Αφηρημένο

Πυρηνική υποδοχέα συν-καταστολέα (Ν-ΕΤΠ) παίζει σημαντικό ρόλο στο μεταγραφικό έλεγχο διαμεσολαβείται από αρκετές πρωτεΐνες καταστολής όγκου. Πρόσφατα, αναφέραμε έναν ρόλο των εξαρτώμενων απώλεια κακώς-αναδιπλωμένου-διαμόρφωση (MCDL) Ν-ΕτΠ στην ενεργοποίηση των ογκογόνων οδού επιβίωσης σε οξεία προμυελοκυτταρική λευχαιμία (APL). Από Ν-ΕτΠ παίζει σημαντικό ρόλο στην κυτταρική ομοιόσταση σε διάφορους ιστούς, ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι ένας APL σαν MCDL Ν-ΕτΠ θα μπορούσε επίσης να εμπλέκεται και σε άλλες κακοήθεια. Πράγματι, η αρχική μας έλεγχο της κατάστασης Ν-ΕτΠ στις διάφορες λευχαιμίας και στερεών καρκινικών κυττάρων αποκάλυψε μια APL όπως MCDL Ν-ΕτΠ στην πρωτοβάθμια και δευτεροβάθμια καρκινικά κύτταρα που προέρχονται από μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Η ειδική NSCLC κύτταρο απώλεια Ν-ΕΤΠ θα μπορούσε να μπλοκαριστεί από το Kaletra, μια κλινική αναστολέα πρωτεάσης βαθμού και από γενιστεΐνη, έναν αναστολέα της λανθασμένης αναδιπλώσεως Ν-ΕτΠ προηγουμένως χαρακτηρίζονται από εμάς. Η misfolded Ν-ΕτΠ παρουσιάζονται σε κύτταρα NSCLC συνδέθηκε με την ενίσχυση του ER στρες και υποβλήθηκε σε αποικοδόμηση από ειδική παρεκκλίνουσα δραστικότητα πρωτεάσης NSCLC κυττάρου. Σε κύτταρα NSCLC, κακώς αναδιπλωμένο Ν-ΕτΠ βρέθηκε να σχετίζεται με Hsc70, μοριακός συνοδός που εμπλέκονται στην μεσολάβηση chaperone autophagy (CMA). Γενετική και χημική αναστολή της Lamp2A, ένα ποσοστό παράγοντα της CMA περιορισμό, μπλοκάρει σημαντικά την απώλεια των Ν-ΕτΠ στα κύτταρα NSCLC, προτείνοντας έναν κρίσιμο ρόλο της CMA στην υποβάθμιση Ν-ΕτΠ. Τα ευρήματα αυτά προσδιορίζουν σημαντικό ρόλο της CMA που προκαλείται υποβάθμιση του misfolded Ν-ΕτΠ στην εξουδετέρωση των ER στρες και προτείνουν ένα πιθανό ρόλο των misfolded πρωτεΐνης Ν-ΕτΠ στην ενεργοποίηση των ογκογόνων μονοπατιού επιβίωσης σε κύτταρα NSCLC.

Παράθεση: Ali AB, Nin DS, Tam J, Khan M (2011) Ο ρόλος της είτε με την απόκτηση Mediated Autophagy (CMA) στην Υποβάθμιση της πρωτεΐνης misfolded Ν-ΕτΠ σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) κύτταρα. PLoS ONE 6 (9): e25268. doi: 10.1371 /journal.pone.0025268

Επιμέλεια: Μιχαήλ Sherman, Boston University Medical School, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 25, 2011? Αποδεκτές: 30 Αυγούστου 2011? Δημοσιεύθηκε: 23 του Σεπτέμβρη 2011

Copyright: © 2011 Ali et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις SSCC-04-06 και NMRC /1213/2009 για την ΜΚ από τη Σιγκαπούρη Stem Κοινοπραξία κυττάρων και του Εθνικού Συμβουλίου Ιατρικής Έρευνας της Σιγκαπούρης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μεταγραφικών παραγόντων και συγγενείς συν-παράγοντες τους είναι οι κύριοι ρυθμιστές της ανάπτυξης των επιθηλιακών κυττάρων και είναι από τα πιο συχνοί στόχοι των ογκογόνων προσβολή σε διάφορες ανθρώπινες κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα [1] – [4]. Μεταγραφικό έλεγχο που μεταδίδεται από πυρηνικού υποδοχέα συν-καταστολέα (Ν-ΕτΠ) παίζει σημαντικό ρόλο στην λειτουργία κατασταλτική ανάπτυξη αρκετών πρωτεϊνών ογκοκατασταλτικών [5], [6]. Απορρύθμιση της Ν-ΕτΠ μεσολάβηση μεταγραφικό έλεγχο οφείλεται σε μια κακώς-αναδιπλωμένη διαμόρφωση εξαρτώμενη απώλεια (MCDL) Ν-ΕτΠ έχει ενοχοποιηθεί για την παθογένεση της οξείας προμυελοκυτταρικής λευχαιμίας (APL) [7], [8]. Είναι ενδιαφέρον ότι μερικοί από τους παράγοντες μεταγραφής και συν-παράγοντες που αρχικά αναγνωρίστηκαν ως οι ρυθμιστές της κανονικής αιματοποιήσεως βρέθηκαν επίσης να εμπλέκονται στην ρύθμιση της φυσιολογικής αύξησης και ανάπτυξης των επιθηλιακών κυττάρων του πνεύμονα [2] – [4]. Αυτά τα ευρήματα πρότεινε ότι σημαντική αλληλεπικάλυψη μπορούσε επίσης να υπάρχει στο μηχανισμό βασίζονται οι αιματολογικές κακοήθειες και καρκίνο του πνεύμονα. Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας που σχετίζονται με τον καρκίνο και τη νοσηρότητα σε ανθρώπινο όλο τον κόσμο. Με ένα ποσοστό επιβίωσης 5 ετών μόνο το 15%, θεωρείται ως μία από τις πιο θανατηφόρες καρκίνους στον άνθρωπο. Με βάση το παρόν γνωστά κριτήρια ιστο-παθολογική, ο καρκίνος του πνεύμονα είναι γενικά κατηγοριοποιούνται σε δύο μεγάλες υποκατηγορίες: καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου [9], [10] και τον καρκίνο του πνεύμονα μικρών κυττάρων (SCLC) [11]. NSCLC, το οποίο αποτελείται από 80% όλων των καρκίνων του πνεύμονα σε άνθρωπο, υποδιαιρείται περαιτέρω σε αδενοκαρκινώματα, καρκινώματα πλακωδών κυττάρων, καρκινώματα αδενοχοληδωτό, και καρκινώματα μεγάλων κυττάρων [12]. Παρά το γεγονός ότι η κύρια αιτία της ανθρώπινης θνησιμότητας και της κινητικότητας, πολύ λίγα είναι γνωστά σχετικά με το μηχανισμό βασίζεται η κακοήθης ανάπτυξη και μεταμόρφωση των κυττάρων που αποτελούν το μεγαλύτερο μέρος της μάζας του όγκου στον καρκίνο του πνεύμονα. Αυτό οφείλεται εν μέρει στην έλλειψη σαφούς κατανόησης του μηχανισμού ογκογόνων επιβίωσης που στηρίζει την ανάπτυξη των κακοηθών κυττάρων σε θρεπτικά συστατικά εξαντληθεί και αγχωτικό μικροπεριβάλλον παρουσιάζονται ευρέως εντός της στερεάς μάζας του ιστού καρκίνου του πνεύμονα.

