Αφηρημένο

Ιστορικό

μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου στην αστάθεια μικροδορυφόρου υψηλή (MSI-High ) του παχέος εντέρου είναι μια πιθανή πηγή της στόχευσης, νεο-αντιγόνα. Πολλές μεταγραφές ανοησίες υπόκεινται σε ταχεία υποβάθμιση λόγω ανοησίες μεσολάβηση αποσύνθεσης (NMD), αλλά μεταγραφές ανοησίες με ένα CMS στο τελευταίο εξόνιο ή κοντά στην τελευταία διασταύρωση εξόνιο-εξόνιο έχουν εγγενή αντίσταση σε ανοησία τη μεσολάβηση αποσύνθεσης (NMD). NMD ανθεκτικά μεταγραφές είναι επομένως μια πιθανή πηγή εκφράζονται μεταλλαγμένων πρωτεϊνών σε MSI-High όγκων.

Μέθοδοι

Χρησιμοποιώντας αντισώματα κατά του διατηρημένη Ν-άκρα της προβλεπόμενης μεταλλαγμένες πρωτεΐνες, αναλύσαμε MSI-High καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές για παραδείγματα φυσικώς εκφράζονται μεταλλαγμένων πρωτεϊνών που προκύπτουν από μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου στην κωδικοποίηση μικροδορυφόρων (CMS) με ανοσοκαταβύθιση και πειράματα Western Blot. Εντοπίστηκε μεταλλαγμένη πρωτεΐνη συγκροτήματα από NMD ανθεκτικά μεταγραφές περαιτέρω επικυρωθεί από ειδική γονιδιακή μικρής παρεμβολής RNA (siRNA) νοκ ντάουν. Μια αναζήτηση γονιδιώματος σε επίπεδο διεξήχθη για να προσδιορίσει CMS που περιέχουν γονίδια που ενδέχεται να δημιουργήσει NMD ανθεκτικά μεταγραφές που θα μπορούσαν να κωδικοποιούν αντιγονικές εκφράζονται μεταλλαγμένες πρωτεΐνες σε MSI-High καρκίνων του παχέος εντέρου. Αυτά τα γονίδια εξετάστηκαν για CMS μεταλλάξεις στις καρκινικές κυτταρικές σειρές MSI-High κόλον.

Αποτελέσματα

Μεταλλαγμένα ζώνες πρωτεΐνης του αναμενόμενου μοριακού βάρους ανιχνεύθηκαν σε μεταλλαγμένα MSI-High κυτταρικές γραμμές για NMD ανθεκτικά μεταγραφές (CREBBP, EP300, TTK), αλλά όχι NMD ευαίσθητα μεταγραφές (ΒΑΧ, CASP5, MSH3). Έκφραση του μεταλλαγμένου CREBBP και πρωτεΐνες EP300 επιβεβαιώθηκε από siRNA νοκ ντάουν. Πέντε CMS που φέρουν γονίδια που εντοπίστηκαν από την έρευνα του γονιδιώματος-ευρεία και χωρίς τα υπάρχοντα δεδομένα μετάλλαξη (SFRS12IP1, MED8, ASXL1, FBXL3 και RGS12) βρέθηκαν να μεταλλαχθεί σε τουλάχιστον 5 από 11 (45%) των MSI-High κυτταρικές σειρές δοκιμαστεί.

Συμπέρασμα

NMD ανθεκτικά μεταγραφές μπορεί να οδηγήσει σε εκφράζεται μεταλλαγμένες πρωτεΐνες στα κύτταρα του καρκίνου MSI-High παχέος εντέρου. Αν συνήθως εκφράζεται σε πρωτογενή MSI-High καρκίνους του παχέος εντέρου, MSI που προέρχονται από μεταλλαγμένες πρωτεΐνες θα μπορούσαν να είναι χρήσιμα ως καρκίνο ειδική ανοσολογική στόχους σε ένα εμβόλιο στοχεύει MSI-High παχέος όγκους

Παράθεση:. Ουίλιαμς DS, Bird MJ, Jorissen RN , Yu YL, Walker F, Zhang HH, et al. (2010) Ανοησίες Mediated Decay Ανθεκτικό μεταλλάξεις αποτελούν πηγή Εκφράζεται Μεταλλαγμένων Πρωτεϊνών σε Colon Cancer Cell Lines με αστάθεια μικροδορυφόρου. PLoS ONE 5 (12): e16012. doi: 10.1371 /journal.pone.0016012

