Αφηρημένο

Τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) είναι ένα κρίσιμο γεγονός στην εισβολή όγκου και μετάσταση. Ωστόσο, οι περισσότερες από παλαιότερες μελέτες EMT έχουν διεξαχθεί με τη συμβατική δισδιάστατη (2D) μονοστρωματική καλλιέργεια. Ως εκ τούτου, παραμένει ασαφές ποια επεμβατική φαινοτύπους αποκτώνται από EMT που προκαλείται από τα καρκινικά κύτταρα. Για να αντιμετωπιστεί αυτό το σημείο, προσπαθήσαμε να χαρακτηρίσει κύτταρα EMT στην πιο φυσιολογικό, τρισδιάστατο πολιτισμό gel (3D) κολλαγόνου. EMT προκλήθηκε με κατεργασία τρεις κυτταρικές σειρές καρκινώματος ανθρώπου (Α549, Panc-1 και ΜΚΝ-1) με ΤΟΡ-β. Η θεραπεία ΤΟΡ-β διεγερμένα αυτά τα κύτταρα να υπερεκφράζουν το γ2 δείκτες εισβολή λαμινίνη και ΜΤ1-ΜΜΡ σε 2D καλλιέργεια, εκτός από την επαγωγή των γνωστών μορφολογική αλλαγή και έκφρασης δείκτη EMT. EMT επαγωγή αυξημένη κυτταρική κινητικότητα και κολλητικότητα σε ινονεκτίνη και το κολλαγόνο σε 2D πολιτισμό. Αν και EMT κύτταρα έδειξε συγκρίσιμη ανάπτυξη των κυττάρων για τον έλεγχο των κυττάρων σε 2D πολιτισμό, τα ποσοστά ανάπτυξής τους ήταν εξαιρετικά καταστέλλεται σε καλλιέργειες μαλακού άγαρ και το κολλαγόνο γέλη. Τα περισσότερα χαρακτηριστικά, EMT που προκαλείται από τα καρκινικά κύτταρα συχνά και έντονα επεκτάθηκε επεμβατική προεξοχές σε πηκτή κολλαγόνου. Αυτές οι προεξοχές υποστηρίχθηκαν κυρίως από τους μικροσωληνίσκους και όχι ακτίνης του κυτταροσκελετού. Σαλιγκάρι-εισήγαγε, σταθερά κύτταρα EMT έδειξαν παρόμοια προεξοχές σε 3D συνθήκες χωρίς TGF-β. Επιπλέον, αυτές οι προεξοχές κατεστάλησαν με κολχικίνη ή αναστολείς πρωτεΐνη θερμικού σοκ 90 (HSP-90) και την πρωτεϊνική φωσφατάση 2Α. Ωστόσο, οι αναστολείς ΜΜΡ δεν καταστέλλει το σχηματισμό προεξοχή. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι ΕΜΤ ενισχύει διείσδυση των καρκινικών κυττάρων σε διάμεσο στρώμα επεκτείνοντας προεξοχές μικροσωληνίσκων που βασίζεται και καταστολή της ανάπτυξης των κυττάρων. Η αυξημένη προσκόλληση των κυττάρων σε ινονεκτίνη και το κολλαγόνο και την υψηλή κινητικότητα των κυττάρων φαίνεται επίσης σημαντική για την εισβολή όγκου

Παράθεση:. Oyanagi J, Ogawa Τ, Sato Η, Higashi S, Μιγιαζάκι Κ (2012) Τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση Τονώνει Ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα να επεκτείνει μικροσωληνίσκων που βασίζεται Επεμβατική προεξοχές και καταστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων στο κολλαγόνο Gel. PLoS ONE 7 (12): e53209. doi: 10.1371 /journal.pone.0053209

Επιμέλεια: Olivier de Wever, Πανεπιστήμιο της Γάνδης, Βέλγιο

Ελήφθη: 23 του Αυγούστου του 2012? Αποδεκτές: 27 του Νοεμβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 31 Δεκεμβρίου 2012 |

Copyright: © 2012 Oyanagi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις-in-Aid (23112517 και 23300351) για την Επιστημονική Έρευνα από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας. (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/index.html) Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου.

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Όπως φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα, κύτταρα πορογενές καρκίνωμα

in situ

διατηρήσει την πολικότητα των κυττάρων, η οποία υποστηρίζεται από την επαφή κυττάρου-κυττάρου και προσκόλληση κυττάρου σε βασική μεμβράνη. Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου, μερικά κύτταρα καρκινώματος χάνουν το κύτταρο πολικότητα και εισβάλλουν μέσω της μεμβράνης και στη συνέχεια σε συνδετικό ιστό. Αυτό το φαινόμενο αναφέρεται ως επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) και πιστεύεται ότι είναι ένα κρίσιμο γεγονός της εξέλιξης του καρκίνου [1] – [3]. ΕΜΤ είναι κρίσιμη όχι μόνο για πολλές αναπτυξιακές στάδια όπως γαστριδίωση και σχηματισμός νευρική ακρολοφία αλλά επίσης για παθολογικές εκδηλώσεις όπως επούλωση τραυμάτων και των ιστών ίνωση [1], [3], [4]. EMT γενικά χαρακτηρίζεται από την απώλεια των επιθηλιακών δείκτη Ε-καδερίνης, τα επάνω ρύθμιση δεικτών μεσεγχυματικών όπως Ν-καδερίνης και βιμεντίνη, και την απόκτηση του σχήματος ατράκτου κύτταρο που μοιάζουν με ινοβλάστες σε καλλιέργειες μονοστοιβάδας [4].

ΕΜΤ των καρκινικών κυττάρων διεγείρεται τυπικά με ΤΟΡ-β [5], αλλά άλλοι παράγοντες ανάπτυξης και μικροπεριβάλλον παράγοντες, όπως HGF, EGF και FGF, είναι επίσης ικανά να επάγουν ή προάγουν παρόμοια φαινοτυπικές αλλαγές ανάλογα με τους τύπους κυττάρων [1] , [3], [6]. ΤΟΡ-β ασκεί πολλαπλές βιολογικές δραστηριότητες σχετικά με την ανάπτυξη και την αύξηση, διαφοροποίηση, εξωκυτταρική παραγωγή μήτρας και την απόπτωση των φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων [7]. ΤΟΡ-β είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής της ανάπτυξης των φυσιολογικών επιθηλιακών κυττάρων. Ενώ ΤΟΡ-β καταστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου σε πρώιμα στάδια της καρκινογένεσης, προωθεί εξέλιξης του όγκου σε προχωρημένα στάδια [7]. Από καιρό ήταν γνωστό ότι ο TGF-β σε συνδυασμό με άλλους παράγοντες, όπως ΤΟΡ-α και EGF, προωθεί αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη των κανονικών ινοβλαστών [8]. Η δραστικότητα ΕΜΤ επαγωγής του ΤΟΡ-β προκαλείται κυρίως από την οδό Smad, μια κύρια οδός σύνθετων σημάτων ΤΟΡ-β, το οποίο προωθεί την έκφραση των παραγόντων μεταγραφής ΕΜΤ σχετίζονται συμπεριλαμβανομένων σαλιγκάρι, Slug, Twist, και Zeb 1/2 [ ,,,0],6]. Αυτοί οι παράγοντες μεταγραφής συνδέονται σε στοιχεία του αλληλουχίες προαγωγού δέσμευσης E-box και καταστέλλει την έκφραση Ε-καδερίνης σε επίπεδο μεταγραφής [9], [10].