Πυρηνική υποδοχέα συν-καταστολέα (Ν-ΕτΠ) είναι ένα ζωτικό συστατικό ενός πολυ-πρωτεΐνη καταστολέα συγκρότημα απαραίτητη για την λειτουργία πολλών παραγόντων μεταγραφής και πρωτεΐνες καταστολής όγκου [13] – [16]. Από μεταγραφικό έλεγχο που μεταδίδεται από παράγοντες όπως η Ν-ΕτΠ πιστεύεται ότι εμπλέκονται στην ρύθμιση της φυσιολογικής αύξησης και ανάπτυξης των κυττάρων σε διάφορους υποτύπους του ιστού, ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι ένας APL σαν MCDL Ν-ΕτΠ θα μπορούσε επίσης να συνδέεται με την ογκογόνο ανάπτυξη άλλων ανθρώπινων όγκων. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, αναλύσαμε την κατάσταση Ν-ΕτΠ σε κύτταρα όγκου που προέρχονται από μεγάλες ανθρώπινη λευχαιμία και συμπαγείς όγκους και παρατηρείται μια επιλεκτική misfolded διαμόρφωση εξαρτώμενη απώλεια του Ν-ΕτΠ σε πολλαπλές κυτταρικές σειρές όγκων και πρωτογενών ανθρώπινων ιστών του καρκίνου που προέρχεται από NSCLC. Σε κύτταρα NSCLC, κακώς αναδιπλωμένο Ν-ΕτΠ βρέθηκε να σχετίζεται με Hsc70, μοριακός συνοδός που εμπλέκονται στην μεσολάβηση chaperone autophagy (CMA). Γενετική και χημική αναστολή της CMA οδήγησε σε σταθεροποίηση Ν-ΕτΠ στα κύτταρα NSCLC, προτείνοντας έναν κρίσιμο ρόλο της CMA στην απώλεια Ν-ΕτΠ. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ένα πιθανό ρόλο του αυτοφαγικά αποικοδόμησης του κακώς-αναδιπλωμένου Ν-ΕτΠ στην εξουδετέρωση των ER στρες καθώς και στην επιβίωση και ανάπτυξη των κυττάρων NSCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρικές σειρές και αντιδραστήρια

Όλες οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και διατηρήθηκαν σε μέσο που συνιστάται από την ATCC. Genistein, χλωροκίνη και νικοτίνη αγοράστηκαν από τη Sigma (St. Louis, ΜΟ, USA), ενώ Kaletra ήταν από την Abbott Laboratories (IL, USA). Ν-ΕτΠ (C-20), PDI και η HSC-70 αντισώματα αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Αντισώματα έναντι Lamp-2A (Abcam Inc, ΜΑ, USA) και β-ακτίνης (Sigma, St Louis, ΜΟ, USA) αγοράστηκαν από τις αντίστοιχες πηγές. Η ανασυνδυασμένη flag-tagged Ν-ΕτΠ παρασκευάστηκε από κύτταρα 293Τ [17] επιμολυσμένα με πλασμίδιο έκφρασης Ν-ΟοΡ (συνδέεται με δύο ακολουθία σημαία tandem) χρησιμοποιώντας το Fugene 6 (Roche, Βασιλεία, Ελβετία). Το Ν-ΟοΡ και siRNA ελέγχου duplex περιγράφηκε προηγουμένως [18], [19] συνετέθησαν με μικρή τροποποίηση στην αλληλουχία Ν-ΟοΡ (Qiagen GmbH, η Hilden, Γερμανία), και επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Oligofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ).

πρωτοβάθμια δείγματα ανθρώπινου όγκου πνεύμονα και συστοιχίες ιστών

Δέκα επιβεβαιώθηκε ιστολογικά δείγματα ανθρώπινων πρωτογενών NSCLC ελήφθησαν από το αποθετήριο ιστό του Εθνικού Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου-Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σιγκαπούρης (NUS NUH-) με η έγκριση του Εθνικού Πανεπιστημίου της επιτροπής αναθεώρησης Σιγκαπούρης-Θεσμική (NUS-IRB). Αυτά τα δείγματα καταψύχθηκαν ακαριαία εντός 40 λεπτών (κατά μέσο όρο) της χειρουργικής εκτομής και αποθηκεύεται στους -80 ° C. Ανθρώπινα καρκίνο του πνεύμονα συστοιχίας ιστού BC04012 αγοράστηκε από Biomax (US Biomax Inc, Maryland, USA) και χρωματίστηκαν με Ν-ΟοΡ (C-20) αντισώματος χρησιμοποιώντας ABC σύστημα χρώσης (Santa Cruz, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Ημι-ποσοτική και σε πραγματικό χρόνο

δοκιμασία PCR

Το συνολικό RNA απομονώθηκε με RNeasy Mini Kit (Qiagen GmbH, η Hilden, Γερμανία). Από κάθε δείγμα, 2 μg του RNA μετατράπηκε σε cDNA με ολιγο (dT)

18-εναρχθέν ανάστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας Superscript II RT First-Strand kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή. Το cDNA υποβλήθηκε σε ημι-ποσοτική ανάλυση PCR χρησιμοποιώντας σύστημα πολυμεράσης Taq AccuPrime (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Η ανάλυση PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα έκφρασης Δοκιμασία TaqMan® Gene (Applied Biosystems, CA, USA) και C

t τιμές καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα Real Time PCR ΑΒΙ Prism 7300 (Applied Biosystems, CA, USA) .

Ανάλυση πραγματικού χρόνου δεδομένα PCR

τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το συγκριτικό C

t μέθοδος όπου η κυτταρική γραμμή SAEC χρησιμοποιήθηκε ως το δείγμα αναφοράς και το γονίδιο HPRT χρησιμοποιήθηκε ως η ενδογενής έλεγχος του γονιδίου. Τα δεδομένα που εκπροσωπούνται σε ένα ραβδόγραμμα σχεδιάζεται σε λογαριθμική κλίμακα με βάση το επίπεδο έκφρασης 10. Ν-ΕτΠ σε διάφορες κυτταρικές σειρές ήταν υπολογίζονται σε σχέση με το επίπεδο Ν-ΕτΠ στις SAEC [20] κύτταρα, τα οποία είχε οριστεί σε 0. δεδομένα αντιπροσωπεύονται είναι ο μέσος όρος που λαμβάνεται από 3 ανεξάρτητα πειράματα.

