Αφηρημένο

Η χημειοθεραπεία ή /και ακτινοθεραπεία χρησιμοποιούνται ευρέως ως θεραπείες για τον καρκίνο, αλλά τα αποτελέσματα κατά των όγκων που παράγουν μπορεί να είναι ενισχύεται όταν συνδυάζεται με ανοσοθεραπείες. Η χημειοθεραπεία σκοτώνει τα καρκινικά κύτταρα, αλλά απελευθερώνει επίσης αντιγόνο όγκου και επιτρέπει την εγκάρσια παρουσίαση του αντιγόνου όγκου για να προκαλέσει αντιγονο-ειδικών μεσολάβηση κυττάρων ανοσολογικές αποκρίσεις. Προώθηση ανοσοαποκρίσεις CD4 + Τ βοηθητικών κυττάρων μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να ενισχύσει την εγκάρσια παρουσίαση του αντιγόνου του όγκου μετά από χημειοθεραπεία. Η λεκάνη HLA-DR δέσμευσης επιτόπου (PADRE πεπτίδιο) είναι σε θέση να παράγει αντιγόνου-ειδικών CD4 + Τ κυττάρων που δεσμεύονται διάφορα μόρια τάξης MHC II με υψηλή συγγένεια και έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως σε συνδυασμό με εμβόλια για την βελτίωση της ισχύος τους με την ενίσχυση αποκρίσεις CD4 + Τ κυττάρων . Εδώ, ερευνήσαμε αν ενδοογκική ένεση PADRE και το ανοσοενισχυτικό CpG σε HPV16 Ε7-εκφράζοντα TC-1 όγκους μετά σισπλατίνη χημειοθεραπεία μπορεί να οδηγήσει σε ισχυρές επιδράσεις κατά του όγκου και του αντιγόνου-ειδική μεσολάβηση κυττάρων ανοσολογικές αποκρίσεις. Παρατηρήσαμε ότι η θεραπεία με τα τρία παράγοντες παράγονται τα πιο ισχυρά αποτελέσματα κατά του όγκου σε σύγκριση με συνδυασμούς κατά ζεύγη. Επιπλέον, η θεραπεία με σισπλατίνη, CpG και PADRE ήταν σε θέση να ελέγξει όγκους σε μία απομακρυσμένη θέση, υποδεικνύοντας ότι η προσέγγισή μας είναι σε θέση να προκαλεί διασταυρούμενη παρουσίαση του αντιγόνου του όγκου. Η θεραπεία με σισπλατίνη, CpG και PADRE ενίσχυσαν επίσης τη δημιουργία ΡΑϋΚΕ-ειδικά CD4 + Τ κύτταρα και Ε7-ειδικά CD8 + Τ κυττάρων και μείωσε τον αριθμό των MDSCs σε τόπους του όγκου. Η θεραπευτική αγωγή που παρουσιάζεται εδώ αποτελεί μια καθολική προσέγγιση για τον έλεγχο του καρκίνου

Παράθεση:. Song L, Yang MC, Knoff J, Wu TC, Hung CF (2014) Cancer ανοσοθεραπεία Χρησιμοποιεί μια καινοτόμο στρατηγική για την ενίσχυση των CD4 + Τ κυττάρων Βοήθεια στο μικροπεριβάλλον του όγκου. PLoS ONE 9 (12): e115711. doi: 10.1371 /journal.pone.0115711

Επιμέλεια: Thorbald van Hall, Leiden University Medical Center, Ολλανδία

Ελήφθη: 19 Μαρ 2014? Αποδεκτές: 27 Νοεμβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 22, Δεκεμβρίου του 2014

Copyright: © 2014 Song et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας /Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου του Τραχήλου της Μήτρας Καρκίνος SPORE P50CA098252 και 2R01CA114425-06 επιχορηγήσεις. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η χημειοθεραπεία ή /και ακτινοθεραπεία χρησιμοποιούνται ευρέως ως θεραπείες για τον καρκίνο. Τόσο η χημειοθεραπεία και η ακτινοθεραπεία έχουν δειχθεί να μετατρέψει το μικροπεριβάλλον του όγκου σε ένα κατάλληλο περιβάλλον για μεταγενέστερη ανοσοθεραπευτικό εμβολιασμό [1], [2]. Έχουμε χρησιμοποιήσει προηγουμένως σισπλατίνη χημειοθεραπεία για να εκκινήσουν την μικροπεριβάλλον του όγκου για τον εμβολιασμό με μία ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη, και βρήκαν ότι αυτή η θεραπευτική αγωγή που επάγεται ισχυρά αποτελέσματα κατά του όγκου και αντιγόνου-ειδικών κυττάρων ανοσοαποκρίσεις [1]. Δεν είναι μόνο το καρκινικά κύτταρα σισπλατίνη kill αλλά επίσης απελευθερώνει αντιγόνο όγκου και επιτρέπει την εγκάρσια παρουσίαση του αντιγόνου όγκου για να προκαλέσει αντιγονο-ειδικών μεσολάβηση κυττάρων ανοσολογικές αποκρίσεις. Ωστόσο, τα αποτελέσματα κατά των όγκων που παράγονται από τη χημειοθεραπεία μπορεί να ενισχυθεί όταν συνδυάζεται με ανοσοθεραπειών.

Μια στρατηγική για την ενίσχυση της εγκάρσιας παρουσίαση του αντιγόνου του όγκου μετά από χημειοθεραπεία είναι η προώθηση της CD4 + Τ βοηθητικών κυττάρων ανοσοαποκρίσεων. Ένας παράγοντας ικανός να παράγει αντιγόνου-ειδικών CD4 + Τ κυττάρων που δεσμεύονται διάφορα μόρια MHC τάξης II με υψηλή συγγένεια είναι το παν HLA-DR δέσμευσης επιτόπου (πεπτίδιο ΡΑϋΚΕ) [3]. Το πεπτίδιο ΡΑϋΚΕ έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως σε συνδυασμό με εμβόλια για την βελτίωση της ισχύος τους με την ενίσχυση αποκρίσεις CD4 + Τ κυττάρων [4] – [7]. Ως εκ τούτου, εντός του όγκου χορήγηση PADRE δυνητικά μπορεί να δημιουργήσει ΡΑϋΚΕ-ειδικά CD4 + Τ βοηθητικών κυττάρων για την περαιτέρω βελτίωση διασταυρούμενη παρουσίαση για τη δημιουργία όγκου αντιγόνου-ειδικά CD8 + Τ κύτταρα. Η απασχόληση ενός ανοσοδιεγερτικού ανοσοενισχυτικού με το πεπτίδιο PADRE μπορεί να ενισχύσει περαιτέρω όγκου αντιγόνου-ειδικά CD8 + Τ κύτταρα.

