Αφηρημένο

Εφαρμογή της doxorubicin (Dox) για τη θεραπεία του καρκίνου είναι περιορισμένη λόγω των σοβαρών παρενεργειών της. Χρησιμοποιήσαμε στρατηγική συνδυασμό με το συνδυασμό δοξορουβικίνη (Dox) με withaferin Α (WFA) για να ελαχιστοποιήσει τις αρνητικές συνέπειες της Dox. Θεραπεία των διαφόρων επιθηλιακών καρκινικών κυτταρικών γραμμών ωοθηκών (Α2780, Α2780 /CP70 και Caov3) με συνδυασμό WFA και Dox (WFA /ϋΟΧ) έδειξε μία χρόνου και δοσο-εξαρτώμενη συνεργική επίδραση στην αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και επαγωγή του κυτταρικού θανάτου, έτσι μείωση της απαίτησης δοσολογίας της Dox. Η συνδυασμένη θεραπεία οδήγησε σε σημαντική αύξηση της παραγωγής ROS καταλήγοντας σε τεράστιες βλάβες στο DNA, η επαγωγή της αυτοφαγία αναλύθηκε με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο και αύξηση στην έκφραση του δείκτη LC3B αυτοφαγία, και κορυφώθηκε με κυτταρικό θάνατο αναλύθηκαν με διασπασμένης κασπάσης 3. Θα επικυρωθεί θεραπεία συνδυασμού επί του όγκου ανάπτυξη χρησιμοποιώντας ένα in vitro (3D) μοντέλο όγκου 3Dimension και το πιο κλασικό

in vivo

ξενομοσχεύματος μοντέλο καρκίνου των ωοθηκών. Και τα δύο μοντέλα όγκων έδειξαν μία μείωση 70 έως 80% στην ανάπτυξη του όγκου σε σύγκριση με τον έλεγχο ή ζώα που έλαβαν θεραπεία με WFA ή Dox μόνο. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση των ιστών όγκου από ζώα που υπέστησαν αγωγή με WFA /Dox συνδυασμός έδειξε μία σημαντική μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και το σχηματισμό μικροαγγείων συνοδεύεται από αυξημένη σε επίπεδο LC3B, διασπασμένη κασπάση 3, και βλάβη του DNA. Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι ο συνδυασμός WFA με Dox μειώνει την απαίτηση δοσολογίας της Dox, ως εκ τούτου, η ελαχιστοποίηση /εξάλειψη των σοβαρών παρενεργειών που σχετίζονται με υψηλές δόσεις DOX, υποδεικνύοντας την εφαρμογή της στρατηγικής αυτής συνδυασμού για τη θεραπεία των καρκίνων των ωοθηκών και άλλων με καθόλου ή ελάχιστη παρενέργειες

Παράθεση:. Fong ΜΟΥ, Jin S, M Rane, Singh RK, Gupta R, Kakar SS (2012) Withaferin Α συνεργεί η θεραπευτική επίδραση της δοξορουβικίνη μέσω ROS Μεσολαβεί Autophagy σε καρκίνο των ωοθηκών . PLoS ONE 7 (7): e42265. doi: 10.1371 /journal.pone.0042265

Επιμέλεια: Yunli Zhou, Ιατρική Σχολή του Χάρβαρντ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 22, 2012? Αποδεκτές: 2 Ιούλη, 2012? Δημοσιεύθηκε: 30 του Ιούλη του 2012

Copyright: © Fong et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση ήρθε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας /National Cancer Institute CA124630. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Raj Κ Singh έχει προσληφθεί από Vivo Biosciences Inc. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα ανάπτυξη ή εμπορία προϊόντων να δηλώσει. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η πιο θανατηφόρα κακοήθεια του γυναικείου αναπαραγωγικού συστήματος [1]. Λόγω της έλλειψης συμπτωμάτων σε ένα πρώιμο στάδιο της ασθένειας, το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης είναι μόνο 27,2% [1]. Η κύριων θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών είναι κυτταρομειωτική χειρουργική επέμβαση που ακολουθείται από πλατίνα χημειοθεραπεία με βάση [2]. Αρχικά, ο καρκίνος των ωοθηκών ανταποκρίνεται θετικά σε 70 έως 80% των περιπτώσεων [3]. Ωστόσο, μέσα σε 18 έως 24 μήνες μετά την αρχική θεραπεία, υποτροπή του όγκου συμβαίνει, η οποία (περίπου το 70% των ασθενών) αποδίδεται στα καρκινώματα που έχουν γίνει [3] Αυτό το χαμηλό ποσοστό επιβίωσης πλατίνα ανθεκτικά για τις γυναίκες με πλατίνα-ανθεκτικά καρκινώματα ωοθηκών σημεία σε μια επείγουσα ανάγκη για μια εναλλακτική στρατηγική της θεραπείας.

η δοξορουβικίνη (Dox) είναι ένα anthracylin ευρέος φάσματος απομονωθεί από

Streptomyces peucetius

που έχει χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία πολλών μορφών καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων των ωοθηκών, του μαστού, του προστάτη και [4]. Στην πραγματικότητα, anthracylins είναι το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο FDA εγκεκριμένο αντικαρκινικό φάρμακο [5]. αποτελεσματικότητα Dox έχει αποδοθεί στην ικανότητά της να παρεμβάλλονται μεταξύ των κλώνων του DNA να δρα ως αναστολέας τοποϊσομεράσης II και /ή να δεσμεύσει ομοιοπολικά με τις πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην αντιγραφή του DNA και στη μεταγραφή [5]. Η χρήση της Dox περιορίζεται από σοβαρές παρενέργειες δοσοεξαρτώμενο συμπεριλαμβανομένης της οξείας ναυτίας και του εμέτου, στοματίτιδα, νευρολογικές διαταραχές, έμφραγμα τοξικότητα, αλωπεκία, και απλασία του μυελού των οστών [5]. Εναλλακτικά, πεγκυλιωμένη λιποσωμιακή δοξορουβικίνη (PLD) (DOXIL) θεωρείται ως μία από τις βασικές επιλογές θεραπείας σε επαναλαμβανόμενες καρκίνους των ωοθηκών (ROC) [6]. Παρά συγκριτικά λιγότερες παρενέργειες, Doxil έχει πολύ χαμηλό ποσοστό ανταπόκρισης (& lt? 20%) [6]

