Αφηρημένο

TRAIL είναι ένας συνδετήρας υποδοχέα θανάτου που προκαλεί κυτταρικό θάνατο κατά προτίμηση στα κύτταρα του όγκου. Ανασυνδυασμένο διαλυτό TRAIL, ωστόσο, έχει χαμηλή επίδοση ως θεραπευτικός κατά του καρκίνου επειδή ολιγομερισμού απαιτείται για ισχυρή βιολογική δράση. Εμείς προηγουμένως δημιουργείται ένα διάσωμα μορφή του όγκου με στόχευση TRAIL ονομάζονται Db

αEGFR-scTRAIL, που περιλαμβάνει μονόκλωνα μόρια TRAIL (scTRAIL) και τις μεταβλητές περιοχές μιας εξανθρωπισμένης παραλλαγής του αντισώματος αποκλεισμού Cetuximab EGFR. Εδώ ορίζουμε τη βιοδραστικότητα Db

αEGFR-scTRAIL όσον αφορά τόσο την αναστολή EGFR και ενεργοποίησης υποδοχέα TRAIL σε 3D καλλιέργειες καρκινικών κυττάρων Caco-2 του παχέος εντέρου, τα οποία εκφράζουν άγριου τύπου K-Ras. Σε σύγκριση με τις συμβατικές καλλιέργειες 2D, Caco-2 κύτταρα εμφάνισαν αυξημένη ευαισθησία έντονα προς Db

αEGFR-scTRAIL σε αυτές τις καλλιέργειες 3D. Θα δείξουμε ότι το τμήμα αντισώματος της DB

αEGFR-scTRAIL όχι μόνο αποτελεσματικά αγωνίστηκε με τη λειτουργία του EGFR που επάγεται με συνδέτη, αλλά καθορίζεται επίσης την αποπτωτική απόκριση από ειδικά κατευθύνοντας Δβ

αEGFR-scTRAIL με EGFR-θετικά κύτταρα. Για την αντιμετώπιση πώς ενεργοποιούνται ανωμάλως K-Ras, γεγονός που οδηγεί σε αντίσταση Το cetuximab, επηρεάζει Db

ευαισθησία αEGFR-scTRAIL, δημιουργήσαμε σταθερές Caco-2tet κύτταρα επαγόμενα εκφράζουν ογκογόνο Κ-Ras

G12V. Με την παρουσία δοξυκυκλίνης, τα κύτταρα αυτά έδειξαν αυξημένη αντίσταση σε Db

αEGFR-scTRAIL, που συνδέεται με την αυξημένη έκφραση των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών cIAP2, Bcl-xL και Flip

S. Συν-επεξεργασία των κυττάρων με το Smac μιμητική SM83 αποκατασταθεί ΣΠ

αEGFR-scTRAIL που προκαλείται αποπτωτική απόκριση. Είναι σημαντικό, αυτή η συνέργια μεταξύ της DB

αEGFR-scTRAIL και SM83 μεταφράζεται επίσης σε 3D καλλιέργειες ογκογόνο Κ-Ras εκφράζουν HCT-116 και LoVo ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα. Τα ευρήματά μας υποστηρίζουν έτσι την αντίληψη ότι η DB

θεραπεία αEGFR-scTRAIL σε συνδυασμό με παράγοντες της απόπτωσης-ευαισθητοποίηση μπορεί να ελπιδοφόρα για τη θεραπεία του EGFR-θετικούς καρκίνους του παχέος εντέρου, ανεξάρτητα από το

KRAS

την κατάστασή τους.

Παράθεση: Möller Υ, Siegemund Μ, Beyes S, Herr R, Lecis D, Delia D, et al. (2014) στοχεύει EGFR TRAIL και ένα Smac Mimetic Synergize να υπερνικήσει απόπτωση Αντίσταση στο

Cells KRAS

Mutant καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (9): e107165. doi: 10.1371 /journal.pone.0107165

Επιμέλεια: Γιάννης Souglakos, Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο Ηρακλείου και Εργαστήριο όγκων Κυτταρικής Βιολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Κρήτης, Ελλάδα |

Ελήφθη: Ιούνιος 2, 2014? Αποδεκτές: 4 Αυγούστου 2014? Δημοσιεύθηκε: 8 του Σεπτέμβρη του 2014

Copyright: © 2014 Möller et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση: Το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF? https://www.bmbf.de/) ε:. Bio επιχορήγηση «ΠΡΟΒΛΕΨΗ να ΜΑΟ, RK και KP. RH και η φυματίωση υποστηρίζονται από την Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG? https://www.dfg.de/) μέσω του Κέντρου Collaborative Research 850 και την Πρωτοβουλία Αριστείας του BMBF μέσω EXC 294 BIOSs. Της φυματίωσης και της ΜΑΟ υποστηρίζονται από το πρόγραμμα Heisenberg της DFG. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. DL και DD είναι εφευρέτες στο δίπλωμα ευρεσιτεχνίας WO /2013/124701 (PCT /IB2012 /000297: «Ομο- και ετεροδιμερών SMAC μιμητικές ενώσεις ως επαγωγείς απόπτωσης»). KP και RK και MS είναι εφευρέτες στο δίπλωμα ευρεσιτεχνίας CA2831820 Α1 (PCT /EP2012 /001426: «Η ανασυνδυασμένη TNF συνδετήρα πολυπεπτίδια μέλος της οικογένειας με τον τομέα δέσμευσης του αντισώματος και χρήσεις αυτών»). KP είναι σύμβουλος και έχει λάβει την εμπορική χρηματοδότηση της έρευνας από τις ΜΜΕ. RK είναι σύμβουλος και έχει λάβει την εμπορική χρηματοδότηση της έρευνας από BioNTech. Οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι αυτό δεν μεταβάλλει την προσκόλλησή τους σε όλες τις πολιτικές PLoS ONE για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι μια από τις πιο διαδεδομένες καρκίνους παγκοσμίως και ιδιαίτερα στην ασθενείς με προχωρημένο CRC ποσοστά επιβίωσης είναι χαμηλό [1]. Εκτός από τη χημειοθεραπεία, στοχευμένες θεραπείες έχουν εισέλθει στην κλινική. Επί του παρόντος, ο EGFR (υποδοχέας επιδερμικού αυξητικού παράγοντα) αντισώματα αποκλεισμού cetuximab και Panitumumab έχουν εγκριθεί για τη θεραπεία του μεταστατικού CRC σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία ή ως θεραπεία συντήρησης σε χημειο-πυρίμαχων όγκους [2], [3].