Ο υποδοχέας ΤοΙΙ 9 (TLR9) αγωνιστής CpG είναι ένας συχνά χρησιμοποιούμενος ανοσοενισχυτικό που έχει δειχθεί ότι διεγείρει CD8 + T κυττάρων cross-αστάρωμα με την προώθηση της ιντερφερόνης τύπου Ι παραγωγής [8], [9]. CpG έχει επίσης αποδειχθεί ότι έχει αποτελέσματα κατά του όγκου όταν εγχύθηκε απ ‘ευθείας εντός του όγκου [10] – [12]. Επιπλέον, το CpG έχει αποδειχθεί ότι μπλοκάρουν την ανοσοκατασταλτική δράση της MDSCs σε ποντίκια που φέρουν όγκο [13]. Αυτές οι μελέτες υποδεικνύουν ότι το ανοσοδιεγερτικό λειτουργία του CpG μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να ενισχύσει την εγκάρσια παρουσίαση του αντιγόνου όγκου για να δημιουργήσει όγκο αντιγόνου-ειδικά CD8 + Τ κύτταρο άνοσο αποκρίσεις.

Στην παρούσα μελέτη, υποθέσαμε ότι η σισπλατίνη επεξεργασία σε συνδυασμό με CpG ανοσοενισχυτικό και χορήγηση πεπτιδίου PADRE θα ενισχύσει την εγκάρσια παρουσίαση του αντιγόνου όγκου, που οδηγεί σε ισχυρές επιδράσεις κατά του όγκου. Για να ελεγχθεί αυτό, χρησιμοποιήσαμε ποντίκια που φέρουν HPV16 Ε7-εκφράζοντα TC-1 όγκους και τους αντιμετωπίζονται με διάφορους συνδυασμούς της σισπλατίνης ακολουθούμενα από ενδοογκική ένεση με CpG και PADRE πεπτιδίου. Βρήκαμε ότι η θεραπεία με τα τρία παράγοντες παράγονται τα πιο ισχυρά αποτελέσματα κατά του όγκου. Επιπλέον, η θεραπεία με σισπλατίνη, CpG και PADRE ήταν σε θέση να ελέγξει όγκους σε μία απομακρυσμένη θέση, υποδεικνύοντας ότι η προσέγγισή μας ήταν σε θέση να προκαλεί διασταυρούμενη παρουσίαση του αντιγόνου του όγκου. Βρήκαμε ότι η θεραπεία με σισπλατίνη, CpG και PADRE ενίσχυσε την παραγωγή του ΡΑϋΚΕ-ειδικά CD4 + Τ κύτταρα, καθώς και Ε7-ειδικών κυττάρων CD8 + T. Η θεραπεία με σισπλατίνη, CpG και PADRE επίσης μείωσε τον αριθμό των MDSCs σε τόπους του όγκου, μια διαδικασία βρέθηκε να μεσολαβεί ο Fas-FasL μονοπατιού της απόπτωσης. Η θεραπευτική αγωγή που παρουσιάζεται εδώ είναι μια νέα εφαρμογή ενός συνδυασμού ανοσοθεραπείες που επάγει ισχυρή αντικαρκινική ανοσοαποκρίσεις, χωρίς να απαιτείται η γνώση των αντιγόνων ανοσοκυρίαρχων όγκου, καθιστώντας την προσέγγιση δυνητικά ευρέως εφαρμόσιμη.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλες οι διαδικασίες των ζώων που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που έχουν εγκριθεί για τη συγκεκριμένη μελέτη και σύμφωνα με τις συστάσεις για την ορθή χρήση και τη φροντίδα των πειραματόζωων από Johns Hopkins University φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή χρήσης. Όλες οι κυτταρικές σειρές καθιερώθηκαν και διατηρήθηκαν με εγκεκριμένα πρωτόκολλα. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν για τους σκοπούς της παρούσας μελέτης με τη χρήση CO

2, σύμφωνα με το πρωτόκολλο των ζώων. Όσον αφορά τα ανθρώπινα πρότυπα τελικό σημείο, τα ποντίκια που δείχνουν έντονη δυσφορία ή φέρουν όγκους που υπερέβη 20 χιλιοστά σε διάμετρο υποβλήθηκαν σε ευθανασία με CO

2 σύμφωνα με το πρωτόκολλο των ζώων.

Πειραματόζωα

έξι έως οκτώ -Εβδομάδα-old γυναίκα C57BL /6 ποντίκια ελήφθησαν από το National Cancer Institute-Frederick Περιοχή Ζωικής παραγωγής (Frederick, MD). Οι ποντικοί στεγάστηκαν στην εγκατάσταση ογκολογία ζώο του Johns Hopkins Hospital (Baltimore, MD).

Cells

Το μοντέλο όγκου TC-1 παρήχθη στο εργαστήριο μας με μετασχηματισμό επιθηλιακών κυττάρων του πνεύμονα πρωτογενούς από C57BL /6 ποντίκια με ενεργό Ras μαζί με HPV16 Ε6 και Ε7 ογκογονίδια και την παραγωγή και τη συντήρηση υπό εγκεκριμένα πρωτόκολλα αυτής της κυτταρικής γραμμής έχει προηγουμένως περιγραφεί [14]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 που περιέχει 10% FBS, 2 mM L-γλουταμίνη, 10% πυροσταφυλικό νάτριο, 10% μη-απαραίτητο αμινοξύ, και 100 pg /ml στρεπτομυκίνη σε μία υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 /95% αέρα στους 37 ° C. Ε7-ειδικά CD8 + Τ κύτταρα δημιουργήθηκαν από σπληνοκύτταρα Ε7 εμβολιασμένα ποντίκια και διεγέρθηκαν με ακτινοβολημένα κύτταρα TC-1 και 10 IU ιντερλευκίνη-2 (IL-2) κάθε εβδομάδα. PADRE-ειδικά CD4 + Τ κύτταρα δημιουργήθηκαν από C57BL /6 ποντικούς ανοσοποιημένους με pcDNA3-II-PADRE με εκτοξευτήρα γονιδίων. Τα κύτταρα διεγέρθηκαν με ακτινοβολημένα PADRE πεπτίδιο-παλμική DCs και IL-2 (10 IU) εβδομαδιαία [15].