Πιο πρόσφατα συνδυαστική θεραπεία με Dox έχει συγκεντρώσει περισσότερη προσοχή.. Συνδυάζοντας Dox με sildenafil ως αποτέλεσμα μια ενισχυμένη κυτταρικού θανάτου μέσω της προς τα κάτω ρύθμιση του Bcl-2 συνδέεται με αυξημένη κασπάσης 3 μέσω της ενίσχυσης της Dox επαγόμενη παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS), ενώ εξασθένησης Dox επαγόμενη καρδιακή δυσλειτουργία [7]. Dox έχει επίσης συνδυαστεί με HO-3867, ένα συνθετικό ανάλογο κουρκουμίνη, ώστε να εξασφαλίζεται καλύτερη κυτταρικό θάνατο και μειωμένη μυοκαρδιακή τοξικότητα μέσω της χρήσης χαμηλότερων δόσεων Dox [8]. Ως εκ τούτου, η θεραπεία συνδυασμού έχει αποδειχθεί ότι είναι μια χρήσιμη μέθοδος για τη μείωση των παρενεργειών που συνδέονται με Dox ενώ διατηρεί ακόμη θεραπευτική λειτουργία του.

Withaferin A (WFA) είναι βιοδραστικό, κελί διαπερατό στεροειδείς λακτόνης έχοντας withanolide σκελετού ως βασική του δομή. WFA απομονώνεται από το φυτό

Withania somniferia

, η οποία έχει ένα μέρος της ινδικής Ayurvedic ιατρική για αιώνες και είναι τώρα διαθέσιμο ως over-the-counter συμπλήρωμα διατροφής στις ΗΠΑ Έχει χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία μιας ποικιλίας των συνθηκών που οφείλονται σε αντι-φλεγμονώδη και αντι-βακτηριακή ιδιότητες. Πιο πρόσφατα, έχει προταθεί ως μια πιθανή ένωση κατά του καρκίνου καθώς έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει την ανάπτυξη όγκου, αγγειογένεση, μετάσταση και [9], [10]. Αρκετές βιολογικές λειτουργίες έχουν επηρεαστεί από WFA συμπεριλαμβανομένων επαγωγή απόπτωσης μέσω αδρανοποίησης των Akt και NF-κΒ [11], καθώς και μείωση της πρωτεΐνης προ-επιβίωσης Bcl-2 [12], [13], η επαγωγή της Par-4 [14 ], η αναστολή της Hsp90 και Notch-1 [15], G2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου [16], FOXO3a και ΒΙΜ ρύθμιση [9], η παραγωγή ROS [17], [18] και τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης του HPV Ε6 και Ε7 ογκοπρωτεΐνες [19].

μια προηγούμενη μελέτη έχει δείξει ότι WFA ενισχύει την κυτταροτοξική δράση του Dox σε ένα οστεογενές σάρκωμα (U2OS) και κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού (MCF-7) με τη χρήση μίας ανιχνεύσεως πολλαπλασιασμού των κυττάρων [20] . Ωστόσο, το συνδυασμένο αποτέλεσμα της Dox και WFA δεν έχει μελετηθεί στον καρκίνο των ωοθηκών, ένας μηχανισμός δράσης προσδιορίζεται, ή ο συνδυασμός θεραπείας δοκιμάστηκαν

in vivo

για την καταστολή της ανάπτυξης του όγκου. Προτείναμε ότι WFA όταν συνδυάζεται με Dox θα αποσπάσει μια συνεργική επίδραση για την καταστολή της ανάπτυξης του όγκου των ωοθηκών. Για να ελεγχθεί η υπόθεση μας, μελετήσαμε το συνδυασμένο αποτέλεσμα της Dox και WFA επί σισπλατίνη ευαίσθητα ωοθηκών επιθηλιακών Α2780 κυτταρική σειρά καρκίνου, η σισπλατίνη ανθεκτική ωοθηκών επιθηλιακής κυτταρικής γραμμής Α2780 /CP70, και ρ53 μεταλλαγμένη ωοθηκών επιθηλιακής Caov3 κυτταρική γραμμή. Για πρώτη φορά δείξαμε ότι ο κυτταρικός θάνατος προκλήθηκε από την παραγωγή ROS και βλάβης του DNA, οδηγώντας σε επαγωγή της αυτοφαγία και πιστοποιείται με κυτταρικό θάνατο σε κασπάσης 3 εξαρτώμενο τρόπο. Δείξαμε επίσης ότι η επίδραση του Dox και WFA

in vitro

χρήση 3D όγκοι που δημιουργούνται από τα κύτταρα Α2780 σε ανθρώπινη εξωκυτταρική μήτρα. Επιπλέον, εξετάσαμε την επίδραση της θεραπείας συνδυασμού

in vivo

στην ανάπτυξη του όγκου, τον πολλαπλασιασμό, αγγειογένεση, αυτοφαγία, κυτταρικό θάνατο, και βλάβη του DNA χρησιμοποιώντας ξενομοσχεύματος όγκων που παράγονται με την έγχυση των κυττάρων Α2780 σε γυμνά ποντίκια.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθικοί

Ζώα εργασίες που αναφέρονται στο χειρόγραφο έγινε μετά την έγκριση του πρωτοκόλλου από το Πανεπιστήμιο του Louisville επιτροπής Animal Care Χρήση (IACUC).

