Αφηρημένο

Ιστορικό και Σκοπός

NAD (P) H: κινόνη οξειδορεδουκτάσης 1 (NQO1) μείωση μεσολάβηση κινόνης και μετέπειτα UDP-γλυκουρονοσυλτρανσφερασών (UGTs) καταλύεται γλυκουρονιδίωση είναι η κυρίαρχη μεταβολικό μονοπάτι της Tanshinone ΙΙΑ (TSA), ένα πολλά υποσχόμενο αντικαρκινικό παράγοντα. UGTs θετικά εκφράζονται σε διάφορους ιστούς όγκων και παίζουν σημαντικό ρόλο στη μεταβολική αποβολή του TSA. Η μελέτη αυτή έχει ως στόχο να διερευνήσει το ρόλο των UGT1A στον καθορισμό του ενδοκυτταρική συσσώρευση και την προκύπτουσα αποπτωτική δράση της TSA.

πειραματική προσέγγιση

Εξετάσαμε TSA ενδοκυτταρική συσσώρευση και γλυκουρονιδίωση στο ΗΤ29 (UGT1A θετικό) και HCT116 (UGT1A αρνητικό) ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου. Εξετάσαμε επίσης TSA μεσολάβηση αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) παραγωγή, κυτταροτοξικότητα και αποπτωτικό αποτέλεσμα σε ΗΤ29 και κύτταρα HCT116 να διερευνηθεί εάν τα επίπεδα UGT1A συνδέονται άμεσα με TSA αντικαρκινικό αποτέλεσμα. UGT1A siRNA ή προποφόλη, ένα UGT1A9 συναγωνιστικό αναστολέα, χρησιμοποιήθηκε για να αναστείλει την έκφραση ή τη δραστηριότητα UGT1A UGT1A9.

Βασικά Αποτελέσματα

πολλαπλές ισομορφές UGT1A θετικά εκφράζονται σε ΗΤ29 αλλά όχι σε κύτταρα HCT116. Cellular S9 κλάσματα που παρασκευάζονται από κύτταρα ΗΤ29 εμφανίζουν ισχυρή δραστικότητα γλυκουρονιδίωση προς TSA, η οποία μπορεί να ανασταλεί από την προποφόλη ή UGT1A siRNA παρεμβολές. TSA ενδοκυτταρική συσσώρευση σε κύτταρα ΗΤ29 είναι πολύ χαμηλότερη από ότι σε κύτταρα HCT116, η οποία συσχετίζεται με υψηλά επίπεδα έκφρασης του UGT1A σε κύτταρα ΗΤ29. Σταθερά, TSA επάγει λιγότερο ενδοκυτταρική ROS, κυτταροτοξικότητα, και αποπτωτικό αποτέλεσμα στα κύτταρα ΗΤ29 από εκείνα σε κύτταρα HCT116. Προεπεξεργασία των κυττάρων ΗΤ29 με UGT1A siRNA ή προποφόλη μπορεί να μειώσει TSA γλυκουρονιδίωση και ταυτόχρονα να βελτιώσει την ενδοκυτταρική συσσώρευση του, καθώς και την ενίσχυση της TSA αντικαρκινικό αποτέλεσμα.

Συμπεράσματα και Επιπτώσεις

UGT1A μπορεί να θέσει σε κίνδυνο TSA κυτταροτοξικότητα μέσω της μείωσης ενδοκυτταρική έκθεσή της και η αλλαγή του κύκλου οξειδοαναγωγής NQO1-ενεργοποιείται με μεταβολική αποβολή. Η μελέτη μας μπορεί να ρίξει φως στην κατανόηση της κυτταρικής φαρμακοκινητικές και μοριακός μηχανισμός με τον οποίο UGTs τον προσδιορισμό των επιδράσεων της χημειοθεραπείας των φαρμάκων που είναι υποστρώματα UGTs «

Παράθεση:. Liu Μ, Wang Q, Liu F, Cheng Χ, Γου Χ, Wang Η, et al. (2013) UDP-γλυκουρονοσυλ- 1Α συμβιβασμούς ενδοκυτταρική συσσώρευση και Anti-Cancer Επίδραση της Tanshinone ΙΙΑ σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (11): e79172. doi: 10.1371 /journal.pone.0079172

Επιμέλεια: Devanand Sarkar, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 27, 2013? Αποδεκτές: 20 Σεπτέμβρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 14 Νοεμ 2013

Copyright: © 2013 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε οικονομικά από ένα Ίδρυμα για τον συγγραφέα του Εθνικού Εξαιρετική Διδακτορικής Διατριβής της Κίνας (Grant 200979), Φυσικών Επιστημών Ίδρυμα της Κίνας (Επιχορηγήσεις 91029746 και 81273586), Φυσικό Ίδρυμα Επιστημών της επαρχίας Jiangsu (Επιχορηγήσεις BK2011065 και BK2012026), και το Πρόγραμμα για την New Century εξαιρετικά ταλέντα στο Πανεπιστήμιο (Grant NCET-09-0770). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