Peptide, αντισώματα και αντιδραστήρια

Το πεπτίδιο ΡΑϋΚΕ (αντιδραστική επίτοπο Pan HLA-DR , AKFVAAWTLKAAA), και Η2-D

b-περιορισμένο HPV16 E7aa49-57 πεπτίδιο (RAHYNIVTF) συντέθηκαν από την Beckman Coulter με καθαρότητα 90%.

FITC, ΡΕ και APC-συζευγμένη αντι-ποντικού CD8a (κλώνος 53.6.7), FITC-συζευγμένο αντι -mouse ΙΡΝ-γ (κλώνος XMG1.2), FITC και ΡΕ- συζευγμένο αντι-ποντικού CD4 (κλώνος RM4-5), ΑΡΟ-συζευγμένο αντι-ποντικού CD11b (κλώνος Μ1 /70), ΡΕ-συζευγμένο αντι-ποντικού Ly6G (κλώνος 1Α8), ΡΕ-συζευγμένο αντι-ποντικού CD154 (CD40L, κλώνος MR1), Λειτουργική αντι-ποντικού CD95 (Fas, κλώνος Jo2) αγωνιστικά αντισώματα, και FITC Annexin V ανίχνευσης απόπτωσης Kit, αγοράστηκαν από Βϋ Pharmingen (San Diego, CA). ΡΕ-συζευγμένο CD178 (Fas-L, κλωνοποιήσει MFL3), ΡΕ-συζευγμένο αντι-ποντικού CD95 (Fas, κλώνος 15A7), συζευγμένο με FITC αντι-ποντικού CD40 (cloneHM40-3), λειτουργική CD40 αγωνιστή αντι-ποντικού (κλώνος 1C10) , και CD154 (CD40L, κλώνος MR1) αντισωμάτων ποντικού αντι αγοράστηκαν από eBioscience (San Diego, CA). ΡΕ-συζευγμένο, HPV16 E7aa49-57 πεπτίδιο και RAHYNIVTF φορτωμένο Η2-D

β τετραμερή ελήφθησαν από το Εθνικό Ινστιτούτο Αλλεργιών και Λοιμωδών Νοσημάτων τετραμερούς Διευκόλυνσης (Atlanta, GA). Fas /Fas L ανταγωνιστή Kp7-6 αγοράστηκε από την EMD Chemicals (San Diego, CA).

In vivo πειράματα

θεραπεία όγκων και

εξάντληση αντισώματος

Τα πειράματα θεραπεία όγκων διεξήχθησαν δύο φορές ανεξάρτητα. Την ημέρα 0, 1 × 10

5 TC-1 κύτταρα όγκου εμβολιάσθηκαν υποδορίως σε ποντίκια C57BL /6 (5 ανά ομάδα). Τέσσερις ημέρες αργότερα, τα ποντίκια που φέρουν όγκο υπέστησαν αγωγή με σισπλατίνη (5 mg /kg σωματικού βάρους) ή μάρτυρα PBS ενδοπεριτοναϊκώς. Την ημέρα 5, τα ποντίκια ανοσοποιήθηκαν εντός του όγκου είτε με έλεγχο PBS, πεπτίδιο PADRE 20 μg, 10 μg CpG, ή ο συνδυασμός των δύο τελευταίων. Όλες οι αγωγές επαναλήφθηκαν 3 φορές σε διαστήματα 7-ημερών. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε με οπτική επιθεώρηση, ψηλάφηση, και ψηφιακό παχύμετρο (Scienceware) δύο φορές την εβδομάδα. Οι ποντικοί θανατώθηκαν όταν η διάμετρος του όγκου έφθασε τα 20 mm.

Για συστημική αξιολόγηση κατά του όγκου, τα ποντίκια (5 ανά ομάδα) προκλήθηκαν υποδορίως με 1 χ 10

5 TC-1 καρκινικά κύτταρα στη δεξιά πλευρά . Πέντε ημέρες αργότερα, 3 × 10

4 TC-1 κύτταρα όγκου εμβολιάσθηκαν υποδορίως στο αριστερό πλευρό. Ποντικοί που φέρουν όγκο είτε σε επεξεργασία με τον έλεγχο PBS ή υποβλήθηκαν σε τριπλή θεραπεία (σισπλατίνη 5 mg /kg ΙΡ σε συνδυασμό με το πεπτίδιο PADRE 20 μg και 10 μg CpG από ενδοογκική ένεση) τρεις φορές σε διαστήματα 5 ημερών. Στην ομάδα εξάντληση των κυττάρων CD8 + Τ, αντι-ποντικού CD8 αντίσωμα 100 μg (κλώνος 2.43) χορηγήθηκε στους ποντικούς μέσω ενδοπεριτοναϊκής ένεσης τις ημέρες 3, 4, 5 μετά την πρόκληση όγκου. Στη συνέχεια, 150 αντι-ποντικού CD8 αντίσωμα μg /ποντικό παραδόθηκε ανά εβδομάδα για να διατηρηθεί περισσότερο από 90% μείωση κυττάρων CD8 + Τ.

Παρασκευή μονοκύτταρους εναιωρήματα από TC-1 υποδόρια καρκινικά

Οι ιστοί όγκου ήπια αποκόπηκαν από τους ποντικούς. Οι στερεοί όγκοι στη συνέχεια κιμά σε 1 έως τεμάχια 2-mm και επωάζονται με RPMI 1640 που περιέχει 0,05 mg /ml κολλαγενάσης χωρίς ορό Ι, 0.05 mg /ml κολλαγενάση IV, 0,025 mg /ml υαλουρονιδάση IV, 0,25 mg /ml Dnase Ι (και τα δύο από τη Roche, Indianapolis, ΙΝ), 100 U /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη και επωάζονται στους 37 ° C για 60 λεπτά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16].

χρώσης κυτταρικής επιφάνειας, η ενδοκυτταρική κυτοκίνη χρώση και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Για τη χρώση τετραμερούς, μονοκύτταρους ανασταλεί σπληνοκύτταρα ή λεμφοκύτταρα που διεισδύουν σε όγκους χρωματίστηκαν με καθαρισμένο αντι-ποντικού CD16 /32 (Fc block, BD Pharmingen, San Diego, CA) πρώτα, και στη συνέχεια με αντι-ποντικού CD8-FITC, ΡΕ-συζευγμένο HPV16 Ε7 aa49-57 (RAHYNIVTF) φορτωμένων με πεπτίδιο Η2-D

b τετραμερές στους 4 ° C. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 7-AAD πριν από την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για τον αποκλεισμό των νεκρών κυττάρων.

