεράσης (Fire-fly? δοκιμών και Renilla, επιμόλυνση έλεγχο της αποτελεσματικότητας) δραστηριότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα διπλής λουσιφεράσης δοκιμασία. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως κανονικοποιημένη πολλαπλή μεταβολή στη δραστικότητα λουσιφεράσης (μέση ± SD? Η = 3, * ρ & lt? 0,05). (Β) Total, πυρηνικά και κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν από κύτταρα κατεργασμένα με Honokiol (20, 40, ή 60 μΜ) για 6 ώρες και η έκφραση του ΝΡ-κΒ /p65, ρ-ΙκΒ-α (S32 /36) και IκB- α προσδιορίστηκε με ανάλυση κηλίδας Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Εντάσεις των ανοσοαντιδραστικές ζώνες ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία. Οι τιμές Κανονικοποιημένη πυκνομετρία υποδεικνύεται στην κορυφή των ζωνών υποδεικνύει μειωμένη εντοπισμός του ΝΡ-κΒ /p65 στον πυρήνα με μια συνακόλουθη αύξηση της κυτταρόπλασμα. Σε αντίθεση, η έκφραση του ρ-ΙκΒ-α μειώθηκε οδηγώντας σε αυξημένα επίπεδα της ΙκΒ-α. Συνολικά, τα στοιχεία αυτά δείχνουν σαφώς ότι Honokiol αναστέλλει τη δράση του NF-κΒ μέσω της σταθεροποίησης της ΙκΒ-α.

Η

Honokiol chemosensitizes τα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα για την τοξικότητα γεμσιταμπίνη

Γεμσιταβίνη είναι το μόνο FDA- εγκεκριμένο χημειοθεραπευτικό φάρμακο κατά του καρκίνου του παγκρέατος? Ωστόσο, παραμένει ελάχιστα αποτελεσματική λόγω χημειοαντίσταση [3], [5], [10]. Δεδομένου ότι η ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ θεωρείται ως ένας από τους μηχανισμούς ενισχυτικά χημειοαντίσταση, εξετάσαμε αν Honokiol θα λειτουργούσε ως χημειοευαισθητοποιητή σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (MiaPaCa και PANC1) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με μόνη ή σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη σε υπο-IC

50 συγκεντρώσεις Honokiol και επίδραση στην αναστολή της ανάπτυξης εξετάστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι γεμσιταμπίνη ανέστειλε την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος σε έναν δοσοεξαρτώμενο τρόπο και συνδυασμένη θεραπεία με Honokiol οδήγησε σε σημαντική μείωση του IC

50 γεμσιταβίνης (Σχήμα 7Α). Στα 10 και 20 μΜ δόσεις Honokiol, αντίστοιχα, ένα ~1.53 και 2,41 φορές (σε MiaPaCa) και ~1.40 και 2,08 φορές (σε PANC1) μείωση IC

50 γεμσιταβίνης παρατηρήθηκε σηματοδοτεί την χημειοευαισθητοποιητική επίδραση του Honokiol (Εικόνα 7Α). Για τον εντοπισμό ένα ρόλο του ΝΡ-κΒ, εξετάσαμε την κυτταρική εντόπιση του στην γεμκιταβίνη (μόνη ή σε συνδυασμό με Honokiol) επεξεργασμένων με παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Τα δεδομένα μας εμφανίζεται μια βελτιωμένη συσσώρευση του ΝΡ-κΒ σε πυρηνικό διαμέρισμα και μια συνακόλουθη μείωση στην κυτταροπλασματική κλάσμα με αυξανόμενες δόσεις γεμσιταβίνης τόσο MiaPaCa και κυττάρων PANC1 (Σχήμα 7Β). Αξίζει να σημειωθεί ότι, παρατηρήσαμε ότι Honokiol (ακόμη και στα 20 δόση μΜ) ήταν αποτελεσματική στην αναστολή της gemcitabine επαγόμενη ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σε δύο κύτταρα MiaPaCa και PANC1 (Σχήμα 7C). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν σαφώς ότι Honokiol ενισχύει την αποτελεσματικότητα κατά του όγκου της γεμσιταβίνης ενεργώντας ως χημειο-ευαισθητοποιητής σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα.