UDP-γλυκουρονοσυλτρανσφερασών (UGTs) καταλύουν την γλυκουρονιδίωση πολλών λιπόφιλων ενδογενή υποστρώματα, όπως η χολερυθρίνη και στεροειδείς ορμόνες, και ξενοβιοτικών ουσιών, συμπεριλαμβανομένων καρκινογόνων ουσιών και των κλινικών φάρμακα [1], [2], [3]. Στις περισσότερες περιπτώσεις, ο μεταβολισμός UGT μεσολάβηση προωθεί τη μεταβολική αποβολή και μειώνει τις βιολογικές αποτελεσματικότητες των υποστρωμάτων, αν και έχουν παρατηρηθεί αρκετές περιπτώσεις βιοενεργοποίηση [4], [5]. έτσι είναι UGTs θεωρείται ως ένα σημαντικό σύστημα αποτοξίνωσης. Γενετικοί πολυμορφισμοί του UGTs προκαλούν μειωμένη δραστικότητα ενζύμου έχουν συσχετιστεί με τον κίνδυνο καρκίνου, όπως του ορθοκολικού καρκίνου, του καρκίνου του μαστού, ο καρκίνος του πνεύμονα, καρκίνος εγγύς του πεπτικού συστήματος, ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, και του καρκίνου του προστάτη [6], [7]. Εναλλακτικά, οι ενισχυμένες ενζυματικές δραστηριότητες του UGTs μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα σημαντικό παράγοντα για την χημειοθεραπευτική αντίσταση πολλών φαρμάκων τα οποία είναι υποστρώματα UGTs », όπως η ιρινοτεκάνη, η μεθοτρεξάτη, επιρουβικίνη, και ταμοξιφένη [8], [9], [10], [11] , υπονοώντας έναν κρίσιμο ρόλο του UGTs στην αντικαρκινική θεραπεία. UGTs θετικά εκφράζονται σε διάφορους τύπους ιστών και κυττάρων όγκου, αν και σε σχετικά χαμηλότερο επίπεδο σε σύγκριση με τα αντίστοιχα φυσιολογικούς ιστούς [12], [13], [14], [15]. Αν και έχουν UGTs αξιωθεί ως σημαντική αιτία των χημειοθεραπευτικών αντίστασης, λίγα είναι γνωστά για την άμεση επιρροή του UGTs όσον αφορά την ενδοκυτταρική συσσώρευση στα καρκινικά κύτταρα-στόχους και χημειοθεραπευτικών αποτελεσματικότητα των φαρμάκων.

Tanshinone ΙΙΑ (TSA) είναι ένα ένωση διτερπένιο φαινανθρενοκινόνη απομονωθεί από αποξηραμένη ρίζα του Salvia miltiorrhiza (Danshen στα κινέζικα), το οποίο είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο φυτικό φάρμακο με καλά αποδεδειγμένη καρδιαγγειακά και εγκεφαλικά απόδοση των [16], [17], [18]. Ειδικότερα, συσσωρεύοντας απόδειξη υποστηρίζει ότι TSA είναι ένα ελπιδοφόρο αντικαρκινικός παράγοντας [19], [20], [21], [22]. Προηγουμένως έχουμε διευκρίνισε ότι η TSA αποβάλλεται κυρίως μέσω της διαδοχικής NAD (P) H: κινόνη οξειδορεδουκτάσης 1 (NQO1) και καταλύεται UGT μεταβολισμό [23], [24]. NQO1 καταλύει μια μείωση δύο ηλεκτρονίων του TSA παράγει ένα εξαιρετικά ασταθές μεταβολίτη κατεχίνης που μπορεί να γλυκουρονιδιώνεται γρήγορα αν UGTs είναι παρόντες. Ωστόσο, όταν UGTs απουσιάζουν, το υψηλής δραστικότητας κατεχόλης ενδιάμεσο μπορεί να υποβληθεί σε έναν κύκλο οξειδοαναγωγής μείωσης κινόνης και αυτοοξείδωση, μια διαδικασία που παράγει υπερβολικές ποσότητες δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS). Με βάση αυτό το εύρημα, έχουμε επικυρωθεί πρόσφατα ότι NQO 1 είναι ένας σημαντικός στόχος της ενδοκυτταρικής TSA που προκαλεί τον αποπτωτικό θάνατο των ανθρώπινων μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων (NSCLC) [25].

Με βάση μας πρόσφατο εύρημα ότι οι πολλαπλές ισομορφές UGT1A εμπλέκονται στην TSA γλυκουρονιδίωση [24], η παρούσα μελέτη εστιάζει στην αποσαφήνιση του ρόλου αυτών των UGTs στον προσδιορισμό της ενδοκυτταρικής συσσώρευσης και αποπτωτικό αποτέλεσμα TSA σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Εδώ δείξαμε ότι TSA γλυκουρονιδίωση σε UGT-θετικά καρκινικά κύτταρα μειώθηκαν TSA ενδοκυτταρική συσσώρευση, έσπασε NOQ1 ενεργοποιούνται κύκλο οξειδοαναγωγής, και κατά συνέπεια μειωμένη TSA προκαλούμενη σχηματισμό ROS και αντικαρκινικό αποτέλεσμα της.

Υλικά και Μέθοδοι

γραμμές κυττάρων και Culture

κυτταρικές σειρές καρκίνου ανθρώπινου κόλου ΗΤ29 και HCT116 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, USA). Τα κύτταρα αυξήθηκαν σε 5a του McCoy (Gibco, USA) με μέσο ορό 10% εμβρυϊκό ορό (Hyclone, USA), 100 U ml

-1 πενικιλλίνη, και 100 mg ml

-1 στρεπτομυκίνη στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2. Για διαφορετικούς σκοπούς, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 24-72 ώρες στο μέσο και στη συνέχεια προστέθηκαν φάρμακα. Θρυψίνη (2,5%) χρησιμοποιήθηκε για την κυτταρική συγκομιδή. Όλα τα κύτταρα ήταν ελεύθερα μυκόπλασμα.

Χημικά και Αντιδραστήρια

TSA αγοράστηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο για τον Έλεγχο Φαρμακευτικών και Βιολογικών Προϊόντων (Πεκίνο, Κίνα), και παρασκευάζεται σε στερεή διασπορά με PEG6000 ως περιγράφεται [26]. Η προποφόλη, 4-μεθυλουμπελλιφερόνη (4-MU), μυκοφαινολικό οξύ (ΜΡΑ), Ν-ακετυλο κυστεϊνη (NAC), δικουμαρόλη (DIC), 6-φωσφορικής γλυκόζης, αφυδρογονάση της 6-φωσφορικής, β-φωσφορικό νικοτιναμιδο-αδενινο δινουκλεοτίδιο (NADP) , ουριδίνη 5′-διφωσφορικής-γλυκουρονικό οξύ (UDPGA), D-σακχαρικό οξύ 1,4-λακτόνη, β-D-γλυκουρονιδάση (Escherichia coli), χλωρζοξαζόνη, 2 ‘, 7’-διχλωρο διοξεικό (DCFH-DA), και 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) ελήφθησαν όλα από την Sigma (St. Louis, ΜΟ, USA). Annexin V-FITC απόπτωση Detection Kit αγοράστηκε από Bipec Biopharma Corporation (ΗΠΑ). Οι εκκινητές PCR σε πραγματικό χρόνο για την ανίχνευση μεταγραφές του UGT1A1, UGT1A3, UGT1A6, UGT1A9 και UGT1A10 αγοράστηκαν από την Invitrogen (CA, USA). Αντισώματα έναντι UGT1A (Abcam, USA), UGT1A9 (Abcam, USA), και GAPDH (Boster Biology, Κίνα) χρησιμοποιήθηκαν σε ανάλυση στυπώματος Western. Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) βαθμού ακετονιτρίλιο ελήφθη από τη Fisher Scientific (Toronto, Canada). Όλα τα άλλα χημικά ήταν ποιότητας HPLC ή το καλύτερο βαθμό που ήταν διαθέσιμα στο εμπόριο.