EGFR, επίσης γνωστή ως ErbB1 ή HER1, συνδέεται με την παθογένεση διαφόρων καρκίνων επιθηλιακών άνθρωπο. Αυτή η κινάση τυροσίνης υποδοχέα περιλαμβάνει μία εξωκυτταρική περιοχή σύνδεσης συνδετήρα, μία περιοχή ενιαία μεμβράνη εκτείνονται, και κυτταροπλασματική περιοχή κινάσης τυροσίνης [4], [5]. Κατά την πρόσδεση των προσδεμάτων όπως EGF και ΤΟΡ-α, ομο- υποδοχέα και ετεροδιμερίζεται κατά προτίμηση με το μέλος της οικογένειας ErbB2 /HER2 που οδηγεί στην ενεργοποίηση του υποδοχέα και διαφωσφορυλίωση συγκεκριμένων τυροσίνες στην κυτταροπλασματική ουρά. Αυτές φωσφοτυροσίνες παρέχουν θέσεις σύνδεσης για ενδοκυτταρικά μόρια σηματοδοτήσεως που πυροδοτούν την ενεργοποίηση του ΜΑΡΚ και ΡΙ3Κ, οι οποίοι μεσολαβούν βιολογικές αποκρίσεις όπως πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την επιβίωση [5], [6]. Το cetuximab ανταγωνίζεται με συνδετήρες EGFR για, έτσι καταστολή φωσφορυλίωση του υποδοχέα σύνδεσης υποδοχέα και την ενεργοποίηση των κατάντη σηματοδότησης [1].

Οι διάφορες γενετικές αλλοιώσεις βρέθηκαν σε CRC περιορίζει την αποτελεσματικότητα των αντι-EGFR θεραπείες. Σχεδόν το 40% όλων των CRC περιπτώσεων λιμάνι ενεργοποίηση μεταλλάξεων στο

KRAS

γονίδιο. Υποδοχέα σηματοδότηση κινάσης τυροσίνης συγκλίνει στο επίπεδο της μικρής ΟΤΡάσης Ras, ένα κύριο ρυθμιστή των δύο, ΜΑΡΚ και ΡΙ3Κ μονοπάτια. Οι πιο συχνές μεταλλάξεις συμβαίνουν στο κωδικόνιο 12 ή 13, που οδηγούν σε συστατική ενεργοποίηση Ras και, κατά συνέπεια, μειωμένη ή καθόλου ανταπόκριση στη θεραπεία Cetuximab [7], [8].

TRAIL (νέκρωσης όγκου απόπτωση παράγοντα που σχετίζονται επάγει συνδέτη) είναι ένας συνδετήρας θανάτου που επάγει απόπτωση επιλεκτικά σε κύτταρα όγκου μέσω των υποδοχέων θανάτου TRAILR1 και TRAILR2, επίσης γνωστή ως DR4 και DR5, αντίστοιχα [9]. Η δέσμευση του TRAIL προκαλεί ολιγομερισμό του υποδοχέα, που ακολουθείται από την πρόσληψη των πρωτεϊνών προσαρμογέα και τον σχηματισμό του συμπλόκου σηματοδότησης που επάγει θάνατο. Αυτό οδηγεί τελικά στην ενεργοποίηση των κασπασών ενάρξεως και συνεχόμενη ενεργοποίηση κασπασών τελεστή, με αποτέλεσμα αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο [10]. Οι κλινικές δοκιμές με χρήση ανασυνδυασμένων TRAIL επιβεβαίωσε την χαμηλή τοξικότητα σε κανονικό ιστό, αλλά θεραπευτικά αποτελέσματα ήταν ανεπαρκή [11], [12]. Για να ξεπεραστούν αυτές οι προσεγγίσεις μηχανικής περιορισμούς πρωτεΐνης έχουν στόχο τη βελτίωση της βιοδραστικότητας, διατηρώντας παράλληλα την επιλεκτικότητα του όγκου. Σωστή τριμερισμό και ψευδαργύρου συντονισμό των ανασυνδυασμένου TRAIL φαίνεται να είναι ζωτικής σημασίας για τη βιολογική δραστηριότητα [13]. Κατά συνέπεια, ο σχεδιασμός ενός πολυπεπτίδιο μονής αλυσίδας που περιλαμβάνει τις εξωκυτταρικές περιοχές των τριών μονομερών TRAIL (scTRAIL) ενίσχυσε την βιοδραστικότητα του ανασυνδυασμένου μορίου [14]. Τέτοια μόρια μπορεί περαιτέρω να συντηχθεί με αντισώματα που κατευθύνονται εναντίον καρκινικών δεικτών. Έχουμε προηγουμένως έδειξαν ότι η σύντηξη του scTRAIL σε ένα θραύσμα αντισώματος μονής αλυσίδας (scFv) λειτουργικά μιμείται το φυσικό TRAIL δεσμευμένη σε μεμβράνη και ήταν πιο αποτελεσματική από μόνη της scTRAIL [14]. Η εισαγωγή ενός διασώματος διαμόρφωση με βάση τις ανθρωποποιημένες μεταβλητές περιοχές του cetuximab (Db

αEGFR-scTRAIL) οδήγησε σε ακόμη υψηλότερη βιοδραστικότητα της ανασυνδυασμένης TRAIL τόσο in vitro όσο και in vivo, όπως φαίνεται από την ισχυρή μείωση του μεγέθους του όγκου και παρατεταμένη επιβίωση γυμνών ποντικών που φέρουν ξενομοσχεύματα ΟοΙο205 [15].