(Α) και MiaPaCa PANC1 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 96 κυψελίδες πλακών μικροτίτλου διαλύματος (1 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο). Σε υπο-συρροής, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με γεμκιταβίνη (1,25 έως 40 μΜ) μόνη ή σε συνδυασμό με Honokiol (10 ή 20 μΜ) για 48 ώρες. Η επί τοις εκατό βιωσιμότητα μετρήθηκε με WST-1 προσδιορισμό. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως επί τοις εκατό σε σχέση βιωσιμότητα σε σχέση με μη επεξεργασμένα ή Honokiol μόνο-επεξεργασμένα κύτταρα για τον έλεγχο για τις επιδράσεις καταστολής της ανάπτυξης του Honokiol (μέση ± SD? η = 3. *, ρ & lt? 0,05). Μια σημαντική μείωση στο IC

50 αξίες της γεμσιταβίνης παρατηρήθηκε σε κύτταρα συν-επεξεργασία με Honokiol. (Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με γεμκιταβίνη (5, 10 και 20 μΜ) για 6 ώρες και η έκφραση του ΝΡ-κΒ /p65 σε πυρηνικά, κυτταροπλασματικά και συνολικό προϊόντα λύσης κυττάρου προσδιορίστηκε με ανάλυση κηλίδας Western. θεραπεία γεμσιταβίνη των κυττάρων οδήγησε σε ενισχυμένη πυρηνική συσσώρευση του ΝΡ-κΒ /p65 σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο (C) Πυρηνικές και κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν από κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με γεμσιταβίνη (10 μΜ), Honokiol (20 μΜ) μόνη ή σε συνδυασμό για 6 h. Η έκφραση του ΝΡ-κΒ /p65 σε προϊόντα λύσης των πυρηνικών, κυτταροπλασματική και η συνολική κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση κηλίδας Western. Τα στοιχεία δείχνουν ότι Honokiol συν-θεραπεία περιορίζεται γεμσιταβίνη που προκαλείται από NF-κΒ /p65 πυρηνική συσσώρευση. Μαζί, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι Honokiol λειτουργεί ως χημειοευαισθητοποιητή και αυξάνει τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα της γεμσιταβίνης στον καρκίνο του παγκρέατος.

Η

Συζήτηση

Ο καρκίνος του παγκρέατος παραμένει μια καταστροφική κακοήθεια εξαιτίας της έλλειψης αποτελεσματικής θεραπείας για τη θεραπεία [3]. Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι Honokiol (ένα φυσικό biphenolic ένωση) είναι αποτελεσματική στην καταστολή της ανάπτυξης των ανθρώπινων παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων (MiaPaCa και PANC1) λόγω κυτταροστατικές και κυτταροτοξικές ιδιότητες. Επιπλέον, μελέτες μας παρέχονται αποδείξεις για έναν ρόλο της Honokiol σε χημειοευαισθητοποιητικός τα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε τοξικότητα gemcitabine. Honokiol ανέστειλε δραστικότητα ΝΡ-κΒ και προκάλεσε αλλαγμένη έκφραση της επιβίωσης που σχετίζονται πρωτεΐνες για να προσδώσει ανάπτυξη κατασταλτικό της και χημειοευαισθητοποιητική επιδράσεις σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα πολλών κυτταρικού κύκλου και.

Η απορρύθμιση της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων αποδίδεται συχνά σε απώλεια του ελέγχου σε πολλαπλασιαστική και αποπτωτικών οδών [24]. Στην πραγματικότητα, οι μοριακές μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι η έκφραση των ρυθμιστικών του κυτταρικού κύκλου και πρωτεϊνών που σχετίζονται με την κυτταρική επιβίωση συχνά μεταβάλλεται σε πολλαπλούς ανθρώπινους καρκίνους [25] – [27]. κυτταρικού κύκλου ρυθμίζεται από συντονισμένες δράσεις των κυκλινών, εξαρτώμενες από κυκλίνη κινάσες (CDKs) και αναστολείς Cdks [26], [28]. Παρατηρήσαμε ότι η θεραπεία των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων με Honokiol οδήγησε σε G

1-φάση σύλληψη πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, μαζί με μείωση της κυκλίνης D1, κυκλίνη Ε, Cdk2 και CDK4 και αύξηση των ρ21 και ρ27 σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Κυκλίνης D1 και καταλυτική εταίρο της Cdk4 κυριαρχήσει στην G

1 φάση, ενώ, κυκλίνη Ε και πολύπλοκες Cdk2 ρυθμίζει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου από το G

1 έως S [26], [28]. Συνεπώς, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η Honokiol επαγόμενη σύλληψη του παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε G

φάση του κύκλου 1 κύτταρο μπορεί να προκαλείται μέσω της προς τα κάτω ρύθμιση κυκλινών και Cdks μαζί με την προς τα πάνω ρύθμιση των πρωτεϊνών ρ21 και ρ27, που σχηματίζουν ετεροτριμερή σύμπλοκα με G

1-S Οι cdks και κυκλίνες να αναστέλλουν τη δράση τους [29]. Αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες για την επίδραση του Honokiol σε ανθρώπινα λεμφοειδή λευχαιμία, πλακώδους καρκίνου των πνευμόνων και κύτταρα καρκίνου του μαστού [16], [17], [30].