In-vitro δοκιμασία διάσπασης Ν-ΕτΠ

Ακατέργαστα κυτταρικά εκχυλίσματα που περιέχουν δραστικές πρωτεάσες ελήφθησαν με επώαση, καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα ή κρυο-διατηρημένα ανθρώπινα πρωτογενή πνεύμονα καρκινικούς ιστούς σε RSB ρυθμιστικό διάλυμα [10 mM Tris (ρΗ 8.0), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl

2, 0,1% ΝΡ-40] στους 4 ° C για 10 λεπτά και πυρήνες κατόπιν αφαιρέθηκαν με φυγοκέντρηση. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και το περιεχόμενο πρωτεΐνης στη συνέχεια προσδιορίστηκε. υπόστρωμα Ν-ΕτΠ παρασκευάστηκε με επιμόλυνση των κυττάρων 293Τ με Flag-tagged πλασμίδιο Ν-ΕτΠ. δοκιμασία διάσπασης Βελτιστοποιημένη διεξήχθη σε 300 mM NaCl, 50 mM Tris (ρΗ 8,0), στους 37 ° C για διάφορα διάρκεια του χρόνου. Η αντίδραση τερματίστηκε με θέρμανση στους 50 ° C σε SDS ρυθμιστικό δείγματος και οι πρωτεΐνες αναλύθηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF για western αποτύπωση.

Ανοσοκαταβύθιση

Δύο προσεγγίσεις έχουν σχεδιαστεί για να ανιχνεύουν τη φυσική αλληλεπίδραση μεταξύ Ν-ΕτΠ και Hsc70. Σε μία προσέγγιση, πρωτεάση απεμπλουτισμένο κλασματώνεται HLPC του H2170 κυττάρων επωάστηκε με σημαία-tagged Ν-ΕτΠ σε ρυθμιστικό IP [40 mM Tris-HCl (ρΗ 7,4), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,75 mM MgCl

2, 0,25% ΝΡ-40] για 5 λεπτά με περιστροφή στους 4 ° C. Προστέθηκαν αντι-ΡΕΑΟ Μ2 σφαιρίδια γέλης συγγένειας (Sigma) και περαιτέρω επωάστηκαν για 2 ώρες με περιστροφή στους 4 ° C. Στη δεύτερη προσέγγιση, το όχημα ή Kaletra επεξεργασμένα H2170 κυττάρων (στα 5 μΜ για 96 ώρες) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υπερήχους σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης [150 mM NaCl, 0,5% ΝΡ40, 1 mM EDTA, 20 mM Tris (ρΗ 7.4), 1 mM NaF, 1 mM Na

2VO

4, 20 mM β-φωσφορικής γλυκερόλης, 1,5 mg /ml ΙΑΑ, κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης] για 10 s. Τα προϊόντα λύσης διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση και στη συνέχεια επωάστηκαν με Hsc70 ή αντισώματα ελέγχου για 2,5 ώρες με περιστροφή στους 4 ° C. Σφαιρίδια πρωτεΐνης G κατόπιν προστέθηκαν ακολουθούμενα από 1,5 ώρα περιστροφή στους 4 ° C. Τα ανοσοϊζήματα διαχωρίστηκαν σε SDS-PAGE γέλη και Ν-ΟοΡ και Hsc70 ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western.

ανοσοφθορισμού χρώση

Τα κύτταρα αλείφεται πάνω σε γυάλινες πλάκες χρησιμοποιώντας cytospin φυγοκέντρηση, σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και διαπερατά χρησιμοποιώντας 0.2% Triton Χ-100 σε PBS στους 4 ° C. Τα σταθερά κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με τη σχετική πρωτογενή αντισώματα που ακολουθείται από FITC- ή ροδαμίνη-συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα (Invitrogen-Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA). DNA χρωματίσθηκε με DAPI (Invitrogen-Molecular Probes) και τα σήματα φθορισμού συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία.

διαλυτότητα Protein

δοκιμασία

δοκιμασία διαλυτότητας Ν-ΕτΠ διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως με κάποια τροποποίηση [8 ]. Εν συντομία, τα κύτταρα σε επεξεργασία με υπερήχους για λίγο σε ρυθμιστικό κυτταρικής λύσης [50 mM Tris (ρΗ 8.0), 5 mM MgCl

2, 100 mM NaCl, 0,5% ΝΡ-40 και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης] και διατηρήθηκε σε πάγο για 30 λεπτά. Τα διαλυτά και αδιάλυτα κλάσματα διαχωρίζονται μέσω φυγοκέντρησης στις 15.000 rpm για 10 λεπτά στους 4 ° C. Το αδιάλυτο κλάσμα υπέστη επεξεργασία με ϋΝΑση Ι για 30 λεπτά στους 37 ° C. Τα διαλυτά και αδιάλυτα κλάσματα έπειτα διαχωρίστηκαν σε SDS-PAGE και χρωματίστηκαν με αντι-Ν-ΕτΠ (C-20).

λυσοσωμικές δοκιμασία πρόσληψης

Τα λυσοσώματα απομονώθηκαν από H2170 κύτταρα χρησιμοποιώντας το λυσόσωμα εμπλουτισμός Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Η δοκιμασία πρόσληψης λυσοσωματικής, χρησιμοποιώντας τη σημαία-tagged Ν-ΕτΠ ως υπόστρωμα, διεξήχθη ουσιαστικά όπως περιγράφεται αλλού [21].