Εκτός από τη στόχευση του όγκου αποτέλεσμα, το τμήμα αντισώματος EGFR-σκηνοθεσία που περιέχεται μέσα στο Db

αEGFR-scTRAIL μόριο μπορεί να παρεμβαίνει ενεργά με τη λειτουργία του EGFR, ενώ ταυτόχρονα την τόνωση της απόπτωση. Για να τεμαχίσει τη συμβολή των αποκλεισμός EGFR στην βιοδραστικότητα Db

αEGFR-scTRAIL χρησιμοποιήσαμε το Caco-2 κυτταρική γραμμή CRC EGFR-θετικός, που φιλοξενεί μεταλλάξεις σε APC, ρ53, και Smad4 αλλά είναι άγριου τύπου για την ΜΑΡΚ και οδούς ΡΙ3Κ [16]. Για να μιμούνται περισσότερο στενά την in vivo κατάσταση, τα κύτταρα Caco-2 αναπτύχθηκαν σε 3D καλλιέργειες κολλαγόνου /matrigel όπου σχηματίζουν πλήρως διαφοροποιημένα πολωμένο κύστεις [17]. συνθήκες ανάπτυξης είναι γνωστό ότι επηρεάζουν την ισορροπία των σημάτων επιβίωσης και απόπτωσης, υπογραμμίζοντας την ανάγκη για τη μελέτη των μηχανισμών φαρμακευτική αγωγή και αντίσταση όχι μόνο σε συμβατικά 2D καλλιέργειες [18]. Πράγματι, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η καλλιέργεια των κυττάρων Caco-2 σε μία μήτρα 3D καθιστά τα κύτταρα TRAIL-ευαίσθητα. Έχουμε αποδείξει περαιτέρω ότι η σηματοδότηση EGFR συμβάλλει σε πολλαπλασιασμό κυττάρου Caco-2 και μπορεί να μπλοκαριστεί από φαρμακολογική αναστολή EGFR. Η σημασία του τμήματος αντισώματος EGFR-ειδικά για την αποτελεσματική στόχευση της DB

αEGFR-scTRAIL υπογραμμίζεται από το γεγονός ότι τα χαμηλά επίπεδα EGFR χαρακτηρίζουν τον υποπληθυσμό κυττάρων που επιβιώνει Δβ

θεραπεία αEGFR-scTRAIL. Επιπλέον, αν και επηρεάζεται από τον αποκλεισμό EGFR per se, οι EGFR-θετικά Ras μεταλλαγμένα κύτταρα CRC στοχευμένη και ευαισθητοποιημένα σε Db

αEGFR-scTRAIL απόπτωση που επάγεται με συν-επεξεργασία με το Smac μιμητικό SM83. Η ισχυρή κυτταροτοξική δραστικότητα των Db

αEGFR-scTRAIL αποκαλύπτεται σε αυτή τη μελέτη έτσι προσφέρεται στήριξη για την περαιτέρω ανάπτυξη του ως αντικαρκινικό θεραπευτικό για την θεραπεία της CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

αντισώματα και αντιδραστήρια

Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα μονοκλωνικά αντι-pEGFR (Y1068) (1:1000), μονοκλωνικό αντι-κασπάσης-3 (1:1000), πολύκλωνα αντι-TRAILR2 (1:500), κουνελιού πολυκλωνικό αντι-pERK (T202 /Y204) (1:1000), μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού αντι-ρΑΚΤ (T308) (1:1000), πολύκλωνα αντι-cIAP1 (1:1000), μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού αντι-cIAP2 (1:1000 ), αντι-ΕΚΚ μονοκλωνικό ποντικού (1:1000), μονοκλωνικό ποντικού αντι-ΑΚΤ (pAN) (1:1000), μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού έναντι Ε-καδερίνης (1:250), μονοκλωνικό ποντικού αντι-Smac (1:1000), πολυκλωνικό κουνελιού αντι-ΒοΙ-2 (1:1000), μονοκλωνικά αντι-Bcl-xL (1:400) και μονοκλωνικά αντι-survivin (1:1000) (όλα από την Cell Signaling, Danvers, ΜΑ, USA), μονοκλωνικά ποντικού αντι-ΧΙΑΡ (1:400), μονοκλωνικό ποντικού αντι-Ras (1:200) (BD, CA, Sanjosé, USA), μονοκλωνικό ποντικού αντι-κτυπήματα /L (1:400) και πολυκλωνικό κουνελιού αντι-TRAILR1 (1 :1000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, ΤΧ, USA), μονοκλωνικό ποντικού αντι-EGFR (1:500) (Thermo Scientific, Fremont, ΜΑ, USA), αντι-αλφα-τουμπουλίνης μονοκλωνικό ποντικού (1:5000) (Sigma -Aldrich, St Louis, MO, USA), και αντι-GFP μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (1:1000) (Roche Applied Science, Mannheim, Germany). HRP-επισημασμένο δευτερογενές αντι-ποντικού και IgG αντισώματα αντι-κουνελιού (1:10000) ήταν από την GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). Alexa Fluor 488- και 546-επισημασμένο δευτερογενές αντι-ποντικού και των αντισωμάτων IgG αντι-κουνελιού (1:500) και Alexa Fluor 633-σημασμένο φαλλοειδίνη (1:100) ήταν από την Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). ΫΑΡΙ ήταν από την Sigma-Aldrich, Z-VAD-FMK ήταν από την Bachem AG (Bubendorf, Switzerland), και Cetuximab από την Merck (Darmstadt, Γερμανία). Db

αEGFR-scTRAIL παρήχθη σε κύτταρα ΗΕΚ293 και καθαρίστηκαν από υπερκείμενα κυτταρικής καλλιέργειας [15]. Η σύνθεση και ο καθαρισμός του SM83 έχει περιγραφεί προηγουμένως [19], [20].

Κυτταρική καλλιέργεια

Caco-2, HCT-116, και LoVo κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen ), και Caco-2tet κύτταρα σε ϋΜΕΜ (Invitrogen) συμπληρωμένο με 10% FCS (ΡΑΑ Laboratories, Cölbe, Γερμανία). Οι κυτταρικές γραμμές επωάστηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 στους 37 ° C. Για αυξητικός παράγοντας που εξαρτάται δοκιμασίες κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιέχει 2% FCS συν 10 ng /ml EGF (Sigma-Aldrich) και ΤΟΡ-α (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA). Για την ανάπτυξη σε 3D, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα κρεβάτι του αυξητικού παράγοντα μειωμένη matrigel (BD) και κολλαγόνο PureCol-S (Advanced Biomatrix, San Diego, CA, USA) (1:01) και επιστρώθηκαν με μέσο ανάπτυξης που περιέχει 2% matrigel. Αυλό επέκταση προκλήθηκε με την προσθήκη 100 ng /ml τοξίνης χολέρας. (CTX? Sigma Aldrich) κατά την ημέρα 3 μετά τη σπορά

