Αφηρημένο

Ιστορικό και Στόχοι

GLI1, ως απαραίτητο μεταγραφικού παράγοντα της οδού σηματοδότησης Hedgehog, παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος (PC). μεθυλοτρανσφεράσες DNA (DNMTs) διαμεσολαβούν την μεθυλίωση της ποσότητας του όγκου γονιδίων που σχετίζονται. Η μελέτη μας με στόχο να διερευνήσει τη σχέση μεταξύ GLI1 και DNMTs.

Μέθοδοι

Εκφράσεις της GLI1 και DNMTs ανιχνεύθηκαν σε όγκο και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών των ασθενών PC με ανοσοϊστοχημεία (IHC). κύτταρα PANC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με κυκλοπαμίνη και GLI1-siRNA, ενώ BxPC-3 κύτταρα επιμολύνθηκαν με υπερέκφραση-GLI1 φορέα λεντοϊού. Στη συνέχεια, η έκφραση GLI1 και DNMTs αναλύθηκαν από qRT-PCR και Western Blot (WB). Στη συνέχεια πήραμε χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (chip) θα να αποδείξει GLI1 συνδέονται με DNMT1. Τέλος, ελήφθη ένθετα MSP κατά την εκτίμηση των επιπέδων μεθυλίωσης της APC και hMLH1, όταν μεταβάλλεται η έκφραση GLI1.

Αποτελέσματα

IHC αποτέλεσμα πρότεινε τις εκφράσεις του GLI1, DNMT1 και Dnmt3a στους ιστούς PC ήταν όλα υψηλότερες από εκείνες σε παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς (ρ & lt? 0,05). Μετά την έκφραση GLI1 καταστέλλεται από την κυκλοπαμίνη σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης (κάτω ρύθμιση 88,1 ± 2,2%, 86,4 ± 2,2%, αντίστοιχα), DNMT1 και Dnmt3a mRNA και το επίπεδο της πρωτεΐνης μειώθηκαν κατά 91,6% ± 2,2% και 83,8 ± 4,8%, 87,4 ± 2,7% και 84,4 ± 1,3%, αντίστοιχα. Όταν χτύπησε πιο κάτω την έκφραση των GLI1 από siRNA

(

mRNA μειώθηκε κατά 88,6 ± 2,1%, πρωτεΐνες μειώθηκαν κατά 63,5 ± 4,5%), DNMT1 και Dnmt3a mRNA μειώθηκε κατά 80,9 ± 2,3% και 78,6 ± 3,8% και πρωτεΐνη μειώθηκε κατά 64,8 ± 2,8% και 67,5 ± 5,6%, αντίστοιχα. Υπερ-έκφραση του GLI1 με επιμόλυνση γονιδίων GLI1 (mRNA αυξήθηκαν κατά 655,5 ± 85,9%, και η πρωτεΐνη αυξήθηκε κατά 272,3 ± 14,4%.), DNMT1 και Dnmt3a mRNA και πρωτεΐνης αυξάνεται κατά 293,0 ± 14,8% και 578,3 ± 58,5%, 143,5 ± 17,4 % και 214,0 ± 18,9%, αντίστοιχα. δοκιμασίες ChIP έδειξε πρωτεΐνη GLI1 δεσμεύεται να DNMT1 αλλά να μην Dnmt3a. Τα αποτελέσματα των ένθετων MSP έδειξε έκφραση GLI1 επηρεάζεται το επίπεδο μεθυλίωσης του DNA της APC, αλλά δεν hMLH1 στο PC.

Συμπέρασμα

DNMT1 και Dnmt3a ρυθμίζονται από GLI1 στο PC, και DNMT1 είναι άμεση γονίδιο στόχο της .

Παράθεση: Ο S, Wang F, Yang L, Guo C, Wan R, Ke A, ​​et al. (2011) Έκφραση του DNMT1 και Dnmt3a ρυθμίζονται από GLI1 στην Ανθρώπινη καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 6 (11): e27684. doi: 10.1371 /journal.pone.0027684

Επιμέλεια: Xin-γιουάν Guan, Το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Κίνα

Ελήφθη: 5 Ιουλίου 2011? Αποδεκτές: 21 Οκτωβρίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 14 Νοεμβρίου, 2011

Copyright: © 2011 Ο et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Εθνικό Φυσικό Ίδρυμα Επιστημών της Κίνας (81072005, 81172312) και τη Σαγκάη επιστήμης και Τεχνολογίας Επιτροπή (08411963000, 09JC1412200). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια ιδιαίτερα θανατηφόρα ασθένεια, η οποία συνήθως διαγιγνώσκεται σε προχωρημένο στάδιο για το οποίο υπάρχουν ελάχιστα ή καθόλου αποτελεσματικές θεραπείες. Έχει τη χειρότερη πρόγνωση για οποιαδήποτε σημαντική κακοήθειας (3% επιβίωση 5 ετών) και είναι η τέταρτη πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο κάθε χρόνο σε πολλές χώρες. Παρά τις προόδους σε χειρουργική και ιατρική θεραπεία, μικρή επίδραση έχει σημειωθεί όσον αφορά το ποσοστό θνησιμότητας της νόσου αυτής. Ένα από τα σημαντικότερα χαρακτηριστικά του καρκίνου του παγκρέατος είναι εκτεταμένη τοπική εισβολή όγκου της και την πρώιμη συστηματική διάδοσης. Έτσι, είναι επιτακτική η ανάγκη να αποκαλύψει τα βαθύτερα μηχανισμούς με τους οποίους παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα γίνονται επεμβατικές και μεταστατικά.