τηλέφωνα Πολιτισμός

Ανθρώπινα επιθηλιακά καρκινικά σισπλατίνη ευαίσθητα (Α2780) κυτταρική γραμμή ωοθηκών αποκτήθηκε ως δώρο από τον Δρ Denise Connolly (Αντικαρκινικού Κέντρου Fox Chase, Φιλαδέλφεια, PA). Η κυτταρική γραμμή δημιουργήθηκε αρχικά από ανθρώπινο ασθενή με καρκίνο των ωοθηκών πριν από τη θεραπεία [21]. Η σισπλατίνη ανθεκτική (Α2780 /CP70) κυτταρική γραμμή ελήφθη ως δώρο από τον Dr. Christopher μέλη (University of Louisville, Louisville, ΚΥ). Αυτή η κυτταρική γραμμή προήλθε από κυτταρική σειρά Α2780 μετά την αγωγή με σισπλατίνη [22]. κυτταρική γραμμή Caov3 αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (ATCC). Α2780 και Α2780 κύτταρα /CP70 καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI που περιείχε 10% FBS, 1% πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη, και 0,05% (ν /ν) ινσουλίνη (Sigma). κύτταρα Caov3 καλλιεργήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS και 1% πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη. Αντισώματα έναντι φωσφο-BAD Ser

136, Bcl-XL, διασπασμένη κασπάση 3, και GAPDH αγοράστηκαν από Cell Signaling Technology. Κί67 αντίσωμα αγοράστηκε από Santa Cruz Biotechnology, CD31 και LC3B από Abcam. Η δοξορουβικίνη, withaferin Α, Ν-ακετυλο-L-κυστεΐνη, υπεροξειδική δισμουτάση, καταλάση, και DMSO αγοράστηκαν από τη Sigma.

κυτταρικού πολλαπλασιασμού (ΜΤΤ) Δοκιμασίες

Α2780, Α2780 /CP70, και κύτταρα Caov3 αναπτύσσονται σε φάση ανάπτυξης θρυψινοποιήθηκαν και σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων. Μετά από 24 ώρες επιμετάλλωση, κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία εις τριπλούν με διάφορες δόσεις Dox και WFA τόσο μόνα ή συνδυασμό WFA /Dox για 24, 48 και 72 ώρες. Μετά από καθορισμένο χρόνο, 20 μΙ αντιδραστήριο ΜΤΤ από το κιτ δοκιμασίας κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Promega) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκε για περίπου 1 ώρα. Η ανάπτυξη χρώματος αξιολογήθηκε με αναγνώστη ELISA σε 492 nm όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Dox διαλυτοποιήθηκε σε νερό και WFA διαλυτοποιήθηκε σε DMSO. DMSO (0,1% ν /ν) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος οχήματος.

Ισοβολόγραμμα Ανάλυση

Α2780 και Α2780 κύτταρα /CP70 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία εις τριπλούν για 48 ώρες με χρήση 7 συγκεντρώσεων Dox και WFA τόσο μόνος του ή συνδυασμός WFA /Dox σε σταθερή αναλογία, όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα βιώσιμα κύτταρα προσδιορίστηκαν ποσοτικά με προσδιορισμούς ΜΤΤ όπως περιγράφεται ανωτέρω και το κλάσμα που επηρεάζονται υπολογίστηκε από επί τοις εκατό αναστολή. Το κλάσμα που επηρεάζονται στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε σε λογισμικό CalcuSyn να δημιουργήσει μια καμπύλη δόσης-απόκρισης και ισοβολόγραμμα.

Δοκιμασίες κυτταρικής απόπτωσης χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής για Annexin V

Α2780 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Dox και WFA τόσο μόνα ή συνδυασμό της WFA /Dox όπως περιγράφεται παραπάνω για 24 ώρες. Τα κύτταρα διαχωρίστηκαν με βερσένη (Invitrogen), πλύθηκαν με PBS, και επαναιωρήθηκαν σε αννεξίνης V ρυθμιστικό σύνδεσης σε μία συγκέντρωση 1 × 10

6 κύτταρα /ml. Annexin V-FITC (2 μΙ, BD Biosciences) επωάστηκε για 15 λεπτά στο σκοτάδι με 100 μΙ κυτταρικού εναιωρήματος. Τετρακόσια μΐ ρυθμιστικού δέσμευσης αννεξίνης V προστέθηκε στο αιώρημα. Δύο μΐ του propedium ιωδιούχου (ΡΙ) εμβολιάστηκε σε διάλυμα και χρησιμοποιήθηκε αμέσως σε FACSCaliber (BD Biosciences) όπως περιγράφεται από Betts κ.ά. [24]. Annexin V και ΡΙ βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό FlowJo.

δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) Δοκιμασίες

Α2780 κυττάρων σπάρθηκαν σε γυάλινο πάτο 35 mm

2 πιάτα όλη τη νύκτα ακολουθούμενο από επεξεργασία με Dox και WFA όπως περιγράφεται παραπάνω για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με 2 μΜ H

2DCFDA (Invitrogen) σε μέσο ανάπτυξης για 30 λεπτά στους 37 ° C όπως περιγράφεται από τους Das κ.ά. [7]. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, προβολές υπό ομοεστιακό μικροσκόπιο και φωτογραφήθηκαν.

Ανάλυση Βλάβη DNA χρησιμοποιώντας TUNEL Δοκιμασίες

Α2780 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες θάλαμο και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με Dox και WFA όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα κύτταρα στη συνέχεια προσδιορίστηκαν για βλάβες του DNA χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας αδιέξοδο Φθορομετρικής TUNEL (Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα εξετάστηκαν υπό μικροσκόπιο συνεστιακό και φωτογραφήθηκαν.

δοκιμασίες TUNEL για τομές ιστών διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα ApopTag Plus υπεροξειδάσης Apoptosis Detection Kit (Millipore, Billerica, ΜΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Protein Απομόνωση και Western Blot ανάλυση

κύτταρα Α2780 σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με Dox και WFA τόσο μόνα ή συνδυασμό WFA /Dox, όπως περιγράφεται παραπάνω για 24 ώρες. Τα κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (GE Healthcare). Πρωτογενή αντισώματα αραιώθηκαν όπως υποδεικνύεται από τον κατασκευαστή και επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Η πρόσδεση του αντισώματος αποκαλύφθηκε με επισημασμένα με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη chemioluminescence (GE Healthcare) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Οι κηλίδες στη συνέχεια επανα-διερευνήθηκαν με ΟΑΡϋΗ να εξομαλύνει τις διαφορές σε φόρτωση.