Αποτελέσματα

μετα-μεταγραφική απώλεια Ν-ΕτΠ σε κύτταρα όγκου που προέρχονται από NSCLC

Ανάλυση του καθεστώτος Ν-ΕτΠ σε διάφορα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα αποκάλυψε μια φαινομενική απώλεια της Ν-ΕτΠ σε επίπεδο πρωτεΐνης σε πολλαπλές κυτταρικές γραμμές όγκου που προέρχονται από NSCLC, αλλά όχι σε DMS-79? μια κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται από SCLC (Εικ. 1Α, Υποστήριξη Πληροφορίες S1). Ένα παρόμοιο μοτίβο της απώλειας Ν-ΕτΠ παρατηρήθηκε επίσης σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα των αεραγωγών μικρό (SAEC) μετά από θεραπεία με νικοτίνη, η καρκινογόνος παράγοντας ευρέως συνδέεται με τον καρκίνο του πνεύμονα (Εικ. 1Β). Η απώλεια Ν-ΕτΠ παρατηρήθηκε σε κύτταρα NSCLC ήταν πιθανότατα ένα μετα-μεταγραφικό συμβάν αφού επίπεδο μεταγραφής Ν-ΟοΚ, όπως προσδιορίζεται με PCR πραγματικού χρόνου, δεν ήταν σημαντικά κάτω ρυθμίζονται σε σύγκριση με το επίπεδο του σε DMS-79 ή SAEC κύτταρα (Εικ. 1 C). Πανομοιότυπα μοτίβο της απώλειας Ν-ΕτΠ σε επίπεδο πρωτεϊνών παρατηρήθηκε επίσης σε εννέα από τα δέκα ιστολογικά επιβεβαιωμένο ανθρώπινο πρωτογενή κύτταρα NSCLC, γεγονός που υποδηλώνει ότι η απώλεια Ν-ΕτΠ δεν ήταν μια αποκλειστική εκδήλωση περιορίζονται σε κυτταρικές σειρές NSCLC (Εικ. 1D, τα αποδεικτικά στοιχεία S1) . Η απώλεια Ν-ΕτΠ παρατηρήθηκε σε H2170 κύτταρα θα μπορούσε να μπλοκαριστεί από το Kaletra, ένα κλινικό βαθμό αναστολέα της πρωτεάσης του HIV και τεκμηριωμένο αναστολέας της ανάπτυξης των κυττάρων NSCLC (Σχ. 1Ε) [22]. απώλεια Ν-ΕτΠ επίσης αποκλειστεί από γενιστεΐνη (Εικ. 1 F), ένας αναστολέας της λανθασμένης αναδιπλώσεως Ν-ΕτΠ χαρακτηριζόμενη προηγουμένως από εμάς [23]. Τα ευρήματα αυτά πρότειναν ότι η απώλεια της misfolded Ν-ΕΤΠ θα μπορούσε να αιτιακή σχέση με την ανάπτυξη και την επιβίωση των κυττάρων NSCLC

& amp.? Β, το επίπεδο και η ακεραιότητα του πλήρους μήκους πρωτεΐνης Ν-ΕτΠ σε διάφορες καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων προσδιορίστηκε μέσω της Western blotting δοκιμασίας. Επίπεδο β-ακτίνης προσδιορίστηκε ως πειραματικός έλεγχος. DMS-79 προέρχεται από SCLC ενώ τα υπόλοιπα των κυττάρων που προέρχονται από NSCLC. Β, Επίπεδο πλήρους μήκους πρωτεΐνης Ν-ΕτΠ σε SAEC κατεργάζεται με νικοτίνη για 48 ώρες σε ένα τρόπο που εξαρτάται από τη δόση προσδιορίστηκε. C, Επίπεδο μεταγραφής Ν-ΕτΠ σε κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται στο Σχήμα 1 Α & amp? Β ποσοτικοποιήθηκε με πραγματικού χρόνου PCR. Η ταυτότητα των κυττάρων που χρησιμοποιούνται στο σχήμα 1Α & amp? C παρουσιάζεται στην Υποστήριξη Πληροφορίες S1. Α, Επίπεδο πλήρους μήκους πρωτεΐνης Ν-ΕτΠ στις δέκα επιβεβαιώθηκε ιστολογικά ανθρώπινα κύτταρα πρωτογενή NSCLC προσδιορίστηκε σε κηλίδωση Western δοκιμασία με αντίσωμα Ν-ΕτΠ. Η ταυτότητα των ανθρώπινων δειγμάτων παρουσιάζεται στον Στήριξη Πληροφορίες S1. Ε και F, Επίπεδο ανέπαφης πρωτεΐνης Ν-ΕτΠ στις H2170 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με Kaletra (Ε) ή genistein (F) προσδιορίστηκε προσδιορίστηκε στη δυτική αποτύπωση δοκιμασία.

Η

Σταθεροποίηση του Ν-ΕτΠ με genistein πρότεινε ότι συγκεκριμένες NSCLC κυτταρική απώλεια Ν-ΕτΠ πιθανότατα προκλήθηκε από μη σωστή αναδίπλωση του, όπως παρατηρήθηκε στο παρελθόν σε APL. Για να επιβεβαιώσετε ότι, τη διάπλαση της πρωτεΐνης Ν-ΕτΠ σταθεροποιηθεί από το Kaletra ή genistein προσδιορίστηκε. Στην φυσική διαμόρφωση, Ν-ΕτΠ περιορίζεται στον πυρήνα και παραμένει διαλυτό σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει οργανικό απορρυπαντικό? ενώ σε κακώς-αναδιπλωμένη διαμόρφωση, Ν-ΕτΠ γίνεται αδιάλυτο και μετατοπίζεται προς ενδοπλασματικό δίκτυο [7], [8]. Χρησιμοποιήσαμε αυτά τα κριτήρια για να προσδιοριστεί αν Ν-ΕτΠ που υποβλήθηκε σε αποικοδόμηση σε κύτταρα NSCLC ήταν misfolded. Ένα σημαντικό τμήμα του Ν-ΕτΠ σταθεροποιούνται με Kaletra βρέθηκε στο αδιάλυτο κλάσμα του H2170 κυττάρων, υποδεικνύοντας ότι τα κύτταρα H2170 στέγαζε ένα misfolded πρωτεΐνης Ν-ΕτΠ (Εικ. 2Α). Από την άλλη πλευρά, η Ν-ΕτΠ σταθεροποιούνται με γενιστεΐνη ήταν σε μεγάλο βαθμό απορρυπαντικό διαλυτά, γεγονός που υποδηλώνει ότι η γενιστεΐνη μπορούσε να σώσει την φυσική διαμόρφωση Ν-ΕτΠ (Σχ. 2Β). Ένα σημαντικό τμήμα του Ν-ΕτΠ σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα των αεραγωγών μικρό (SAEC) βρέθηκε σε διαλυτό κλάσμα, ενώ σε SCLC κύτταρα προερχόμενα DSM-79, Ν-ΕτΠ ήταν σε μεγάλο βαθμό αδιάλυτο (Σχ. 2C). Συνεπής με τη διαπίστωση της δοκιμασίας διαλυτότητας, Ν-ΕτΠ εμφανίζεται μια κυρίως κυτοσολικό διανομή σε πολλαπλά NSCLC προερχόμενα κύτταρα (Σχ. 2D, το κόκκινο σήμα) και ιστολογικά επιβεβαιωμένη τομές ιστού ανθρώπινο πρωτογενές NSCLC (Εικ. 2Ε, πάνελ 2-6). Σε αντίθεση, η Ν-ΕΤΠ εντοπίζεται κυρίως στον πυρήνα σε ανθρώπινα φυσιολογικά κύτταρα του πνεύμονα επιθηλιακά (Σχ. 2Ε, πίνακας 1) και σε κύτταρα SAEC (Εικ. 2F, αριστερά πάνελ). Η πυρηνική Ν-ΕΤΠ βρίσκεται σε κύτταρα SAEC είχε μετατοπιστεί προς ER μετά τη θεραπεία νικοτίνη, γεγονός που υποδηλώνει ότι η νικοτίνη μπορεί να προκαλέσει εσφαλμένη αναδίπλωση Ν-ΕτΠ (Σχ. 2F, δεξιά πάνελ). Συλλογικά, αυτά εύρημα πρότεινε ότι η Ν-ΕτΠ που υποβλήθηκε σε αποικοδόμηση σε κύτταρα NSCLC ήταν πιθανότατα ένα misfolded πρωτεΐνη