Hedgehog καταρράκτη σηματοδότησης ενεργοποιούνται ανωμάλως σε μία ποικιλία ανθρώπινων όγκων συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του παγκρέατος (PC) [1]. Η ενεργοποίηση του μονοπατιού Hh απαιτεί η σύνδεση συνδετών Hh, όπως Shh, Ihh και Dhh, να Hh υποδοχέα Patched (Ptch), απελευθερώνοντας έτσι Hh μόριο σηματοδότησης λειαίνονται (ΠΕΑ) από Ptch-επαγόμενη αναστολή. ΠΕΑ με τη σειρά της ενεργοποιεί την απελευθέρωση του παράγοντα μεταγραφής GLI από τον κυτταρικό σκελετό από ένα σύμπλεγμα πρωτεϊνών, διευκολύνοντας έτσι πυρηνική μετατόπιση της, GLI ενεργοποιητές τότε δεσμεύονται στον GACCACCCA-όπως μοτίβο για την μεταγραφική ρύθμιση των γονιδίων στόχων Hedgehog, τα οποία εμπλέκονται στην ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, προσδιορισμός κυττάρου-μοίρα, κυτταρική επιβίωση, και επιθηλιακών-to μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) και μια μεμβράνη κλπ γλυκοπρωτεΐνης Ανθρώπινα Hedgehog πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης (HHIP) μπορεί να συνδέεται προς όλους τους τρεις συνδετήρες και τις λειτουργίες Hh να ρυθμίζουν αρνητικά τη δραστηριότητα του hh σηματοδοτικό μονοπάτι [2], [3].

αλλαγή μεθυλίωση του DNA είναι ένα βασικό παράγοντα που συμβάλλει στην ανθρώπινη ογκογένεση [4]. Σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, η κανονική σωματική πρότυπο μεθυλίωσης του DNA μεταβάλλεται. Αυτές οι αλλαγές περιλαμβάνουν αυξημένη CpG νησιού μεθυλίωση, η οποία μεσολαβεί ογκοκατασταλτικό γονίδιο αποσιώπησης [4], και γονιδιώματος υπομεθυλίωση του DNA, το οποίο μπορεί να οδηγήσει σε γενωμική αστάθεια [5], [6]. Κυτοσίνη μεθυλίωσης του DNA καταλύεται και ρυθμίζεται από μια μικρή οικογένεια μεθυλοτρανσφεράσες DNA (DNMTs), συμπεριλαμβανομένων των DNMT1, Dnmt3a, DNMT3b και DNMT3L [7]. Αν και ο καρκίνος-ειδικές μεταλλάξεις των DNMTs δεν έχουν αναφερθεί, αρκετές μελέτες δείχνουν ότι τα γονίδια DNMT υπερεκφράζονται στον καρκίνο του ανθρώπου και κατά τη διάρκεια του κυτταρικού μετασχηματισμού [8] – [11]. Αρκετοί μηχανισμοί φαίνεται να ευθύνονται για DNMTs υπερ-έκφρασης, συμπεριλαμβανομένης της ανώμαλης έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, αυξημένη mRNA και σταθερότητα της πρωτεΐνης, και η ενεργοποίηση υποκινητή E2F με τη μεσολάβηση DNMTs [11] – [14].

Αν και τα παραπάνω αποδεικτικά στοιχεία δείχνουν ότι οι DNMTs και ενεργό μονοπάτι σηματοδότησης Hh εμπλέκεται τόσο στην ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος, λίγα είναι γνωστά για τη συσχέτιση μεταξύ DNMTs και μελών του μονοπατιού Hh. Εδώ, η μελέτη αυτή έγινε για να διερευνηθεί η έκφραση GLI1 και DNMTs, και τη συσχέτιση μεταξύ τους σε ανθρώπινο καρκίνο του παγκρέατος.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Οι ιστοί καρκίνο του παγκρέατος και της αντίστοιχης μη-καρκινικές πάγκρεας ελήφθησαν από το Νοσοκομείο Σαγκάη Δέκατη Λαϊκό, όπου έχουμε λάβει την έγκριση της δεοντολογίας από την Ιατρική και Επιστήμες της ζωής Επιτροπής δεοντολογίας.

οι κυτταροκαλλιέργειες και φαρμακευτική αγωγή

Ανθρώπινο καρκίνο του παγκρέατος κυτταρική γραμμή PANC-1 και BxPC-3 αναπτύχθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), στρεπτομυκίνη 100 μg /ml, και πενικιλλίνη 100 U /ml στους 37 ° C σε 5% CO2 και 95% αέρα υγρή ατμόσφαιρα θερμοκοιτίδα. BxPC-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν για λεντοϊού επιμόλυνση υπερέκφραση-GLI1 φορέα λεντοϊού. κύτταρα PANC-1 επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 4 × 10

4 κύτταρα /cm

2 σε μια έξι-φρεατίων, κυκλοπαμίνη (Sigma, St. Louis, ΜΟ) διαλύθηκε σε 100% αιθανόλη και στη συνέχεια αραιώνεται φρέσκο ​​την ημέρα της δοκιμής για πειράματα κυτταροκαλλιέργειας. κύτταρα PANC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με την τελική συγκέντρωση της κυκλοπαμίνης σε 10 μΜ για 24 ώρες.

ανοσοϊστοχημεία (IHC)

Είκοσι ζεύγη PC και αντίστοιχα μη καρκινικούς ιστούς παγκρέατος λήφθηκαν από τη Σαγκάη Νοσοκομείο δέκατο Λαϊκής. τομές όγκων του παγκρέατος των ασθενών ήταν de-paraffinised, επανυδατώθηκαν, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10 mM κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα στους 95 ° C για να ανακτήσετε αντιγόνα, αποκλείστηκαν με 5% BSA, και επωάζονται με ποντικού αντι-GLI1 (1:100), κουνελιού αντι-DNMT1 ( αντισώματος 1:100) ή κουνέλι αντι-Dnmt3a (1:100? όλα από Santa Cruz Biotech) τη διάρκεια της νύχτας. Οι τομές του ιστού στη συνέχεια επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα και το αντιδραστήριο DAB (Gene Tech, Σαγκάη, Κίνα). Οι τομές στη συνέχεια με αιματοξυλίνη, τότε αφυδατώθηκαν και οπτικοποιήθηκαν με 3,3-διαμινοβενζιδίνη (Gene Tech, Σαγκάη, Κίνα). Οι αρνητικοί έλεγχοι πραγματοποιήθηκαν σε κάθε περίπτωση με την αντικατάσταση του πρωτογενούς αντισώματος με PBS.