ΕΜΤ σε καρκινικά κύτταρα ενισχύει την έκφραση του invasion- ή μετάστασης -σχετικών γονιδίων όπως μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs). πρόσφατη μελέτη μας έδειξε ότι η εισβολή όγκου λαμινίνη δείκτη γ2, καθώς και ΜΜΡ-9, επάγεται από την επαγωγή του γαστρικού EMT καρκινικών κυττάρων [11]. Άλλες πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι ΕΜΤ-επαγόμενη τα καρκινικά κύτταρα έχουν αντίσταση σε φάρμακα και η ραδιενέργεια [12] και έχουν ιδιότητες βλαστικών κυττάρων του καρκίνου που μοιάζει με [13] αντικαρκινικές. Παρά έναν αριθμό προηγούμενων μελετών σχετικά με την ΕΜΤ των καρκινικών κυττάρων, ωστόσο, δεν είναι σαφές πώς ΕΜΤ συμβάλλει στην εισβολή και μετάσταση όγκου και ποια επεμβατική φαινοτύπους αποκτώνται από ΕΜΤ-επαγόμενη καρκινικά κύτταρα. Αυτό είναι τουλάχιστον εν μέρει λόγω του γεγονότος ότι οι περισσότερες μελέτες έχουν διεξαχθεί EMT στο συμβατικό σύστημα καλλιέργειας δύο διαστάσεων (2D). Έχει καταστεί σαφές ότι τα κύτταρα που αναπτύσσονται σε επίπεδη καλλιέργεια 2D διαφέρουν σημαντικά από εκείνες που καλλιεργούνται σε τρισδιάστατη (3D) καλλιέργεια στην κυτταρική μορφολογία, τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, την αλληλεπίδραση κυττάρου-κυττάρου, αλληλεπίδραση κυττάρου-μήτρας και γονιδιακή έκφραση [14], [15 ]. Για να κατανοήσουμε την παθολογική συνέπεια της ΕΜΤ των καρκινικών κυττάρων, φαίνεται σημαντικό να χαρακτηρίζει τα κύτταρα ΕΜΤ-επαγόμενη σε ένα πιο φυσιολογικό σύστημα 3D καλλιέργειας.

Σε αυτή τη μελέτη, η οποία χαρακτηρίζεται ΕΜΤ-επαγόμενη καρκινικά κύτταρα τόσο 2D μονοστρωματική καλλιέργεια και τον πολιτισμό gel 3D κολλαγόνου, χρησιμοποιώντας τρεις κυτταρικές σειρές. Βρήκαμε ότι ΕΜΤ-επαγόμενα κύτταρα εμφάνισε εξέχοντα επέκταση του μικροσωληνίσκων που βασίζονται επεμβατική προεξοχές και την καταστολή της ανάπτυξης στην καλλιέργεια γέλη κολλαγόνου 3D.

Αποτελέσματα

ΕΜΤ Διέγερση τριών ανθρώπινων Cancer Κυτταρικές Γραμμές

Για να διερευνηθεί φαινοτυπικές μεταβολές που προκαλούνται από EMT των καρκινικών κυττάρων, χρησιμοποιήσαμε τα μοντέλα τριών ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Αναφέραμε προηγουμένως ότι ο TGF-β και ΤΝΡ-α επάγει συνεργικά ΕΜΤ σε καλλιέργεια του ΜΚΝ-1 ανθρώπινου γαστρικού καρκινικών κυττάρων [11] χωρίς ορό. Έχει αναφερθεί ότι αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα γραμμή Α549 [17] και παγκρεατικού καρκίνου κυτταρική γραμμή Panc-1 [16] υφίστανται ΕΜΤ με επεξεργασία με ΤΟΡ-β. Σε αυτή τη μελέτη, εξετάσαμε πρώτα τρία κυτοκίνες (ΤΟΡ-β, ΤΝΡ-α, και EGF) για την επαγωγή ΕΜΤ του Α549 και Panc-1 κύτταρα, αναλύοντας την έκφραση κάποιων δεικτών προσβολή όγκου, καθώς και δείκτες EMT. Σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, μόνο ΤΟΡ-β απαιτήθηκε για την επαγωγή ΕΜΤ όπως κρίνεται από την μεσεγχυματικά μορφολογική αλλαγή (Εικ. S1), καθώς και μείωση της έκφρασης Ε-καδερίνης και επαγωγή βιμεντίνης (Εικ. 1Α και Β). ΤΟΡ-β προσομοιωμένο επίσης την έκφραση δύο δεικτών προσβολή όγκου, ΜΤ1-ΜΜΡ και αλυσίδα λαμινίνης γ2, στις δύο κυτταρικές σειρές. Ωστόσο, ένας συνδυασμός του TNF-α με ΤΟΡ-β αυξάνει περαιτέρω τα επίπεδα της αλυσίδας λαμινίνης γ2 και ΜΜΡ-9 σε κύτταρα Α549 (Εικ. 1Α). Η αλυσίδα λαμινίνης γ2 και ΜΤ1-ΜΜΡ επίσης επάγεται από τον TNF-α και /ή EGF σε Panc-1 κύτταρα (Σχ. 1Β). Επιπλέον, βρήκαμε ότι αν και απαιτείται τόσο ΤΝΡ-α και ΤΟΡ-β για την επαγωγή των κυττάρων ΕΜΤ ΜΚΝ-1 σε καλλιέργεια χωρίς ορό, μόνο ΤΟΡ-β ήταν αναγκαία παρουσία ορού (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ΤΟΡ-β είναι η πιο κοινή και ισχυρός επαγωγέας της EMT για τις τρεις κυτταρικές σειρές καρκίνου, αλλά ΤΝΡ-α είναι επίσης αναγκαία για την αποτελεσματική έκφραση κάποιων δεικτών εισβολής, ανάλογα με τους τύπους κυττάρων.