Α, Β & amp.? C, Διαλυτότητα (S) /αδιαλυτότητα (Ι) Ν-ΟοΡ ή β-ακτίνης σε Kaletra (Α) ή genistein (Β) κατεργάζεται H2170 κύτταρα, καθώς και σε DMS-79 ή SAEC κύτταρα (C), προσδιορίστηκε με δοκιμασία διαλυτότητας της πρωτεΐνης. D, υποκυτταρική κατανομή των Ν-ΕτΠ (κόκκινο σήμα) σε NSCLC (H2170, Η1299, Η358, Η596, H650, H1869 και H1666) και μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (DMS-79) κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία ανοσοφθορισμού εκτελέστηκε με το αντίσωμα Ν-ΕτΠ. DNA (μπλε σήμα) βάφτηκε με DAPI. Ε, υποκυτταρική κατανομή των Ν-ΕτΠ σε επιβεβαιώθηκε ιστολογικά τμήματα ιστού ανθρώπινα πρωτογενή NSCLC (πίνακας 2-6) και φυσιολογικό τμήμα ιστού ανθρώπινου πνεύμονα (πίνακας 1) προσδιορίστηκε με ανοσοϊστοχημική (IHC) δοκιμασία εκτελείται με αντίσωμα Ν-ΕτΠ. Η καφετιά χρώση στο κυτταρόπλασμα εντοπιστούν από μαύρο βέλος αντιπροσωπεύει το σήμα Ν-ΕτΠ (πίνακες 2-6). χρώση Ν-ΕτΠ στο κανονικό τμήμα του πνευμονικού ιστού είναι ορατό ως μαύρες κουκίδες εμπρός από τον πυρήνα (πίνακας 1). Το δεύτερο πάνελ επιδεικνύει μία διατομή η οποία περιέχει τόσο καρκινικού ιστού (αριστερά μισό) και φυσιολογικό ιστό πνεύμονα (δεξιό ήμισυ) δίπλα-δίπλα. F, υποκυτταρική κατανομή των Ν-ΟοΡ και PDI σε SAEC κύτταρα κατεργασμένα με όχημα ή νικοτίνη για 48 ώρες προσδιορίστηκε με συνεστιακή μικροσκόπηση.

Η

ειδικές NSCLC κύτταρο απώλεια Ν-ΕτΠ συνδέεται με ενδοπλασματικό δίκτυο (ER ) άγχος

Σε APL, η απώλεια Ν-ΕΤΠ ήταν αποτέλεσμα της κυτταροπροστατευτικών UPR που επιτεύχθηκε με τη μεσολάβηση ειδικών ανώμαλη δραστικότητα πρωτεάσης APL των κυττάρων που τελικά προστατεύεται κύτταρα APL από ER στρες που προκαλείται απόπτωση [7]. Για να διερευνηθεί κατά πόσο η απώλεια Ν-ΕτΠ στα κύτταρα NSCLC διευκολύνθηκε επίσης από παρόμοια ανώμαλη δράση της πρωτεάσης, μια δοκιμασία διάσπασης Ν-ΕτΠ βελτιστοποιημένη εκτελέστηκε. Σε αυτή τη δοκιμασία, flag-tagged Ν-ΕτΠ εκτοπικά εκφραζόμενη σε κύτταρα 293Τ επωάστηκε με το εκχύλισμα του H2170 κυττάρων, ένα NSCLC παράγωγη κυτταρική γραμμή που εμφάνισαν απώλεια Ν-ΟοΚ, ή DMS-79 κύτταρα, μια που προέρχεται SCLC κυτταρική γραμμή η οποία δεν είχε επιδεικνύει καμία απώλεια Ν-ΟοΚ, και το επίπεδο της Ν-ΕτΠ πέψη κατά τη διάρκεια αυτής της επώασης καθορίστηκε μέσω της Western blotting δοκιμασίας. Flag-tagged Ν-ΕτΠ επωάζονται με το εκχύλισμα των H2170 κυττάρων πέψη σε μια εποχή με τρόπο που εξαρτάται και ένα διασπασμένο θραύσμα Ν-ΕΤΠ 100 kDa δημιουργήθηκε (Εικ. 3Α, λωρίδες 6-8), ενώ η Ν-ΕτΠ-σημαία επωάζονται με το εκχύλισμα του DMS-79 κύτταρα δεν υπέστη πέψη (Εικ. 3Α, διαδρομές 2-4). Είναι ενδιαφέρον ότι η δραστικότητα διάσπασης Ν-ΕτΠ παρουσιάζονται σε H2170 κύτταρα ήταν εντελώς απενεργοποιήθηκε με βρασμό, γεγονός που υποδηλώνει ότι η δραστηριότητα θα μπορούσε να είναι μια θερμοευαίσθητη πρωτεάση (Σχ. 3Α, λωρίδα 9). Όπως παρατηρήθηκε με NSCLC που προέρχονται H2170 κυττάρων, εκχυλισμάτων δύο ανθρώπινα πρωτογενή κύτταρα NSCLC, στα οποία καμία πλήρους μήκους Ν-ΕτΠ ανιχνεύθηκε, περιείχαν δραστηριότητα που υποβάλλονται σε πλήρη πέψη σημαία επισύναψη πρωτεΐνης Ν-ΕτΠ (Σχ. 3Β). Ταυτόσημη δραστικότητα διάσπασης Ν-ΕτΠ θερμοασταθούς βρέθηκε επίσης σε τρία άλλα κύτταρα αντιπροσωπευτικά NSCLC HLF-α, H23 και H1650 (Σχ. 3C).