RT-PCR και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR)

Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα PANC-1 χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, California, USA), 1 μg RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας κιτ αντιδραστηρίου PrimeScript RT (Takara Bio, Shiga, Japan). Για τον προσδιορισμό της ποσότητας του mRNA, το cDNA ενισχύθηκε με PCR πραγματικού χρόνου με το κιτ SYBR πρόμιγμα Ex Taq RT-PCR (Takara Bio, Shiga, Japan), και η οικοκυρική γονίδιο β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Οι προσδιορισμοί Πράσινο SYBR εκτελέστηκαν εις τριπλούν σε ένα όργανο σε πραγματικό χρόνο 7900HT (Applied Biosystems, CA, USA). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για qRT-PCR εισήχθηκαν (Πίνακας 1). Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης υπολογίστηκαν με τη χρήση του 2

-ΔΔCT

μέθοδο.

Η

Western Blot (WB)

Σύνολο λύμα κυττάρων παρασκευάστηκε σε ένα 1 × ρυθμιστικό δωδεκυλοθειικό νάτριο. Οι πρωτεΐνες στο ίδιο ποσό διαχωρίστηκαν με 6% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF) μεμβράνες. Μετά την επώαση με αντισώματα ειδικά για DNMT1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ή Dnmt3a (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ή GLI1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ή β-ακτίνης (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ), τα στυπώματα επωάστηκαν με αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού ή δευτερεύον αντίσωμα αντι-ποντικού (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) και οπτικοποιούνται με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια.

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA διαμεσολαβούμενη αναστολή της έκφρασης GLI1

Stealth μικρή παρεμβολή RNA (siRNA) ακολουθίες για GLI1 σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν από GenePharma να στοχεύσετε GLI1 mRNA. Κωδικοποιητικού κλάδου GLI1 siRNA ήταν 5′-GGCTCAGCTTGTGTGTAAT-3 ‘. Ένα άσχετο αλληλουχία siRNA χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Σε αυτό το πείραμα, τα κύτταρα επωάστηκαν για 12 ώρες και επιμολύνθηκαν σε περίπου 60% συρροή με 50 nm siRNA διπόλων χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση.

λεντοϊών Επιμόλυνση υπερέκφρασης-GLI1 φορέα λεντοϊού

λεντοϊών επιμόλυνση υπερέκφραση-GLI1 φορέα λεντοϊού pGC-FU GLI1 διεξήχθησαν όπως αναφέραμε προηγουμένως [ ,,,0],15]. GLI1 cDNA του ανθρώπου αγοράστηκε από την Open-Biosystem (USA). Η πλήρης αλληλουχία του cDNA της GLI1 δημιουργήθηκε με PCR και εισάγεται στο pGC-FU-3FLAG Vector (GeneChem Εταιρείας, Σαγκάη, Κίνα), η οποία ευθυγραμμίστηκε με το

Age Ι

και

Nhe Ι

( Εικ. S1, S2). Το προκύπτον 3320-bp επιβεβαιώθηκε με αλληλούχιση (Εικ. S3). Φορέα λεντοϊού παρήχθησαν με συν-επιμολύνθηκε σε κύτταρα 293Τ με βοηθητικό μόρφωμα. Οι τίτλοι των 2-5 × 10

7 TU /ml συνήθως επιτυγχάνεται. BxPC-3 κύτταρα επιμολύνθηκαν με την έκφραση βραδέος ιού φορέα και GLI1 ιδρύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR και ανάλυση στυπώματος western.

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (μάρκας)

DNA-GLI1-πρωτεΐνη ανοσοσυμπλόκων ήταν preparated όπως έχουμε ήδη αναφερθεί [15], μετά από αντίστροφη σταυροδεσμούς, το DNA εκχυλίζεται με φαινόλη /χλωροφόρμιο και καταβυθίστηκε. Η παρουσία της περιοχής προαγωγού DNMT1 και Dnmt3a περιέχουν μοτίβα GLI1 σε άνοσο DNA ταυτοποιήθηκε με PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές (Πίνακας 2). Οι συνθήκες της PCR για την περιοχή προαγωγού DNMT1 και Dnmt3a ήταν: μετουσίωση 30 δευτερόλεπτα στους 94 ° C, ανόπτηση 30 s, επιμήκυνση 1 λεπτό στους 72 ° C. θερμοκρασίες αναδιάταξης που παρατίθενται στον πίνακα 2. Η ενίσχυση του DNMT1 και υποκινητή Dnmt3a περιοχή αναλύθηκε μετά από 40 κύκλους. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Η

προετοιμασία του DNA

DNA εξήχθησαν από TIANamp Genomic DNA Kit (Tiangen, Πεκίνο, Κίνα). Περίπου 500 ng εξάγεται DNA ήταν όξινο θειώδες συνομίλησαν και της στήλης-καθαρίζεται με EZ μεθυλίωσης του DNA-Gold ™ Kit (Zymo Έρευνας, Orange, CA, USA) για να κάνει το δείγμα 10 μl.