Μετά G

1- φάση αναστολή του κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα μπορούν είτε να υποβάλλονται σε επισκευή ή πληκτρολογήστε το αποπτωτικό μονοπάτι για τη διατήρηση κυτταρική ακεραιότητα και την εξάλειψη των έσφαλε /μεταλλαγμένα προ-κακοήθη και νεοπλασματικών κυττάρων [31]. Έτσι, η επαγωγή της απόπτωσης είναι ένας από τους μηχανισμούς προστασίας κατά την έναρξη του καρκίνου και την εξέλιξη και τα καρκινικά κύτταρα έχουν συχνά αποκτήσει αντοχή σε απόπτωση [24]. Στην παρούσα μελέτη, παρατηρήσαμε σημαντική επαγωγή απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος Honokiol επεξεργασμένα υποδεικνύοντας ότι Honokiol είναι σε θέση να ενισχύει την αποπτωτική μηχανημάτων. Η επιβίωση των κυττάρων διατηρείται από μια λεπτή ισορροπία των λόγων των προ-αποπτωτικών (π.χ. Bad και Bax) και αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών (π.χ., Bcl-2 και Bcl-XL), η οποία ελέγχει τη διαδικασία της απόπτωσης μέσω της απελευθέρωσης των κασπασών [ ,,,0],32], [33]. Ως εκ τούτου, αλλαγμένη έκφραση των πρωτεϊνών της οικογένειας Bcl-2 που παρατηρείται κατά την κατεργασία Honokiol παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων κατά τρόπο που να ευνοεί την αύξηση των λόγων του Βαχ /Bcl-2 και Bax /Bcl-xL μπορούσε διέπουν την παρατηρηθείσα αποπτωτικό αποτέλεσμα Honokiol. Απορρύθμιση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την απόπτωση έχει επίσης αναφερθεί σε κύτταρα χονδροσαρκώματος μετά την επεξεργασία Honokiol υποστηρίζοντας περαιτέρω το ρόλο της στην επαγωγή απόπτωσης [34].

Επίσης παρατηρήσαμε αναστολή της δραστηριότητας του ΝΡ-κΒ κατά την κατεργασία Honokiol, η οποία σχετίζεται με αναστολή της φωσφορυλίωσης ΙκΒ-α και ταυτόχρονη αύξηση στην έκφραση του. παράγοντα μεταγραφής ΝΡ-κΒ ενεργοποιείται ιδιοσυστατικά σε πολλαπλές κακοήθειες και έχει αναφερθεί ότι εμπλέκονται παθολογικά σε παγκρεατικού καρκίνου [18] – [20]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η ανάπτυξη-κατασταλτική δράση του Honokiol στον προστάτη και του κόλου μεσολαβείται μέσω της αναστολής του ΝΡ-κΒ [35]. Ο παράγοντας μεταγραφής ΝΡ-κΒ αποτελείται από ετεροδιμερή που αποτελούνται από Rel (p65, c-Rel και RelB), ρ52, και πρωτεΐνες ρ50 και εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα σε αδρανή μορφή της, σε σύμπλοκο με ΙκΒ (αναστολέας του ΝΡκΒ που αποτελείται από α και β υπομονάδες οι οποίες μάσκες σήμα πυρηνικού εντοπισμού του [36]. η ενεργοποίηση του NF-κΒ προκαλείται, όταν ΙκΒ-α παίρνει φωσφορυλιώνονται από ΙΚΚ (κινάση αναστολέα) σύμπλεγμα που οδηγεί σε ουβικιτινίωση και την υποβάθμιση του. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση του ΝΡκΒ από τα κυτταρόπλασμα και μεταφορά στον πυρήνα που ακολουθείται από την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ-αποκρινόμενο υποκινητή. NF-κΒ είναι γνωστό ότι επάγει την έκφραση της κυκλίνης D1, Bcl-2 και Bcl-xL (αλλοιωθεί κατά την κατεργασία Honokiol στην τρέχουσα μελέτη) μαζί με μια σειρά πρωτεϊνών που εμπλέκονται στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση [37], [38]. Ως εκ τούτου, μπορεί να προταθεί ότι η καταστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος με Honokiol μεσολαβείται μέσω της αναστολής του ΝΡ-κΒ.