Τρισδιάστατο δοκιμασίες (3D) Ανάπτυξη Όγκου

κύτταρα Α2780 (15000 /σφαιρίδιο) αναμίχθηκαν με Hubiogel® σε αναλογία 1:04 και διανέμεται σε 10 χάντρες μΐ και αφέθηκε να πολυμεριστεί πριν αιωρήθηκε σε θερμό μέσο ανάπτυξης για να σχηματίσουν σφαιρικά όγκους. Κάθε σφαιρικό όγκο (1 mm

3) μεταφέρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων (ένα όγκο /φρεάτιο) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με Dox (0.2, 2 μΜ), WFA (0,5, 2 μΜ), ή συνδυασμός των WFA /Dox (0.5 μΜ /0,2 μΜ ή 2,0 μΜ /0.2 μΜ). Το μέσο αντικαταστάθηκε (δύο φορές /εβδομάδα) με μέσο που περιέχει φρέσκο ​​μέσο. Η ανάπτυξη του όγκου εκτελέστηκε την ημέρα 1, 3, και 7 χρησιμοποιώντας δοκιμασίες ΜΤΤ όπως περιγράφεται ανωτέρω. Οι όγκοι μετά την θεραπεία επωάστηκαν με καλσεϊνη ΑΜ (Invitrogen) για 30 λεπτά και εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας Nikon Β-2EIC μικροσκόπιο φθορισμού χρησιμοποιώντας μπλοκ φίλτρο FITC σε Ex

465-495 nm και Em

515-555 nm) και φωτογραφήθηκαν.

Σχηματισμός ξενομοσχεύματος όγκου και θεραπεία με Dox, WFA ή WFA /DOX

Α2780 κύτταρα αναμιγνύονται με Matrigel (BD Biosciences) σε αναλογία 1:01. Τα κύτταρα (2 χ 10

6) έχουν αμφίπλευρα εγχέονται υποδορίως εντός πλευρό κοιλιακή ηλικίας 5-6 εβδομάδων ηυ /ηυ (Charles River) και οι όγκοι αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 20 ημέρες έως ότου έφθασαν σε 100 mm

3 σε μέγεθος, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Οι ποντικοί στη συνέχεια τυχαιοποιήθηκαν σε 6 ομάδες και ενέθηκαν με: 1) PBS, 2) 10% DMSO + 90% γλυκερύλιο τριοκτανοϊκή (όχημα), 3) Dox 9 mg /kg, 4) Dox 1 mg /kg, 5) WFA 2 mg /kg, ή 6) Dox 1 mg /kg + WFA 2 mg /kg. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή κάθε δεύτερη ημέρα ί.ρ. χρησιμοποιώντας όγκος 100 μΙ και οι όγκοι μετρήθηκαν με ψηφιακή δαγκάνα πριν από κάθε θεραπεία. Dox διαλύθηκε σε φυσιολογικό ορό ενώ WFA διαλύθηκε σε DMSO και γλυκερύλιο τριοκτανοϊκή (10:90 ν /ν). Τα ποντίκια θανατώθηκαν μετά από 12 ημέρες από την έναρξη της θεραπείας. Όλες οι θεραπείες έχουν εγκριθεί από IACUC, Πανεπιστήμιο του Louisville.

ανοσοϊστοχημική ανάλυση ιστών όγκου

ξενομοσχεύματος όγκοι μονιμοποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη για τεμαχισμό. Πλάκες αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη σειρά αιθανόλης. Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη με επώαση των αντικειμενοφόρων πλακών σε 10 mM κιτρικό νάτριο, ρΗ 6,0 για 20 λεπτά στους 95 ° C που ακολουθείται από κατεργασία με 0.3% Η

2O

2 σε μεθανόλη για 20 λεπτά [28]. Διαφάνειες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τη χρήση του κιτ Vectastain ABC Elite Anti-Rabbit (Vector Labs). Οι τομές επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα για Κί67 (αραιωμένο 1:50, την Santa Cruz Biotechnology), CD31 (1:50, Abcam), LC3B (1:500, Abcam) και διασπασμένη κασπάση 3 (1:200, Cell Signaling) σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα πλακίδια ξεπλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα σύμφωνα με τις οδηγίες των προμηθευτών. Χρώμα αναπτύχθηκε με τη χρήση DAB (Vector Labs) και με αιματοξυλίνη QS (Vector Labs) για τη χρώση των πυρήνων όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28].

Στατιστική Ανάλυση

Οι τιμές εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD. Οι τιμές Ρ προσδιορίστηκαν με ανάλυση ANOVA ακολουθούμενη από δοκιμή Student-Newman-Keuls για πολλαπλές συγκρίσεις.

Αποτελέσματα

WFA συνεργεί Η αντικαρκινική επίδραση του Doxorubicin

Dox χρησιμοποιείται συνήθως σε 5 μΜ για να μιμηθεί τη συγκέντρωση που βρέθηκε στο πλάσμα ασθενών που υποβάλλονται σε θεραπεία Dox [29]. Ωστόσο, σε αυτή τη δόση, οι ασθενείς εμφανίζουν σοβαρές παρενέργειες δεδομένου ότι μια συγκέντρωση 1 μΜ είναι απαραίτητη για τη διατήρηση διαφόρων μηχανισμών δράσεων Dox [29]. Για την ελαχιστοποίηση ή την εξάλειψη αυτών των ανεπιθύμητων ενεργειών, θα διερευνηθεί η δυνατότητα χρήσης της θεραπείας συνδυασμού Dox /WFA. Ο καρκίνος των ωοθηκών Α2780 κυτταρικές σειρές και Caov3 και σισπλατίνη ανθεκτική κυτταρική γραμμή Α2780 /CP70 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις Dox και WFA και μεμονωμένα και σε συνδυασμό. Dox /WFA συνδυασμός ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και των τριών κυτταρικών γραμμών σε μια δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Όταν Dox και WFA είχαν χρησιμοποιηθεί μόνο του, το IC

50 τιμές για τα κύτταρα Α2780 μετά από 48 ώρες της θεραπείας ήταν 0,8 μΜ και 4,1 μΜ, αντίστοιχα (Σχ. 1Α-Β). Όταν τα κύτταρα συν-επεξεργασία με ένα συνδυασμό Dox με 1,5 μΜ WFA, το IC

50 τιμή για Dox μειώθηκε στα 0,16 μΜ (Εικ. 1Α). Ομοίως, όταν 200 ηΜ Dox συνδυάστηκε με WFA, το IC