Α549 (Α) και Panc-1 (Β) τα κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού με 10 ng /ml EGF, 10 ng /ml ΤΝΡ-α, 10 ng /ml ΤΟΡ-β, ή ΤΝΡ-α + ΤΟΡ-β . Μετά από 48-ώρες επώασης, ρυθμισμένα μέσα (CMS) και κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση για δείκτες EMT (Ε-καδερίνης και βιμεντίνης στα προϊόντα λύσης κυττάρων), η λαμινίνη δείκτης εισβολή γ2 (CMS), ΜΤ1-ΜΜΡ (κυτταρολύματα ), και ακτίνης ως εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης (κυτταρολύματα). Τα χαμηλότερα πλαίσια δείχνουν ζελατίνη ζυμογραφία του ΜΜΡ-9 και ΜΜΡ-2 στο CMS. Οι τιμές στις παρενθέσεις δείχνουν κατά προσέγγιση μοριακό μέγεθος σε kDa. Οι άλλες πειραματικές συνθήκες που περιγράφονται στο Υλικά και Μέθοδοι.

Η

Επίδραση της EMT επαγωγή κυτταρικής προσκόλλησης και Μετανάστευση στην μονόφυλλο Πολιτισμού

Όπως φαίνεται από τα παραπάνω, TGF-β αποτελεσματικά επαγόμενη EMT στα τρία διαφορετικές κυτταρικές γραμμές καρκινώματος. Στη συνέχεια, εξετάσαμε τι φαινότυποι αποκτήθηκαν από την επαγωγή EMT των καρκινικών κυττάρων για την επεμβατική την ανάπτυξή τους. Πρώτον, η δραστικότητα προσκόλλησης κυττάρου των κυττάρων Α549 εξετάστηκε μετά από επαγωγή EMT, χρησιμοποιώντας τρεις υποστρώματα κυτταρικής προσκόλλησης, λαμινίνη-332, φιμπρονεκτίνη και κολλαγόνο τύπου Ι. Τα κύτταρα προ-αγωγή με ΤΟΡ-β για 24 ώρες και στη συνέχεια σπάρθηκε επί αυτών των υποστρωμάτων. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α και 2Β, τα κύτταρα χωρίς θεραπεία έλεγχος αποτελεσματικότερα τηρηθούν λαμινίνη-332. θεραπεία ΤΟΡ-β μειώθηκε μόνο ελαφρά την κυτταρική προσκόλληση στη λαμινίνη-332. Αντίθετα, αύξησε σημαντικά την αποτελεσματικότητα κυτταρικής πρόσφυσης στα υποστρώματα στρωματικά φιμπρονεκτίνη και κολλαγόνο τύπου Ι. Η δοκιμασία προσκόλλησης κυττάρου ηλεκτρικό time-lapse έδειξε σαφώς τις ΕΜΤ επαγόμενη αλλαγές στην δραστικότητα προσκόλλησης κυττάρου των κυττάρων Α549 σε ινονεκτίνη και κολλαγόνο τύπου Ι (Εικ. 2C). Αυτές οι αλλαγές παρατηρήθηκαν επίσης σε Panc-1 και κύτταρα 1 ΜΚΝ-(τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α και Β) Μια πλάκα ενενήντα έξι φρεατίων επικαλύφθηκε με 2 μg /ml λαμινίνης-332 (Lm332 ), 5 μg /ml ινονεκτίνης (FN), και 2 μg /ml κολλαγόνου Ι (Col Ι) στους 4 ° C όλη τη νύκτα, και στη συνέχεια δεσμεύτηκαν με 1.2% BSA για 1 ώρα στους 37 ° C. κύτταρα Α549 επωάστηκαν με 10 ng /ml ΤΟΡ-β σε μέσο ελεύθερο ορού για 24 ώρες. Οι ΤΟΡ-β-κατεργασμένα κύτταρα (ΤΟΡ-β) και μη κατεργασμένα κύτταρα (ελέγχου) αιωρήθηκαν και εμβολιάστηκαν πάνω στην πλάκα. Μετά από επώαση για 30 λεπτά, λήφθηκαν εικόνες αντίθεσης φάσης δραστηριότητας (Α) και προσκόλληση κυττάρου μετρήθηκε (Β). Μια γραμμή κλίμακας δείχνει 50 μm. Οι σχετικοί αριθμοί των συνδεδεμένων κυττάρων προσδιορίστηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Κάθε μπάρα δείχνει τη μέση ± SD προσκολλημένων κυττάρων σε φρεάτια εις τριπλούν. (C) Ηλεκτρική δοκιμασία προσκόλλησης κυττάρου time-lapse με E-πλάκες. Η πλάκα προεπικαλυμμένα με ινονεκτίνη (○, •) και κολλαγόνο Ι (□, ▪) όπως φαίνεται παραπάνω, και την προσκόλληση του ΤΟΡ-β-κατεργασμένα κύτταρα (ΤΟΡ-β: •, ▪) και μη κατεργασμένα κύτταρα (ελέγχου: ○, □) προς την πλάκα παρακολουθήθηκε κάθε 5 λεπτά. δείκτης κυττάρων υποδεικνύει αυθαίρετη μονάδα αντανακλώντας προσκόλληση και εξάπλωση των κυττάρων στην διάταξη μικροηλεκτρόδιο στον πυθμένα των φρεατίων. Άλλες πειραματικές συνθήκες που περιγράφονται στο Υλικά και Μέθοδοι.

Η

Δεύτερον, δραστικότητα κυτταρικής μετανάστευσης ερευνήθηκε χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικές δοκιμασίες. Στις

in vitro

επούλωσης πληγών δοκιμασία, ΤΟΡ-β προωθείται σημαντικά κυτταρική μετανάστευση του Α549 και κύτταρα Panc-1 σε απουσία ΤΝΡ-α υπό συνθήκες χωρίς ορό συμπληρωμένο (Εικ. 3Α και Β). TNF-α δεν είχαν επιπλέον επίδραση στην δραστικότητα μετανάστευσης κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Όταν η κυτταρική μετανάστευση προσδιορίστηκε με τη μικροσκοπία βίντεο time-lapse, η κινητικότητα των κυττάρων ενισχύεται με την κατεργασία του ΤΟΡ-β ήταν πιο καθαρά φαίνεται με τις δύο κυτταρικές σειρές (Σχ. 3C). Επιβεβαιώσαμε επίσης ότι η ΤΟΡ-β θεραπεία αύξησε την κινητικότητα του ΜΚΝ-1 κύτταρα στο τραύμα δοκιμασία επούλωσης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α και Β) Για να μετρηθεί η δραστικότητα μετανάστευσης κυττάρων, Α549 (αριστερά πάνελ) και Panc-1 (δεξιά πάνελ) κύτταρα υποβλήθηκαν σε