παροδική επιμόλυνση των UGT1A siRNA

παροδική επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε με χρήση Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, το Stealth RNAi siRNA (Invitrogen, USA) για UGT1A σιωπή ή ένας αρνητικός μάρτυρας αναμίχθηκε με το αντιδραστήριο Lipofectamine RNAiMAX σε Ορίί-ΜΕΜ Ι (Gibco, USA) σε μια απόληξη συγκέντρωση 20 ηΜ, και το μίγμα siRNA προστέθηκε σε ένα κατάλληλη πλάκα καλλιέργειας σε θερμοκρασία δωματίου. Εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα στη συνέχεια σπείρονται στην πλάκα μείγμα που περιέχει την επιμόλυνση. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε επωαστήρα (% CO 5

2) στους 37 ° C για 24-72 ώρες.

ποσοτικοποίηση των επιπέδων mRNA

Σύνολο mRNA εκχυλίστηκε από τα κύτταρα, και cDNA συντέθηκε με την PrimeScrip RT Kit αντιδραστήριο (Takara Biotechnology, Dalian, Κίνα). Ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR διεξήχθη από SYBR Προμίγματα Ex Taq II (Takara Βιοτεχνολογίας, Dalian, Κίνα) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιούνται στην PCR πραγματικού χρόνου που απαριθμούνται στην υποστήριξη πληροφοριών 1 (Πίνακας S1). Οι συνθήκες PCR ήταν 95 ° C για 1 λεπτό, που ακολουθείται από 40 κύκλους των 95 ° C για 5 δευτερόλεπτα, 60 ° C για 30 δευτερόλεπτα, και 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα.

Ανάλυση Western Blot

τα κύτταρα συλλέχθηκαν και η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίζεται. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίζεται στη συνέχεια με τη χρήση του BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Κίνα). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης (50 μg) φορτώθηκαν και διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF (PALL, USA). Τα στυπώματα φράχθηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα TBST και επωάστηκαν για 24 ώρες στους 4 ° C με ειδικά πρωτογενή αντισώματα. Η μεμβράνη πλύθηκε 3 φορές με TBST και μετά επωάστηκαν με συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα (KeyGen, Nanjing, Κίνα) για 1 ώρα στους 37 ° C. Το σήμα οπτικοποιήθηκε με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL, Millipore). Τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκαν με GAPDH.

UGT Δραστηριότητα Δοκιμασία

UGT δραστηριότητα παρουσιάστηκε από γλυκουρονιδίωση δραστηριότητα του υποστρώματος με κλάσματα κυττάρων S9. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με 2,5% τρυψίνη και πλύθηκαν σε παγωμένο PBS, ομογενοποιούνται σε PBS και φυγοκεντρήθηκαν στα 9000 g για 20 λεπτά στους 4 ° C για να ληφθεί κυτταρικά κλάσματα S9. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη των κλασμάτων S9 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Κίνα). Σύμφωνα με προηγούμενες εκθέσεις [27], [28], μη-ειδικό υπόστρωμα UGT1A 4-MU χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η γενική δραστηριότητα του UGT1A, και ΜΡΑ, η οποία κατά κύριο λόγο από γλυκουρονιδιώνεται UGT1A9 χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί δραστικότητα UGT1A9. Εν συντομία, 4-MU ή ΜΡΑ (0,5 mM) επωάστηκε σε ένα μίγμα αντίδρασης 200 μΙ που περιέχει 0.1 mg (0.2 mg για MPA) κυτταρικά κλάσματα S9, 2 mM UDPGA, 1 mM σακχαρικό οξύ 1,4-λακτόνη, 5 mM MgCl

2, και 50 mM ρυθμιστικού διαλύματος Tris-HCl (ρΗ 7.4) στους 37 ° C για 15 λεπτά (30 λεπτά για MPA). Τα κλάσματα S9 προκατεργάστηκαν με αλαμεθισίνη σε συγκέντρωση 25 μg mg

-1 σε πάγο για 20 λεπτά. Μετά την προ-επώαση για 5 λεπτά στους 37 ° C, η αντίδραση ξεκίνησε με την προσθήκη UDPGA. Οι αντιδράσεις διακόπηκαν με την προσθήκη 400 μΙ παγωμένου ακετονιτριλίου και δείγματα φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά στα 20.000 g. Το υπερκείμενο δείγματα (100 μΙ) αναλύθηκαν με ένα Shimadzu (Kyoto, Japan) σύστημα HPLC LC-2010C εφοδιασμένη με τεταρτοταγή αντλία, αυτόματο δειγματολήπτη, κλίβανο στήλης και ανιχνευτή UV. Ο διαχωρισμός διεξήχθη χρησιμοποιώντας στήλη σεληνιακό-C18 (250 χ 4,6 mm i.d., 5 μm, Phenomenex Inc., Κίνα) με μια στήλη φύλακα (Phenomenex Inc., Κίνα). Για 4-MU, η κινητή φάση ήταν ακετονιτρίλιο (Α) και νερό με 25 mM Κ

2HPO

3 (Β) με ρυθμό ροής 1 ml min

-1? έκλουση διεξήχθη με την ακόλουθη διαβάθμιση: 15% Α (0-2 min), γραμμική βαθμίδωση από 15% έως 60% Α (2-5 min), 60% έως 40% Α (5-8 λεπτά), και 15% Α για 8-10 λεπτά, και στη συνέχεια για άλλα 5 λεπτά από εξισορρόπηση με μία θερμοκρασία στήλης 40 ° C και ανίχνευση υν στα 322 nm. Για MPA, η κινητή φάση ήταν ακετονιτρίλιο (Α) και νερό με 0.1% (ν /ν) οξικό οξύ (Β) με ρυθμό ροής 1 ml min

-1? έκλουση διεξήχθη με την ακόλουθη διαβάθμιση: 45% (0-2 λεπτά), γραμμική βαθμίδωση από 45% έως 80% Α (2-8 min), 80% Α για άλλη 1 λεπτό, και 45% Α για 9-10min και τότε για ένα άλλο 4 λεπτά εξισορρόπηση με μία θερμοκρασία στήλης 40 ° C και ανίχνευση υν στα 250 nm. Η ακριβής ποσοτικοποίηση του νεοσύστατου γλυκουρονίδια επιτεύχθηκε με τη βαθμονόμηση με αυθεντικά πρότυπα (Sigma, USA).