Επιμέλεια: Ben C. Β Κω, Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 24 Αυγούστου, 2010? Αποδεκτές: 3 Δεκεμβρίου του 2010? Δημοσιεύθηκε: 31 Δεκεμβρίου 2010

Copyright: © 2010 Williams et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από NHMRC πρόγραμμα επιχορήγησης αριθμό 487922. υποστήριξη χρηματοδότηση για το έργο αυτό επίσης παρέχεται από ένα CASS (Συμβολή στην αυστραλιανή Υποτροφιών & amp? Science) Ίδρυμα Επιστημών και Ιατρικής Grant (DSW, AWB, ΕΔΑ), ο καρκίνος του Συμβουλίου Βικτόρια (EN) και Royal College of Παθολόγοι της Αυστραλασία Kitamura /Βραβείο Kanematsu Memorial και Τεχνικής βοήθειας Grant (DSW). Το έργο αυτό υποστηρίζεται επίσης από πόρους του Επιχειρησιακού Προγράμματος Ενίσχυσης Υποδομής που παρέχονται από την κυβέρνηση της Βικτώρια, Αυστραλία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Περίπου το 15% του παχέος εντέρου, του στομάχου και του ενδομητρίου καρκίνων έχουν ελαττωματική επισκευή ασυμφωνία DNA και υψηλού επιπέδου αστάθειας μικροδορυφορικού (MSI-High) [1], [2]. Οι περισσότεροι MSI-High όγκοι προκύπτουν από σποραδικές υπερμεθυλίωση του γονιδίου υποκινητή MLH1 [3], αλλά μετάλλαξη ενός ενζύμου DNA επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων είναι η υποκείμενη ελάττωμα σε περιπτώσεις κληρονομικής μη πολυποδίαση ορθοκολικό καρκίνο (HNPCC) [4]. Όγκοι με MSI έχουν μια μορφή γενετικής αστάθειας που εκδηλώνεται ως πλαισίου μεταλλάξεις σε επαναλαμβανόμενες μικροδορυφορικού αλληλουχίες του DNA [1]. Μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου στην κωδικοποίηση μικροδορυφόρων (CMS) μεταβάλλουν το πλαίσιο ανάγνωσης γενετική και στις περισσότερες περιπτώσεις κωδικοποιούν κολοβωμένες πρωτεΐνες με μοναδικές Ο-τερματικές αλληλουχίες πρωτεΐνης.

Μια ενδιαφέρουσα παθολογικό χαρακτηριστικό της MSI-High παχέος εντέρου είναι μία τάση να έχουν αύξηση του αριθμού των διηθητικών λεμφοκυττάρων όγκου (TILs) σε σχέση με το MSI-Low και μικροδορυφορικών σταθερές (MSS) όγκους [5]. Η TILs σε MSI-High όγκοι ενεργοποιούνται CD8 + κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα (CTLs) [6], κατάλληλη για την αναγνώριση ενδοκυτταρική πεπτίδια όπως MSI προερχόμενο νεο-αντιγόνα, που παρουσιάστηκε από τα μόρια HLA τάξης Ι. Μια MSI-High φαινότυπο και αυξημένη TILs σε καρκίνο του παχέος εντέρου υποδηλώσει μια καλύτερη φάση-συμφωνημένα πρόγνωση σε σχέση με το MSI-Χαμηλή ή MSS όγκους [7], [8]. Αυτό το πλεονέκτημα επιβίωσης μπορεί να αντανακλά ένα προστατευτικό όφελος του ανοσοποιητικού διηθήματος [9].

Συνθετικά πεπτίδια που αντιστοιχούν σε μεταλλαγμένες πρωτεΐνες προβλέπεται να προκύψουν από MSI-συνδέονται οι μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου έχει δειχθεί ότι είναι ανοσογόνος. Κατά την τελευταία δεκαετία, κυτταροτοξικών Τ-λεμφοκυττάρων (CTL) αποκρίσεις έχουν περιγραφεί κατά HLA-A2 πεπτίδια που προκύπτουν από μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου στην Α10 CMS του TGFBR2 [10], [11], η Α10 CMS του CASP5 [12], το T10 δέσμευσης CMS της OGT [13] και πρόσφατα το T15 CMS του U79260 (FTO) [14]. Οι CTL αποκρίσεις σε μεταλλαγμένες πρωτεΐνες έχουν ανιχνευθεί σε ασθενείς με MSI συνδέονται καρκίνων του παχέος εντέρου και σε υγιείς φορείς HNPCC-μετάλλαξη, αυξάνοντας την πιθανότητα του προστατευτικού ανοσοεπιτήρηση στην τελευταία πληθυσμού [15].