Φωλιά MSP

DNA κατάστασης μεθυλίωσης στις περιοχές υποκινητή της APC (αδενωματώδη πολυποδίαση coli) και hMLH1 (ανθρώπινη mutL ομόλογο 1) προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο του MSP τροποποιείται περαιτέρω ως ένθετη δύο στάδια προσέγγιση με τους εκκινητές που περιγράφηκαν προηγουμένως [16], [17 ]. Στο πρώτο βήμα της ένθετων MSP, εκκινητές σχεδιάστηκαν για να ενισχύσουν τόσο μεθυλιωμένων και μη-μεθυλιωμένων γονιδιωματικές περιοχές. Τα προϊόντα ήταν εξίσου αραιώνονται 1:100 και υποβάλλονται στο στάδιο δύο της ένθετων MSP με εκκινητές σχεδιάστηκαν για να αναγνωρίζουν τις διαφορές αλληλουχία διθειώδες επαγόμενη μεταξύ μεθυλιωμένων και μη μεθυλιωμένων γονιδιωματικές περιοχές. Οι συνθήκες της PCR για το βήμα ένα ήταν ως εξής: 95 ° C καυτό ξεκινήσει × 5 λεπτά, στη συνέχεια 40 επαναλαμβανόμενους κύκλους αποδιάταξης (95 ° C χ 30 s), ανασύνδεση (56 ° C χ 30 s), επέκταση (72 ° C × 30 s) ακολουθούμενη από μία τελική επέκταση 5 λεπτών στους 72 ° C. Και αυτό για το Βήμα δύο ήταν: 95 ° C καυτό ξεκινήσει × 5 λεπτά, στη συνέχεια 30 επαναλαμβανόμενους κύκλους αποδιάταξης (95 ° C χ 30 s), ανασύνδεση (59 ° C χ 30 s για την APC, 60 ° C χ 30 s για hMLH1 ), επέκταση (72 ° C χ 30 s) ακολουθούμενη από μία τελική επέκταση 5 λεπτών στους 72 ° C. προϊόντα MSP διαχωρίστηκαν ηλεκτροφορητικά σε πηκτώματα αγαρόζης 2%.

Στατιστική Ανάλυση

Τα ποσοτικά δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD). Real-time PCR δεδομένα αναλύθηκαν σύμφωνα με τις διαφορές της έκφρασης γονιδίου-στόχου από το paired t-test και ήταν 2

-ΔΔCT

μετασχηματισμένο πριν από την ανάλυση. δεδομένα IHC αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το Chi-τετράγωνο τεστ. Μια ρ-τιμή μικρότερη του 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

GLI1, DNMT1 και Dnmt3a ήταν επάνω-ρυθμίζονται σε ανθρώπινο παγκρέατος καρκινικούς ιστούς

Για να επιβεβαιώσετε τους ρόλους της GLI1 και DNMTs στην ανάπτυξη του ανθρώπινου καρκίνου του παγκρέατος, που εξέτασε πρώτα κατά πόσον οι εκφράσεις τους μεταβλήθηκαν σε καρκινικούς ιστούς. Ως εκ τούτου, μελετήσαμε GLI1, DNMT1 και έκφραση Dnmt3a σε 20 ζεύγη βιοψία ιστούς των ασθενών PC από την IHC. Βρήκαμε ότι GLI1, DNMT1 και έκφραση Dnmt3a ήταν όλα υψηλότερα στις περισσότερες PC σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς (14/20 έναντι 5/20, p = 0,004? 15/20 έναντι 6/20, p = 0,004? 13/20 έναντι 5 /20, ρ = 0,011? αντίστοιχα? Σχήμα 1). 14 από 20 περιπτώσεις PC είχαν υψηλότερη έκφραση της πρωτεΐνης GLI1, μεταξύ των οποίων 12 υποθέσεις που εκφράζονται υψηλότερα επίπεδα της πρωτεΐνης DNMT1 (p = 0,004) και 11 περιπτώσεις εκφράζονται υψηλότερα επίπεδα Dnmt3a πρωτεΐνης (p = 0,012).

Η ανοσοϊστοχημική εξέταση για GLI1, DNMT1, Dnmt3a πρωτεΐνης διεξήχθησαν σε 20 ζεύγη PC και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών. Αντιπροσωπευτικά εικόνες που παρουσιάζονται. Δίπλα φυσιολογικούς ιστούς εμφάνισε καμιά ή λιποθυμία χρώση για GLI1, DNMT1 και Dnmt3a, ωστόσο, η συχνότητα εμφάνισης όλων των τριών πρωτεϊνών πυρηνικής ανοσοαντιδραστικότητα ήταν πολύ υψηλότερη σε ιστούς PC. Όλες οι μικροφωτογραφίες λήφθηκαν σε × 200 μεγέθυνση.

Η

Η κυκλοπαμίνη και GLI1 siRNA τόσο ανέστειλε DNMT1 και Dnmt3a έκφραση

Για να καθοριστεί εάν δραστηριότητα Hh επηρέασαν την έκφραση DNMTs, χρησιμοποιήσαμε κυκλοπαμίνη, ένα κλασική αναστολέας της οδού σηματοδότησης Hh, να μειώσουν την έκφραση των GLI1. κύτταρα PANC-1, που είχαν αναφερθεί στο παρελθόν για να εκφράσει ένα υψηλό επίπεδο GLI1 [15], υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ κυκλοπαμίνη για 24 ώρες. Κατόπιν, qRT-PCR και WB ελήφθησαν για την ανάλυση της έκφρασης του GLI1 και DNMTs. DNMT1 και Dnmt3a mRNA μειώθηκε κατά 91.6.0 ± 2,2% και 83,8 ± 4,8%, αντίστοιχα, όταν GLI1 mRNA μειώθηκαν κατά 88,1 ± 2,2%. DNMT1 και πρωτεΐνη Dnmt3a μειώθηκε κατά 87,4 ± 2,7% και 84,4 ± 1,3%, όταν GLI1 πρωτεΐνη μειώθηκε κατά 86,4 ± 2,2% (Σχήμα 2).