Α, κύτταρα H2170 λιμάνι δραστικότητα διάσπασης Ν-ΕτΠ. Επεξεργασία Flag-tagged Ν-ΕτΠ επωάστηκαν με τα εκχυλίσματα του DMS-79 (λωρίδες 2-5) ή H2170 (λωρίδες 6-9) κύτταρα για τη διάρκεια, όπως αναφέρεται προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western δοκιμασία εκτελείται με αντίσωμα Flag. Το εκχύλισμα φορτώθηκε στις λωρίδες φέρουν την ένδειξη «βραστό» θερμάνθηκε στους 100 ° C για 10 λεπτά πριν από την επώαση. Ίσος όγκος του εκχυλίσματος κυττάρων ρυθμιστικού λείπει χρησιμοποιήθηκε στη λωρίδα χαρακτηρισμένα ως «ρυθμιστικό». Το βέλος σημειώνει τη θέση του διασπασμένου 100 kDa θραύσμα Ν-ΕτΠ. Β, Επεξεργασία Flag-tagged Ν-ΕτΠ επωάστηκαν με τα εκχυλίσματα των πρώτων τριών ανθρώπινων κυττάρων πρωτογενούς NSCLC (συμπληρωματικός Πίνακας 2) προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western με αντίσωμα Flag. C, δοκιμασία διάσπασης Ν-ΟοΚ, χρησιμοποιώντας εκχυλίσματα κυττάρων NSCLC HLF-α, H23 ή H1650, διεξήχθη ουσιαστικά όπως περιγράφεται στη λεζάντα του Σχήματος 2Α. D, Επίπεδο ER στρες σε διάφορα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα αναλύθηκε με προσδιορισμό των επιπέδων του GRP-78 και PDI (βασική και HMW: υψηλού μοριακού βάρους). Ε, Ν-ΕτΠ εντοπίζεται σε ER οπτικοποιήθηκε με χρώση H2170 κυττάρων με Ν-ΟοΡ (κόκκινο) και PDI (πράσινο) αντισώματα. DNA χρωματίσθηκε με DAPI (μπλε). F, Επίπεδο PDI σε H2170 ή DMS-79 κύτταρα που εκτέθηκαν να αγωνίζομαι ή Ν-ΕτΠ siRNA προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western (άνω πάνελ). Η knock-down απόδοση Ν-ΕτΠ σε κάθε υποσύνολο των κυττάρων επιβεβαιώθηκε με ανάλυση RT-PCR (κάτω πάνελ). G, Επίπεδο PDI μεταγραφή σε SAEC κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με νικοτίνη για 48 ώρες προσδιορίστηκε με ανάλυση RT-PCR.

Η

Επόμενο για να ελέγξετε αν συγκεκριμένες NSCLC κυτταρική απώλεια Ν-ΕτΠ συνδέθηκε με ER στρες όπως παρατηρήθηκε σε APL, το επίπεδο του στρες ER απέναντι κύτταρα NSCLC συγκρίθηκε με εκείνη των DMS-79 κύτταρα με μέτρηση των επιπέδων των πρωτεϊνών GRP78 και PDI, δύο bona fide δεικτών ER στρες [24], [25]. Επίπεδα GRP78 και PDI, φυσιολογικούς και ένα υψηλού μοριακού βάρους (HMW) παραλλαγή ειδικώς βρίσκεται σε κύτταρα που υποβάλλονται σε ER στρες, ήταν σημαντικά υψηλότερες σε όλα τα κύτταρα NSCLC που εμφάνισαν απώλεια Ν-ΟοΚ, ενώ αυτές οι δύο πρωτεΐνες ήταν σχεδόν μη ανιχνεύσιμα σε DMS-79 κύτταρα (Σχ. 3D). Ένας πιθανός ρόλος της misfolded Ν-ΕτΠ στην ενίσχυση του ER στρες προτάθηκε από τον συν-εντοπισμό των Ν-ΕτΠ και PDI σε H2170 κύτταρα (Εικ. 3Ε), και από τη μείωση του επιπέδου PDI μετά από νοκ ντάουν Ν-ΕτΠ (Εικ . 3F). Επιπλέον, η θεραπεία των κυττάρων SAEC με νικοτίνη σε συγκέντρωση που προκάλεσε απώλεια Ν-ΕτΠ οδήγησε στην επάνω επίπεδο PDI ρύθμιση, γεγονός που υποδηλώνει ότι η νικοτίνη που προκαλείται από απώλεια Ν-ΕΤΠ θα μπορούσε επίσης να συνδέεται με ER στρες (Εικ. 3G). Τα ευρήματα αυτά πρότειναν από κοινού μια σύνδεση μεταξύ της απώλειας Ν-ΕτΠ και την ενίσχυση της ER στρες στα κύτταρα NSCLC. Πρότεινε, επίσης, ότι η υποβάθμιση της misfolded Ν-ΕΤΠ μπορεί να συνέβαλαν στην εξασθένηση του ER στρες και την ενδεχόμενη προστασία των κυττάρων NSCLC από ER στρες που προκαλείται απόπτωση όπως διαπιστώθηκε προηγουμένως στο APL.

misfolded Ν-ΕτΠ αποδομείται μέσω συνοδός μεσολάβηση αυτοφαγία

για να αποκτήσουν περαιτέρω πληροφορίες για το μηχανισμό βασίζεται η απώλεια της Ν-ΕτΠ και να κατανοήσουν τη λειτουργική συνέπεια της απώλειας Ν-ΕτΠ, αποφασίσαμε να προσδιορίσει τις πρωτεΐνες που μπορεί να σχετίζονται με misfolded Ν-ΕτΠ πρωτεΐνης πριν από την υποβάθμιση του. Για την επίτευξη αυτού του στόχου, ένα ειδικά σχεδιασμένο δοκιμασία συνανοσοκαθίζησης πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της πρωτεάσης-εξαντλημένο εκχύλισμα κυτταρολύματος των H2170 κυττάρων και τη σημαία-tagged Ν-ΕτΠ εκτοπικά εκφράζεται σε κύτταρα 293Τ. Flag-tagged Ν-ΕτΠ επωάζεται με πρωτεάση-εξαντλημένο εκχύλισμα κυτταρολύματος από κύτταρα H2170 ανοσοκατακρημνίστηκε με αντίσωμα σημαίας και την ταυτότητα των πρωτεϊνών που σχετίζονται με Ν-ΟοΡ προσδιορίστηκε με φασματομετρία μάζας (MS) μετά τον διαχωρισμό τους σε SDS-PAGE. Είναι ενδιαφέρον ότι, εκτός από αρκετές πρωτεΐνες συν-καθιζάνουν με σημαία-tagged Ν-ΟοΚ, ένας ταυτοποιήθηκε ως Hsc70 (Σχήμα 4Α.), Ένα μοριακός συνοδός απαραίτητη για την μετατόπιση των ειδικών υποστρωμάτων CMA στα λυσοσώματα [26] – [28]. Για να ελέγξετε την άμεση συσχέτιση μεταξύ Ν-ΕτΠ και Hsc70, ένα κλάσμα της πρωτεάσης-εξαντλημένο εκχύλισμα κυτταρολύματος από H2170 κυττάρων επωάστηκε με το εκχύλισμα των κυττάρων 293Τ επιμολυσμένα με σημαία-tagged πλασμίδιο Ν-ΕτΠ, και το επίπεδο των Hsc70 κατακρημνίστηκε με Ν-ΕτΠ προσδιορίστηκε σε κηλίδωση Western δοκιμασίας. Σημαντική ποσότητα Hsc70 πρωτεΐνης (Σχ. 4Β, άνω πάνελ) συν-κατακρημνίζεται μαζί με το Flag-tagged Ν-ΕτΠ (Σχ. 4Β, κάτω πάνελ) καθιζάνει με αντίσωμα Flag. Η συσχέτιση μεταξύ Ν-ΕΤΠ και πρωτεΐνες Hsc70 επιβεβαιώθηκε περαιτέρω σε δοκιμασία συνανοσοκαθίζησης εκτελούνται με τα αποσπάσματα του οχήματος ή του Kaletra αντιμετωπίζονται H2170 κύτταρα (Εικ. 4C). Επιπλέον, σε δοκιμασία έμμεσου ανοσοφθορισμού, σημαντικό συν-εντοπισμός των Ν-ΕτΠ και Hsc70 παρατηρήθηκε, υποδηλώνοντας περαιτέρω τους ένωση in-vivo σε H2170 κύτταρα (Εικ. 4D).