Υπάρχουν δημοσιεύεται διαθέσιμα στοιχεία μετάλλαξης για τουλάχιστον 1522 κωδικοποίησης μονονουκλεοτίδης μικροδορυφόρων από 460 γονίδια σε MSI-High παχέος εντέρου [16]. Υπάρχει συσχέτιση μεταξύ του μήκους CMS και του ρυθμού μετάλλαξης. Γονίδια με μεταλλάξεις CMS είναι πιθανές πηγές δυνατότητα στόχευσης πρωτεϊνών για τις στρατηγικές του ανοσοποιητικού θεραπεία. Δεδομένου ότι οι μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου επηρεάζουν CMS επαναλήψεις με προβλέψιμο τρόπο, οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες που παράγονται είναι πιθανό να διατηρούνται σε έναν πληθυσμό ασθενών με MSI-High καρκίνων του παχέος εντέρου [17], [18]. Παρά το γεγονός ότι κανείς δεν μεταλλαγμένο μεταγραφής είναι κοινή σε όλες MSI-High όγκων, ένα εμβόλιο που στοχεύει ένα σύνολο συνήθως μεταλλαγμένες πρωτεΐνες μπορεί να είναι μια αποτελεσματική θεραπεία για MSI-High καρκίνων του παχέος εντέρου. Υπάρχει ανάγκη για νέες θεραπείες κατά της MSI-High καρκίνους του παχέος εντέρου, αφού πολλαπλές μελέτες έχουν δείξει ότι αυτές οι όγκοι να είναι ανθεκτικά σε χημειοθεραπευτικά πρότυπο όπως 5-φθοριοουρακίλη [19], [20], [21].

Η ύπαρξη του MSI προερχόμενων μεταλλαγμένες πρωτεΐνες έχει συναχθεί με ανοσολογικές μελέτες, αλλά υπάρχει έλλειψη δημοσιευμένων δεδομένων σχετικά με την άμεση ανίχνευση των προβλεπόμενων MSI προερχόμενων μεταλλαγμένες πρωτεΐνες. Οι αναλύσεις στυπώματος Western έχουν δημοσιευθεί στις οποίες ανιχνεύτηκαν δυναμικό μεταλλαγμένη ζώνες πρωτεΐνης για την CREBBP, EP300 [22] και τα γονίδια MBD4 [23], αλλά δεν υπήρξε καμία επικύρωση των ζωνών αυτών. Επιβεβαιώνοντας την έκφραση των μεταλλαγμένων πρωτεϊνών σε MSI-High όγκοι είναι σημαντικό, αν αυτά είναι για να είναι επιτυχής θεραπευτικοί στόχοι για ένα εμβόλιο. Σταθερή έκφραση μεταλλαγμένων πρωτεϊνών που διευκολύνει την εγκάρσια παρουσίαση των αντιγόνων όγκου από επαγγελματίες αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα και διεγείρει μια απόκριση Τ βοηθού είναι πιθανό να παρέχουν ανώτερη ανοσία κατά του όγκου [18]. Ωστόσο, τα περισσότερα μεταλλαγμένα μεταγραφές που παράγονται από MSI στόχο για ταχεία αποικοδόμηση από ανοησίες μεσολάβηση αποσύνθεσης (NMD) [24], [25] και με την απουσία παρέμβασης, σε λίγο δεν στόχευσης, μεταλλαγμένη πρωτεΐνη θα παράγεται από αυτές τις παρεκκλίνουσα μεταγραφές [24 ].