50 αξία για WFA μειώθηκε σε 1,5 μΜ (Εικ. 1Β). Τα κύτταρα όταν συν-επεξεργασία με 200 ηΜ του Dox και 2,0 μΜ WFA οδήγησε σε 90 έως 95 κυτταρικό θάνατο% (Εικ. 1Β), ενώ η αγωγή των κυττάρων με Dox μόνο (200 ηΜ) και WFA μόνο (2,0 μΜ) οδήγησε σε 9 % και 20% αναστολή, αντίστοιχα. Για Α2780 κύτταρα /CP70, το IC

50 τιμές για Dox και WFA ήταν 0,65 μΜ και 6 μΜ αντίστοιχα. Συνδυάζοντας Dox με 1,5 μΜ WFA μείωσε το IC

50 αξία των Dox σε 0,18 μΜ, και συνδυάζοντας WFA με 200 nM της Dox μείωσε το IC

50 αξίας έως 1,2 μΜ (Εικ. 1Γ-Δ). κύτταρα Caov3 ήταν πιο ευαίσθητα στη θεραπεία με Dox και WFA μόνα ή συνδυασμό Dox /WFA (τα αποτελέσματα δεν φαίνονται). IC

50 τιμές συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι ο συνδυασμός Dox /WFA εργάζεται σε μια συνεργική τρόπο να μεσολαβήσει αντικαρκινική δράση. Τα δεδομένα Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετά από 24 ώρες και 72 ώρες της θεραπείας φαίνεται στο Σχ. S1 και S2.

Α2780 και Α2780 /κύτταρα CP απλώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων. Μετά από 24 ώρες επιμετάλλωση, κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις Dox και WFA, τόσο μόνα τους ή σε συνδυασμό. Μετά από 48 ώρες αγωγής, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασίες ΜΤΤ. Οι τιμές που παρουσιάζονται είναι μέση τιμή ± SD από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο, # p & lt? 0,05 σε σύγκριση με Dox ή WFA μόνο. (Ε) Ισοβολόγραμμα ανάλυση των κυττάρων Α2780 (n = 4) και (F) Α2780 /CP70 (n = 4) χρησιμοποιώντας 7 δόσεις Dox και WFA διατηρείται σε σταθερή αναλογία και θάνατο των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασίες ΜΤΤ. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με το λογισμικό CalcuSyn.

Η

Για να επιβεβαιωθεί ότι η επίδραση του συνδυασμού της WFA με Dox ήταν συνεργιστική, πραγματοποιήσαμε ανάλυση ισοβολογράμματος. Τόσο Α2780 και Α2780 κύτταρα /CP70 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 7 συγκεντρώσεις Dox και WFA σε σταθερή αναλογία για 48 ώρες και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων αναλύθηκε με δοκιμασίες ΜΤΤ. λογισμικό CalcuSyn χρησιμοποιήθηκε για να παραχθούν τα ισοβολογράμματα, αποδεικνύοντας ότι Dox και WFA δρουν συνεργιστικώς (Σχ. 1Ε-F), τόσο για τις κυτταρικές γραμμές.

Για να προσδιοριστεί εάν η απόπτωση ήταν η αιτία του κυτταρικού θανάτου, πραγματοποιήσαμε αννεξίνης V -FITC κυτταρομετρία ροής σε κύτταρα Α2780 σε επεξεργασία με Dox και WFA τόσο μόνα τους ή σε συνδυασμό. Ανάλυση της Dox, WFA και Dox με δείγματα WFA αντιμετωπίζεται έδειξαν μη σημαντική αύξηση σε σχέση με τον έλεγχο για αννεξίνη V (Εικ. S3). Για να επιβεβαιωθεί η τεχνική μας, δείγματα θετικού ελέγχου παρήχθησαν χρησιμοποιώντας έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία για 30 δευτερόλεπτα και την ανάλυση των κυττάρων 4 ώρες, 6 ώρες, και 24 ώρες μετά την έκθεση για να εξασφαλιστεί αποτελεσματικότητα της χρώσης (Εικ. S4). Επιπλέον, ερευνήσαμε την εγγενή αποπτωτικών πρωτεϊνών φωσφο-BAD

136 (ρΒΑϋ

136) και Bcl-XL. Εμείς δεν βρήκε σημαντικές αλλαγές σε ρΒΑϋ

136 ή Bcl-xL (Εικ. S5), υποδεικνύοντας ότι μία εναλλακτική οδός προς τις εγγενείς απόπτωσης χρησιμοποιείται για να επάγει τον κυτταρικό θάνατο.

Dox και WFA Τα προϊόντα ROS να επάγει

θανάτου Κυττάρου

Dox είναι γνωστό ότι παράγει ROS ως μέρος των μηχανισμών του [4], [5]. Υπήρξαν επίσης πολλές αναφορές για WFA παραγωγής παραγωγής ROS ως ένα μέρος των μηχανισμών αποπτωτικών της σε διάφορους τύπους καρκίνου [12], [17], [18], [30]. Ως εκ τούτου, ρωτήσαμε αν WFA θα μπορούσε να ενισχύσει την επίδραση της χαμηλής συγκέντρωσης της Dox μετά από 24 ώρες θεραπείας, χρησιμοποιήσαμε H