Η γλυκουρονιδίωση Δοκιμασία της TSA σε S9 κλάσματα

Το κλάσμα S9 (0,25 mg) επωάστηκε με υποδεικνύεται συγκεντρώσεις TSA σε ένα μίγμα αντίδρασης αποτελούμενο από 2 mM UDPGA, 1 mM σακχαρικό οξύ 1,4-λακτόνη, 5 mM MgCl

2, και ένα σύστημα ΝΑΟΡΗ-αναγέννησης που περιείχε 0,2 mM NADP, 1,9 mM 6-φωσφορική γλυκόζη, 1,2 U ml

-1 αφυδρογονάση γλυκόζης-6-φωσφορικής, και ρυθμιστικό διάλυμα 50 mM Tris-HCl (ρΗ 7.4) σε τελικό όγκο 200 μΙ. Το κλάσμα S9 προκατεργάστηκε με αλαμεθισίνη σε συγκέντρωση 25 μg mg

-1 σε πάγο για 20 λεπτά ώστε να μειώνει τον λανθάνοντα χρόνο του UGT δραστηριότητας. Για τη δοκιμασία κινητικής ενζύμου, μετά την προ-επώαση για 5 λεπτά στους 37 ° C, η αντίδραση ξεκίνησε με την προσθήκη UDPGA και επωάζεται στους 37 ° C για 60 λεπτά. Για τη μελέτη της αναστολής της προποφόλης, προποφόλη (0-400 μΜ) συν-επωάστηκαν με TSA (20 μΜ) στους 37 ° C για 20 λεπτά. Όλες οι αντιδράσεις τερματίστηκαν με παγωμένο ακετονιτρίλιο, ακολουθούμενο από φυγοκέντρηση στα 20.000 g για 10 λεπτά για να ληφθούν τα υπερκείμενα, και στη συνέχεια αναλύθηκε με HPLC σύστημα το ίδιο όπως περιγράφηκε παραπάνω με τη μέθοδο που βασίζεται στην προηγούμενη αναφορά μας [24].

TSA ενδοκυτταρική συσσώρευση και γλυκουρονιδίωση στα ζωντανά κύτταρα

Εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα με 70% συμβολή εκτέθηκαν σε 20 μΜ TSA για 0,5, 2, 6, 24 και 48 ώρες. Κύτταρα και μέσο καλλιέργειας συλλέχθηκαν ξεχωριστά σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με παγωμένο PBS. Υπερκαθαρό νερό (300 μΙ) προστέθηκε σε κάθε δείγμα κυττάρων και την κατάψυξη /απόψυξη τρεις φορές για να σπάσουν τα κύτταρα. Είτε κύτταρο ή δείγμα μέσο καλλιέργειας (100 μΐ) προστέθηκε με παγωμένο ακετονιτρίλιο (300 μΐ) και αναμίχθηκαν με έντονη περιδίνηση για 5 λεπτά, ακολουθούμενο από φυγοκέντρηση στα 20.000 g για 10 λεπτά για να ληφθεί το υπερκείμενο, στη συνέχεια αναλύθηκαν με τη μέθοδο HPLC βασίζεται στην προηγούμενη έκθεσή μας [24]. Οι συγκεντρώσεις του φαρμάκου ομαλοποιήθηκαν με προσδιορισμό της συγκέντρωσης πρωτεΐνης των κυτταρικών δειγμάτων με τη χρήση του BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Κίνα).

ROS Δοκιμασία

ενδεικνυόμενη συγκέντρωση TSA χορηγήθηκε στα κύτταρα σε 70% συρροή επί 1 ώρα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DCFH-DA για 30 λεπτά και πλύθηκαν με παγωμένο PBS τρεις φορές. Cellular ROS μπορεί να συνομιλήσει μη φθορίζουσα DCFH-DA φθορισμού του παραγώγου DCF. σχηματισμός ROS αναλύθηκε με μέτρηση της έντασης φθορισμού των DCF στα 535 nm (με 488 nm διέγερση) σε συνέργεια-H1 φθοριόμετρο (Bio-Tek Instruments).

κυτταροτοξικότητας Δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 7000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκα 96 φρεατίων και επωάζονται όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα στη συνέχεια εκτίθενται σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις TSA. Μετά από 48 ώρες (για HCT116) ή 72 ώρες (για ΗΤ29), ΜΤΤ (5 mg ml

-1) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και η πλάκα επωάστηκε στους 37 ° C για άλλες 4 ώρες. Το διάλυμα ΜΤΤ απομακρύνθηκε έπειτα και 150 μι DMSO προστέθηκαν ανά φρεάτιο. Η απορρόφηση στα 570 nm μετρήθηκε με αναγνώστη μικροπλάκας.

Προσδιορισμός απόπτωσης

Τα κύτταρα σπάρθηκαν με 2 χ 10

5 /φρεάτιο σε πλάκα 6 φρεατίων και έφθασε το 60% συρροή μετά 72 πολιτισμό ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα εκτέθηκαν στην ενδεικνυόμενη συγκέντρωση TSA για 48 ώρες (HCT116) ή 72 ώρες (ΗΤ29) και συλλέχθηκαν με 0.25% θρυψίνη χωρίς ΕϋΤΑ και πλύθηκαν με παγωμένο PBS. Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Bipec Biopharma Corporation, USA) χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση των κυττάρων σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δείγματα αναλύθηκαν με τη χρήση ενός κυτταρομέτρου ροής (BD FACSCalibur, USA).