Για την ανίχνευση HPV16 Ε7-ειδικές αποκρίσεις κυττάρων CD8 + Τ και ΡΑϋΚΕ-ειδικών κυττάρων CD4 + Τ από την ΙΡΝ-γ ενδοκυτταρική χρώση, PBMCs, μονοκύτταροι ανασταλεί σπληνοκύτταρα ή λεμφοκύτταρα που διεισδύουν σε όγκους διεγέρθηκαν με είτε HPV16 E7aa49-57 ή PADRE πεπτίδιο (1 μg /ml) παρουσία του Golgiplug (BD Pharmingen, San Diego, CA) στους 37 ° C όλη τη νύκτα. Τα διεγερμένα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν μία φορά με ρυθμιστικό FACScan και χρωματίστηκαν με ΡΕ-συζευγμένο μονοκλωνικό αρουραίου αντι-ποντικού CD8a ή CD4 αντι-ποντικού. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε χρώση ενδοκυτταρικής κυτοκίνης χρησιμοποιώντας το κιτ Cytofix /Cytoperm σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (BD Pharmingen, San Diego, CA). Η ενδοκυτταρική ΙΡΝ-γ βάφτηκε με αντι-ποντικού ΙΡΝ-γ FITC-συζευγμένο αρουραίου. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε με τη χρήση FACSalibur με λογισμικό CELLQuest. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό FlowJo (αστέρι Tree).

Απομόνωση του μυελοειδούς που προέρχονται κατασταλτικών κυττάρων σε ποντίκια που φέρουν όγκους και την καταστολή του πολλαπλασιασμού των Τ κυττάρων

CD11b + Ly6G

Hi MDSCs ήταν απομονώνονται από εναιωρήματα μονών κυττάρων σπληνοκυττάρων από TC-1 που φέρουν όγκο ποντικών C57BL /6 με χρήση κιτ απομόνωσης CD11b + Ly6G και LS στήλες για μαγνητικό διαχωρισμό σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Miltenyi Biotec). Η καθαρότητα ήταν όχι λιγότερο από 95%.

In vitro

MDSC απόπτωση

αξιολόγηση

Τα καθαρισμένα MDSCs επωάστηκαν στους 37 ° C ή συν-καλλιεργημένα με PADRE-ειδικά CD4 + T κύτταρα σε αναλογία 1:01 για 24 ώρες σε πλάκες 96 φρεατίων. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με APC αντι-ποντικού CD11b, ΡΕ αντι-ποντικού Ly6G, FITC αντι-ποντικού αννεξίνης V αντισώματα και 7-AAD (FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit, BD Pharmingen, San Diego, CA) και εξετάστηκαν με κυτταρομετρία ροής. MDSCs πρώτα περίφραξη σε CD11b + και Ly6G

Γεια σου, και στη συνέχεια, η συχνότητα της απόπτωσης μετρήθηκε με Annexin V + και 7-AAD.

Για να αξιολογηθεί επάγεται αντίσωμα MDSC απόπτωση, που απομονώνονται MDSC καλλιεργήθηκαν για 12 ώρες με αγωνιστικού αντισώματος αντι-Ραδ (2 μg /ml, BD Pharmingen, κλώνος Jo2, San Diego, CA), ή ισότυπος mAb. Για in vitro δοκιμασία, απομονωμένες MDSCs συν-καλλιεργήθηκαν με PADRE- ειδικών CD4 + κυττάρων Τ αποκλεισμού σε 1:01 σιτηρέσιο, στη συνέχεια επωάστηκαν με ισότυπο mAb, ή Fas-Fas L ανταγωνιστή (Kp7-6, Calbiochem) επί 24 ώρες.

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα στοιχεία που παρουσιάζονται στην παρούσα μελέτη εκφράζονται ως μέσος όρος ± SE όπου ενδείκνυται. Συγκρίσεις μεταξύ των μεμονωμένων σημείων δεδομένων για ενδοκυτταρική χρώση κυτοκίνης με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής και του όγκου θεραπεία έγιναν χρησιμοποιώντας t-test δύο ουρών σπουδαστή από Graph Prism 6.0. Στα πειράματα θεραπεία όγκων, το κύριο αποτέλεσμα του ενδιαφέροντος ήταν διάρκειας μέχρι θυσιάστηκαν ποντίκια. Τα χρονικά εκδήλωση κατανομές για διαφορετικούς ποντίκια σε σύγκριση με τη χρήση της μεθόδου Kaplan-Meier και τη δοκιμασία log-rank με Graph Prism 6.0. Όλες οι ρ-τιμές μικρότερες από 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές.

Αποτελέσματα

Κατεργασία της TC-1 που φέρουν όγκο ποντικών με σισπλατίνη, CpG και PADRE πεπτίδιο δημιουργεί ισχυρή αντικαρκινική επιδράσεις

TC-1 ποντίκια που φέρουν όγκο χρησιμοποιήθηκαν για να εξετασθούν τα αποτελέσματα κατά του όγκου των διαφόρων θεραπειών συνδυασμού ενδοπεριτοναϊκή χημειοθεραπεία σισπλατίνης, ενδοογκική ένεση πεπτιδίου PADRE ή /και εντός του όγκου έγχυση του CpG. C57BL 6 ποντίκια /προκλήθηκαν με 1 × 10

5 TC-1 κύτταρα όγκου την ημέρα 0, και χωρίζονται σε πέντε ομάδες αγωγής. Τα ποντίκια στην ομάδα 1 ήταν χωρίς θεραπεία, εκείνοι στην ομάδα 2 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σισπλατίνη ακολουθούμενη από ενδοογκική CpG, εκείνοι στην ομάδα 3 έλαβαν θεραπεία με σισπλατίνη ακολουθούμενη από ενδοογκική ΡΑϋΚΕ πεπτίδιο, εκείνοι στην ομάδα 4 έλαβαν θεραπεία με ενδοογκική CpG και PADRE, και εκείνων στην ομάδα 5 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σισπλατίνη ακολουθούμενη από ενδοογκική CpG και PADRE (Εικ. 1Α). Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Β, η αγωγή με σισπλατίνη ακολουθούμενη από ενδοογκική CpG και PADRE σημαντικά μειωμένο όγκο του όγκου σε σύγκριση με τον έλεγχο και την θεραπεία με CpG και PADRE μόνο. Επιπλέον, η θεραπεία με σισπλατίνη ακολουθούμενη από ενδοογκική CpG και PADRE σημαντικά βελτιωμένη επιβίωση σε σύγκριση με όλες τις άλλες ομάδες αγωγής (Σχ. 1 C). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ο συνδυασμός σισπλατίνης, CpG και PADRE έχει σημαντικές επιπτώσεις κατά του όγκου έναντι TC-1 όγκων.