2DCFDA να καθορίσει την παραγωγή των ROS. H

2DCFDA είναι ένα σταθερό μη-πολική ένωση που διαχέεται εύκολα εντός των κυττάρων. Αυτή η ένωση κατόπιν υδρολύεται από ενδοκυτταρικές εστεράσες για να σχηματίσει DCFH, η οποία με τη σειρά της οξειδώνεται με υπεροξείδιο του υδρογόνου για να δώσει την πολύ φθορίζουσα ένωση 2’7′-διχλωροφθορεσκεϊνης (DCF). Μετά από 6 ώρες θεραπείας με WFA 1,5 μΜ αυξήθηκε σημαντικά ROS θετικά κύτταρα από 2% έως 17% σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (τα αποτελέσματα δεν φαίνονται). Μετά από 24 ώρες θεραπείας, Dox 200 ηΜ έδειξαν χαμηλό αριθμό ROS θετικών κυττάρων, 18% (Σχ. 2Α-Β). Ενώ WFA 0,5 μΜ (23%) δεν ήταν σημαντικά διαφορετική από Dox, συνδυασμός Dox 200 ηΜ με WFA 0,5 μΜ είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντική αύξηση σε 37%. Αυτό το αποτέλεσμα ενισχύεται σημαντικά με ένα συνδυασμό Dox 200 ηΜ με WFA 1.5 μΜ, με αύξηση σε 90% θετικά κύτταρα ROS (Σχ. 2Α-Β). Η θεραπεία με WFA 2 μΜ καταστραφεί τα κύτταρα πάρα πολύ σοβαρά για την παραγωγή ROS, υποδεικνύοντας ότι η επίδραση της WFA στην παραγωγή ROS είναι δοσοεξαρτώμενη και μετά από συνδυασμό με Dox προκαλεί μια συνεργική δράση.

Για να επιβεβαιώσετε ότι ROS είναι υπεύθυνη για παρατηρήθηκαν κυτταρικό θάνατο μας, έχουμε συν-επεξεργασμένα κύτταρα Α2780 με τον σαρωτή ROS Ν-ακετυλο-L-κυστεΐνη (NAC, 5 mM) ή με ενζυμική αντιοξειδωτικά υπεροξειδική δισμουτάση (SOD) και η καταλάση μαζί με Dox και WFA θεραπείες για 24 και 48 ώρες όπως περιγράφεται παραπάνω. Ενώ NAC ήταν αναποτελεσματική να εμποδίσει κυτταρικό θάνατο που επάγεται από Dox στις 24 ώρες, παρείχε μέτρια προστασία μετά από 48 ώρες της αγωγής (Σχ. 3Α) προσδιορίζεται με προσδιορισμούς ΜΤΤ. NAC ήταν ιδιαίτερα αποτελεσματική για να εμποδίσει το θάνατο των κυττάρων που προκαλείται από WFA μετά από 24 ώρες και συνέχισαν να παρέχουν προστασία μετά από 48 ώρες επώασης (Εικ. 3C). NAC ήταν επίσης αποτελεσματική στην παρεμπόδιση θεραπεία συνδυασμού Dox /WFA (Σχ. 3Β-D). Να γίνει διάκριση μεταξύ της κύρια μορφή της ROS παράγονται από Dox και θεραπεία WFA, θα αντιμετωπίζονται τα κύτταρα με ενζυματική αντιοξειδωτικά καταλάση 500 U /ml ή SOD 100 U /ml. Έχει αναφερθεί ότι η καταλάση χρησιμοποιείται συχνά από τα κύτταρα για την αποικοδόμηση του υπεροξειδίου του υδρογόνου [31] ενώ SOD καταλύει ειδικά ανιόντα υπεροξειδίου [32]. Μετά από 48 ώρες θεραπείας, SOD μπλοκάρει σημαντικά κυτταρικό θάνατο που επάγεται από Dox και WFA μόνο και σε συνδυασμό (Εικ. 4). Παρόμοια με SOD, καταλάσης έδειξαν προστασία από τον κυτταρικό θάνατο με Dox και WFA τόσο μόνα ή συνδυασμό WFA /Dox (τα αποτελέσματα δεν φαίνονται), υποδεικνύοντας ότι τα ανιόντα υπεροξειδίου είναι τα κύρια είδη ROS παράγονται από Dox και WFA.

Α2780 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πιάτα γυάλινο πάτο. Μετά από 24 ώρες επιμετάλλωση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Dox και WFA, τόσο μόνος του ή συνδυασμός WFA /DOX, όπως περιγράφεται στο Σχήμα 1. Μετά από 24 ώρες αγωγής, το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιείχε H

2DCFDA και επωάστηκαν για 30 min. Τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με PBS και εξετάστηκαν κάτω από μικροσκόπιο συνεστιακό. θετικά κύτταρα (Α) ROS (πράσινο χρώμα) μετρήθηκαν με βάση 3 πεδία χαμηλής ισχύος. Η μέση ± SD. Οι τιμές Ρ προσδιορίστηκαν με ανάλυση ANOVA ακολουθούμενη από δοκιμή Student-Newman-Keuls για πολλαπλές συγκρίσεις. * P & lt? 0.05 από τον έλεγχο, $ P & lt? 0,05 σε σύγκριση με Dox, & amp? P & lt? 0,05 σε σύγκριση με WFA. (Β) ανάλυση Ομοεστιακή μικροσκόπιο των κυττάρων που δείχνει την παραγωγή των ROS (πράσινο χρώμα).

Η

κύτταρα Α2780 συν-θεραπεία με NAC και Dox, WFA ή συνδυασμός WFA /WFA για 48 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασίες ΜΤΤ. Οι τιμές που παρουσιάζονται είναι μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο, # Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με μη NAC και NAC

Η

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασίες ΜΤΤ.. Οι τιμές που παρουσιάζονται είναι μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. * P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο, # Ρ & lt?. 0.05 σε σύγκριση με καμία SOD και SOD

Η

Όπως ROS προκαλεί βλάβες στο DNA, πραγματοποιήθηκε δοκιμασία TUNEL για να απεικονίσει την έκταση της βλάβης του DNA όταν έλαβαν θεραπεία με Dox και WFA μόνα τους ή σε συνδυασμό. Μετά από 24 ώρες θεραπείας, Dox 200 ηΜ οδήγησε σε βλάβη του DNA σε μερικά κύτταρα ενώ WFA 1,5 μΜ και μόνο ελαφρώς αυξημένο αριθμό των κατεστραμμένων κυττάρων (Εικ. 5). Ωστόσο, η θεραπεία με Dox 200 ηΜ και WFA 1,5 συνδυασμός μΜ είχε ως αποτέλεσμα μια ενισχυμένη επίδραση για να επάγει βλάβη του DNA. Σχεδόν κάθε κύτταρο έδειξε βλάβη του DNA (Εικ. 5).

κύτταρα Α2780 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με Dox, WFA τόσο μόνος ή συνδυασμό των WFA /Dox. Μετά από 24 ώρες θεραπείας, βλάβης του DNA αναλύθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασίες σήραγγας. Εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία σε μεγέθυνση 20x.