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι στατιστικές διαφορές μεταξύ δύο ομάδων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία t του Student? για πολλαπλές συγκρίσεις, εφαρμόστηκε ένας τρόπος ανάλυσης της διακύμανσης ακολουθούμενη από τεστ Dunnet. Η διαφορά θεωρήθηκε σημαντική σε * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01, ή *** P & lt? 0.001

Αποτελέσματα

πολλαπλές ισομορφές UGT1A θετικά Εκφράζεται σε ΗΤ29 αλλά όχι σε HCT116. κύτταρα

Θα αξιολογούνται πρώτα τα επίπεδα έκφρασης των ισομορφών UGT1A που συμμετείχαν στην TSA γλυκουρονιδίωση με PCR σε πραγματικό χρόνο και στις δύο κυτταρικές σειρές ΗΤ29 και HCT116. Το Σχήμα 1Α δείχνει το μοτίβο έκφρασης του γονιδίου των ισομορφών UGT1A σε κύτταρα ΗΤ29. Αντίθετα, καμία έκφραση γονιδίων UGT1A ανιχνεύθηκε σε κύτταρα HCT116 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να διερευνήσουν περαιτέρω το ρόλο της UGTs, ειδικά siRNA χρησιμοποιήθηκε για να φιμώσουν γονίδια UGT1A στα κύτταρα ΗΤ29. Τρία ζεύγη siRNAs που κατευθύνονται κατά της αλληλουχίας UGT1A σχεδιάστηκαν, και η καλύτερη ζεύγος με τα υψηλότερα αποτελέσματα σίγηση μαζί με μη-ειδική siRNA ως εξετάστηκε ένας αρνητικός μάρτυρας. Μετά siRNA επιμολύνσεις, τα επίπεδα mRNA εκτιμήθηκαν σε ΗΤ29 κύτταρα. Τα επίπεδα mRNA του UGT1A1, UGT1A3, UGT1A6, UGT1A9 και UGT1A10 μειώθηκαν κατά 85,8%, 31,4%, 87,5%, 66,5% και 68,2%, αντίστοιχα, ενώ οι αρνητικές siRNA ελέγχου είχαν μικρή επίδραση (Σχήμα 1Α). δοκιμασία κηλίδος Western υποστηρίζεται ένα υψηλό επίπεδο έκφρασης της UGT1A σε ΗΤ29 κύτταρα, ενώ δεν παρατηρήθηκε καμία ανιχνεύσιμη πρωτεΐνη UGT1A σε κύτταρα HCT116 (Σχήμα 1Β). Η έκφραση της πρωτεΐνης του συνολικού UGT1A και ειδικών UGT1A9 απότομα μειώθηκε κατά UGT1A siRNA σε κύτταρα ΗΤ29 (Σχήμα 1Β και 1Γ). Τα αποτελέσματα της ανάλυσης UGT δραστηριότητας έδειξε ότι τα κύτταρα ΗΤ29 διαθέτουν υψηλή ικανότητα προς την γλυκουρονιδίωση της 4-MU, ένα γενικό υπόστρωμα UGT1A, και MPA, ένα σχετικά συγκεκριμένο ανιχνευτή UGT1A9. 4-MU δραστηριότητες γλυκουρονιδίωση και MPA μειώθηκαν με UGT1A siRNA διαμόλυνση με 85,6% και 57%, αντίστοιχα (Εικόνα 1Β και 1Γ). Συνεπής με mRNA και εξέταση των επιπέδων της πρωτεΐνης, δεν UGT1A ειδική ενζυματική δραστικότητα ανιχνεύθηκε σε HCT116 κύτταρα (Εικόνα 1Β).

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με UGT1A siRNA, μη ειδική siRNA (αρνητικός έλεγχος) ή όχημα για 48 ώρες. επίπεδα (Α) mRNA του UGT1A ισομορφών σε κύτταρα ΗΤ29. επίπεδο UGT1A1 mRNA των κυττάρων με όχημα ελήφθη ως 1? (Β) Τα επίπεδα πρωτεΐνης και δραστηριότητες ενζύμου του UGT1A? (C) Τα επίπεδα πρωτεΐνης και δραστηριότητες ενζύμου UGT1A9. Η συνολική δραστικότητα UGT1A προσδιορίσθηκε με την ανίχνευση της ταχύτητας του 4-Mu γλυκουρονιδίωση, και η ειδική δραστικότητα UGT1A9 προσδιορίστηκε με ανίχνευση της ταχύτητας του MPA γλυκουρονιδίωση. Η δραστικότητα του ενζύμου εκφράστηκε ως nmol ανά λεπτό ανά mg πρωτεΐνης. Μια δραστηριότητα UGT1A & lt? 0,1 nmol min

-1 mg

-1 θεωρήθηκε μη ανιχνεύσιμα (ΝΔ). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Η αναστολή της έκφρασης UGT1A ή UGT1A9 δραστηριότητα μειώνει TSA γλυκουρονιδίωση στο ΗΤ29 κυττάρων S9 κλάσματα

Για να κερδίσει την κατανόηση της TSA γλυκουρονιδίωσης από καρκινικά κύτταρα κόλου, εκτελέσαμε το ένζυμο κινητική δοκιμασία χρησιμοποιώντας κλάσματα S9 παρασκευάζεται από κύτταρα ΗΤ29 με ή χωρίς επεξεργασία UGT1A siRNA. Σύμφωνα με προηγούμενη μελέτη μας [24], Μ1 και Μ2, ένα ζεύγος τοποϊσομερών του TSA γλυκουρονιδών κατεχόλη, ανιχνεύθηκαν από ΗΤ29 αλλά κλάσματα δεν HCT116 κυττάρων S9. TSA γλυκουρονιδίωση εμφανίζεται μια τυπική κινητική Michaelis-Menten (Σχήμα 2Α και 2Β). Κινητικές παραμέτρους, συμπεριλαμβανομένης της εμφανούς Κ

m, μέγιστη ταχύτητα (V

max), η ενδογενής κάθαρση (CL

int, V

max /K

m) για την Μ1 και Μ2, και το άθροισμα CL

int (M1 + M2) συνοψίζονται στον πίνακα 1. Η φίμωση των ισομορφών UGT1A με UGT1A siRNA οδήγησαν σε περίπου 10-φορές μείωση του V

μέγιστες τιμές για την παραγωγή τόσο Μ1 και Μ2, ενώ είχε μικρή επιρροή στην Κ

τιμές m. Κατά συνέπεια, η CL

int για Μ1 και Μ2 και το άθροισμα CL

int (M1 + M2) της ομάδας σιωπής UGT1A ήταν περίπου 10 φορές χαμηλότερα από αυτά της αρνητικής ομάδας ελέγχου.