Δημιουργία Caco-2tet Ras

κύτταρα G12V

Η pTET /

KRAS

G12V-IRES-GFP-BSR φορέα έκφρασης, η οποία επιτρέπει την δοξυκυκλίνη-επαγόμενη έκφραση του K-Ras

G12V, δημιουργήθηκε από την ανάκτηση του K-Ras

G12V ανοικτής ανάγνωσης πλαίσιο από ρΒΑΒΕ-K-Ras

G12V (Addgene) από το

BamH

Ι πέψης, ακολουθούμενη από την εισαγωγή μέσα στο

Βα

II-ευθυγραμμισμένο φορέα pMIG [21]. Το προκύπτον K-Ras

G12V-IRES-GFP κασέτα ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας ολιγονουκλεοτίδια που περιέχουν πλευρικές

Δεν

Ι θέσεις, οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν για υποκλωνοποίηση σε pSC-Α-amp /kan (Stratagene, La Jolla , CA, USA). Στη συνέχεια, η K-Ras

G12V-IRES-GFP κασέτα κλωνοποιήθηκε μέσω

Δεν

Ι πέψη στον φορέα pTET-BSR [22], αποδίδοντας pTET /K-Ras

G12V-IRES- GFP-BSR. Για να επιτευχθεί η δοξυκυκλίνη-επαγώγιμη έκφραση των ογκογόνων K-Ras, Caco-2tet κύτταρα, που εκφράζουν σταθερά τα δοξυκυκλίνη επαγόμενο εξαρτήματα του συστήματος rtTA και RTT [21], επιμολύνθηκαν με το

Ahd

I-γραμμικοποιημένο pTET /K- Ras

G12V-IRES-GFP-BSR φορέα με ηλεκτροφόρηση. Μετά από επιλογή με blasticidine S (5 μg /ml) και πουρομυκίνης (5 μg /ml), ανθεκτικές πισίνες κυττάρων υποβλήθηκαν σε διαλογή για την αποτελεσματική επαγωγή K-Ras

έκφραση G12V. Η διαγονιδιακή έκφραση επήχθη με προσθήκη 2 μg /ml δοξυκυκλίνης (Merck).

FACS ανάλυση

Ανάλυση διαγονιδίου έκφραση των Caco-2tet κυττάρων πραγματοποιήθηκε μετά από αγωγή 72 DOX. Τα κύτταρα πλύθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε PBS που περιέχει 2% FCS και 0,01% αζίδιο του νατρίου, και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα EPICS FC500 (Beckman Coulter, Krefeld, Germany). ανάλυση των δεδομένων μετά την εξαγορά πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού FlowJo (Δέντρο Αστέρι? Ashland, OR, USA).

κηλίδωση Western

Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% Triton-Χ 100, 0.5 δεοξυχολικό νάτριο, 0.1% SDS, 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 10 mM φθοριούχο νάτριο και 20 β-γλυκεροφωσφορικό συν αναστολείς πρωτεάσης Complete mM (Roche)). Για 3D λύματα, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε αγνά matrigel χωρίς κολλαγόνο. Τα σφαιροειδή απομονώθηκαν μετά από 4 ημέρες χρησιμοποιώντας Solution ανάκτηση κυττάρων (BD) και λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA. Τα προϊόντα λύσης διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση, ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE (NuPAGE Novex Bis-Tris Gel? Invitrogen) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (iBlot Gel Μεταφορά Στοίβες? Invitrogen). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν με 0.5% αντιδραστήριο αποκλεισμού (Roche) σε PBS που περιέχει 0.1% Tween-20 και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα, που ακολουθείται από συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα. Οπτικοποίηση έγινε με το σύστημα ανίχνευσης ECL (Pierce, Rockford, IL, USA).

Δοκιμασίες

ΜΤΤ, κυτταροτοξικότητα και κασπάσης 3/7 δραστηριότητα

Για 2D πολιτισμούς, 2.5 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε 100 μΙ μέσου τοποθετήθηκαν σε μη επικαλυμμένες πλάκες 96-φρεατίων. Για 3D καλλιέργειες, 5 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε matrigel /96-φρεατίων επικαλυμμένες με κολλαγόνο σε 100 μΙ μέσου που περιέχει 2% matrigel. Η βιωσιμότητα προσδιορίστηκε με την προσθήκη 10 μΐ 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2yl-) 2,5-διφαινυλ τετραζολίου (ΜΤΤ? Roth, Karlsruhe, Germany) διάλυμα (5 mg /ml) που ακολουθείται από επώαση για 3 ώρες. Τα κύτταρα λύθηκαν με προσθήκη 100 μΙ 50% διμεθυλοφορμαμίδιο που περιέχει 10% SDS και μετρήθηκε η απορρόφηση στα 570 nm χρησιμοποιώντας τον αναγνώστη πολύτροπη άπειρο 200 PRO (Tecan, Männedorf, Ελβετία). Η κυτταροτοξικότητα μετρήθηκε με τη χρήση της Δοκιμασίας CytoTox-Glo από την Promega κυτταροτοξικότητα (Madison, WI, USA). Η δραστικότητα των νεκρών κυττάρων πρωτεάσης στην καλλιέργεια προσδιορίσθηκε με προσθήκη 50 μΙ φωτογονικό υπόστρωμα. Μετά από 15 λεπτά επώαση σε RT, φωταύγεια μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον αναγνώστη πολύτροπη άπειρο 200 PRO (Tecan), ακολουθούμενη από λύση των κυττάρων και τη μέτρηση της συνολικής φωταύγειας για ομαλοποίηση.

Caspase 3/7 δραστικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την Caspase- Glo3 /7 Δοκιμασία από την Promega (Madison, WI, USA) με προσθήκη 70 μλ φωτογονικό υπόστρωμα που περιέχει την αλληλουχία DEVD. Μετά από 30 λεπτά επώασης σε θερμοκρασία δωματίου, φωταύγεια μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον αναγνώστη πολύτροπη Άπειρο 200 PRO (Tecan).