C57BL /6 ποντίκια (5 ποντικοί /ομάδα) προκλήθηκαν υποδορίως με TC-1 καρκινικά κύτταρα και υπέστησαν αγωγή με διάφορες συνδυασμοί σισπλατίνης, CpG και PADRE πεπτιδίου. Α Σχηματικό διάγραμμα των θεραπευτικών σχημάτων. Β Οικόπεδο της κινητικής ανάπτυξης του όγκου. Γ Kaplan-Meier οικόπεδο επιβίωσης. (*

σ

& lt? 0,05, ***

σ

& lt? 0.001, ***

σ

& lt? 0.0001).

Η

Η θεραπεία με σισπλατίνη, CpG και PADRE πεπτίδιο προκαλεί ισχυρές επιδράσεις συστημική αντικαρκινική

Δεδομένου ότι η θεραπεία με σισπλατίνη, CpG και PADRE παράγονται τα πιο ισχυρά αποτελέσματα κατά των όγκων (Σχ. 1), μπορούμε επόμενο εξετάστηκε εάν η θεραπεία με τις τρεις παράγοντες θα μπορούσαν παράγουν αποτελέσματα κατά του όγκου σε ένα δευτερεύον όγκου. C57BL /6 ποντικοί υποδορίως προκλήθηκαν με TC-1 καρκινικά κύτταρα στο δεξί πλευρό την ημέρα 0, και στη συνέχεια και πάλι στην αριστερή πλευρά την ημέρα 5. Μια ομάδα ποντικών υποβλήθηκε έπειτα σε επεξεργασία με αντι-CD8 αντίσωμα κατά τις ημέρες 3-5 και τότε εβδομαδιαίες να καταστρέφουν CD8 + Τ κύτταρα. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, με σισπλατίνη ένεση ενδοπεριτοναϊκά και με CpG και PADRE εγχέεται εντός του όγκου στον πρωτογενή όγκο στη δεξιά πλευρά. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β, ο όγκος του πρωτογενούς όγκου μειώθηκε σημαντικά σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με σισπλατίνη, CpG και PADRE σε σύγκριση με ποντικούς άνευ αγωγής. Επιπλέον, ο όγκος του δευτερεύοντος όγκου στο αριστερό πλευρό μειώθηκε επίσης σημαντικά σε ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με τα τρία παραγόντων σε σύγκριση με τα μη θεραπευμένα ποντίκια (Σχ. 2C). Η εξάντληση των CD8 + Τ κυττάρων μειώθηκε σημαντικά το θεραπευτικό αποτέλεσμα της σισπλατίνης, CpG και PADRE θεραπεία τόσο στις πρωτογενείς και δευτερογενείς όγκους, υποδεικνύοντας ότι τα CD8 + Τ κύτταρα είναι σημαντικά για την αποτελεσματικότητα της θεραπείας (Εικ. 2Β και C). Σύκο. 2D δείχνει ότι η θεραπεία με σισπλατίνη, CpG και PADRE παρατείνει σημαντικά την επιβίωση των TC-1 ποντικούς που φέρουν όγκο σε σύγκριση με ποντικούς στερούμενους CD8 + Τ κυττάρων και χωρίς θεραπεία ποντικούς. Παρομοίως, η εξάντληση των CD4 + Τ κυττάρων μειωμένη σημαντικά τις επιπτώσεις κατά του όγκου της αγωγής τριπλής θεραπείας (S1A Εικ.). Επιπλέον, η έγχυση του PADRE-ειδικά CD4 + Τ κυττάρων σε ποντικούς που φέρουν όγκο σημαντικά ενισχυμένη αντικαρκινική δράση (S1B Εικ.). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι CD4 + Τ κύτταρα είναι επίσης σημαντική για την παρατηρούμενη θεραπευτική δράση. Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα δείχνουν ότι η θεραπεία με σισπλατίνη ακολουθούμενη από CpG και PADRE δημιουργεί ισχυρή συστημική αντικαρκινική ανοσοαποκρίσεις σε θέση να ενεργούν κατά των όγκων σε απομακρυσμένες θέσεις.

C57BL /6 ποντίκια (5 ποντικοί /ομάδα) προκλήθηκαν διαδοχικά με TC-1 κύτταρα όγκου κατά την ημέρα 0 (δεξιά πλευρά) και την ημέρα 5 (αριστερό πλευρό), και στη συνέχεια είτε μη επεξεργασμένα ή επεξεργασμένα με σισπλατίνη σε συνδυασμό με ένεση εντός του όγκου με CpG και PADRE πεπτιδίου στον πρωτογενή όγκο. Στην ομάδα εξάντληση των κυττάρων CD8 + Τ, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως ανωτέρω, με την adition των 100 μg CD8 αντίσωμα αντι-ποντικού (κλώνος 2.43) ενίεται ενδοπεριτοναϊκά τις ημέρες 3, 4 και 5 μετά την πρόκληση όγκου, και στη συνέχεια 150 μg ανά εβδομάδα στη συνέχεια. Α Σχηματικό διάγραμμα του σχήματος θεραπείας. Β Διάγραμμα διασποράς της κινητικής ανάπτυξης πρωτογενούς όγκου. Γ Διάγραμμα διασποράς της κινητικής δευτερογενή ανάπτυξη του όγκου. Δ Kaplan-Meier οικόπεδο επιβίωσης. (***

σ

& lt? 0.001, ****

σ

& lt? 0.0001)

Η

Η θεραπεία με σισπλατίνη, CpG και PADRE ενισχύει την συστημική PADRE. -ειδικές αποκρίσεις CD4 + Τ κυττάρων σε TC-1 που φέρουν όγκο ποντικών

στη συνέχεια, εξετάσαμε την επίδραση της θεραπείας με διάφορους συνδυασμούς σισπλατίνη, CpG και PADRE στο συστημικό ανοσοαποκρίσεων CD4 + Τ κυττάρων. TC-1 ποντίκια που φέρουν όγκο υπέστησαν αγωγή με διάφορους συνδυασμούς σισπλατίνη, CpG και PADRE πεπτιδίου όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α και PBMCs αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής 1 εβδομάδα μετά την τελευταία παράδοση αντιγόνου για την παρουσία ΙΡΝ-γ που εκκρίνει PADRE-ειδικά CD4 + Τ κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α και Β, τα ποντίκια που φέρουν όγκο σε επεξεργασία με σισπλατίνη ακολουθούμενη από CpG και PADRE παράγεται το μεγαλύτερο αριθμό των ΡΑϋΚΕ-ειδικά CD4 + Τ κύτταρα IFN-γ + συστημικά σε σύγκριση με όλες τις άλλες ομάδες θεραπείας. Αυτό δείχνει ότι η θεραπεία με σισπλατίνη, CpG και PADRE μπορεί να παράγει ισχυρά ΡΑϋΚΕ-ειδικές αποκρίσεις CD4 + Τ κυττάρων σε TC-1 ποντικούς που φέρουν όγκο.