κύτταρα PANC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 10 μΜ κυκλοπαμίνη για 24 ώρες, στη συνέχεια σχετική έκφραση GLI1, DNMT1 και Dnmt3a mRNA εκτιμήθηκε με qRT-PCR (Α, Β, C), ενώ η έκφραση του GLI1, DNMT1 και πρωτεΐνη Dnmt3a αναλύθηκε με κηλίδα Western (D). Το ένθετο δείχνει μια σημαντική μείωση στην GLI1, DNMT1 και έκφραση Dnmt3a. Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν προς εκείνη της έκφρασης β-ακτίνης. Όλα τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων.

Η

περαιτέρω σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν GLI1 siRNA, τότε επιμολύνθηκε σε PANC-1 κυτταρική γραμμή. PANC-1 κύτταρα επιμολυσμένα με μια άσχετη αλληλουχία siRNA χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος [18], και PANC-1 που έλαβαν αγωγή με Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) χρησιμοποιήθηκε μόνο ως τυφλός μάρτυρας. 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, qRT-PCR και WB ελήφθησαν για τον προσδιορισμό της έκφρασης των GLI1 και DNMTs. DNMT1 και Dnmt3a mRNA μειώθηκε κατά 80,9 ± 2,3% και 78,6 ± 3,8%, αντίστοιχα, όταν GLI1 mRNA μειώθηκε κατά 88,6 ± 2,1%. DNMT1 και πρωτεΐνη Dnmt3a μειώθηκε κατά 64,8 ± 2,8% και 67,5 ± 5,6% όταν GLI1 πρωτεΐνη μειώθηκε κατά 63,5 ± 4,5% (Σχήμα 3).

PANC-1 κύτταρα επιμολύνθηκαν με GLI1 siRNA, 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, σχετική έκφραση GLI1, DNMT1 και Dnmt3a mRNA εκτιμήθηκε με qRT-PCR (Α, Β, C), ενώ η έκφραση του GLI1, DNMT1 και πρωτεΐνη Dnmt3a αναλύθηκε με κηλίδα Western (D). Το ένθετο δείχνει μια σημαντική μείωση στην DNMT1 και την έκφραση Dnmt3a μετά από παρέμβαση GLI1. Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν προς εκείνη της έκφρασης β-ακτίνης. Όλα τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Η έκφραση της DNMT1 και Dnmt3a ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω με GLI1 υπερέκφραση

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η ρύθμιση των DNMT1 και Dnmt3a από GLI1, έχουμε σχεδιάσει και κατασκευάσει ένα ενδιάμεσο ξενιστή ιού lenti που υπερεκφράζονται GLI1, και επιμολύνθηκαν σε αυτό BxPC-3 με τη χαμηλότερη έκφραση GLI1 σε κυτταρικές σειρές PC όπως προηγούμενα αναφερθεί [15]. Κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορέα φακοϊό χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι, ενώ κύτταρα χωρίς διαμόλυνση χρησιμοποιήθηκαν ως τυφλό μάρτυρες. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, qRT-PCR και WB ελήφθησαν για τον προσδιορισμό της έκφρασης των GLI1 και DNMTs στις τρεις κυτταρικές σειρές. DNMT1 και Dnmt3a mRNA αυξήθηκαν κατά 293,0 ± 14,8% και 578,3 ± 58,5%, αντίστοιχα, όταν GLI1 mRNA αυξήθηκαν κατά 655,5 ± 85,9%. DNMT1 και πρωτεΐνη Dnmt3a αυξήθηκε κατά 143,5 ± 17,4% και 214,0 ± 18,9%, αντίστοιχα, όταν GLI1 πρωτεΐνη αυξήθηκε κατά 272,3 ± 14,4% (Σχήμα 4).

BxPC-3 κύτταρα επιμολύνθηκαν με pGC-FU GLI1 , σχετική έκφραση GLI1, DNMT1 και Dnmt3a mRNA εκτιμήθηκε με qRT-PCR (Α, Β, C), ενώ η έκφραση του GLI1, DNMT1 και πρωτεΐνη Dnmt3a αναλύθηκε με κηλίδα Western (D). Το ένθετο παρουσίασαν σημαντική αύξηση σε DNMT1 και έκφραση Dnmt3a μετά GLI1 υπερ-έκφραση. Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν προς εκείνη της έκφρασης β-ακτίνης. Όλα τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων.

Η

Επιβεβαίωση πρωτεΐνης GLI1 δεσμεύεται με την περιοχή προαγωγού του γονιδίου DNMT1