Σε αυτή τη μελέτη έχουμε εντοπιστεί τρεις MSI που προέρχονται από μεταλλαγμένες πρωτεΐνες, οι οποίες προκύπτουν από την NMD ανθεκτικά μεταγραφές. Μετά από αναζήτηση γονιδίωμα κλίμακα για επιπλέον NMD ανθεκτικά μεταγραφές, CMS που περιέχουν γονίδια υποβλήθηκαν σε διαλογή για μεταλλάξεις σε ένα πάνελ καρκινικών κυτταρικών γραμμών 11 MSI-High κόλον. Γονίδια επιλέχθηκαν για ανάλυση μετάλλαξης με βάση πιθανό υψηλή συχνότητα μετάλλαξης (ανάλογα με τη διάρκεια CMS), πιθανόν ανοσογονικότητα (με βάση την μεταλλαγμένη C-άκρο μήκος αμινοξύ) και πιθανόν έκφραση σε καρκίνο του παχέος εντέρου (με βάση τα δεδομένα των γονιδίων και έκφραση πρωτεΐνης όπου είναι διαθέσιμα ). Κοινώς μεταλλαγμένο NMD ανθεκτικά μεταγραφές αξιολογήθηκαν για πιθανά HLA-A * 0201 επίτοποι CTL χρησιμοποιώντας

in silico

έξυπνη λογισμικό, SYFPEITHI [26], για σύγκριση με το MSI-προερχόμενο επιτόπων ήδη δειχθεί ότι είναι ανοσογόνος

σε vitro

.

τα αποτελέσματά μας επιβεβαιώνουν ότι NMD ανθεκτικά μεταγραφές να προκαλέσει εξέφρασε μεταλλαγμένες πρωτεΐνες και επίσης δείχνουν ότι συχνά εμφανιζόμενων πλαισίου μεταλλάξεις που δημιουργούν NMD ανθεκτικά μεταγραφές αποτελούν μια πολλά υποσχόμενη πηγή των αντιγόνων δυνατότητα στόχευσης του όγκου σε MSI- καρκίνους του παχέος εντέρου υψηλή. Μια σειρά από κοινά εκφράζεται μεταλλαγμένες πρωτεΐνες έχει τη δυνατότητα να αποτελέσει τη βάση για ένα πολυδύναμο εμβόλιο ή ανοσοθεραπευτική στόχευση MSI-High όγκους.

Αποτελέσματα

MSI-High κόλον καρκινικές κυτταρικές σειρές λιμάνι πλαισίου μεταλλάξεις σε πολλαπλές CMS

η διαλογή των γραμμών καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων για παρεκκλίνουσα πρωτεΐνες επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων του DNA έκφρασης αποκάλυψε ένα παθολογικό φαινότυπο σύμφωνο με MSI σε 11 από 17 κυτταρικές σειρές (Πίνακας 1). Οι κυτταρικές γραμμές αξιολογούνται για μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου σε μια επιλογή των γονιδίων με CMS έχουν αναφερθεί στο παρελθόν για την ανάπτυξη μεταλλάξεων στο MSI-High καρκίνων του παχέος εντέρου. Πολυάριθμες μεταλλάξεις συμβαδίζει με μια MSI-High φαινότυπο ανιχνεύθηκαν σε κάθε κυτταρική σειρά με έκτροπη έκφραση επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων του DNA με ανοσοϊστοχημεία, αλλά λίγοι μεταλλάξεις αν υπάρχουν ανιχνεύθηκαν στα υπόλοιπα κυτταρικές σειρές (Πίνακας 2, Πίνακας S1). Διαγραφή του 1 ζεύγος βάσεων DNA ήταν η πιο κοινή μετάλλαξη, αντιπροσωπεύοντας το 82% (214/262) των μεταλλάξεων που παρατηρήθηκαν στη μελέτη αυτή (πιθανή διαλληλόμορφο μεταλλάξεις υπολογίζονται ως 2 μεταλλάξεις). Οι περισσότερες μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου κωδικοποιούν κολοβωμένες πρωτεΐνες χαμηλότερου μοριακού βάρους με ένα μεταλλαγμένο C-άκρο (Πίνακας 3).

Η

Η

Ανιχνεύσιμες MSI προερχόμενο μεταλλαγμένες πρωτεΐνες εκφράζονται από NMD ανθεκτικά μεταγραφές