Κλινική έκβαση σε καρκίνο του παγκρέατος παρέμεινε φτωχή λόγω των προηγμένων και μεταστατική κατάσταση της νόσου κατά τη στιγμή της διάγνωσης και την αναποτελεσματικότητα των επιτρεπόμενων φάρμακο θεραπείας λόγω χημειοαντίσταση [3], [5], [10]. Επί του παρόντος, γεμσιταμπίνη είναι το εθνικό πρότυπο χημειοθεραπευτικό φάρμακο για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος. Η γεμσιταβίνη παρεμβαίνει με τη σύνθεση του DNA που οδηγούν σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης σε τελική πορεία [39], [40]. Ένας από τους μηχανισμούς που περιορίζει την αποτελεσματικότητα γεμσιταβίνη επάγεται ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σε απόκριση σε θεραπεία του [41], η οποία μπορεί να προκαλέσει καθυστέρηση αποπτωτικά ή καταστολής. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε χημειοευαισθητοποιητική επίδραση του Honokiol επί παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε τοξικότητα gemcitabine. Επιπλέον, δείξαμε ότι η αγωγή με gemcitabine επαγόμενη πυρηνική συσσώρευση του ΝΡ-κΒ, η οποία θα μπορούσε να ανασταλεί αποτελεσματικά με συν-κατεργασία με Honokiol. Αυτές οι παράλληλες ευρήματα δείχνουν ότι η αναστολή της δραστηριότητας του ΝΡ-κΒ μπορεί επίσης να μεσολαβήσει στην χημειοευαισθητοποίηση παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων με Honokiol. Πράγματι, έχει αναφερθεί προηγουμένως ότι αντικαρκινικές επιδράσεις χημειοθεραπευτικών παραγόντων μπορεί να ενισχυθεί από την αναστολή της δραστικότητας του ΝΡ-κΒ [22], [41].

Συμπερασματικά, έχουμε δείξει, για πρώτη φορά , η ανασταλτική της ανάπτυξης και χημειοευαισθητοποιητική δυναμικό των Honokiol στον καρκίνο του παγκρέατος. Honokiol προκαλεί G

1 φάση διακοπή του κυτταρικού κύκλου και η επαγωγή απόπτωσης με μεταβολή της έκφρασης των πρωτεϊνών που σχετίζονται επιβίωση του κυτταρικού κύκλου και. Η αναστολή της ΝΡ-κΒ μπορεί να είναι ένα από τα σημαντικά μηχανισμών Honokiol επαγόμενη κατασταλτική της ανάπτυξης και χημειοευαισθητοποιητική επιδράσεις σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Επομένως, πιστεύουμε ότι Honokiol θα μπορούσε να είναι ένας νέος ελπιδοφόρος φυσικό παράγοντα για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος και μπορεί επίσης να χρησιμεύσει ως ένα χημειοευαισθητοποιητή για τη βελτίωση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας της γεμσιταβίνης, η οποία είναι ήδη σε κλινική χρήση ως ένα θεραπευτικό φάρμακο.

υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle (DMEM) και Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) μέσο ελήφθησαν από Thermo Scientific (Logan, UT). Εμβρυϊκή-ορού βοός (FBS) ήταν από την Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA). Πενικιλίνη, στρεπτομυκίνη και τρυψίνη-ΕϋΤΑ αγοράσθηκαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA). Honokiol είχε αγοραστεί από LKT Laboratories (St. Paul, MN). Gemcitabine δόθηκε από USAMCI φαρμακείο. FuGENE αντιδραστήριο επιμόλυνσης, φωσφατάση /κοκτέιλ αναστολέων πρωτεάσης και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων αντιδραστήριο WST-1 που προμηθεύονται από την Roche Diagnostics (Mannheim, Germany). Ιωδιούχο προπίδιο /ρυθμιστικό χρώσης RNAse και κιτ ανίχνευσης απόπτωσης ΡΕ αννεξίνης V αγοράστηκαν από BD Bioscience (San Diego, CA). κιτ πυρηνική εκχύλισμα που προμηθεύονται από το Active Motif, LLC (Carlsbad, CA). Αντισώματα έναντι Bcl-2, Βαχ και ρ-ΙκΒ-α (Ser32 /36) (κουνέλι πολυκλωνικό), Bcl-XL και NF-κΒ /ρ65 (μονοκλωνικά κουνέλι) και ΙκΒ-α (ποντικού μονοκλωνικό) ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Αντισώματα έναντι ρ21, CDK4 (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού), ρ27, κυκλίνη D1, κυκλίνη Ε, Cdk2 (κουνελιού πολυκλωνικό), και συζευγμένο με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα χρένο προμηθεύτηκε από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). β-ακτίνης (ποντικού μονοκλωνικό) αντίσωμα αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). ECL συν δυτική κιτ ανίχνευσης κηλίδωση που προμηθεύονται από την Thermo Scientific. pGL4.32 [luc2P /ΝΡ-κΒ-RE /Hygro] πλασμίδιο, ρΡΙ_-ΤΚ πλασμιδίου και κιτ διπλής λουσιφεράσης σύστημα προσδιορισμού ήταν από την Promega (Madison, WI).