Η

Συνδυασμός Dox και WFA κυτταρικό θάνατο που επάγεται από Autophagy

Διάφορα αντικαρκινικά χημειοθεραπείες περιλαμβανομένων Dox έχουν δειχθεί ότι επάγουν αυτοφαγία, η οποία συνεργάζεται με απόπτωση να επάγει κυτταρικό θάνατο [33] – [38] ως μέσο για την εξάλειψη των κατεστραμμένων οργανίδια που μπορεί να παράγει ένα υψηλό επίπεδο ROS και ως εκ τούτου να περιορίσει χρωμοσωμική αστάθεια [39]. Ως εκ τούτου, διερευνά το ρόλο του παράγοντα χημειοθεραπείας Dox σε συνδυασμό με WFA στην αυτοφαγία είναι μια λεωφόρος ενδιαφέροντος. Electron ανάλυση μικροσκοπία κυττάρων ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με DMSO έδειξε την παρουσία των μιτοχονδρίων και μια άθικτη πυρηνικό φάκελλο (Εικ. 6). Ενώ WFA 0,5 μΜ και μόνο είχε μικρή ή καθόλου επίδραση, WFA 1,5 και 2 μΜ έδειξαν λίγα αυτοφαγοσώματα ως δείκτης της αυτοφαγία, αλλά άφησε τα μιτοχόνδρια ανέπαφη, πιθανώς ως μηχανισμός προσαρμογής. Τα κύτταρα όταν υποβάλλονται σε επεξεργασία με Dox 200 ηΜ και μόνο έδειξε σχηματισμό αυτοφαγοσώματα περιέχουν κυτταρόπλασμα και καταστροφή των μιτοχονδρίων. Η επεξεργασία των κυττάρων με Dox /WFA συνδυασμός είχε ως αποτέλεσμα μια ενισχυμένη επίδραση σε μία δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Dox 200 nM συν WFA 2 μΜ έδειξαν έντονο αυτοφαγικά κενοτόπια, μαζί με την κατάρρευση του πυρηνικού φάκελλο, αποσύνθεση της μεμβράνης, και η απουσία των μιτοχονδρίων (Εικ. 6), υποδεικνύοντας έντονη κυτταρική βλάβη μετά από θεραπεία με Dox /WFA συνδυασμό.

Α2780 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Dox και WFA, τόσο μόνος του ή συνδυασμός WFA /Dox. Μετά από 24 ώρες αγωγής, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με PBS, σταθεροποιήθηκαν και υπέστησαν επεξεργασία για ανάλυση ΤΕΜ. Οι ηλεκτρονικό μικροσκόπιο εικόνες σε μεγέθυνση 5,600X δείξει.

Η

Για να επιβεβαιώσετε την επαγωγή της αυτοφαγία κατά την κατεργασία των κυττάρων με Dox /WFA συνδυασμό, προσδιορίσαμε την έκφραση του κανονικού δείκτη του σχηματισμού autophagosome, μικροσωληνίσκων που σχετίζονται με πρωτεΐνη-1 ελαφριά αλυσίδα 3Β (LC3B) [38]. Η ανάλυση στυπώματος Western των κυττάρων έδειξε δύο συγκεκριμένες ζώνες: μία άνω ζώνη (18 kDa) που αντιπροσωπεύει LC3B-Ι και ένα κάτω ζώνη (16 kDa) που αντιστοιχεί σε LC3B-II (Εικ. 7). Κυτοσολίου LC3B-Ι μετατρέπεται σε LC3B-ΙΙ μέσω λιπιδίωση και επιτρέπει LC3B-ΙΙ να συνδεθούν με αυτοφαγικά κυστίδια. Η θεραπεία με Dox επαγόμενη παραγωγή LC3B-II (Εικ. 7), ενώ WFA μόνος διεγείρεται παραγωγή του προ-δρομέας LC3B-I, καθώς και LC3B-II (Εικ. 7). Η θεραπεία συνδυασμού ενισχυμένη LC3B-ΙΙ με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο με Dox 200 ηΜ με WFA 2 μΜ που δείχνει την υψηλότερη έκφραση (Εικ. 7). Για να προσδιοριστεί εάν autophagy ήταν μια απάντηση προσαρμογή ή ένας μηχανισμός κυτταρικού θανάτου, ερευνήσαμε διασπασμένης κασπάσης 3 ως δείκτη για τον κυτταρικό θάνατο. ανάλυση κηλίδας Western έδειξε μια μέτρια αύξηση των κυττάρων σε επεξεργασία με Dox 200 ηΜ. Σε αντίθεση, WFA στα 0.5 μΜ έδειξαν καμία ένδειξη κυτταρικού θανάτου, ενώ WFA 1,5 και 2 μΜ έδειξαν μια αύξηση στο επίπεδο της διασπασμένης κασπάσης 3. Η επεξεργασία των κυττάρων με Dox /WFA συνδυασμός έδειξε μία περαιτέρω βελτίωση του κυτταρικού θανάτου σε ένα δοσο εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 7), υποδεικνύοντας ότι autophagy προωθεί τον κυτταρικό θάνατο και όχι να επάγει ένα μηχανισμό προσαρμογής για την προώθηση της κυτταρικής επιβίωσης με τη συνδυαστική θεραπεία Dox /WFA.

Μετά από 24 ώρες αγωγής, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και λυμένα. Η ανάλυση στυπώματος Western εκτελέστηκε για LC3B, κασπάσης 3 και πρωτεΐνες GAPDH.