για την ανίχνευση εκφράζεται μεταλλαγμένες πρωτεΐνες, θα αγοράσει αντισώματα προς το διατηρημένη Ν-τερματικό τμήμα των επιλεγμένων πρωτεϊνών. Μελετήσαμε αρχικά μια επιλογή από τα κοινά μεταλλαγμένα γονίδια αναφέρεται ότι είναι εν δυνάμει «γονίδια στόχους» [1]. πειράματα στυπώματος Western σε λύματα και ανοσοϊζήματα των γονότυπου κυτταρικές σειρές που προσδιορίζονται ζώνες πρωτεϊνών που αντιστοιχούν στο αναμενόμενο μοριακό βάρος για τη φυσιολογική ΒΑΧ πλήρους κυττάρου (Σχήμα 1), MSH3 και CASP5 πρωτεΐνες (αδημοσίευτα δεδομένα) σε κυτταρικές σειρές με μη μεταλλαγμένα αλληλόμορφα αυτών των γονιδίων . Ωστόσο, δεν μεταλλαγμένη ζώνες πρωτεϊνών ανιχνεύθηκαν για οποιοδήποτε από αυτά τα γονίδια. Στην περίπτωση του ΒΑΧ δημιουργήσαμε πολυκλωνικά αντισώματα κουνελιού σε ένα συνθετικό πεπτίδιο που αντιστοιχεί στην μεταλλαγμένη Ο-άκρο. Αυτά τα αντισώματα παρουσίασαν ειδική σύνδεση με συνθετικό μεταλλαγμένο πεπτίδιο σε Biacore, ELISA και προσδιορισμούς στυπώματος Western, αλλά δεν ανίχνευσε μία μεταλλαγμένη πρωτεϊνική ζώνη ΒΑΧ σε προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου ή ανοσοκαταβύθισης του ΒΑΧ μεταλλαγμένες κυτταρικές γραμμές (μη δημοσιευμένα δεδομένα). Μεταλλάξεις σε ΒΑΧ, MSH3 και CASP5 όλες κωδικοποιούν για NMD-ευαίσθητα (NMD-S) μεταλλαγμένο μεταγραφές? μεταλλαγμένο ΒΑΧ και MSH3 είναι γνωστό ότι είναι ευαίσθητα σε αποδόμηση [27]. NMD-ευαισθησίας θα μπορούσε να εξηγήσει την αδυναμία μας να διαπιστωθούν τυχόν μεταλλαγμένες πρωτεΐνες που προκύπτουν από αυτά τα τρία γονίδια, αν και μη φυσιολογική πρωτεΐνη αναδίπλωση με την απώλεια των επιτόπων αντισώματος μπορεί επίσης να είναι ένας παράγοντας.

(Α) πρωτεΐνη Κανονική ΒΑΧ (21 kDa , βέλος), αλλά καμία μεταλλαγμένη πρωτεΐνη ΒΑΧ (προβλεπόμενη 6,4 kDa) ανιχνεύθηκε σε στύπωμα Western αναλύσεις σε κυτταρολύματα κυτταρικών σειρών καρκίνου του παχέος εντέρου σύνολο. Οι κυτταρικές σειρές με την κατάσταση μετάλλαξης ΒΑΧ G8 CMS: 1. LoVo (-1, +1), 2. SW480 (κ.β.), 3. HCA7 (-1, κβ), 4. LS174T (-1), 5. HCT116 (- 1, κ.β.), 6. HeLa (wt), 7. LIM1215 (-1). (Β) Ομόζυγος -1 βάσης μετάλλαξη στο CMS της G8 στη LS174T κυτταρική σειρά (επάνω) σε σύγκριση με μη-μεταλλαγμένη κυτταρική γραμμή, SW1222 (κάτω) (αναστροφή της αλληλουχίας του DNA). πρωτεΐνη (C) Κανονική ΒΑΧ (βέλος), αλλά καμία μεταλλαγμένη πρωτεΐνη ΒΑΧ ανιχνεύεται με ανοσοκαταβύθιση: 1. HeLa (wt), 2. LS174T (-1). IgG ελαφριά αλυσίδα στα 25 kDa.