in vitro επούλωσης πληγής

δοκιμασία με την παρουσία ή απουσία (έλεγχος) του ΤΟΡ-β, όπως περιγράφεται στο κείμενο. μικρογραφήματα φάσης-αντίθεσης καλλιεργειών λήφθηκαν μετά από 16-ώρες επώασης. Μαύρες διακεκομμένες γραμμές δείχνουν την αρχική άκρες του τραύματος. μπαρ κλίμακα, 50 μm. Β) περιοχή μετανάστευση κυττάρων εκτιμήθηκε με ανάλυση του pixel με Image J. Κάθε γραμμή υποδεικνύει την μέση ± SD για τους τομείς της μετανάστευσαν κυττάρων σε 3 διαφορετικά πεδία (δεξιά πάνελ). (C) Τα κύτταρα που είχαν υποστεί προεπεξεργασία με ή χωρίς ΤΟΡ-β για 24 ώρες επωάστηκαν σε 1% μέσον FBS που περιέχει χωρίς ή με ΤΟΡ-β σε ένα 24-φρεατίων για 6 ώρες στους 37 ° C. Η μετανάστευση των κυττάρων παρακολουθήθηκε με ένα σύστημα βίντεο time-lapse για 12 ώρες. απόσταση μετανάστευσης των κυττάρων μετρήθηκε για 15 τυχαία επιλεγμένα κύτταρα. Κάθε γραμμή υποδεικνύει την μέση ± SD για κυτταρική μετανάστευση ταχύτητα 15 κυττάρων. Άλλες πειραματικές συνθήκες που περιγράφονται στο Υλικά και Μέθοδοι.

Η

Επίδραση της EMT επαγωγή στο Anchorage-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από την ανάπτυξη κυττάρων

Τρίτον, δραστικότητα ανάπτυξης κυττάρου του ΕΜΤ-επαγόμενα κύτταρα διερευνήθηκε κάτω από τρεις διαφορετικές συνθήκες. Σε 2D μονοστρωματική καλλιέργεια, θεραπεία ΤΟΡ-β δεν επηρέασε την ανάπτυξη των ΜΚΝ-1 κύτταρα και αμελητέα ή μόνο ελαφρώς καταστέλλεται εκείνη των Α549 και κύτταρα Panc-1 (Σχ. 4Α). Όταν σχηματισμός αποικίας εξετάστηκε σε αραιά 2D καλλιέργειες (500 κύτταρα /35 mm δίσκο) της Α549 και Panc-1 κύτταρα, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των ΤΟΡ-β-κατεργασμένα και μη-επεξεργασμένες καλλιέργειες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στην καλλιέργεια εναιωρήματος σε μη-κόλλα πλάκες, οι τρεις κυτταρικές σειρές αυξήθηκε αργά σχηματίζοντας συσσωματώματα κυττάρων ή σφαιροειδή στις πλάκες. Υπό αυτές τις συνθήκες, η θεραπεία ΤΟΡ-β κατέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων ΜΚΝ-1 αλλά δεν είχε καμία επίδραση σε αυτό της Α549 και Panc-1 κύτταρα (Σχ. 4Β). Σε αντίθεση, ο σχηματισμός αποικίας των τριών κυτταρικών γραμμών σε μαλακό άγαρ καλλιέργεια ήταν έντονα καταστέλλεται με την κατεργασία του ΤΟΡ-β. Τόσο ο αριθμός των συνολικών αποικιών και το συνολικό εμβαδόν αποικίας εξαιρετικά μειωμένη στα ΤΟΡ-β-αγωγή κυτταρικών σειρών από τα μη-επεξεργασμένα αυτοί (Σχ. 4C, 4D, και S2). Ωστόσο, ο ΤΟΡ-β-κατεργασμένα κύτταρα Panc-1 σχηματίζονται σχετικά μεγάλες αποικίες σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. S2). Η έλλειψη Ε-καδερίνης μεσολάβηση προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου σε ΤΟΡ-β-κατεργασμένων κυττάρων θα μπορούσε να καταστείλει τις δυνατότητες των κυτταρικών επιβίωση και πολλαπλασιασμό στην αγκύρωση-ανεξάρτητη κατάσταση.

(Α) ΜΚΝ-1 (1.0 × 10

4 κύτταρα), Α549 (0.5 × 10

4 κύτταρα) και Panc-1 (1.0 × 10

4 κύτταρα) επωάστηκαν σε κάθε φρεάτιο που περιέχει 1% FBS μέσου που περιέχει χωρίς (μάρτυρας) ή με ΤΟΡ-β σε πλάκες καλλιέργειας των 24 φρεατίων για 7 ημέρες σε καλλιέργεια μονοστοιβάδας. Μετά την επώαση, ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε με ένα μετρητή κυττάρων. Κάθε μπάρα δείχνει τη μέση ± SD από τους αριθμούς των κυττάρων σε φρεάτια εις τριπλούν. (Β) Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πυκνότητα 1 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες καλλιέργειας εναιωρήματος των 24 φρεατίων που περιείχε 1% FBS μέσου που περιέχει χωρίς (μάρτυρας) ή με ΤΟΡ-β για 7 ημέρες. Ο σχετικός αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ μέτρησης κυττάρων Dojindo 8. Κάθε γραμμή υποδεικνύει τη μέση τιμή ± SD από τις τιμές απορρόφησης στα 485 nm σε φρεάτια εις τριπλούν. (Γ και Δ) Κύτταρα εμβολιάστηκαν σε πυκνότητα 7000 κύτταρα ανά 35 mm δίσκο σε 10% FBS περιέχον μαλακό μέσο άγαρ χωρίς (μάρτυρας) ή με ΤΟΡ-β και επωάστηκαν για 10 (ΜΚΝ-1) ή 14 (Α549 και Panc-1) ημέρα. Μετά την επώαση, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με το

σ

-iodonitrotetrazolium ιώδες, και ο αριθμός του συνόλου των αποικιών (C) και την περιοχή συνολική αποικία (D) προσδιορίστηκαν με Image J και παρουσιάζονται ως σχετικό αριθμό με τον έλεγχο ( 100%). Κάθε γραμμή υποδεικνύει την μέση ± SD σε φρεάτια εις τριπλούν. Άλλες πειραματικές συνθήκες που περιγράφονται στο Υλικά και Μέθοδοι.