Η

Επίδραση της Dox και WFA σε 3D όγκοι in vitro

Εκτός από την δοκιμασία αναστολής της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων, μπορούμε αξιολόγησαν τις επιδράσεις της Dox και WFA τόσο μόνες ή WFA /Dox συνδυασμός για την αποτελεσματικότητα κατά του όγκου τους, χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο mini-όγκου 3D που προσομοιώνει

in vivo

-όπως πολυκύτταρους ανάπτυξης του όγκου και της βιολογίας. Βιώσιμα mini-όγκους (1 mm

3 μέγεθος) του Α2780 ωοθηκικών καρκινικών κυττάρων παρήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα 3D σύστημα Biogel καλλιέργεια ανθρώπινων (HuBiogel®, Vivo Biosciences Inc.). Hubiogel® έχει αποδειχθεί ότι αντιπροσωπεύουν την ανθρώπινη μήτρα με μεγαλύτερη ακρίβεια από Matrigel με σκοπό την πρόγνωση προκλινικές τελικά σημεία [40]. Μίνι όγκοι υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1) Dox 0,2 μΜ, 2) Dox 2,0 μΜ, 3) WFA 0,5 μΜ, 4) WFA 2,0 μΜ, 5) Dox 0.2 μΜ με WFA 0,5 μΜ, και 6) Dox 0.2 μΜ με WFA 2 μΜ . Μετρήσεις της αύξησης του όγκου διεξήχθησαν την ημέρα 1, 3, και 7 χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς ΜΤΤ και μικροσκοπία φθορισμού. Μεσαίες και DMSO αντιμετωπίζονται οι όγκοι συνέχισε να αυξάνεται κατά τη διάρκεια της θεραπείας, ενώ Dox 0,2 μΜ είχαν την ανάπτυξή τους σταμάτησε την ημέρα 7 (Εικ. 8Α). Dox 2,0 μΜ μόνο και WFA 2,0 μΜ μόνη θεραπεία όγκων έδειξαν μειωμένη ανάπτυξη και αυτή η ανασταλτική δράση ενισχύθηκε κατά την κατεργασία με Dox 0,2 μΜ συν WFA 2,0 μΜ (Εικ. 8Α). Συνδυασμός Dox 0,2 μΜ με WFA 0,5 μΜ επιτευχθεί μια δραστικά βελτιωμένη δράση σε σύγκριση με κάθε μια ένωση μόνη (Εικ. 8Α). ανάλυση Μικροσκοπία των όγκων μετά από την ημέρα 3 και 7 φαίνεται στο Σχ. 8Β και 8C, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας συνεργική δράση του συνδυασμού Dox και WFA στην καταστολή της ανάπτυξης του όγκου.

(Α) Τα κύτταρα Α2780 συνδυάζονται με Hubiogel® σε αναλογία 1:04 και αναπτύχθηκε από 10 σφαιρίδια μL. Οι όγκοι υποβλήθηκαν σε θεραπεία με Dox και WFA, τόσο μόνος του ή συνδυασμός WFA /Dox. Οι όγκοι υποβλήθηκαν σε αγωγή δύο φορές /εβδομάδα με αντικατάσταση του μέσου με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει παράγοντα. Η ανάπτυξη του όγκου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασίες ΜΤΤ μετά την ημέρα 3 ή 7 της θεραπείας. (Β-Ο) Οι όγκοι μετά την θεραπεία επωάστηκαν με καλσεϊνη ΑΜ για 30 λεπτά, και λήφθηκαν εικόνες χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού μετά από 3 ημέρες θεραπείας (Β) ή 7 ημέρες θεραπείας (C).

Η

επίδραση της Dox και WFA επί ξενομοσχεύματος όγκου Growth

για να μελετηθεί η επίδραση της Dox και WFA μόνα τους ή σε συνδυασμό στην αύξηση του όγκου

in vivo

, ξενομοσχεύματα όγκου ποντικού αναπτύχθηκαν με ένεση κυττάρων Α2780 (2 × 10

6) υποδορίως σε διμερές επίπεδο στο πλευρό του κοιλιακού ηλικίας 5-6 εβδομάδων nu ηυ /. Οι όγκοι αφέθηκαν να αναπτυχθούν έως ότου έφτασαν 100 mm

3 σε μέγεθος. Την ημέρα 20 της μετά την ένεση των κυττάρων, οι ποντικοί τυχαιοποιήθηκαν σε 6 ομάδες των 5 ποντικών η κάθε μία και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικούς παράγοντες: 1) αρνητικός μάρτυρας (PBS), 2) τον έλεγχο του οχήματος (10% DMSO και 90% γλυκερύλιο τριοκτανοϊκή), 3) Dox 9 mg /kg, 4) Dox 1 mg /kg, 5) WFA 2 mg /kg, και 6) Dox 1 mg /kg με WFA 2 mg /kg, όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. Οι όγκοι μετρήθηκαν κάθε δεύτερη ημέρα και τα ποντίκια χορηγήθηκαν με 100 μΙ ε.π. όγκος για 12 ημέρες για μια συνολική περίοδο 32 ημερών. Οι ποντικοί που έλαβαν Dox 9 mg /kg φάνηκε να είναι πολύ άρρωστος με μια απώλεια της όρεξης με αποτέλεσμα την απώλεια βάρους μετά την πρώτη θεραπεία και στη συνέχεια πέθανε μετά από 4 θεραπείες. Τα ποντίκια στις άλλες ομάδες φάνηκε να είναι υγιή, χωρίς απώλεια της όρεξης ή βάρους κατά τη διάρκεια ολόκληρης της περιόδου θεραπείας. Ο όγκος του όγκου δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των οχημάτων, Dox 1 mg /kg και WFA 2 mg /kg ομάδες. Ωστόσο, τα ποντίκια που έλαβαν Dox 1 mg /kg με WFA 2 mg /kg (ομάδα 6) έδειξε μία πολύ σημαντική (70 έως 80%) μείωση στην ανάπτυξη του όγκου (Σχ. 9Α). Ομοίως, το βάρος του όγκου μετρήθηκε την ημέρα 32 συλλέγονται κατά τον χρόνο της θυσίας των ζώων, έδειξε μια δραστική μείωση στην Dox 1 mg /kg με WFA 2 mg /kg ομάδα (Σχ. 9Β) σε σύγκριση με άλλες ομάδες που δείχνει ότι ο συνδυασμός της WFA με Dox προκαλεί μια συνεργική επίδραση επί της καταστολής του όγκου της ανάπτυξης του όγκου

in vivo

.

(Α) όγκους αύξησης μετρήθηκε από την ημέρα 20-32 (μετά την εμφύτευση των κυττάρων) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία κάθε δεύτερη ημέρα * P & lt? 0,05.