C57BL /6 ποντίκια (5 ποντικοί /ομάδα) προκλήθηκαν υποδορίως με TC-1 καρκινικά κύτταρα και στη συνέχεια κατεργάζεται με διάφορους συνδυασμούς σισπλατίνη, CpG και PADRE πεπτιδίου όπως υποδεικνύεται. PBMCs αναλύθηκαν 1 εβδομάδα μετά την τελευταία παράδοση αντιγόνου. Η παρουσία του ΡΑϋΚΕ-ειδικά CD4 + Τ κύτταρα σε PBMCs αναλύθηκε χρησιμοποιώντας χρώση ενδοκυτταρικής κυτοκίνης για την ΙΡΝ-γ και χρώση CD4 + που ακολουθείται από ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. A. Αντιπροσωπευτικά κυτταρομετρίας ροής οικόπεδο περίγραμμα απεικονίζει τη συχνότητα της ΙΡΝ-γ που εκκρίνουν CD4 + Τ κύτταρα στην κυκλοφορία αφού παλλόμενα με πεπτίδιο ΡΑϋΚΕ. B. Μπαρ γράφημα ποσοτικοποίηση των δεδομένων (μέση ± SE).

Η

Η θεραπεία με σισπλατίνη, CpG και PADRE επάγει τοπική όγκου αντιγόνου-ειδικών αποκρίσεων των κυττάρων CD8 + Τ σε TC-1 ποντικούς που φέρουν όγκο

TC-1 ποντίκια που φέρουν όγκο υπέστησαν αγωγή με διάφορους συνδυασμούς σισπλατίνη, CpG και PADRE πεπτιδίου όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α. Διηθούν όγκο λεμφοκύτταρα (TIL) συλλέχθηκαν για ανάλυση 12 ημέρες μετά την τελευταία παράδοση αντιγόνου. Η παρουσία του ΡΑϋΚΕ-ειδικά CD4 + Τ κύτταρα και Ε7-ειδικά CD8 + Τ κύτταρα μεταξύ των TILs χαρακτηρίστηκε χρησιμοποιώντας ενδοκυτταρική χρώση κυτοκίνης για ΙΡΝ-γ, καθώς και χρώση CD4 και CD8 και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α και C, τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με σισπλατίνη ακολουθούμενη από CpG και PADRE παράγεται το μεγαλύτερο ποσοστό ΡΑϋΚΕ-ειδικά CD4 + Τ κύτταρα μεταξύ των διηθημένων από όγκο CD4 + Τ κυττάρων σε σύγκριση με όλες τις άλλες ομάδες θεραπείας. Επιπλέον, τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με σισπλατίνη, CpG και PADRE παράγεται το μεγαλύτερο αριθμό των Ε7-ειδικών CD8 + Τ κυττάρων μεταξύ των κυττάρων όγκου σε σύγκριση με όλες τις άλλες ομάδες αγωγής (Σχ. 4Β και D). Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι TILs συλλέγονται από το εσωτερικό μικροπεριβάλλον του όγκου είναι σε μια ενεργοποιημένη κατάσταση όπου γίνονται εσωτερικεύονται οι υποδοχείς των Τ κυττάρων. Έτσι, η χρώση φαίνεται ως μια κλίση με βάση τα διάφορα επίπεδα των TCR εσωτερίκευσης. Αυτή η εμφάνιση διαφέρει από το πρότυπο χρώσης συνήθως παρατηρείται σε εκτίμηση των αντιγονο-ειδικών Τ κυττάρων στην συστηματική κυκλοφορία, όπου θα μπορούσε να παρατηρηθεί μια ξεχωριστή πληθυσμού. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η θεραπεία με σισπλατίνη, CpG και PADRE μπορεί να οδηγήσει στην εγκάρσια παρουσίαση του αντιγόνου όγκου, Ε7, έχοντας σαν αποτέλεσμα αυξημένη όγκου αντιγόνου-ειδικά CD8 + Τ κύτταρο άνοσο αποκρίσεις σε τόπους του όγκου.

C57BL /6 ποντίκια (5 ανά ομάδα) προκλήθηκαν υποδορίως με TC-1 καρκινικά κύτταρα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορους συνδυασμούς σισπλατίνη, CpG και PADRE πεπτιδίου όπως υποδεικνύεται. 12 ημέρες μετά την τελευταία παράδοση αντιγόνου, ογκο-διηθητικά λεμφοκύτταρα συλλέχθηκαν για την ανάλυση των υποσυνόλων ανοσοκυττάρων. ροής Α Αντιπροσωπευτικά ανάλυση κυτταρομετρίας απεικονίζει τη συχνότητα των ΡΑϋΚΕ-ειδικών ΙΡΝ-γ που εκκρίνουν CD4 + Τ κύτταρα μεταξύ του συνολικού όγκου που διηθούν CD4 + Τ κύτταρα. B. Μπαρ γράφημα ποσοτικοποίηση των δεδομένων από Α (μέση ± S.E.). ροής C. Αντιπροσωπευτικά ανάλυση κυτταρομετρίας απεικονίζει τον απόλυτο αριθμό των Ε7 τετραμερούς δέσμευσης CD8 + Τ κυττάρων σε εναιώρημα 5 × 10

5 μονοκύτταροι παρασκευάζεται από όγκους. Δ Μπαρ γράφημα ποσοτικοποίηση των δεδομένων από το Γ (μέση τιμή ± SE).

Η

Η θεραπεία με σισπλατίνη, CpG και PADRE μειώνει προέρχεται μυελοειδή κατασταλτικά κύτταρα σε θέσεις όγκου

Για να εξετάσει περαιτέρω το επιδράσεις της σισπλατίνης, CpG και PADRE θεραπεία, αναλύσαμε τα ανοσοκατασταλτικά παράγωγα μυελοειδή κατασταλτικά κύτταρα (MDSCs) μεταξύ του όγκου διηθούντα-λεμφοκύτταρα επεξεργασμένων TC-1 ποντίκια που φέρουν όγκο. Μεταξύ 30 και 35 ημέρες μετά την πρόκληση του όγκου, οι όγκοι συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α. Σύκο. 5Β δείχνει ότι οι όγκοι των ποντικών που έλαβαν θεραπεία με σισπλατίνη, CpG και PADRE είχαν σημαντικά χαμηλότερο ποσοστό CD11b + Ly6G

Hi MDSCs στους τόπους όγκου σε σύγκριση με όλες τις άλλες ομάδες θεραπείας. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η θεραπεία με σισπλατίνη, CpG και PADRE προκαλεί αντικαρκινική δράση, τουλάχιστον εν μέρει, μέσω της μείωσης του πληθυσμού των MDSCs στο μικροπεριβάλλον του όγκου.