Η

Συμπεριφορά του ΕΜΤ-επαγόμενης Cancer Cells σε 3D Collagen Gel Culture

Η γονιδιακή έκφραση

in vivo

είναι διαφορετικό από ότι στο σύστημα μονοστιβάδας καλλιέργειας (15). Ως ένα σύστημα καλλιέργειας που μιμείται

in vivo

συνθήκες, χρησιμοποιήσαμε 3D καλλιέργεια γέλη κολλαγόνου να χαρακτηριστούν περαιτέρω οι ΕΜΤ-επαγόμενη καρκινικά κύτταρα. Τα καρκινικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν εντός στρώμα πήγματος κολλαγόνου που περιέχουν ΤΟΡ-β ή /και άλλους παράγοντες για 7 ημέρες. Στο 3D γέλη κολλαγόνου, τα κύτταρα ΜΚΝ-1 έδειξε εξέχοντα επεκτάσεις μεμβράνη ή προεξοχές όταν θεραπεύτηκαν με ΤΟΡ-β (Σχ. 5Α και Β). Μια παρόμοια μορφολογική μεταβολή παρατηρήθηκε σε Α549 και κυτταρικές γραμμές Panc-1 (Σχ. S3). Η προσθήκη του ΤΝΡ-α στην καλλιέργεια ΤΟΡ-β που περιέχει προωθηθεί περαιτέρω αυτή την μορφολογική αλλαγή μόνο στην περίπτωση των κυττάρων ΜΚΝ-1 (Σχ. 5Β). EGF μόνο, το οποίο επάγεται σε κύτταρα ΕΜΤ ΜΚΝ-1, επίσης προκάλεσε το σχηματισμό προεξοχή σε αυτή την κυτταρική γραμμή, αλλά αυτό το αποτέλεσμα δεν παρατηρήθηκε σε Α549 και Panc-1 κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η μορφολογική αλλαγή είναι ειδικό για την επαγωγή ΕΜΤ αντί ΤΟΡ-β διέγερση.

(Α) ΜΚΝ-1 κύτταρα επωάστηκαν σε 3D κολλαγόνου με ή χωρίς υποδεικνύεται κυτοκινών σε πλακίδια θαλάμου 3-καλά για 7 ημέρες. Το μέσο καλλιέργειας αλλάχθηκε κάθε 3η ημέρα. μπαρ κλίμακα, 50 μm. (Β) Μετά από 5-ημερών επώαση, οι αριθμοί των συνολικών κυτταρικών μάζες και αυτές με προεξοχές μετρήθηκαν σε έναν κεντρικό τομέα κάτω από ένα μικροσκόπιο, και το ποσοστό των κυτταρικών συστάδων προεξοχής θετικών υπολογίστηκε. Κάθε μπάρα δείχνει τη μέση ± SD των σχετικών αριθμών της προεξοχής-θετικού κυττάρου συσσωματώματα σε φρεάτια εις τριπλούν. (Γ) Μετά από 7-ημέρες επώασης, τα κύτταρα σε γέλη κολλαγόνου βάφτηκαν με κιτ μέτρησης κυττάρων Dojindo 8 επί 4 ώρες, και η απορρόφηση στα 485 nm του κάθε μέσου καλλιέργειας μετρήθηκε. Κάθε μπάρα δείχνει τη μέση ± SD των τιμών απορρόφησης στα φρεάτια εις τριπλούν. Οι άλλες πειραματικές συνθήκες που περιγράφονται στο Υλικά και Μέθοδοι.

Η

επόμενο εξέτασε κατά πόσον η επαγωγή EMT κατέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων μέσα σε γέλη κολλαγόνου. Όπως διαπιστώθηκε σε μαλακό άγαρ καλλιέργεια, ΤΟΡ-β κατέστειλε έντονα την ανάπτυξη όλων των κυτταρικών γραμμών που εξετάστηκαν σε γέλη κολλαγόνου (Εικ. 5C). EGF ποτέ ή μόνο ασθενώς κατέστειλε την ανάπτυξη των τριών κυτταρικών γραμμών σε 3D γέλη κολλαγόνου. TNF-α δεν είχε καμία σημαντική πρόσθετη επίδραση στις καλλιέργειες αυτές. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η επαγωγή EMT προωθεί εξέχουσα προέκταση των προεξοχών αλλά καταστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων στις καλλιέργειες γέλη κολλαγόνου 3D των κυτταρικών γραμμών τρία καρκίνου.

μικροσωληνίσκων που βασίζεται Δομή του ΕΜΤ-επαγόμενης προεξοχές σε 3D Collagen Gel

Για να χαρακτηριστούν οι EMT που προκαλείται από προεξοχές, αναλύσαμε κυτταροσκελετού αλλαγές μετά την επαγωγή EMT από τον TGF-β. Νηματοειδής ακτίνη (Ρ-ακτίνη) και μικροσωληνίσκων cytoskeletons του ΕΜΤ-επαγόμενης κύτταρα χρωματίστηκαν με φθορισμό με ροδαμίνη Φαλλοϊδίνη και τουμπουλίνης-ειδικό αντίσωμα, αντίστοιχα. κύτταρα ΜΚΝ-1 διεγέρθηκαν με ΤΟΡ-β σε 2D και 3D καλλιέργειες και στη συνέχεια βάφτηκαν για τις cytoskeletons (Fig.6A και Β). Στην καλλιέργεια 2D του ΕΜΤ-επαγόμενης κύτταρα, ισχυρή ίνες στρες του F-ακτίνη, όπως επίσης και μικροσωληνίσκους, υποστηριζόμενη Το μοναδικό σχήμα των κυττάρων (Σχ. 6Α). Στο 3D γέλη κολλαγόνου, F-ακτίνης νημάτια έντονα ανιχνεύεται στην επιφάνεια του σφαιροειδούς δομής σε μη διεγερμένα κύτταρα (Σχ. 6Β). Στα κύτταρα TGF-β-θεραπεία, νημάτια ακτίνης περιφερική βρέθηκαν γύρω από το κυτταρικό σώμα και προεξοχές, αλλά ίνες στρες σπάνια βρίσκονται στις προεξοχές. Αντίθετα, πολλές δέσμες μικροσωληνίσκων ήταν εμφανές σημείο ανιχνεύεται στο κέντρο των προεξοχών στις ΕΜΤ-επαγόμενα κύτταρα. Στα κύτταρα ελέγχου, οι μικροσωληνίσκοι ήταν ομοιόμορφα κατανεμημένα στο κυτταρόπλασμα. Αυτά τα πρότυπα cytoskeletons βρέθηκαν συνήθως σε ΜΚΝ-1 και Panc-1 κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

κύτταρα ΜΚΝ-1 επωάζονται χωρίς (μάρτυρας) ή με 10 ng /ml ΤΟΡ-β σε ελεύθερο ορού που περιέχουν μέσο καλλιέργειας σε 2D (Α) ή 3D καλλιέργεια πηκτής κολλαγόνου (Β) για 3 ημέρες. Αυτά τα κύτταρα φθορισμός-χρωματίστηκαν για α-τουμπουλίνης (πράσινο) με τη χρήση ενός ειδικού αντισώματος, F-ακτίνης με ροδαμίνη phalloidin (κόκκινο), και ϋΑΡΙ (μπλε). εικόνες φθορισμού ελήφθησαν με ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού. Άλλες πειραματικές συνθήκες που περιγράφονται στο Υλικά και Μέθοδοι.