κινητική ενζύμου για το σχηματισμό της TSA γλυκουρονιδών (Μ1 και Μ2) εξετάστηκε σε κλάσματα (Α) κύτταρο S9 παρασκευάστηκε από κύτταρα ΗΤ29 προεπεξεργασία με αρνητικό έλεγχο siRNA, και τα κλάσματα (Β) κυττάρων S9 παρασκευάστηκε από κύτταρα ΗΤ29 προεπεξεργασία με UGT1A siRNA. (Γ) ανασταλτική επίδραση της προποφόλης (0-400 μΜ) επί TSA γλυκουρονιδίωση στα κλάσματα ΗΤ29 κυττάρων S9. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων.

Η

Η ανασταλτική επίδραση της προποφόλης στην TSA γλυκουρονιδίωση σε κυτταρικά κλάσματα ΗΤ29 εξετάστηκε επίσης. Ως ειδικό UGT1A9 υπόστρωμα [8], η προποφόλη έδειξαν κατά προσέγγιση 25% αναστολή τόσο Μ1 και Μ2 στα 100 μΜ και περίπου 40% αναστολή στα 400 μΜ (Σχήμα 2C).

UGT1A που επηρεάζουν αποφασιστικά TSA Συσσώρευση σε καρκίνο παχέος εντέρου κύτταρα

Για να ελέγξετε αν UGT1A μπορεί να επηρεάσει TSA διάθεση στα ζωντανά κύτταρα, πραγματοποιήσαμε μια φαρμακοκινητική μελέτη κυτταρικών. Η δυναμική ενδοκυτταρική συσσώρευση TSA και των μεταβολιτών της (Μ1 και Μ2) προσδιορίστηκαν. Ενδιαφέροντος, η ενδοκυτταρική επίπεδο της TSA συνεχώς αυξάνεται κατά τη διάρκεια των 48 ωρών μετά τη θεραπεία TSA στα κύτταρα HCT116. Ωστόσο, η συγκέντρωση TSA σε κύτταρα ΗΤ29 κορυφώθηκε σε 6 ώρες και στη συνέχεια μειώθηκαν σημαντικά (Σχήμα 3Α). Η περιοχή κάτω από καμπύλη από 0 έως 48 ώρες (AUC

0-48 h) και τη μέγιστη συγκέντρωση (C

max) του TSA σε HCT116 ήταν πολύ υψηλότερη από εκείνη σε ΗΤ29 κύτταρα (Πίνακας 2). Προκατεργασία των κυττάρων ΗΤ29 με προποφόλη οδήγησε σε σημαντική αύξηση της ενδοκυτταρικής συσσώρευσης TSA. Ομοίως, UGT1A siRNA διαμόλυνση αύξησε επίσης την συσσώρευση TSA σε κύτταρα ΗΤ29 (Σχήμα 3Α, Πίνακας 2). Τόσο Μ1 και Μ2 ήταν ανιχνεύσιμα σε κύτταρα ΗΤ29 σε 0,5 ώρα μετά την αγωγή TSA, υποδηλώνοντας μια ταχεία ενδοκυτταρική παραγωγή γλυκουρονιδών. Τα ενδοκυτταρικά επίπεδα του Μ1 και Μ2 κορυφώθηκε σε 6 ώρες και κατόπιν μειώθηκε (Σχήμα 3Β και 3C), ενώ τα επίπεδα της TSA γλυκουρονιδών σε μέσο καλλιέργειας συσσωρευμένη συνεχώς κατά τη διάρκεια της ανίχνευσης (Σχήμα 3D και 3Ε). Ο σχηματισμός του Μ2, αλλά όχι Μ1, μειώθηκε είτε προποφόλη ή UGT1A siRNA διαμόλυνση σε κύτταρα ΗΤ29 (Σχήμα 3Β και 3C, Πίνακας 2). Τόσο η προποφόλη και UGT1A siRNA μείωσε σημαντικά το σχηματισμό TSA γλυκουρονιδών Μ1 και Μ2 στο μέσο καλλιέργειας (Εικόνα 3D και 3Ε, Πίνακας 2).

ΗΤ29 κύτταρα προκατεργάστηκαν με UGT1A siRNA ή όχημα για 48 ώρες, ή προκατεργασμένο με προποφόλη (100 μΜ) για 1 ώρα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε TSA (20 μΜ) επί 0,5, 2, 6, 24, και 48 ώρες και τα δείγματα τόσο του μέσου καλλιέργειας και τα κύτταρα συλλέχθηκαν και παρασκευάστηκε για ανάλυση HPLC. TSA και γλυκουρονίδια της (Μ1 και Μ2) ανιχνεύθηκαν με τη μέθοδο που βασίζεται στην προηγούμενη έκθεσή μας [24]. (Α) ενδοκυτταρικό TSA του ΗΤ29 ή κυττάρων HCT116? (Β) ενδοκυτταρικό M1 κυττάρων ΗΤ29? (Γ) ενδοκυτταρικό M2 κυττάρων ΗΤ29? (D) M1 σε ΗΤ29 μέσο καλλιέργειας κυττάρων? (Ε) Μ2 σε ΗΤ29 μέσο καλλιέργειας κυττάρων. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