Έχουμε, μέχρι τώρα, απέδειξαν το ρόλο του GLI1 στην έκφραση DNMT1 και DNMT3. Ωστόσο, ο μηχανισμός στηρίζεται τέτοια ρύθμιση παραμένει να διευκρινιστεί. Να διερευνήσει κατά πόσον οι DNMTs ρυθμίζονται απευθείας από GLI1 ή όχι, ψάξαμε το DNMT1 και Dnmt3a υποστηρικτής για πιθανές θέσεις πρόσδεσης GLI1 με την συναινετική αλληλουχία DNA 5′-GACCACCCA-3 ‘[19] ή 5′-TGGGTGGTC-3′ [20] και πέντε υψηλής βαθμολόγησης υποψήφιους χώρους των στόχων GLI1 βρέθηκαν σε προαγωγό και έξι στην Dnmt3a του DNMT1 του. Κάθε περιοχή έχει διαφορά μόνο δύο νουκλεοτιδίων σε συγκρίσεις με 5’-GACCACCCA-3 ‘ή 5′-TGGGTGGTC-3’ (Εικόνα 5). ChIP λήφθηκε για να επιβεβαιώσει τη σχέση οριοθέτησης μεταξύ πρωτεΐνης GLI και γονιδιακών /3α DNMT1. DNA εκχυλίζεται από κύτταρα PANC-1 υποβλήθηκαν σε υπερήχους σε 100-1000 bp (Εικ. S4) και ως μήτρα τσιπ PCR. Το αποτέλεσμα της ηλεκτροφόρησης DNA έδειξε την προβλεπόμενη ζώνη DNA σε ΕΙΣΟΔΟΥ, GLI1-Ab, και postive ομάδες ελέγχου με χρήση ανθρώπινων DNMT1 εκκινητή-C, και όχι στο IgG και ομάδες αρνητικού ελέγχου (Σχήμα 6). Μόνο INPUT και ο θετικός έλεγχος έδειξε την προβλεπόμενη ζώνη χρησιμοποιώντας ανθρώπινα DNMT1 εκκινητή-Α, Ο-Ε και Dnmt3a εκκινητή Α-Ε αλλά όχι σε GLI-Ab, IgG, και αρνητικές ομάδες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως θετικοί προϊόν ενισχύθηκε με DNMT1 εκκινητή-C περιέχει υποψήφια τοποθεσία GLI1 πρόσδεσης 2 και 3 (Πίνακας 2 και Σχήμα 5), ενώ το προϊόν ενισχύθηκε με DNMT1 εκκινητή-Β περιέχει θέση δέσμευσης υποψήφιας GLI1 2 ήταν αρνητικά, και τα αποτελέσματα της ανάλυσης αλληλουχίας έδειξε ότι η αλληλουχίες ήταν η ίδια με εκείνη του γονιδίου DNMT1 υποκινητή του θέση 3 (Εικ. S5), πρότεινε ότι GLI1 συνδέθηκε με το γονίδιο DNMT1 υποκινητή του θέση 3 (GGCCTCCCA).

Δύο παράλληλες γραμμές πάνω από την ψηφίο που παριστάνεται DNMT1 ή Dnmt3a DNA, αντίστοιχα (Α, Β), εντός της οποίας γκρι πλαίσιο παριστάνονται εξώνια, λευκά πλαίσια εκπροσωπούνται ιντρόνια και μαύρα πλαίσια εκπροσωπούνται υποκινητή. Στην υποκινητή, μικρό γκρι πλαίσια που σημειώνονται με τον αριθμό 1 έως 5 (Α) ή 1 έως 6 (Β) που αντιπροσωπεύεται του δυναμικού θέσεις δέσμευσης GLI1, η οποία έχει μόνο δύο νουκλεοτίδια διαφορά (υπογραμμισμένη) από αλληλουχία πρόσδεσης GLI1 συναίνεση, GACCACCCA. Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν για να ενισχύσουν το DNMT1 (Α) ή περιοχή υποκινητή Dnmt3a (Β) που περιέχει το υποτιθέμενο GLI1-θέση πρόσδεσης. Η θέση και το μήκος των προϊόντων amplificated από κάθε εκκινητή δείχθηκε.

Η

Τα υλικά λύσεως από κύτταρα PANC-1 υποβλήθηκαν σε ανοσοκαθίζηση χρωματίνης από αντι-GLI1 αντίσωμα. Κατεργασία με υπερήχους χρωματίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος ΕΙΣΟΔΟΣ DNA (INPUT). RNA πολυμεράση II χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος (PC). IgG χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος τυχαία (IgG) και β-ακτίνη Ab χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος (NC). Η μπάντα του τσιπ PCR προϊόντα ενισχύθηκαν με DNMT1 Primer-C (i) και με DNMT1 Primer-Β (ii) έχουν δείξει.

Η

Τα επίπεδα μεθυλίωσης του DNA του APC αλλά όχι περιοχές υποκινητή hMLH1 άλλαξε με GLI1 έκφραση

Ποσό των γονιδίων των όγκων που σχετίζονται με βρέθηκαν να σιγήσει μεθυλίωσης του DNA στον υπολογιστή, συμπεριλαμβανομένων των APC (αδενωματώδη πολυποδίαση coli) και hMLH1 (ανθρώπινη mutL ομόλογο 1). Για να αποκτήσετε πρόσβαση είτε την αναστολή ή την αύξηση της έκφρασης των GLI1 θα μπορούσε επίσης να οδηγήσει σε υπο- ή υπερ-μεθυλίωση της APC και hMLH1 στο PC, χρησιμοποιήσαμε ένθετα MSP για την αξιολόγηση της κατάστασης μεθυλίωσης του PANC-1 με ή χωρίς GLI1 νοκ ντάουν και BxPC-3 με ή χωρίς GLI1 υπερ-έκφραση, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το επίπεδο μεθυλίωσης APC DNA αυξήθηκε σε BxPC-3 κύτταρα επιμολυσμένα με υπερέκφραση-GLI1 φορέα λεντοϊού σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο, και αναστάλθηκε σε κύτταρα PANC-1 επιμολυσμένα με GLI1-siRNA σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο. Ωστόσο, το επίπεδο μεθυλίωσης του DNA του περιοχής προαγωγού hMLH1 δεν άλλαξε σημαντικά μετά την επιμόλυνση (Σχήμα 7). Αυτό πιθανώς επειδή μεθυλίωσης του DNA συντονίζεται από μια οικογένεια DNMTs περιλαμβάνει DNMT1, 3a, -3β και -3L, ίσως η αλλαγή έκφραση μόνο DNMT1 και 3α ρυθμίζονται από GLI1 δεν ήταν αρκετή για να επηρεάσει τα επίπεδα μεθυλίωσης του DNA του κάθε από όγκο σχετικά γονίδια [21].