Η

Για να εξεταστεί αν μικροσωληνίσκων είναι μια αρχή κυτταροσκελετού στήριξη των ΕΜΤ-επαγόμενη προεξοχές, εξετάσαμε αποτελέσματα μερικών κυτταροσκελετική αναστολέων για την επέκταση των κυττάρων ΕΜΤ-επάγεται σε κολλαγόνο γέλη. Κυτοχαλασίνη Β και κολχικίνη είναι γνωστό ότι αναστέλλει τόσο τον πολυμερισμό και σταθεροποίηση του F-ακτίνης και μικροσωληνίσκους, αντίστοιχα. Όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυτούς τους αναστολείς ταυτόχρονα με την αγωγή ΤΟΡ-β, η επέκταση των κυττάρων ανεστάλη εν μέρει με 1 μΜ κυτοχαλασίνης Β, αλλά εντελώς με 10 ηΜ κολχικίνη (Σχ. 7Α). Όταν αυτοί οι αναστολείς προστέθηκαν 24 ώρες μετά την ΤΟΡ-β διέγερση, οι προεξοχές ήταν σημαντικά ανασυρθεί από κολχικίνη μετά από αγωγή 3-h, αλλά όχι από κυτοχαλασίνη Β (Σχ. 7Β). Παρομοίως, δύο άλλοι αναστολείς μικροσωληνίσκων βινβλαστίνη και η ταξόλη (πακλιταξέλη) μπλοκάρει εξαρτώμενο από τη δόση την επέκταση των κυττάρων όταν προστίθεται μαζί με TGF-β με το 3D καλλιέργειας (Σχ. S4). Αναλύσαμε επίσης επιπτώσεις ορισμένων αναστολέων σήματος για την επέκταση των κυττάρων EMT που προκαλείται σε πηκτή κολλαγόνου. Η πρωτεϊνική φωσφατάση 2Α (ΡΡ2Α) cantharidin αναστολέα και του θερμικού σοκ πρωτεΐνη-90 (HSP-90) αναστολέα ραδισικόλη, τόσο οι οποίες αναστέλλουν τη σταθεροποίηση των μικροσωληνίσκων, ανέστειλε ασθενώς την επέκταση των κυττάρων (Σχ. 7C). Όταν και οι δύο cantharidin και ραδισικόλη προστέθηκαν σε συνδυασμό, η επέκταση του κυττάρου προσθετικά καταστέλλεται. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι οι προεξοχές του ΕΜΤ-επαγόμενης καρκινικά κύτταρα σε 3D γέλη κολλαγόνου που υποστηρίζονται κυρίως από μικροσωληνίσκους, και οι δύο ΡΡ2Α και HSP-90 δραστηριότητες είναι απαραίτητες για το σχηματισμό των προεξοχών. Παρά το γεγονός ότι η ακτίνη κυτταροσκελετό απαιτείται για την επέκταση των προεξοχών, φαίνεται περιττό για τη διατήρηση των δομών προεξοχή.

κύτταρα ΜΚΝ-1 επωάστηκαν με 10 ng /ml ΤΟΡ-β σε μέσο που περιέχει ορό σε 3D καλλιέργεια γέλη κολλαγόνου , όπως περιγράφεται στα σχήματα 5 και 6. στο καλλιέργειας κολλαγόνου προστέθηκαν διάφοροι αναστολείς, και ο σχηματισμός προεξοχής μετρήθηκε ποσοτικά 24 ώρες αργότερα (Α, C και D) ή 3 ώρες αργότερα (Β). (Α) Οι αναφερόμενες συγκεντρώσεις κυτοχαλασίνης Β και κολχικίνη προστέθηκαν στο μέσο καλλιέργειας συγχρόνως με την προσθήκη ΤΟΡ-β. (Β) κυτοχαλασίνη Β (5 μΜ) και κολχικίνη (1 μΜ) προστέθηκαν στο μέσο καλλιέργειας μετά από επώαση με ΤΟΡ-β για 24 ώρες. (C) ΜΚΝ-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χωρίς (μάρτυρας) ή με cantharidin (1 μΜ) και /ή ραδισικόλη (1 μΜ) όπως περιγράφεται στο (Α). (D) ΜΚΝ-1 κύτταρα προκατεργάστηκαν με 10 μg /ml από κάθε ουδέτερη αντισώματος στους 37 ° C για 30 λεπτά, και τα προεπεξεργασμένα κύτταρα ενσωματωμένα σε γέλη κολλαγόνου που περιέχει 10 μg /ml του υποδεικνυόμενου αντι-ιντεγκρίνης και 10 ng /ml TGF-β. Όλες αυτές οι αναστολείς δεν ήταν κυτταροτοξικά τουλάχιστον κάτω από τις ανωτέρω πειραματικές συνθήκες, όπως αναλύεται από την βαφή κυανούν τρυπανίου. Ωστόσο, κυτταροτοξικά αποτελέσματα έγινε φανερό όταν τα κύτταρα επωάστηκαν με 5 μΜ κυτοχαλασίνη Β ή 1 μΜ κολχικίνης για 24 ώρες.

Η

Οι προεξοχές σχηματίζονται σε ΕΜΤ-επαγόμενη καρκινικά κύτταρα εντός πήγματος κολλαγόνου διέφεραν σε μεγάλο βαθμό στην εμφάνιση από το κύτταρο μορφολογία στην καλλιέργεια μονοστοιβάδας. Αυτό συνεπάγεται ότι η αλληλεπίδραση των κυττάρων με κολλαγόνο στο περιβάλλον 3D εμπλέκεται στο σχηματισμό προεξοχή. Η δυνατότητα αυτή εξετάστηκε χρησιμοποιώντας αντι-ιντεγκρίνης, ουδέτερη αντισώματα. Όπως αναμενόταν, τα αντισώματα αντι-ιντεγκρίνης-α2 και αντι-ιντεγκρίνης-SS1 μπλοκάρει αποτελεσματικά την επέκταση προεξοχών (Εικ. 7d). Ένας συνδυασμός των δύο αντισωμάτων ανέστειλε περισσότερο έντονα το σχηματισμό προεξοχή από κάθε αντίσωμα. Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι ο σχηματισμός των προεξοχών μικροσωληνίσκων που βασίζονται απαιτεί τόσο ΕΜΤ-επαγωγής κυτοκίνης και κολλαγόνου /σήματα ιντεγκρίνης.