Tunel χρώση

ρηγμάτων της έλικας DNA αναλύθηκαν με την in situ κιτ ανίχνευσης κυτταρικού θανάτου (ΕΚΕ ) από τη Roche. Τα κύτταρα στερεώθηκαν με 4% PFA για 1 ώρα σε RT και διαπερατά με 0,1% Triton-X 100 σε 0.1% κιτρικό νάτριο για 2 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Επισήμανση διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή για 1 ώρα στους 37 ° C. Πυρήνες αντίθετα με DAPI. Τα πλακίδια τοποθετούνται σε Fluoromount G (Southern Biotechnology, Birmingham, AL, USA) και αναλύθηκαν σε ένα συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ (LSM 700? Zeiss, Oberkochen, Germany). Εικόνες επεξεργάστηκαν με το λογισμικό ZEN (Zeiss). Tunel-θετικά κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ImageJ (W. Rasband, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας των ΗΠΑ? Version 1.48).

ανοσοφθορισμού μικροσκοπία

Τα κύτταρα που αναπτύχθηκαν σε 3D στο matrigel /επικαλυμμένων με κολλαγόνο 8 φρεατίων διαφάνειες θάλαμος γυαλί (BD) σταθεροποιήθηκαν με 4% PFA για 15 λεπτά, διαπερατά με PBS που περιέχει 0.1% Triton Χ-100 για 10 λεπτά και αποκλείστηκαν με 5% ορό κατσίκας (Invitrogen) σε PBS που περιέχει 0.1% Tween-20. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα σε ρυθμιστικό διάλυμα φραγμού (2 h σε RT), πλύθηκε με PBS που περιέχει 0.1% Tween-20 και επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα σε ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού (2 ώρες σε RT). F-ακτίνης και οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με Alexa Fluor 633-σημασμένο φαλλοειδίνη και DAPI. Τα πλακίδια τοποθετούνται σε Fluoromount G και αναλύθηκαν σε ένα συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ (LSM 700? Zeiss, Oberkochen, Germany) με τη χρήση 488, 561 και 633 nm διέγερση με λάδι αντικειμενικοί φακοί Σχέδιο Αχρωματικός 63x /1.40 DIC M27. Οι εικόνες επεξεργάστηκαν με το λογισμικό ΖΕΝ (Zeiss).

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος (± S.E.M.), και «ν» αναφέρεται στον αριθμό των ανεξάρτητων πειραμάτων. Η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε με t-test, και μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από post-test κατά Tukey (GraphPad Prism version 4.03? GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). p-τιμές κάτω από 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές (* p & lt? 0,05? ** p & lt? 0,01? *** p & lt? 0.001? ns, p & gt? 0,05).

Αποτελέσματα

Σε 3D matrigel καλλιέργειες, τα κύτταρα Caco-2 διαφοροποιούνται σε πολωμένο κύστεις που αποτελείται από ένα μόνο στρώμα κυττάρων που περιβάλλει έναν κεντρικό αυλό [17], [21], αντανακλώντας την οργάνωση οργανοτυπικές του παχέος εντέρου. Επειδή αυτά τα κύτταρα είναι EGFR-θετικά και εκφράζουν το Ras άγριου τύπου, αντιπροσωπεύουν ένα ιδανικό σύστημα μοντέλο για τη μελέτη το συνδυασμένο αποτέλεσμα της αναστολής EGFR και ενός παράγοντα που επάγει την απόπτωση όπως TRAIL. Για να δοκιμαστεί πρώτα η αποτελεσματικότητα της Db

αEGFR-scTRAIL, Caco-2 κύτταρα καλλιεργήθηκαν για τρεις ημέρες σε 3D σε μέσο που περιέχει 10% FCS πριν την προσθήκη Db

αEGFR-scTRAIL ακολουθούμενη από μετρήσεις ΜΤΤ τρεις ημέρες αργότερα. Σε αυτές τις καλλιέργειες, σχετικά χαμηλές δόσεις Db

αEGFR-scTRAIL προκάλεσε μια σημαντική μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων που συνδέονται με τη διαταραχή των κύστεων και του σχηματισμού αποπτωτικών σωμάτων (Σχ. 1α, β), scTRAIL μόνη ή σε συνδυασμό με το cetuximab απέτυχε να προκαλέσει μία κυτταροτοξική απόκριση σε Caco-2 3D καλλιέργειες (Εικ. S1), που υποστηρίζει προηγούμενα δεδομένα μας ότι η διάσωμα μεσολάβηση διμερή δομή του Db

αEGFR-scTRAIL προσδίδει ανώτερη βιοδραστικότητα επί scTRAIL [15]. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε συμβατικές καλλιέργειες 2D κυττάρων σε πλαστικά, τα κύτταρα Caco-2 ήταν ιδιαίτερα ανθεκτικό σε Db

θεραπεία αEGFR-scTRAIL (Εικ. 1α, β), σύμφωνα με μια προηγούμενη αναφορά, χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένη ανθρώπινη TRAIL [23]. Προκατεργασία των Caco-2 3D καλλιέργειες με Z-VAD, έναν αναστολέα παν-κασπάσης, μείωσε σημαντικά την κυτταροτοξική δράση του Db

αEGFR-scTRAIL (Εικ. 1c), και η επαγωγή της απόπτωσης από Db

αEGFR- scTRAIL επιβεβαιώθηκε από την ανάλυση του κατακερματισμού του DNA με Tunel χρώσης (Σχ. 1δ, ε). Επιπλέον, σε σύγκριση με 2D καλλιέργειες, η δοσο-εξαρτώμενη ενεργοποίηση των κασπασών 3/7 σε απόκριση προς Db

αEGFR-scTRAIL ήταν σημαντικά αυξημένη σε 3D καλλιέργειες (Σχ. 1f). Αυτή η διαφορά στην ευαισθησία προς Db