UGT1A Μειώνει TSA που προκαλείται σχηματισμός ROS

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι TSA μεταβολίζεταισε NQO1 για την παραγωγή ένα ιδιαίτερα ασταθές κατεχίνης ενδιάμεσο, το οποίο θα μπορούσε να είναι είτε συζευγμένο με UGTs ή αυθόρμητα επανήλθε πίσω στη μητρική TSA για να σχηματίσουν μια μάταιη κύκλο οξειδοαναγωγής με υπερβολικές ποσότητες της παραγωγής ROS [23]. Επιπλέον, βρήκαμε ότι TSA παρήγαγε ένα σημαντικό επίπεδο των ROS στα κύτταρα NSCLC, μια θετική και UGT αρνητική κυτταρική σειρά NQO1 [25]. Έτσι αιτιολογημένη ότι, με την παρουσία του UGT1A, η TSA-πυροδότησε κύκλο οξειδοαναγωγής μπορεί να αλλάξει σε μεταβολική αποβολή και μειώνοντας έτσι την παραγωγή των ROS. Για να εξεταστεί αυτή η υπόθεση, η δοκιμασία χρώσης DCF διεξήχθη για την παρακολούθηση του σχηματισμού ROS TSA προκαλούμενη. TSA προκαλούμενη δοσοεξαρτώμενη σχηματισμό ROS στα κύτταρα HCT116 (Σχήματα 4Α). Ωστόσο, αυτές οι αλλαγές στο σχηματισμό ROS δεν παρατηρήθηκαν σε ΗΤ29 κύτταρα (Σχήμα 4Β). Όταν προποφόλη χρησιμοποιήθηκε για να αναστέλλουν τη δραστικότητα UGT1A9 σε κύτταρα ΗΤ29, η TSA προκαλούμενη επίπεδο ROS ήταν σημαντικά αυξημένη κατά περίπου 3,6 φορές σε 40 μΜ TSA, και η αύξηση αυτή αντιστρέφεται με NAC (Σχήμα 4Β). Σε αντίθεση, η προποφόλη δεν άλλαξε την TSA προκαλούμενη επίπεδο ROS στα κύτταρα HCT116, αλλά ο συνδυασμός του NAC ακόμη μειώθηκε TSA προκαλούμενη επίπεδο ROS (Σχήματα 4Α). Επιπλέον, UGT1A siRNA διαμόλυνση επίσης σημαντικά αυξημένα επίπεδα ROS κατά 2,0 φορές σε 40 μΜ σε κύτταρα ΗΤ29 (Σχήμα 4C).

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με UGT1A siRNA ή μη-ειδική siRNA (αρνητικός έλεγχος) για 48 ώρες ή προεπεξεργασία με προποφόλη (100 μΜ) /NAC (5 mM) για 1 ώρα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε TSA (5, 20, 40 μΜ) για 1 ώρα και στη συνέχεια κατεργάζεται με DCFH-DA. Η ένταση φθορισμού μετρήθηκε με φθοριόμετρο. (Α) κύτταρα HCT116? (Β) και (C) κυττάρων ΗΤ29. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD από τουλάχιστον τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα (* Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt? 0,01, *** Ρ & lt? 0.001, αγωγή TSA vs κύτταρα ελέγχου?

# Ρ & lt? 0,05,

# # P & lt? 0,01,

### P & lt?. 0.001, προποφόλη /NAC προεπεξεργασία vs TSA μόνο, ή UGT1A siRNA προεπεξεργασία vs αρνητικού ελέγχου siRNA προεπεξεργασίας)

η

UGT1A Προκαλεί την αντίσταση του καρκίνου του παχέος εντέρου Τα κύτταρα στην TSA προκαλούμενη κυτταροτοξικότητα

Η περίσσεια ROS μπορεί να προκαλέσει διαταραχή της ενδοκυτταρικής ομοιόστασης οξειδοαναγωγής, και μη αναστρέψιμη οξειδωτική τροποποιήσεις λιπιδίων, πρωτεΐνης, ή DNA, στη συνέχεια, την προώθηση των κυττάρων αποπτωτικό θάνατο μέσω τόσο των υποδοχέων θανάτου και μιτοχόνδρια μεσολάβηση οδών [29 ]. Έχουμε επικυρωθεί πρόσφατα ότι TSA-επαγόμενη κυτταροτοξικότητα είναι ROS εξαρτάται [25]. Επειδή η παρουσία UGT1A σε κύτταρα ΗΤ29 σε κίνδυνο την παραγωγή ROS, προτείνουμε ότι η έκφραση των γονιδίων UGT1A θα αυξήσει την αντίσταση των καρκινικών κυττάρων να TSA επαγόμενη κυτταροτοξικότητα. Για το σκοπό αυτό, ΜΤΤ δοκιμασία διεξήχθη σε δύο ΗΤ29 και κύτταρα HCT116. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι TSA παράγεται δραματική κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα HCT116 που εκφράζουν καμία UGT1A με IC

50 τιμή στα 4,5 ± 0,4 μΜ (Σχήμα 5Α). Σε αντίθεση, τα κύτταρα ΗΤ29 εκφράζουν άφθονα ένζυμα UGT1A, βρέθηκαν ιδιαίτερα ανθεκτικά σε TSA κυτταροτοξικότητα με IC

50 τιμή στα 54.3 ± 4.7 μΜ (Σχήμα 5Β). Η προεπεξεργασία με προποφόλη να αναστέλλουν δραστικότητα UGT1A9 αυξήθηκε σημαντικά TSA κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα ΗΤ29 με IC

50 τιμή στα 29.9 ± 4.5 μΜ (Σχήμα 5Β), η οποία αντιστράφηκε από τον συνδυασμό του NAC (IC

50 & gt? 80 μΜ) . Σε κύτταρα HCT116, προποφόλη ενισχυμένη TSA κυτταροτοξικότητα δεν παρατηρήθηκε, αλλά NAC συνδυασμός προκάλεσε υψηλή αντίσταση TSA (Σχήμα 5Α). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η επίδραση της προποφόλης σε κύτταρα ΗΤ29 είναι από την αναστολή της UGT1A9 και έτσι να προωθήσει την μάταιη κύκλο οξειδοαναγωγής του TSA. Σταθερά, UGT1A siRNA επιμολύνσεις ενίσχυσε επίσης την κυτταροτοξική δράση του TSA στα κύτταρα ΗΤ29 και μείωσε σημαντικά το IC

50 αξία σε 25,9 ± 5,6 μΜ (Σχήμα 5C).