Διαφορές από άλλες επεμβατικές προεξοχές.

Είναι γνωστό ότι τα κακοήθη καρκινικά κύτταρα εισβάλλουν σε 3D εξωκυττάρια μήτρα από την επέκταση κάποιων ειδών προεξοχή ή προβολή. Invadopodium είναι ένα ακτίνη που βασίζεται, χαρακτηριστική προεξοχή που παράγεται από επεμβατικές καρκινικά κύτταρα [18]. ΜΤ1-ΜΜΡ πιστεύεται ότι είναι ένας δείκτης invadopodia και η δραστικότητα του είναι απαραίτητη για το σχηματισμό invadopodium. Για να ελεγχθεί αν οι προεξοχές παρατηρήθηκαν στα ΕΜΤ-επαγόμενη καρκινικά κύτταρα στο εσωτερικό του πήγματος κολλαγόνου είναι πανομοιότυπα με invadopodia, εξετάσαμε επίδραση ενός ευρέος φάσματος αναστολέα ΜΜΡ (TAPI) για την επέκταση προεξοχής. Όταν TAPI προστέθηκε ταυτόχρονα με ΤΟΡ-β στην κουλτούρα κολλαγόνο, λίγο ή πολύ αδύναμη επίδραση στην παράταση προεξοχή ελήφθη στις τρεις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (Εικ. S5, A-C). Ουσιαστικά τα ίδια αποτελέσματα ελήφθησαν όταν ΤΙΜΡ-2, ένα φυσικό αναστολέα των ΜΜΡ, χρησιμοποιήθηκε αντί του TAPI (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Επειδή δραστικότητα Src κινάσης συνδέεται επίσης με το σχηματισμό invadopodium, εξετάσαμε την επόμενη επιδράσεις της τρία είδη των αναστολέων κινάσης Src, αναλογικό ΡΡ1, SU6656 και λαβενδουστίνης C, για το σχηματισμό προεξοχή σε 3D γέλη κολλαγόνου. Τυχόν είδη των αναστολέων δεν κατέστειλε τον σχηματισμό προεξοχή του ΜΚΝ-1 κύτταρα (Σχ. S5, D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η EMT που προκαλείται προεξοχή είναι μια διαφορετική δομή των κυττάρων από invadopodium.

μικροσωληνίσκων που βασίζεται προεξοχές στο σαλιγκάρι που προκαλείται από κύτταρα EMT στο κολλαγόνο Gel

Όπως φαίνεται από τα παραπάνω, TGF-SS- διεγείρονται τα καρκινικά κύτταρα να επεκτείνει συνήθως μικροσωληνίσκων που βασίζεται επεμβατική προεξοχές στην κουλτούρα 3D τζελ κολλαγόνου. Για περισσότερες γενικεύσει αυτό το φαινόμενο, ιδρύσαμε σταθερά EMT που προκαλείται από τα κύτταρα με την εισαγωγή ενός cDNA φορέα έκφρασης σαλιγκάρι σε κύτταρα Panc-1 (σαλιγκάρι-Panc-l). Όπως κύτταρα ΤΟΡ-β που διεγείρεται, σαλιγκάρι-Panc-l κύτταρα έδειξαν διάσπαρτα μορφολογία κυττάρων σε σύγκριση με τον κενό φορέα-επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου (Mock-Panc-1) (Σχ. 8Α). Σύμφωνα με την μορφολογική αλλαγή, η έκφραση Ε-καδερίνης κατεστάλη και βιμεντίνης έκφραση ενισχύθηκε σε Σαλιγκάρι-Panc-l κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 8Α). Όταν αυτά τα επιμολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε 3D πηκτή κολλαγόνου, σαλιγκάρι-Panc-l αλλά δεν Mock-Panc-1 κύτταρα παραταθεί μικροσωληνίσκων που βασίζεται, ισχυρή προεξοχές απουσία TGF-β (Σχ. 8Β). Η επέκταση των προεξοχών σε Σαλιγκάρι-Panc-l κύτταρα ήταν έντονα αναστέλλεται από κολχικίνη, αλλά ελάχιστα με κυτοχαλασίνη Β (Εικ. 8C και D). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν επίσης ότι ο σχηματισμός προεξοχή μικροσωληνίσκων που βασίζεται αντανακλά EMT σε 3D γέλη κολλαγόνου.

Panc-1 κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα άδειο φορέα (Mock-Panc-1) ή ένας φορέας έκφρασης σαλιγκάρι (σαλιγκάρι-Panc -1), και τα σταθερά διαμολυνθέντα τους καθορίστηκαν. Αυτά τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν χωρίς TGF-β σε 2D μονοστρωματική καλλιέργεια ή 3D πολιτισμό τζελ κολλαγόνου. (Α) Μορφολογία Mock-Panc-1 (άνω πάνελ) και σαλιγκάρι-Panc-1 (κάτω πλαίσιο) κυττάρων επωάζονται για 2 ημέρες σε 2D μονοστρωματική καλλιέργεια, και η έκφραση της Ε-καδερίνης, βιμεντίνη και σαλιγκάρι σε αυτά τα κύτταρα (δεξιά πάνελ ). Βλέπε Σχήμα 1 για πειραματικές συνθήκες. μπαρ κλίμακα, 50 μm. (Β) Μορφολογία Mock-Panc-1 (άνω πάνελ) και τα κύτταρα επωάζονται σε 3D καλλιέργεια γέλη κολλαγόνου για 3 ημέρες Σαλιγκάρι-Panc-1 (κάτω πλαίσιο), και το σχηματισμό προεξοχή τους (δεξιά εικόνα). Βλέπε Εικόνα 5 για πειραματικές συνθήκες. μπαρ κλίμακα, 50 μm. (Γ και Δ) Επιδράσεις του 1 μΜ cholchicine (Γ) και 5 μΜ κυτοχαλασίνη Β (Δ) στο σχηματισμό προεξοχή σε 3D καλλιέργεια γέλη κολλαγόνου. Αυτοί οι αναστολείς προσετέθησαν στο μέσο καλλιέργειας μετά από 24-ώρες επώασης με ΤΟΡ-β. Άλλες πειραματικές συνθήκες είναι οι ίδιες όπως περιγράφεται στα σχήματα 5 και 7Β.