αEGFR-scTRAIL σε 3D έναντι 2D καλλιέργειες δεν θα μπορούσε να αποδοθεί σε αλλαγές στην EGFR ή TRAILR1 /2 έκφραση (Εικ. 1 g, h). Δυστυχώς, επειδή τους υποδοχείς δολώματα DcR1, DcR2 δεν μπορούσε να ανιχνευθεί με ανοσοστύπωση με τα διαθέσιμα αντισώματα, οι αλλαγές έκφρασης σε αυτούς τους υποδοχείς δεν θα μπορούσε να αποκλειστεί. Ανάλυση των βασικών οδών σηματοδότησης αποκάλυψε ότι, σε 3D καλλιέργειες, η δραστηριότητα της οδού της ΡΙ3Κ κατεστάλη σε σύγκριση με κύτταρα που καλλιεργούνται σε 2D όπως μετράται με φωσφο-Ακί επίπεδα, ενώ η οδός /ΜΑΡΚ ΕΚΚ ρυθμίζεται αυξητικά όπως φαίνεται από την αυξημένη ERK1 /2 φωσφορυλίωση ( Σχ. 1 g, h). Ωστόσο, η αναστολή της ΡΙ3Κ με LY294002 σε 2D καλλιέργειες δεν ήταν αρκετή για να ευαισθητοποιήσει κύτταρα σε Db

αEGFR-scTRAIL (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), υποδεικνύοντας μια πιο σύνθετη σενάριο σε 3D καλλιέργειες. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υπογραμμίζουν την επίδραση των συνθηκών καλλιέργειας από την κυτταρική απόκριση προς παράγοντες που προκαλούν απόπτωση.

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 3D ή 2D σε μέσο που περιέχει 10% FCS. (Α) Τρεις ημέρες μετά την σπορά, οι καλλιέργειες υποβλήθηκαν σε θεραπεία με Δβ

αEGFR-scTRAIL. Η βιωσιμότητα μετρήθηκε 72 ώρες αργότερα με δοκιμασία ΜΤΤ και ομαλοποιήθηκε ως προς το μη επεξεργασμένο έλεγχο (η = 3). (Β) τις εικόνες αντίθεσης φάσης του 3D και 2D καλλιέργειες που περιγράφονται στο (α) υποβάλλεται σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις Db

αEGFR-scTRAIL για 72 h (bar κλίμακα: 50 μm). (Γ) Τρεις ημέρες μετά τη σπορά, 3D καλλιέργειες προεπεξεργασία με 20 μΜ Z-VAD, όπως αναφέρεται πριν από την προσθήκη του 1 nM Db

αEGFR-scTRAIL. Η βιωσιμότητα μετρήθηκε 72 ώρες αργότερα με δοκιμασία ΜΤΤ και ομαλοποιήθηκε ως προς το μη επεξεργασμένο έλεγχο (ut) (n = 3). (Δ) 24 ώρες μετά την αγωγή, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν για διάσπαση της έλικας του DNA. Tunel-θετικά κύτταρα μετρήθηκαν (n = 2). (Ε) Εκπρόσωπος εικόνες των χρώσεις Tunel που περιγράφονται στο (δ), Tunel-θετικά κύτταρα (κόκκινο), DAPI (πυρήνες? Μπλε). Εμφανίζονται είναι ομοεστιακό τμήματα (γραμμή κλίμακας: 100 μm). (Στ) Τρεις ημέρες μετά την σπορά, οι καλλιέργειες υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0,1 ηΜ ή 1 ηΜ Db

αEGFR-scTRAIL για 24 ώρες. δραστικότητα Caspase 3/7 μετρήθηκε και κανονικοποιήθηκε ως προς το αντίστοιχο μη επεξεργασμένο έλεγχο (ut) (n = 3). (Ζ) Τέσσερις ημέρες μετά την σπορά, τα προϊόντα λύσης και αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση. Παρίσταται ένα αντιπροσωπευτικό στύπωμα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Τουμπουλίνης ανιχνεύθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Οι συγκεκριμένες ζώνες χαρακτηρίζονται από αιχμές βελών. (H) Ποσοτικοποίηση των Western blots από (g). Τα επίπεδα πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκαν με την αντίστοιχη του ελέγχου τουμπουλίνης? καθορίστηκαν τα επίπεδα στα 2D καλλιέργειες ως 1 (n = 3).

Η

επόμενο διερευνηθεί το πώς η παρουσία των συνδετήρων EGFR επηρεάζονται ανάπτυξη και διαφοροποίηση των κυττάρων Caco-2 στις καλλιέργειες 3D. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε καλλιέργειες matrigel περιέχουν χαμηλές ορού (2%) με την παρουσία EGF ή ΤΟΡ-α, εξασφαλίζοντας ότι ο πολλαπλασιασμός οφειλόταν κυρίως μέσω της σηματοδότησης EGFR. μετρήσεις δραστικότητας ΜΤΤ μετά από έξι ημέρες καλλιέργειας έδειξαν ότι EGF και ΤΟΡ-α ενισχυμένη τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Caco-2 σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου που αναπτύσσονται σε χαμηλές ορού μόνο (Σχ. 2α). Η μικροσκοπική ανάλυση αποκάλυψε ότι υπό την παρουσία EGF και ΤΟΡ-α κύστεις Caco-2 ήταν μεγαλύτερα και περιείχαν περισσότερα κύτταρα (Σχ. 2β). Αξίζει να σημειωθεί ότι, η προσθήκη συνδετήρων EGFR δεν παρεμβαίνει με τη διαφοροποίηση, όπως κρίνεται από την τυπική κορυφαία διανομή του F-ακτίνης και τον σχηματισμό ενός ελεύθερου κυττάρων αυλού (Σχ. 2β). Για την αντιμετώπιση πώς EGFR αποκλεισμό πλήττονται βασικά και συνδέτη-επαγόμενο πολλαπλασιασμό EGFR των καθιερωμένων Caco-2 κύστεις, έχουμε αντιμετωπίζεται των κυττάρων τρεις ημέρες μετά την σπορά με cetuximab (0,5 μΜ) και ανέλυσε τις κουλτούρες τρεις ημέρες αργότερα. Σε σύγκριση με τον μάρτυρα, σε αυτές τις καλλιέργειες η δραστικότητα ΜΤΤ μειώθηκε σημαντικά κατά 35-50%, αλλά τα κύτταρα ήταν ακόμη βιώσιμα, δεν έδειξε οποιαδήποτε σημάδια της απόπτωσης και μόνο αμελητέα αυξημένη κυτταροτοξικότητα (Εικόνα 2c-e?. S1d). Αυτό υποδεικνύει ότι η ενεργοποίηση του EGFR συμβάλλει στην βασική πολλαπλασιασμό, αλλά δεν απαιτείται για την επιβίωση. Το cetuximab επίσης ισχυρά ανέστειλε πολλαπλασιασμό παρουσία του EGF και ΤΟΡ-α, όπως φαίνεται από τη μείωση της δραστηριότητας ΜΤΤ και το μειωμένο μέγεθος των κύστεων (Σχ. 2c, d). Μαζί αυτά τα πειράματα επιδεικνύουν ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων Caco-2 σε 3D καλλιέργειες μπορεί να κατευθύνεται από σηματοδότηση EGFR και είναι ευαίσθητο σε φαρμακολογική αναστολή EGFR, και μπορούν έτσι δυνητικά να κατασταλεί με Db

αEGFR-scTRAIL.