Αποτελέσματα ένθετων MSP της APC και hMLH1 σε έξι είδη των κυττάρων PC αντίστοιχα δείχθηκαν. Β εκπροσωπείται BxPC-3 κύτταρα? B-G + εκπροσωπούνται BxPC-3 επιμολυσμένα με pGC-FU-GLI1 να GLI1 υπερ-έκφρασης, και Β-NC εκπροσωπείται αρνητικού ελέγχου της? Ρ εκπροσωπείται PANC-1? P-G-σι εκπροσωπούνται PANC-1 επιμολυσμένα με GLI1-siRNA και P-NC εκπροσωπείται αρνητικού ελέγχου του. Θετικές ζώνες υπό Μ και U αντιπροσώπευε το μετουσιωμένο και μη μεθυλιωμένο DNA των αντίστοιχων γονιδίων στη δεξιά πλευρά, αντίστοιχα.

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι GLI1, DNMT1 και Dnmt3a οι υπερ-εκφράζεται σε ιστούς PC σε σύγκριση με τις αντίστοιχες μη-καρκινικούς ιστούς παγκρέατος, τότε δείξαμε ότι DNMT1 και έκφραση Dnmt3a αλλάζει σύμφωνα με την έκφραση GLI1 σε κυτταρικές σειρές PANC-1 και BxPC-3 από ειδικές παρεμβολές GLI1 και γονίδιο επιμόλυνση, καθώς και φαρμακολογική μέθοδο

in vivo

. Το πιο σημαντικό, έχουμε αποδείξει πέρα ​​από κάθε λογική αμφιβολία ότι GLI1 ήταν σε θέση να συνδεθεί με το γονίδιο DNMT1 υποστηρικτής του site 3 (GGCCTCCCA) από τα πειράματα του τσιπ. Τέλος, χρησιμοποιήσαμε ένθετα MSP για να αποδείξει ότι η έκφραση GLI1 επηρεάζεται το επίπεδο μεθυλίωσης του DNA της APC, αλλά δεν hMLH1 στο PC. Για το καλύτερο της γνώσης μας, αυτή είναι η πρώτη έκθεση κατέδειξε GLI1 ως μεταγραφικός παράγοντας που ρυθμίζονται DNMT1 και 3α της έκφρασης, καθώς και το επίπεδο μεθυλίωσης APC στο PC, και DNMT1 είναι άμεση γονίδιο στόχο της.

GLI1, ως μεταγραφικός παράγοντας του μονοπατιού σηματοδότησης Hh, υπερεκφράζεται στους περισσότερους όγκους πεπτικό συμπεριλαμβανομένων PC [22], [23]. Μέχρι τώρα, μόνο μερικά κατάντη στόχοι της GLI1 έχουν εντοπιστεί [24]. Πρόσφατα, αναφέρθηκε ότι εμπλέκεται σε PC εισβολή και μετάσταση, και έχει γίνει ένας νέος στόχος για τη θεραπεία [25], [26]. Ωστόσο, λίγα ήταν γνωστά για τον πραγματικό μηχανισμό υπονοείται στην προώθηση της εισβολής και της μετάστασης στο PC. Επιπλέον, εστιάσαμε στην συσσώρευση αποδεικτικά στοιχεία που έδειξαν ότι καρκίνωμα σε διάφορα όργανα, συμπεριλαμβανομένου του παγκρέατος, σχετίζεται με παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του DNA, στην οποία DNMTs είναι το κλειδί καταλύτης συσχετίστηκε σημαντικά με συσσώρευση μεθυλίωσης των γονιδίων όγκων που σχετίζονται, μεταξύ των οποίων μερικοί συνδέθηκαν withcell πολλαπλασιασμό, όπως APC, ορισμένοι είχαν σχέση με την αποκατάσταση της βλάβης του DNA, όπως hMLH1, μερικοί ήταν invasion- ή μετάστασης που σχετίζονται, όπως ΤΙΜΡ-3, SPARK, και Cdh1, ή κυτταρικό θάνατο που σχετίζονται όπως DAPK-1, έτσι παίζουν σημαντικό ρόλο στην πολυβάθμια καρκινογένεση του παγκρέατος από νωρίς προκαρκινικών σταδίων για κακοήθη εξέλιξη [27]. Πρόσφατα, βρέθηκε ότι το φορτίο του όγκου μειώνεται σημαντικά με τη μείωση των επιπέδων DNMT1

in vivo

, γεγονός που υποδηλώνει ότι DNMTs μεσολάβηση DNA μεθυλίωση εμπλέκεται σε παγκρεατικά καρκινογένεση [28]. Με βάση αυτή τη μελέτη και τις προηγούμενες εκθέσεις παραπάνω, είναι πιθανό ότι GLI1-DNMTs καταρράκτη βοήθεια στην εισβολή ή μετάσταση μέσω της προώθησης της μεθυλίωσης μερικών invasion- ή μετάστασης που σχετίζονται με τα γονίδια, και μπορεί να διευκολύνει την ανάπτυξη του όγκου με την προώθηση της μεθυλίωσης κάποιου κυτταρικού θανάτου που σχετίζονται με γονίδια.

η μελέτη μας έδειξε ότι η έκφραση Dnmt3a ρυθμίζεται από GLI1 σε ανθρώπινο καρκίνο του παγκρέατος. Ωστόσο, ο πραγματικός μηχανισμός στη ρύθμιση της Dnmt3a από GLI1 είναι ακόμα άγνωστη. Τα τελευταία χρόνια, έχουν πολλά χειρόγραφα αναφερθεί ότι κάποιες οικογένειες microRNA θα μπορούσε να στοχεύσει DNMTs σε μια ποικιλία καρκίνων του ανθρώπου [29] – [32]. Από την άλλη πλευρά, είχε αναφερθεί ότι μερικοί microRNA όπως microRNA-29 οικογένεια μεταγραφική καταστολή από το c-myc, hedgehog και NF-κΒ [33]. Με βάση τα παραπάνω στοιχεία, είναι πιθανό ότι HH-GLI μπορεί να ρυθμίσει Dnmt3a μέσα από κάποιες συγκεκριμένες microRNAs, το οποίο μένει να διερευνηθεί.