Η

Για το λόγο αυτό προσπάθησε να ανιχνεύσει μεταλλαγμένες πρωτεΐνες που προκύπτουν από την NMD ανθεκτικά (NMD-R) μεταγραφές. Προηγουμένως δημοσιευθέντα δεδομένα κηλίδας Western έδειξε δυναμικό μεταλλαγμένη πρωτεΐνη μπάντες του CREBBP και EP300 γονίδια, το καθένα που προκύπτουν από μία ετερόζυγο (-1, άγριου τύπου) μετάλλαξη μετατόπισης πλαισίου ενός 5 mer CMS επαναλαμβάνει το τελευταίο εξόνιο, ανιχνεύεται στο LoVo (CREBBP) και HCT116 (EP300) κυτταρικές γραμμές αντίστοιχα [22]. Επιβεβαιώσαμε την παρουσία αυτών των μεταλλάξεων σε LoVo και HCT116 κυτταρικές γραμμές με PCR και αλληλούχιση του DNA. Αυτές CMS δεν μεταλλάχθηκαν σε οποιαδήποτε από τις άλλες MSI-High ή MSS κυτταρικές γραμμές. Συγκροτήματα που αντιστοιχούν στα αναμενόμενα μοριακά βάρη της κανονικής CREBBP και πρωτεΐνη EP300 ανιχνεύθηκαν με συνέπεια σε αναλύσεις Western blot μη μεταλλαγμένη κυτταρικές σειρές. Διαπιστώσαμε ανώμαλη ζώνες πρωτεϊνών που αντιστοιχούν στα αναμενόμενα μοριακά βάρη των μεταλλαγμένων CREBBP και μεταλλαγμένα EP300 στην LoVo και HCT116 κυτταρικές γραμμές αντίστοιχα σε κηλίδες Western σε λύματα ολόκληρων κυττάρων (Σχήμα 2) και επί ανοσοϊζήματα (Σχήμα S1). κηλίδα μας ταίριαζαν με τα προηγούμενα δημοσιευμένα δεδομένα για EP300 [22]. Τα δεδομένα πριν CREBBP συμφωνημένα μια περιοχή μη-ειδικές ζώνες σε κηλίδα μας, αλλά ζώνες πρωτεΐνης του κατάλληλου μοριακού βάρους ήταν επίσης παρούσα σε κηλίδες μας. Οι ζώνες CREBBP ανιχνεύθηκαν επίσης σε πειράματα όπου ένα αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε για την ανοσοκατακρήμνιση και ενός αντισώματος σε ένα διαφορετικό επίτοπο CREBBP χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση.

ανιχνεύθηκαν Κανονική πρωτεΐνες (λευκό βέλος) και μεταλλαγμένες πρωτεΐνες (μαύρο βέλος) σε Western Blot αναλύσεις σε προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου για το (Α) CREBBP και (Β) EP300. (Α) CREBBP C5 CMS: 1. SW480 (wt), 2. LoVo (-1, wt), 3. HCT116 (wt), 4. LIM1215 (wt), 5. LS174T (κ.β.). MW (kDa): βάρος 265, mut 209. (Β) EP300 A5 CMS: 1. LoVo (wt), 2. HCT116 (-1, wt), 3. HCA7 (wt), 4. LIM1215 (wt), 5 . LS174T (κ.β.). MW (kDa): βάρος 223, mut 187.

Η

Επικύρωση οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες

Για την επιβεβαίωση της ταυτότητας των ανώμαλη πρωτεϊνικών ζωνών και να αποδείξει ότι αυτά αποτελούν γνήσια παραδείγματα των αναμενόμενων μεταλλαγμένες πρωτεΐνες, αρχικά πραγματοποιείται διαδοχική φασματομετρία μάζας για ανοσοϊζήματα από τις κυτταρικές σειρές. Αυτή η τεχνική επιβεβαίωσε την ταυτότητα του κανονικού CREBBP και πρωτεϊνικές ζώνες EP300 (Σχήμα S1), επιβεβαιώνοντας έτσι την εξειδίκευση των αντισωμάτων που χρησιμοποιούνται. Οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες δεν ανιχνεύθηκαν με τη μέθοδο αυτή, πιθανώς λόγω συν-ανοσοκαταβύθιση των πιο άφθονες πρωτεΐνες παρόμοιου μοριακού βάρους όπως MYH9 (μη δημοσιευμένα δεδομένα). Η εξειδίκευση των μεταλλαγμένων πρωτεϊνικών ζωνών επιβεβαιώθηκε αντί με τη χρήση μικρών RNA παρεμβολής (siRNA) για την εκτέλεση συγκεκριμένων γονιδίων knockdowns του μεταλλαγμένου CREBBP και πρωτεΐνες EP300. Μειωμένη έκφραση της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης CREBBP σε σχέση με μη επιμολυσμένα και μη-στοχευμένη ελέγχους συσχετίζεται με μία σημαντική μείωση σε στοχευόμενο mRNA, επιβεβαιώθηκε με qRT-PCR (Σχήμα 3). Knockdown της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης EP300 παρομοίως αποδείχθηκε σε ανοσοϊζήματα (Σχήμα 4). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι οι μη φυσιολογικές ζώνες πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν είναι μεταλλαγμένες παραλλαγές των πρωτεϊνών CREBBP και EP300. Αυτό το εύρημα υποδεικνύει ότι ορισμένα MSI προερχόμενο μεταλλαγμένες πρωτεΐνες εκφράζονται φυσικά σε ανιχνεύσιμα επίπεδα.