Caco -2 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 3D καλλιέργειες που περιέχουν 2% FCS υπό την παρουσία αυξητικών παραγόντων (10 ng /ml) ή σε 2% μόνο FCS (con). (Α) Οι καλλιέργειες αναλύθηκαν με ανάλυση ΜΤΤ την ημέρα 6 και ομαλοποιούνται στη ελέγχου (n = 5). (Β) Τρεις ημέρες μετά την διαδικασία σποράς 100 ng /ml CTX προστέθηκε για να επάγει αυλό διαστολής. Τα σφαιροειδή μονιμοποιήθηκαν την ημέρα 6 και χρωματίσθηκαν με φαλλοειδίνη (F-ακτίνη) και ϋΑΡΙ (πυρήνες). Εμφανίζονται είναι ομοεστιακό τμήματα ενός εκπροσώπου κύστης (γραμμή κλίμακας: 10 μm). (Γ) Τρεις ημέρες μετά την σπορά, οι καλλιέργειες 3D αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με 0,5 μΜ Cetuximab (CET) για 72 ώρες. Η βιωσιμότητα προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ και ομαλοποιήθηκε ως προς το μη επεξεργασμένο έλεγχο (ut). (N = 4) (δ) Caco-2 3D καλλιέργειες αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με 0,5 μΜ Cetuximab για 72 ώρες και αναλύθηκε με μικροσκοπία φάσης (γραμμή κλίμακας: 50 μm). (Ε) Τρεις ημέρες μετά την σπορά, οι καλλιέργειες 3D αφέθηκαν χωρίς θεραπεία (UT) ή υποβάλλεται σε επεξεργασία με 0,5 μΜ Cetuximab (CET) για 72 ώρες. Η κυτταροτοξικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία CytoTox-Glo κυτταροτοξικότητα (n = 3).

Η

ενεργοποίηση EGFR διεγείρει όχι μόνο τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αλλά μπορεί επίσης να προστατεύσει από TRAIL-επαγώμενη απόπτωση [24]. Ως εκ τούτου, έχουμε την επόμενη διερεύνησε την αποτελεσματικότητα του Db

αEGFR-scTRAIL παρουσία προσδεμάτων EGFR. Ανοσοκηλίδωση των προϊόντων λύσης των EGF- και ΤΟΡ-α-διεγερμένα κύτταρα αποκάλυψε παρόμοιο βαθμό καταστολής της φωσφορυλίωσης του EGFR που επάγεται με συνδέτη είτε Cetuximab ή Db

αEGFR-scTRAIL προεπεξεργασίας (Σχ. 3α, β), υποδεικνύοντας το αποτελεσματικό ανταγωνισμό του διασώματος ήμισυ με τους συνδέτες EGFR. Αυτό θα μπορούσε επίσης να επιβεβαιωθεί σε καλλιεργημένα κύτταρα 3D Caco-2 διεγείρεται με EGF (Εικ. S2). Κατά συνέπεια, EGF και ΤΟΡ-α είχε καμία προστατευτική επίδραση επί της βιωσιμότητας σε 3D (Εικ. 3c), ούτε ήταν αυτά τα συνδεσμικά μπορούν να παρεμβαίνουν με την ενεργοποίηση της κασπάσης (Εικ. 3δ), καταδεικνύοντας ότι η DB

δραστικότητα αEGFR-scTRAIL δεν περιορίζεται από η παρουσία των συνδετήρων EGFR. Για να κατανοήσουμε σε περισσότερους μηχανισμούς αντίστασης λεπτομέρεια προς Db

αEGFR-scTRAIL, έχουμε εκ νέου απομονωθεί κύστεων από μη επεξεργασμένο και Δβ

αEGFR-scTRAIL επεξεργασμένο 3D καλλιέργειες matrigel ακολουθούμενη από ανοσοαποτύπωση των προϊόντων λύσης κυττάρων (Εικ. 3 στ, ζ). Είναι ενδιαφέρον, λύματα που προέρχονται από τα σωζόμενα κύστεις (Εικ. 3ε, βέλη) αποκάλυψε ότι αυτά Δβ

αEGFR-scTRAIL-αναίσθητη κυττάρων που περιέχονται ιδιαίτερα χαμηλά επίπεδα EGFR. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα επίπεδα του υποδοχέα TRAIL στα κύτταρα αυτά ήταν παρόμοια με εκείνα σε μη επεξεργασμένα κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η κατανομή της έκφρασης του EGFR στον κυτταρικό πληθυσμό έντονα αντίκτυπο Db

ευαισθησία αEGFR-scTRAIL (Εικ. 3f, g). Έτσι, αν και η χαρακτηριστική ομάδα διάσωμα δεν συμβάλλει ενεργά σε απόπτωση και κυρίως έχει μια λειτουργία αναστολής αύξησης σε Caco-2 3D καλλιέργειες, ο EGFR-κατευθυνόμενη στόχευση είναι σημαντική για την αύξηση της τοπικής συγκέντρωσης TRAIL και να ενεργοποιούν μια αποτελεσματική αποπτωτική απόκριση.