Στη μελέτη μας, οι αναλύσεις έδειξαν ChIP GLI1 συνδέονται με DNMT1 αλλά όχι Dnmt3a. Παρατηρήσαμε επίσης ότι GLI1 αυξημένα Dnmt3a περισσότερες πτυχές από DNMT1. Νομίζαμε ότι υπήρχαν κάποιες πιθανές υποκείμενων μηχανισμών ως εξής: Πρώτον, GLI1 δεν μπορεί να ρυθμίσει Dnmt3a άμεσα, αλλά μέσω ενός συγκεκριμένου γονιδίου, το οποίο θα μπορούσε να είναι μια κινάση ή ακτιβίνης, και μέσω της ενίσχυσης καταρράκτη, έτσι ώστε να οδηγήσει σε υψηλότερη ρυθμιστική αποτελεσματικότητα της Dnmt3a από GLI1. Δεύτερον, Hedghog-GLI1 μπορούσε ρυθμίζουν άμεσα ή έμμεσα αρκετά γονίδια που εμπλέκονται σε διαφορετικές οδούς σηματοδότησης, και δύο ή περισσότερα από αυτά τα γονίδια ρυθμίζουν επίσης Dnmt3a και έχουν συνεργικά αποτελέσματα, έτσι ώστε παρά GLI1 μην ρυθμίζουν άμεσα Dnmt3a, αλλά θα ανυψώσει Dnmt3a περισσότερες πτυχές όταν το υπερ-εκφράζει. Για να λυθεί αυτό το ζήτημα, είναι απαραίτητο να διερευνηθούν περισσότερα γονίδια-στόχους του Hedgehog-GLI1, και να διερευνήσουν τη στιχομυθία μεταξύ των διαφόρων μονοπατιών σηματοδότησης. Νομίζαμε ότι η κανονιστική σχέση μεταξύ HH-GLI1 και DNMTs δεν θα ήταν τόσο απλό όπως έχουμε ήδη επιβεβαιωθεί. Περαιτέρω μελέτες χρειάζονται επίσης να διερευνήσει κατά πόσον η βιολογική συμπεριφορά των GLI1 στο PC μπορεί να επιτευχθεί με τη ρύθμιση DNMTs.

Το πρόσφατα εντοπίστηκαν GLI1 /DNMTs άξονα που μια γέφυρα μεταξύ Hh μονοπατιού σηματοδότησης και επιγενετική, η οποία θα βοηθήσει να φωτιστούν ο υποτακτικός μοριακός μηχανισμός για την ανάπτυξη του PC, και μπορούν να παρέχουν νέων θεραπευτικών στόχων ή βιοδεικτών για την έγκαιρη διάγνωση.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Αναγνώριση των θετικού κλώνου προϊόντων σε υπερέκφραση-GLI1 κατασκευή φορέα λεντοϊού. Τα προϊόντα GLI1 cDNA εισήχθησαν εντός γραμμικοποιημένο φορέα pGC-FU 3FLAG να κατασκευάσει pGC-FU GLI1 πλασμιδίου μετά ενισχύεται και καθαρίζεται, στη συνέχεια μετασχηματίζονται σε κατάλληλα κύτταρα. Τα μετασχηματισμένα κύτταρα αναγνωρίζονται με PCR και ηλεκτροφόρηση σε 1.5% πηκτή αγαρόζης, τα μετασχηματισμένα-1 και -4 είχαν έδειξε ως bp ταινία 731 η οποία αποδείχθηκε ότι είναι θετικός κλώνος

doi:. 10.1371 /journal.pone.0027684.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Προσδιορισμός της έκφρασης GLI1 σε pGC-FU-GLI1 κλώνος με WB. pGC-FU-GLI1 κατασκευάζεται ως ένας φορέας λεντοϊού που εκφράζεται GLI1, το οποίο συν-εκφράζεται με FLAG. (1) WB μοριακού βάρους Marker, με ετικέτα 3-FLAG, λιωμένο με το γονίδιο GFP (48 kDa). (5-8) Δείγμα μετά pGC-FU-GLI1 κύτταρα 293Τ. (7) πρωτεΐνη σύντηξης GLI1-FLAG (122 KDa + 2 KDa = 124 kDa), πιστοποιημένη έκφραση GLI1 σε pGC-FU-GLI1 πλασμίδιο

doi:. 10.1371 /journal.pone.0027684.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

ανάλυση της αλληλουχίας του θετικού κλώνου προϊόντων σε GLI1-υπερέκφραση κατασκευή φορέα λεντοϊού. Το προκύπτον 3320-bp επιβεβαιώθηκε με αλληλούχιση οποία είναι η ίδια με την αλληλουχία της περιοχής γονιδιακής έκφρασης GLI1 στην GenBank (NM_005269.2)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0027684.s003

(TIF )

Εικόνα S4.

Electropheretogram του σε υπερήχους λύση χρωματίνης. διάλυμα υφίσταται κατεργασία με υπερήχους χρωματίνη σε διαφορετικές συνθήκες (100 W, 80 W και 60 W, αντιστοίχως) υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε 1,5% γέλη αγαρόζης που περιέχει αιθίδιο bromied

doi:. 10.1371 /journal.pone.0027684.s004

(TIF)

Εικόνα S5.

ανάλυση της αλληλουχίας των προϊόντων ChIP οποία ενισχύεται από DNMT1 αστάρι-C. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι η αλληλουχία ενισχύθηκε με DNMT1 εκκινητή-C είναι η ίδια με εκείνη της περιοχής του γονιδίου DNMT1 προαγωγού που περιέχει GLI1 θέση πρόσδεσης 2 και 3.

DOI: 10.1371 /journal.pone.0027684.s005

(TIF )