C57BL /6 ποντίκια (5 ανά ομάδα) προκλήθηκαν υποδορίως με TTC- 1 καρκινικά κύτταρα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορους συνδυασμούς σισπλατίνη, CpG και PADRE πεπτιδίου. Σε 30-35 ημέρες μετά την πρόκληση του όγκου, όταν οι διάμετροι των όγκων υπερέβη τα 10 mm, τα καρκινικά κύτταρα που διηθούν συλλέχθηκαν για την ανάλυση για την παρουσία του CD11b + Ly6G

hi MDSCs. Α Εκπρόσωπος οικόπεδα περιγράμματος που απεικονίζει τη συχνότητα των CD11b + Ly6G

hi MDSCs σε μονά-κυτταρικό εναιώρημα που παρασκευάζεται από όγκο. Β Μπαρ γράφημα ποσοτικοποίηση των δεδομένων από το Α (μέση τιμή ± SE) (*

σ

& lt? 0,05, ***

σ

& lt? 0.0001).

Η

PADRE-ειδικά CD4 + Τ κύτταρα επάγει MDSC απόπτωση μέσω Fas και Fas οδό συνδέτη

Παρατηρήσαμε ότι η θεραπεία με σισπλατίνη ακολουθούμενη από CpG και PADRE μείωσε τον αριθμό των MDSCs σε τόπους του όγκου. Προηγουμένως, έχει δειχθεί ότι MDSCs εκφράζουν Fas και θα υποβληθούν σε Fas-FasL απόπτωση εάν συναντήσει ένα Τ κύτταρο που εκφράζει FasL [17]. Ως εκ τούτου, χαρακτηρίζεται από την επίδραση των ενεργοποιημένων ΡΑϋΚΕ-ειδικά CD4 + Τ κύτταρα επί MDSCs σε όρους αποπτωτική δραστικότητα και βρήκαν ότι MDSCs επωάζονται με ΡΑϋΚΕ-ειδικά CD4 + Τ κυττάρων είχαν σημαντικά υψηλότερη έκφραση αννεξίνης V σε σύγκριση με εκείνους που επωάστηκαν με μέσο ελέγχου, υποδεικνύοντας ότι ενεργοποιημένων CD4 + Τ κύτταρα είναι ικανά να επάγουν απόπτωση MDSCs (Εικ. 6). Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι MDSCs συν-καλλιεργήθηκαν με PADRE-ειδικά CD4 + Τ κύτταρα σε συνδυασμό με Fas-FasL ανταγωνιστής Kp7-6 μείωσε σημαντικά την συχνότητα της απόπτωσης σε σύγκριση με τον έλεγχο (Εικ. 7). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ΡΑϋΚΕ-ειδικά CD4 + Τ κύτταρα επάγουν απόπτωση σε MDSCs μέσω Fas-FasL-εξαρτώμενη οδό, υποδεικνύοντας ότι η θανάτωση MDSC μπορεί να συμβεί μέσω ενός μονοπατιού μη αντιγονο-ειδική.

Καθαρίστηκε σπληνός CD11b + Ly6G

Hi MDSCs επωάστηκαν με ΡΑϋΚΕ-ειδικά CD4 + Τ κύτταρα ή μέσο ελέγχου για 24 ώρες. Α Εκπρόσωπος κυτταρομετρίας ροής οικόπεδα που απεικονίζει τη συχνότητα των CD11b + Ly6G

Hi αννεξίνη V + MDSCs. Β Μπαρ γράφημα ποσοτικοποίηση των δεδομένων Α (μέση τιμή ± Τ.Α.) (****

σ

& lt? 0.0001)

Η

Α.. Η έκφραση του Fas στην MDSCs με την παρουσία και απουσία του ΡΑϋΚΕ-ειδικά CD4 + Τ κύτταρα. Β Μπαρ γράφημα ποσοτικοποίηση των δεδομένων στο Α (μέση τιμή ± Τ.Α.). C. Καθαρισμένα σπληνός Ly6G

Hi MDSCs επωάστηκαν για 12 ώρες με αντίσωμα Fas αγωνιστή (Jo2) ή άσχετο IgG ελέγχου, και η CD11b + Ly6G

κύτταρα Hi αναλύθηκαν για την συχνότητα της απόπτωσης (αννεξίνης V + και 7-AAD -). Δ MDSCs συν-καλλιεργήθηκαν με PADRE-ειδικά CD4 + Τ κυττάρων για 24 ώρες σε συνδυασμό με την άσχετη IgG ελέγχου ή Fas-FasL ανταγωνιστής Kp7-6. Οι CD11b + Ly6G

Hi κύτταρα αναλύθηκαν για την συχνότητα της απόπτωσης, που χαρακτηρίζεται από αννεξίνης V + και 7-Aad-. Εκπρόσωπος κυτταρομετρία ροής οικόπεδα κουκίδα απεικονίζει τη συχνότητα των CD11b + Ly6G

Hi αννεξίνη V + MDSCs. Ε Μπαρ γράφημα ποσοτικοποίηση των δεδομένων στο D (μέση τιμή ± SE) (***

σ

& lt? 0.001, ***

σ

& lt? 0.0001).

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι η αγωγή με σισπλατίνη ακολουθούμενη από ενδοογκική ένεση ενός ισχυρού ανοσοενισχυτικού, CpG, και Pan HLA-DR αντιδραστικό επίτοπο, PADRE πεπτιδίου, δημιουργεί ισχυρός αντιγόνου ειδικό κύτταρο άνοσο αποκρίσεις και τις επιπτώσεις κατά του όγκου. Αξίζει να σημειωθεί ότι η θεραπεία με σισπλατίνη, CpG και PADRE δημιουργούνται συστημικές επιδράσεις κατά του όγκου και ήταν σε θέση να ελέγξει τους όγκους σε απομακρυσμένες περιοχές. Επιπλέον, η θεραπεία μας μείωσε τον πληθυσμό των MDSCs σε τόπους του όγκου, μειώνοντας έτσι την ανοσοκαταστολή στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η σισπλατίνη, CpG και PADRE ενισχυθεί η διασταυρούμενη παρουσίαση του αντιγόνου όγκου για να δημιουργήσει όγκο αντιγόνου-ειδικά CD8 + Τ κύτταρο άνοσο αποκρίσεις. Ο συνδυασμός της χημειοθεραπείας, επικουρική και ανοσογονικό πεπτίδιο που παρουσιάζεται εδώ αποτελεί μια καθολική προσέγγιση στον έλεγχο του όγκου.