Μια στήλη καθαρίζεται εκχυλίσματα του κυτταροπλάσματος των H2170 κύτταρα επωάστηκε με σημαία-tagged Ν-ΕτΠ εκτοπικά εκφράζεται σε κύτταρα 293Τ. Ν-ΕτΠ ανοσοκαταβυθίστηκε με αντίσωμα αντι-flag και πρωτεΐνες συν-κατακρημνίζονται με Ν-ΟοΡ επιλύθηκαν SDS-PAGE, εκτομή και την ταυτότητά τους προσδιορίστηκε με MS. Β, Η συσχέτιση μεταξύ Flag-tagged Ν-ΕτΠ και Hsc70 επαναβεβαιώθηκε στη δοκιμασία συνανοσοκαθίζησης πραγματοποιήθηκε ουσιαστικά όπως περιγράφεται στο μύθο του σχήματος 4Α. Μετά την ανίχνευση του συν-καθιζάνει Hsc70 με αντίσωμα Hsc70 (άνω πάνελ), η μεμβράνη επανα-διερευνήθηκαν με αντίσωμα σημαία να ποσοτικοποιηθεί η ποσότητα της πρωτεΐνης καταβυθίζεται Ν-ΟοΡ (κάτω πίνακας). Στις λωρίδες «εισόδου», ένα κλάσμα του εκχυλίσματος ολικού κυττάρου φορτώθηκε. C, Hsc70 ανοσοκατακρημνίσθηκε από τα εκχυλίσματα του οχήματος ή 5 μΜ Kaletra αντιμετωπίζονται H2170 κυττάρων και το επίπεδο της συν-καθιζάνει Ν-ΕτΠ προσδιορίστηκε με αντίσωμα Ν-ΕτΠ (άνω πάνελ). Η μεμβράνη επανα-διερευνήθηκαν με αντίσωμα Hsc70 (κάτω πίνακας). Στις λωρίδες «εισόδου», ένα κλάσμα του εκχυλίσματος ολικού κυττάρου φορτώθηκε. D, N-ΕτΠ (κόκκινο) και Hsc70 (πράσινο) τη διανομή στο H2170 κυττάρων προσδιορίστηκε μέσω ανάλυσης ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία. Η ένταση του κίτρινου σημάτων σηματοδοτεί το βαθμό του συν-εντοπισμό των δύο πρωτεϊνών. DNA σημάνθηκε με DAPI (μπλε).

Η

Τα περισσότερα από τα γνωστά υποστρώματα της CMA περιέχουν ένα μοτίβο που στοχεύουν λυσοσωμική βιοχημικά σχετίζονται με KFERQ [21], [29]. Αυτό το μοτίβο αποτελείται από ένα Q πλαισιώνεται εκατέρωθεν από τέσσερα αμινοξέα που αποτελείται από ένα βασικό, ένα όξινο, ένα ογκώδες υδρόφοβο, και μία επαναλαμβανόμενη βασικό ή ογκώδη υδρόφοβο αμινοξύ. Μια ανάλυση της αλληλουχίας του πεπτιδίου Ν-ΕτΠ αποκάλυψε την παρουσία ενός σχεδόν ταυτόσημη στόχευσης λυσοσωμική μοτίβο που περιλαμβάνει από QEIFR πενταπεπτιδίου, υποδηλώνοντας ότι η Ν-ΕτΠ μπορεί να είναι ένα υπόστρωμα του CMA (Εικ. 5Α). Σε CMA, Hsc70 πρώτα συνεργάτες με misfolded φορτίο του στην cytosole και στη συνέχεια σύμπλοκο Hsc70-φορτίο μεταφέρεται στο λυσόσωμα [29], [30]. Μόλις παραδοθεί στη λυσοσωμιακή μεμβράνη με Hsc70, οι misfolded πρωτεΐνες φορτίου μετατοπίζεται προς την κοιλότητα λυσοσωματικής με τη βοήθεια Lamp2A, περιοριστικός ρυθμός παράγοντα CMA [26] – [28]. Για να αποδειχθεί ότι η Ν-ΕτΠ αποδομήθηκε μέσα από το Lamp2A μεσολάβηση μονοπάτι λυσοσωμική, επίδραση της Lamp2A εκτομή στο επίπεδο της πρωτεΐνης Ν-ΕτΠ προσδιορίστηκε. απώλεια Ν-ΕτΠ ήταν σημαντικά αντιστραφεί (Σχ. 5Β, άνω πάνελ) μετά Lamp2A εκτομή με ένα αποτελεσματικό αντι-Lamp2A siRNA (Σχ. 5Β, κάτω πάνελ), γεγονός που υποδηλώνει ένα σημαντικό ρόλο του Lamp2A στην απώλεια της πρωτεΐνης Ν-ΕτΠ. Επιπλέον, η θεραπεία του H2170 κυττάρων με χλωροκίνη, ένα χημικό αναστολέα της λειτουργίας λυσοσωμικών [31], μπλοκάρει σημαντικά την απώλεια της πρωτεΐνης Ν-ΕτΠ (Εικ. 5C).