Κυτταρική καλλιέργεια και θεραπείες

Τα ανθρώπινα παγκρεατικά κυτταρικές σειρές MiaPaCa και PANC1 (ATCC, Manassas, VA) διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια όπως προσκολλημένα μονοστιβάδα σε RPMI-1640 και DMEM αντίστοιχα, συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) FBS, πενικιλλίνη (100 μονάδες /ml) και στρεπτομυκίνη (100 μg /mL). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε 5% CO

2 υγροποιημένο επωαστήρα στους 37 ° C. μέσο ανάπτυξης άλλαξε κάθε 3 ημέρες και τα κύτταρα χωρίστηκαν (1:03) όταν έφτασαν 80% συρροή. Για θεραπείες, στοκ διάλυμα Honokiol (10 mmol /L) παρασκευάστηκε σε DMSO, φυλαγμένο στους -20 ° C, και αραιώνεται με φρέσκο ​​πλήρες μέσο αμέσως πριν τη χρήση. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις Honokiol μόνο, gemcitabine μόνες ή σε συνδυασμό (όπως ορίζεται στις λεζάντες σχήμα). Ένας ίσος όγκος DMSO (τελική συγκέντρωση, & lt? 0,1%) προστέθηκε στον έλεγχο

Η ανάπτυξη των κυττάρων δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων (1 χ 10

4. κύτταρα /φρεάτιο) μία ημέρα πριν από τη θεραπείες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων στα επεξεργασμένα κύτταρα εξετάστηκε μετά 24-72 ώρες με τη χρήση WST-1 (4- [3- (4-ιωδοφαινυλ) -2- (4-νιτροφαινυλ) -2Η-5-τετραζολιο] -1, 3-βενζόλιο δι-σουλφονικό) κιτ δοκιμασίας σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή με κατάλληλους ελέγχους. Αυτή η δοκιμασία βασίζεται στη διάσπαση του WST-1 σε μεταβολικώς δραστικά κύτταρα να σχηματίσουν υδατοδιαλυτά φορμαζάνης. Η απορρόφηση της φορμαζάνης μετρήθηκε σε μήκος κύματος 450 nm, με αφαίρεση του υποβάθρου στα 630, χρησιμοποιώντας αναγνώστη Benchmark μικροπλάκας Βίο-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Ανάπτυξης υπολογίστηκε ως εκατοστιαία βιωσιμότητα = [(Α /Β) χ 100], όπου Α και Β είναι η απορρόφηση των επεξεργασμένων και ελέγχου κύτταρα, αντίστοιχα.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Η επίδραση του Honokiol θεραπεία για την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ). Εν συντομία, τα κύτταρα (1 χ 10

6 κύτταρα /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε 6 πλάκα καλά και συγχρονίζεται με καλλιέργεια αυτών σε μέσο ελεύθερο ορού. Μετά από 48 ώρες, το μέσο αντικαταστάθηκε με πλήρες μέσο που περιέχει τις επιθυμητές συγκεντρώσεις του Honokiol ή DMSO. Πλωτή και προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 24 ώρες της θεραπείας και μονιμοποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο, χρησιμοποιώντας ΡΙ RNase ρυθμιστικού /χρώση για 1 ώρα στους 37 ° C. Βιτρώ κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής σε ένα BD-FACS Canto ™ II (Becton-Dickinson, San Jose, CA) για τον υπολογισμό του ποσοστού του πληθυσμού των κυττάρων σε διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου, χρησιμοποιώντας το λογισμικό Mod Fit LT (Verity Software House, Topsham