Αξίζει να σημειωθεί ότι η σημερινή προσέγγιση συνδυασμένη θεραπεία τριπλού δεν περιλαμβάνει την εισαγωγή του αντιγόνου Ε7 μέσω του εμβολιασμού. Παρ ‘όλα αυτά, η παραγωγή του Ε7-ειδικών CD8 + Τ κυττάρων παρατηρείται (Εικ. 4Β). Εμείς λόγο ότι η παρατηρούμενη απόκριση Ε7-ειδικά CD8 + Τ κυττάρων που προκαλείται από διασταυρούμενη παρουσίαση των αντιγόνων Ε7 απελευθερώνονται από όγκο μετά από σισπλατίνη απόπτωση που επάγεται από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα. Τύπου 1 η παραγωγή της ιντερφερόνης μετά από θεραπεία με CpG χρησιμεύει επίσης για την προώθηση της πολλαπλής παρουσίασης.

Εδώ παρατηρούμε ότι ΡΑϋΚΕ-ειδικά CD4 + Τ κύτταρα είναι σε θέση να σκοτώσει MDSCs μέσω Fas-FasL αλληλεπίδρασης. Εκτός από την ΡΑϋΚΕ-ειδικά CD4 + Τ κύτταρα είναι σε θέση να σκοτώσει MDSCs στο μικροπεριβάλλον του όγκου, οποιαδήποτε άλλα ενεργοποιημένα Τ κύτταρα θα μπορούσαν επίσης να σκοτώσει θεωρητικά MDSCs. Πράγματι, έχουμε δείξει πρόσφατα ότι Ε7-ειδικά CD8 + Τ κύτταρα και ΟΤ-1 Τ κύτταρα είναι ικανά να επάγουν απόπτωση σε MDSCs μετά από θεραπεία με σισπλατίνη, CpG και το πεπτίδιο gp33 (Wu et al, προσωπική επικοινωνία). Μόλις ενεργοποιηθεί, τα κύτταρα CD4 + και CD8 + Τ απελευθερώνουν σχετικές κυτοκίνες όπως IL-2, που οδηγεί σε προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης Fas επί MDSCs. FasL εκφράζεται από τα ενεργοποιημένα Τ ίδια τα κύτταρα. Ως αποτέλεσμα, όταν ένα ενεργοποιημένο Τ κύτταρο συναντήσει ένα MDSC, ο MDSC θα υποβληθεί Fas-FasL απόπτωση [17]. Η αφαίρεση των ανοσοκατασταλτικών MDSCs από το μικροπεριβάλλον του όγκου συμβάλλει στον έλεγχο του όγκου.

Η τρέχουσα μελέτη χρησιμεύει ως μια πλατφόρμα που μπορεί να εφαρμοστεί σε πολλούς ασθενείς με διάφορους καρκίνους. Ένα μοναδικό χαρακτηριστικό του πεπτιδίου PADRE είναι ότι το επιτόπιο αποτελείται από είναι ειδικό για πολλά μόρια MHC τάξης II, και ως εκ τούτου ισχύουν για πολλά άτομα. Επιπλέον, υποθέτουμε ότι η προσέγγιση αυτή δεν απαιτεί αναγνώριση του αντιγόνου του όγκου. Ο πρώτος γύρος της θεραπείας μπορεί να επάγουν θανάτωση των καρκινικών κυττάρων και την απελευθέρωση του αντιγόνου όγκου στο μικροπεριβάλλον του όγκου, καθώς και την παραγωγή του ΡΑϋΚΕ-ειδικά CD4 + Τ κυττάρων (Εικ. 3). Μετά τις επόμενες γύρους θεραπείας, η απελευθέρωση του αντιγόνου όγκου οδηγεί στη διασταυρούμενη εκκίνηση και την παραγωγή του όγκου αντιγόνου-ειδικά CD8 + Τ κύτταρα, τα οποία είναι επίσης σε θέση να σκοτώσει τα καρκινικά κύτταρα (Εικ. 4). Λόγω αυτού του μηχανισμού, δεν είναι απαραίτητο να γνωρίζουμε αντιγόνα ανοσοκυρίαρχο όγκου, καθιστώντας την προσέγγιση δυνητικά ευρέως εφαρμόσιμη.

Δεδομένου ότι η τρέχουσα προσέγγιση περιλαμβάνει εντός του όγκου έγχυση θεραπευτικών παραγόντων, είναι περισσότερο εφαρμόσιμη σε προσβάσιμες όγκους, όπως το κεφάλι και το λαιμό, το δέρμα και του τραχήλου της μήτρας όγκους. Ωστόσο, η προσέγγιση αυτή μπορεί να περιοριστεί σε περίπτωση απρόσιτες όγκων, ένα θέμα που πρέπει να αντιμετωπιστεί με στόχο την περαιτέρω επέκταση αυτής της έννοιας για την κλινική μετάφραση. Αυτό μπορεί να επιλυθεί με την τροποποίηση του πεπτιδίου PADRE να συμπεριλάβει παλιννόστησης όγκου ή περιβάλλον στόχευση όγκου απταμερή. Για παράδειγμα, συνδέτης CD13 έχει δειχθεί ότι είναι ικανή να παρέχει το αντιγονικό πεπτίδιο να loci όγκου [18], [19] και εκμαιεύσει αντιγονο-ειδική απόκριση κατά του όγκου [1]. Επιπλέον, έχουμε δείξει ότι mesothelin και NKG2D μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μονάδες όγκου-homing σε χιμαιρικές πρωτεΐνες, την παράδοση των θεραπευτικών πρωτεϊνών σε τόπους του όγκου [20], [21]. Οι μελλοντικές μελέτες δικαιολογείται να διευρύνει την εφαρμογή της τρέχουσας προσέγγισης σε απρόσιτες όγκους.

Η προσέγγιση που παρουσιάζεται εδώ μπορεί να είναι ένας ιδανικός υποψήφιος για κλινική μετάφραση. Πράγματι PADRE και CpG έχουν δοκιμαστεί σε διάφορες κλινικές δοκιμές και βρέθηκε να είναι ασφαλής.