Α, Ν-ΕτΠ περιέχει μια συναίνεση λυσοσωμιακή στόχευση μοτίβο. Το μοτίβο που στοχεύουν λυσοσωμικών στην πεπτιδική αλληλουχία Ν-ΕτΠ τονίζεται στην υπογραμμίζεται έντονα γράμματα. Β, Lamp2A κατάλυση εμποδίζεται η απώλεια Ν-ΕτΠ στις H2170 κυττάρων. επίπεδο Ν-ΕτΠ σε H2170 κύτταρα που εκτίθενται σε αντι-Lamp2A ή ελέγχουν siRNA για 72 ώρες προσδιορίστηκε με αντίσωμα Ν-ΟοΡ (άνω πάνελ), μετά την επιβεβαίωση Lamp2A εκτομή με ανάλυση RT-PCR (κάτω πίνακας). C, Χημική αναστολή της λειτουργίας λυσοσωμικής σταθεροποιηθεί Ν-ΕτΠ. Επίπεδο Ν-ΕτΠ στον H2170 κύτταρα σε αγωγή για 72 ώρες με όχημα ή 25 μΜ χλωροκίνη, ένας εκλεκτικός αναστολέας της λειτουργίας λυσοσωμικών, προσδιορίστηκε με αντίσωμα Ν-ΕτΠ. D, Flag-tagged Ν-ΕτΠ επωάστηκε με καθαρισμένο λυσοσωματικές ή μη λυσοσωματική κλάσματα H2170 (αριστερά) ή DMS-79 (δεξιά) κύτταρα και το επίπεδο της αποικοδόμησης Ν-ΕτΠ προσδιορίστηκε με αντίσωμα σημαία. Επίπεδο Lamp2, μια λυσοσωμική πρωτεΐνη, προσδιορίστηκε για να αποδειχθεί η καθαρότητα του κάθε κλάσματος. Ε, Ν-ΕτΠ παραλαμβάνεται από χυμοστατίνη αγωγή λυσοσώματα προστατεύθηκε από πέψη με πρωτεϊνάση Κ. Flag-tagged Ν-ΕΤΠ ή Hsc70 επωάζονται με λυσοσώματα απομονωμένη μορφή H2170 κυττάρων προ-θεραπεία με χυμοστατίνη υποβλήθηκε σε πέψη πρωτεϊνάσης Κ και το σχετικό επίπεδο των προστατευόμενων Ν-ΕτΠ ή Hsc70 προσδιορίστηκε με σημαία ή Hsc70 αντισώματος. επίπεδο Lamp2 ήταν αποφασισμένος να υπολογιστεί το ποσό της λυσοσώματα σε κάθε δείγμα.

Η

Για να αποδείξουν περαιτέρω ότι λυσοσώματα ήταν η πηγή της δραστηριότητας διάσπασης Ν-ΕτΠ παρουσιάζονται σε κύτταρα NSCLC, η πέψη της Flag-tagged Ν-ΕτΠ επωάζονται με το εκχύλισμα του λυσοσωμικού ή μη λυσοσωματική κλάσματα των κυττάρων H2170 προσδιορίστηκε. Flag-tagged Ν-ΕτΠ επωάζονται με το εκχύλισμα του λυσοσωμικού κλάσμα H2170 κυττάρων υποβάλλονται σε πλήρη πέψη ενώ Flag-tagged Ν-ΕτΠ επωάζονται με μη λυσοσωμικής κλάσματα δεν ήταν (Εικ. 5D, αριστερό πάνελ), γεγονός που υποδηλώνει ότι η δραστηριότητα διάσπασης Ν-ΕτΠ πιθανότατα εντοπίζεται στα λυσοσώματα. Υπό τις ίδιες συνθήκες δοκιμασίας, Flag-tagged Ν-ΕτΠ επωάζονται με το κλάσμα λυσοσωμικού DMS-79 κύτταρα δεν υπέστη πέψη (Σχ. 5D, δεξί πάνελ). Για να αποδειχθεί ότι η Ν-ΕτΠ είναι πράγματι ένα υπόστρωμα του CMA, μία δοκιμασία πρόσληψης λυσοσωματικής, στην οποία CMA υποστρώματα που καταλαμβάνεται από λυσοσώματα χυμοστατίνη αγωγή θα πρέπει να προστατεύονται από πέψη με πρωτεϊνάση Κ, εκτελέσθηκε [21]. Flag-tagged Ν-ΟοΚ ή Hsc70, ένα γνωστό υπόστρωμα CMA, επωάστηκε με πρωτεϊνάση Κ και λυσοσώματα isolaed από χυμοστατίνη αγωγή H1270 κύτταρα, και το επίπεδο των πρωτεϊνών Ν-ΟοΡ ή Hsc70 προστατεύεται από πέψη με πρωτεϊνάση Κ προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western. Μία σημαντική ποσότητα Flag-tagged Ν-ΕτΠ, καθώς και Hsc70 προστατεύθηκε από πέψη με πρωτεϊνάση Κ όταν επωάζονται με λυσοσώματα αγωγή χυμοστατίνη, υποδηλώνοντας ότι η Ν-ΕτΠ, όπως Hsc70, μπορεί να μετατοπίζεται προς την κοιλότητα λυσοσωματική (Σχ. 5Ε).

με βάση τα στοιχεία που περιγράφονται μέχρι τώρα σε αυτή την έκθεση, ο δυνητικός ρόλος της CMA που προκαλείται υποβάθμιση της misfolded πρωτεΐνης Ν-ΕτΠ στην επιβίωση και ανάπτυξη των κυττάρων NSCLC παρουσιάζεται μέσα από ένα σχηματικό μοντέλο (Εικ. 6). Αυτό το μοντέλο δείχνει πόσο απώλεια Ν-ΕτΠ θα μπορούσε ενδεχομένως να συμβάλλουν στην επιβίωση και ανάπτυξη των κυττάρων NSCLC μέσω ενός διπλού μηχανισμού. Η υποβάθμιση των misfolded πρωτεΐνης Ν-ΟοΚ, αφενός, θα μπορούσε έμμεσα συμβάλλουν στην επιβίωση των κυττάρων NSCLC με εξουδετέρωση του στρες ER που προκαλείται από ενδοκυτταρική συσσώρευση misfolded πρωτεΐνης Ν-ΕτΠ. Ταυτόχρονα, απώλεια της λειτουργίας Ν-ΕτΠ λόγω εσφαλμένη αναδίπλωση μπορεί να οδηγήσει στην ενεργοποίηση των οδών ογκογονικής επιβίωσης που κανονικά καταστέλλεται από έναν εγγενώς διπλωμένη και λειτουργικής πρωτεΐνης Ν-ΕτΠ. Επιπλέον, misfolded Ν-ΕτΠ και υποβαθμισμένα κομμάτια της θα μπορούσαν επίσης να ενεργοποιήσει άμεσα διάφορες ογκογόνο μηχανισμό που συνδέεται με την ανάπτυξη και την επιβίωση των κυττάρων NSCLC. Έτσι, CMA-επαγόμενη αποικοδόμηση του κακώς-αναδιπλωμένου Ν-ΕτΠ μπορεί να συμβάλλει στην ανάπτυξη και το μετασχηματισμό των κυττάρων NSCLC μέσω ενός συνδυασμού απώλεια και το κέρδος των μηχανισμών λειτουργίας.

Αυτό το μοντέλο απεικονίζει πώς CMA-επαγόμενη αποικοδόμηση της misfolded Ν- ΕΤΠ θα μπορούσε να συμβάλει στην επιβίωση και ανάπτυξη των κυττάρων NSCLC με την απώλεια της φυσιολογικής λειτουργίας και αύξηση της ανώμαλης μηχανισμό λειτουργίας.

Η

Συζήτηση

Η αστάθεια Ν-ΕΤΠ ή misfolding παρατηρήθηκαν σε NSCLC