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με UGT1A siRNA ή μη ειδικό siRNA (αρνητικός έλεγχος) για 24 ώρες, ή σε προεπεξεργασία με προποφόλη (100 μΜ) /NAC (5 mM) για 1 ώρα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε κλίση συγκεντρώσεις TSA (2,5 έως 80 μΜ για ΗΤ29? 0.5-40 μΜ για HCT116) για προκαθορισμένο χρόνο και δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη. (Α) κύτταρα HCT116? (Β) και (C) κυττάρων ΗΤ29. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD από τουλάχιστον τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα (* Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt? 0,01, *** Ρ & lt? 0.001)

Η

UGT1A συμβιβασμοί TSA απόπτωση που επάγεται από Colon. καρκινικά κύτταρα

Για να διερευνήσουν περαιτέρω το ρόλο της συνολικής UGT1A και UGT1A9 στην TSA μεσολάβηση αντικαρκινική δράση, αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο εξετάστηκε από το V FITC-δοκιμασία αννεξίνη /ΡΙ χρώση. Όταν τα κύτταρα ΗΤ29 έχουν εκτεθεί στον ενδεικνυόμενη συγκέντρωση TSA για 72 ώρες, υπήρχαν λίγες ανιχνεύσιμα αποπτωτικών κυττάρων (Σχήμα 6Β). Ωστόσο, αποπτωτικό θάνατο παρατηρήθηκε σε κύτταρα HCT116 μετά από 48 ώρες έκθεσης TSA με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο ήταν 20,7 ± 1,7%, 30,8 ± 2,4%, και 48,7 ± 3,0% με συγκεντρώσεις TSA από 5, 20, και 40 μΜ, αντίστοιχα (Σχήμα 6Α). Η προποφόλη (100 μΜ) αποκατέστησε σημαντικά την ευαισθησία των κυττάρων ΗΤ29 σε TSA προκαλούμενη αποπτωτικό θάνατο, από τα βασικά αποπτωτικών επίπεδα σε αποπτωτικό αναλογία 27.8 ± 4.5%, 45.0 ± 3.5%, και 53,5 ± 14,7% στα 5, 20, και 40 μΜ TSA, αντίστοιχα (Σχήμα 6Β). Η προποφόλη ενισχυμένη απόπτωση δεν παρατηρήθηκε σε κύτταρα HCT116 (Σχήμα 6Α). Ομοίως, UGT1A siRNA διαμόλυνση αυξήθηκαν TSA προκαλούμενη κυτταρικής απόπτωσης σε κύτταρα ΗΤ29, χαρακτηρίζοντας με 16,2 ± 1,4%, 40,3 ± 4,3%, και 48,5 ± 3,2% αποπτωτικά κύτταρα σε συγκεντρώσεις TSA από 5, 20, και 40 μΜ, αντίστοιχα (Σχήμα 6C ).

τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με UGT1A siRNA ή μη-ειδική siRNA (αρνητικός έλεγχος) για 72 ώρες, ή σε προεπεξεργασία με προποφόλη (100 μΜ) για 1 ώρα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε TSA (5, 20, 40 μΜ) για προκαθορισμένο χρόνο και συλλέγεται. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Annexin V-FITC /ΡΙ και εξετάζεται από κυτταρομετρία ροής. (Α) κύτταρα HCT116? (Β) και (C) κυττάρων ΗΤ29. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD τριών τουλάχιστον ανεξάρτητων πειραμάτων (* Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt? 0,01, *** Ρ & lt? 0.001, αγωγή TSA vs κύτταρα ελέγχου?

# Ρ & lt? 0,05,

# # P & lt? 0,01,

### P & lt?. 0.001, προποφόλη προεπεξεργασίας vs TSA μόνο, ή UGT1A siRNA προεπεξεργασία vs αρνητικού ελέγχου siRNA προεπεξεργασίας)

Η

Συζήτηση

Πολλοί αντι -cancer παράγοντες είναι υποστρώματα του UGTs, και για το λόγο αυτό, η λειτουργική σημασία της UGTs στην πρόκληση χημειοθεραπευτικά αντίσταση έχει καταστεί ένα σημαντικό πρόβλημα. Παρά τις προηγούμενες προσπάθειες για την αντιμετώπιση αυτού του σημαντικού ζητήματος, λίγα είναι γνωστά σχετικά με το άμεσο αποτέλεσμα της UGTs εκφράζονται σε καρκινικά ιστούς /τα κύτταρα στον προσδιορισμό της ενδοκυτταρικής συσσώρευσης και την προκύπτουσα αντικαρκινική δράση αυτών των παραγόντων που είναι υποστρώματα UGTs ». Δείχνουμε στην παρούσα μελέτη ότι το επίπεδο έκφρασης της UGT1A, και ιδίως UGT1A9, είναι ένας σημαντικός παράγοντας για τον προσδιορισμό της ενδοκυτταρικής συσσώρευσης και την αποπτωτική επίδραση της TSA σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου.

προηγούμενη μελέτη μας διαπίστωσε ότι UGT1A ισομορφών, συμπεριλαμβανομένων UGT1A1, UGT1A3, UGT1A6, UGT1A10, και ιδίως το UGT1A9, είναι τα κυρίαρχα ένζυμα που εμπλέκονται στη γλυκουρονιδίωση της TSA μετά από μείωση της από NQO1. Αν και UGT2B7 μπορεί να εμπλέκεται στην παραγωγή του Μ1 και συμβάλλουν στη συνολική γλυκουρονιδίωση TSA, η CL

int (M1 + M2) αξία του UGT1A9 ήταν πολύ υψηλότερο από εκείνο των UGT2B7 [24]. Και στα κύτταρα ΗΤ29, η βασική έκφραση του UGT2B7 είναι πολύ χαμηλότερη από ό, τι UGT1A9 (Σχήμα S1). Με βάση αυτό το εύρημα, η αποσιώπηση των UGT1A από UGT1A siRNA και η παρακώλυση της UGT1A9 από προποφόλη εξετάστηκαν στο μεταβολισμό TSA και τοξικότητας στην παρούσα μελέτη.

ΗΤ29 κύτταρα διαθέτουν επαρκή UGT ενζύμων δραστηριότητα για glucuronidate TSA τόσο η κλάσματα S9 και ζωντανά κύτταρα (Σχήμα 1, 2, 3).