(α) Caco-2 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 2D αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή αγωγή με 4 ηΜ Db

αEGFR-scTRAIL ή 4 ηΜ Cetuximab για 15 λεπτά πριν από τη διέγερση με EGF ή ΤΟΡ-α (10 ng /ml) για 10 λεπτά. Οι φωσφορυλιωμένες και ολικές πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με ανοσοκηλίδωση. Παρίσταται ένα αντιπροσωπευτικό στύπωμα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Τουμπουλίνης ανιχνεύθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) Ποσοτικοποίηση των Western blots από το (α). επίπεδα φωσφο-EGFR κανονικοποιήθηκαν προς τις αντίστοιχες επίπεδα ολικής πρωτεΐνης? καθορίστηκαν τα επίπεδα του μη επεξεργασμένου ελέγχου, όπως 1 (n = 3). (C, d). Τρεις ημέρες μετά την σπορά, Caco-2 3D καλλιέργειες που αναπτύσσονται απουσία ή παρουσία αυξητικών παραγόντων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 ηΜ Db

αEGFR-scTRAIL. (Γ) Η βιωσιμότητα προσδιορίστηκε με δοκιμασία ΜΤΤ μετά από 72 ώρες και ομαλοποιήθηκε ως προς το αντίστοιχο μη επεξεργασμένο μάρτυρα (ut). (N = 3) (δ) δραστηριότητα κασπάσης 3/7 μετρήθηκε μετά από 24 ώρες. Οι τιμές ομαλοποιήθηκαν με την αντίστοιχη μη επεξεργασμένο έλεγχο (η = 3). (Ε) Τρεις ημέρες μετά τη σπορά, Caco-2 3D καλλιέργειες είτε αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με 5 ηΜ Db

αEGFR-scTRAIL για 72 ώρες. Τα σωζόμενα κύστεις στις εικόνες αντίθεσης φάσης υποδεικνύεται από τα βέλη (γραμμή κλίμακας: 50 μm). (Στ) Κυτταρολύματα που προέρχονται από τις καλλιέργειες 3D φαίνεται στο (ε) αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση. Παρίσταται ένα αντιπροσωπευτικό στύπωμα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Τουμπουλίνης ανιχνεύθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Οι συγκεκριμένες ζώνες χαρακτηρίζονται από αιχμές βελών. (Ζ) Ποσοτικοποίηση των Western blots από (στ). Τα επίπεδα πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκαν με την αντίστοιχη του ελέγχου τουμπουλίνης? επίπεδα στα μη επεξεργασμένα καλλιέργειες οριστεί ως 1 (n = 3).

Η

Περίπου το 40% όλων των όγκων CRC φιλοξενούν ενεργό μετάλλαξη στην

KRAS

γονίδιο, που οδηγεί σε ιδιοσυστατική ERK /ενεργοποίηση ΜΑΡΚ και την απώλεια της ανταπόκρισης στο cetuximab [7], ενώ η ευαισθησία TRAIL μπορεί να αυξηθεί [25]. Για να διερευνηθεί η επίδραση των ογκογόνων Ras σε Db

αEGFR-scTRAIL επαγόμενη κυτταροτοξικότητα, δημιουργήσαμε σταθερές κύτταρα Caco-2 επαγόμενα εκφράζουν K-Ras

G12V. Σε αυτά τα κύτταρα, η δοξυκυκλίνη επάγει την bi-cistronic έκφραση του ογκογονιδίου και GFP, ενώ τα κύτταρα ελέγχου φορέα εκφράζουν μόνο GFP. Τρεις ημέρες μετά την προσθήκη δοξυκυκλίνη, περισσότερο από το 85% των κυττάρων Caco-2tet ήταν GFP θετικά με ανάλυση FACS (Σχ. 4α). Ανοσοαποτύπωση των Caco-2tet K-Ras

λύματα G12V κυττάρων επιβεβαίωσε Ras υπερέκφραση μαζί με αυτό της GFP, ταυτόχρονα με ισχυρή φωσφορυλίωση ERK, ενώ τα κύτταρα ελέγχου φορέα εκφράζεται μόνο GFP (Σχ. 4β). Όταν αυτά τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 3D καλλιέργειες εν απουσία δοξυκυκλίνη, τόσο Caco-2tet φορέα και K-Ras

G12V κύτταρα σχηματίζονται καλά διαφοροποιημένα και πολωμένο σφαιροειδή με βασεοπλευρική ενώσεις προσφύσεως (χρώση Ε-καδερίνης) και κορυφαία F-ακτίνης συσσώρευση γύρω από ένα ελεύθερο κυττάρων αυλού. Η προσθήκη της δοξυκυκλίνης δεν είχε καμία επίδραση στην μορφολογία των κυττάρων ελέγχου, ενώ οι Κ-Ras

κύτταρα που εκφράζουν G12V σχηματίζεται πολλαπλών αυλού σφαιροειδή που στερούνταν διακριτές πόλωση (Εικ. 4γ). Αυτά τα ελαττώματα διαφοροποίηση που προκαλείται από K-Ras

G12V είναι σύμφωνα με μια πρόσφατη έκθεση από Magudia et al. (2012) [16].

(α) Caco-2tet φορέα ελέγχου και Κ-Ras

G12V κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2 μg /ml δοξυκυκλίνης για 72 ώρες (+ DOX). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και ο φθορισμός GFP αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Μη επαγόμενα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος (-ΟΟΧ). (Β) Caco-2tet φορέα ελέγχου και Κ-Ras

G12V κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 2D και θεραπεία με δοξυκυκλίνη για τους υποδεικνυόμενους χρόνους πριν από την λύση. GFP, Ras, pERK (T202 /Y204) και τα επίπεδα ERK προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western. Τουμπουλίνης ανιχνεύθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Όλοι οι πίνακες που παρουσιάζονται είναι από την ίδια κηλίδα. (Γ) Caco-2tet φορέα ελέγχου και Κ-Ras

G12V κύτταρα σπάρθηκαν σε 3D καλλιέργειες εν απουσία ή παρουσία δοξυκυκλίνη. Τρεις ημέρες μετά την σπορά αυλό διαστολής προκλήθηκε με την προσθήκη 100 ng /ml CTX. Οι καλλιέργειες σταθεροποιήθηκαν τρεις ημέρες αργότερα και χρωματίστηκαν με αντίσωμα Ε-καδερίνης-ειδική (πράσινο), φαλλοειδίνη (κόκκινο) και DAPI (πυρήνες? Μπλε). Εμφανίζονται είναι ομοεστιακό τμήματα του εκπροσώπου κύστεις (γραμμή κλίμακας: 10 μm)

Η

Για τον προσδιορισμό των επιπτώσεων της K-Ras

έκφραση G12V σε Db

αEGFR-scTRAIL που προκαλείται κυτταροτοξικότητα, 3D πολιτισμούς. υποβλήθηκαν σε θεραπεία με δοξυκυκλίνη για τρεις ημέρες.