Η

σύγκριση επίσης τις δυνατότητες ανάπτυξης στην αγκύρωση-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη συνθήκες μεταξύ σαλιγκάρι-Panc-l κύτταρα Mock-Panc-1 και. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο ρυθμό ανάπτυξης μεταξύ των δύο ειδών κυττάρων σε καλλιέργεια μονοστοιβάδας (Εικ. 9Α). Σε μαλακό καλλιέργεια άγαρ, τόσο συνολικός αριθμός των αποικιών και η συνολική έκταση αποικία ήταν σαφώς χαμηλότερη σε Σαλιγκάρι-Panc-l κύτταρα από Mock-Panc-1 κύτταρα (Σχ. 9Β και C), αλλά μεγάλες αποικίες ήταν περισσότερο άφθονη στο σαλιγκάρι-Panc-l κύτταρα από τα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 9D). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων σε πηκτή κολλαγόνου ήταν ελαφρώς αλλά σημαντικά χαμηλότερη σε σαλιγκάρι-Panc-l κύτταρα από τα κύτταρα ελέγχου (

σ

& lt? 0,05) (Σχήμα 9Ε.)

(Α) μονόφυλλο. Πολιτισμός. Mock-Panc-1 (ανοικτής στήλης) και σαλιγκάρι-Panc-1 (κλειστή στήλη) σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1,0 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο πλακών 24 φρεατίων σε 10% FBS μέσου που περιέχει και επωάστηκαν για 7 ημέρες. Μετά την επώαση, ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε με ένα μετρητή κυττάρων. (Β-Δ) μαλακό καλλιέργεια άγαρ. Mock-Panc-1 και τα κύτταρα Σαλιγκάρι-Panc-1 καλλιεργήθηκαν σε μαλακό άγαρ μέσο για 14 ημέρες. Μετά την επώαση, ο αριθμός των συνολικών αποικιών (Β) και το συνολικό εμβαδόν αποικιών (C) αναλύθηκαν με Image J. Οι καλλιέργειες μαλακού άγαρ φωτογραφήθηκαν και κάθε χαρακτηριστική εικόνα που φαίνεται στο (D). μπαρ κλίμακα, 500 μm. Άλλες πειραματικές συνθήκες ήταν οι ίδιες όπως περιγράφονται στο Σχήμα 4. καλλιέργεια (Ε) κολλαγόνου. Mock-Panc-1 και τα κύτταρα Σαλιγκάρι-Panc-1 καλλιεργήθηκαν σε 3D γέλη κολλαγόνου για 7 ημέρες, όπως περιγράφεται στο Σχήμα 5. Μετά την επώαση, ο σχετικός αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ μέτρησης κυττάρων Dojindo 8.

Συζήτηση

σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε τα μοντέλα ΕΜΤ τριών κυτταρικές σειρές καρκινώματος ανθρώπου (Α549, Panc-1 και ΜΚΝ-1) για τον χαρακτηρισμό των ΕΜΤ-επαγόμενα κύτταρα σε συστήματα καλλιέργειας τόσο 2D και 3D . Σε συμφωνία με άλλες μελέτες [16], [17], Α549 και Panc-1 κύτταρα παρουσίασαν τυπικό φαινοτύπων EMT μετά τη θεραπεία με TGF-β και μόνο σε καλλιέργειες μονοστοιβάδας 2D. κύτταρα ΜΚΝ-1 που απαιτείται ΤΟΡ-β συν TNF-α σε μέσο άνευ ορού για επαγωγή ΕΜΤ όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [11], αλλά μόνο ΤΟΡ-β απαιτήθηκε σε μέσο που περιέχει ορό. Η έκφραση των δύο δεικτών εισβολή λαμινίνης γ2 και ΜΤ1-ΜΜΡ συνδέθηκε με την επαγωγή EMT αυτών των κυτταρικών σειρών. Ωστόσο, η έκφραση της ΜΜΡ-9 και του γ2 λαμινίνης ήταν πολύ μεγαλύτερη με ΤΟΡ-β συν TNF-α από ό, τι μόνο του ΤΟΡ-β [11]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η απόκτηση του διηθητικού φαινοτύπους των καρκινικών κυττάρων απαιτεί ΤΝΡ-α ή /και άλλους παράγοντες εκτός ΤΟΡ-β, ακόμη και αν ΤΟΡ-β και μόνο είναι αρκετό για την επαγωγή μορφολογικών ΕΜΤ.

Η παρούσα μελέτη αποκάλυψε ότι ΕΜΤ-επαγόμενα κύτταρα Α549 πιο αποτελεσματικά προσκολλάται στο στρωματικών κυττάρων υποστρώματα προσκόλλησης φιμπρονεκτίνη και κολλαγόνο τύπου Ι από μη επαχθέντα κύτταρα ελέγχου, αν και η προσκόλληση των κυττάρων στο υπόστρωμα βασικής μεμβράνης λαμινίνη-332 δεν άλλαξε από την επαγωγή EMT. Αυτό είναι συνεπές με το γεγονός ότι η έκφραση πρωτεϊνών εξωκυτταρικής μήτρας στρωματικά όπως ινονεκτίνη και τύπου Ι κολλαγόνο ενισχύεται από επαγωγή EMT [16]. Επιβεβαιώσαμε επίσης την αυξημένη παραγωγή φιμπρονεκτίνης στις ΕΜΤ-επαγόμενα κύτταρα σε 2D καλλιέργεια (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Είναι ιδιαίτερα Αναμένεται ότι η EMT επαγόμενη μεταβολή της δραστικότητας προσκόλλησης κυττάρου εξαρτάται από εκείνο της ιντεγκρίνης έκφρασης. Επιπλέον, δείξαμε ότι τα δυναμικά κυτταρική μετανάστευση από τις τρεις κυτταρικές σειρές σε καλλιέργεια 2D αυξήθηκαν σημαντικά κατά την επαγωγή EMT, σε συμφωνία με τα αποτελέσματα για Panc-1 κύτταρα αναφέρονται από Horiguchi et al. [17]. Αυτές οι φαινοτυπικές αλλαγές, οι οποίες συνάδουν με τη γενική έννοια του EMT, φαίνεται να απαιτείται για τον καρκίνο των κυττάρων εισβολής μέσα από ενδιάμεσους ιστούς του στρώματος.

Η παρούσα μελέτη αποκάλυψε μεγάλες διαφορές στις φαινοτύπους του EMT που προκαλείται από τα καρκινικά κύτταρα μεταξύ 2D και 3D πολιτισμούς.