Ιδιαιτερότητα της μεταλλαγμένης ζώνη πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε με ειδική γονιδιακή knockdown σε επιμολυντές του siRNA CREBBP στόχευσης. (Α) Ανίχνευση μεταλλαγμένων πρωτεϊνική ζώνη (μαύρο βέλος) σε κυτταρικά λύματα της κυτταρικής σειράς LoVo σύνολό της, αλλά φυσιολογική πρωτεΐνη μόνο (λευκό βέλος) σε μη-μεταλλαγμένη κυτταρική γραμμή SW480. (Β) Western Blot ολόκληρων κυτταρικών λυμάτων LoVo από siRNA SMARTpool επιμολύνσεις δείχνουν μειωμένη έκφραση του φυσιολογικού (λευκό βέλος) και μεταλλαγμένων (μαύρο βέλος) ζώνη πρωτεΐνης CREBBP σε CREBBP στόχευσης λύματα (λωρίδα 1). ελέγχου βήτα-κατενίνης φόρτωσης (γκρι βέλος) 92 kDa. (C) Σχετική ένταση της κανονικής (μπλε) και μεταλλαγμένων (κόκκινο) πρωτεΐνη CREBBP συγκροτήματα σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα κύτταρα (PBS). (D) Μειωμένη έκφραση CREBBP mRNA σε CREBBP siRNA επιμολύνσεων (αριστερή λωρίδα) σε σχέση με μη επιμολυσμένα κύτταρα (δεξιά λωρίδα).

Η

Ιδιαιτερότητα της μεταλλαγμένης ζώνη πρωτεΐνης επιβεβαιώνεται με γονιδίου-ειδική νοκ ντάουν σε επιμολύνσεις του siRNA που στοχεύει EP300. (Α) δεδομένα qRT-PCR για την αξιολόγηση siRNAs που στοχεύουν EP300 (καλύτερα νοκ ντάουν χρησιμοποιώντας P300-1 και P300-3). (Β-Ο) μειώθηκαν μεταλλαγμένης πρωτεΐνης EP300 ανιχνεύθηκε σε στύπωμα Western αναλύσεις σε ανοσοϊζήματα της EP300 siRNA επιμόλυνσης σε σχέση με μη επιμολυσμένα μάρτυρες (PBS).

Η

Ανίχνευση επιπλέον δυνατότητες μεταλλαγμένης ζώνες πρωτεΐνης

σε περαιτέρω πειράματα Western Blot (Σχήμα 5), μεταλλαγμένες πρωτεϊνικές ζώνες TTK ανιχνεύθηκαν σε πολλαπλές μεταλλαγμένη κυτταρικές γραμμές σε ελαφρώς υψηλότερο μοριακό βάρος (101 kDa) από μη μεταλλαγμένο TTK πρωτεΐνη (97 kDa), συμφωνεί με το προβλεπόμενο μέγεθος (Πίνακας 3) . Προσπάθειες siRNA νοκ ντάουν των μεταλλαγμένων TTK παρεμποδίστηκαν από δυσκολία στην επίλυση των μεταλλαγμένων και κανονικές ζώνες πρωτεΐνης. Μια ζώνη AIM2 ανιχνεύθηκε σε περίπου 46 kDa σε κηλίδες Western επί ανοσοϊζήματα από λύματα ολόκληρων κυττάρων, συνεπής το μέγεθος ανιχνεύθηκε σε προηγούμενες μελέτες που χρησιμοποιούν αυτό το αντίσωμα [28]. AIM2 πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε σε πολλαπλά μη μεταλλαγμένο κυτταρικές γραμμές και επίσης σε ομόζυγη AIM2 μεταλλαγμένα κύτταρα LoVo. Οι μεταλλαγμένες και άγριου τύπου πρωτεΐνες AIM2 είναι παρόμοιου προβλεπόμενα μοριακά βάρη (39 kDa και 40 kDa αντίστοιχα). Επειδή NMD ανθεκτικά μεταγραφές έχουν συχνά μια CMS στο τελευταίο εξόνιο πλησίον του Ο-άκρου, μεταλλαγμένες πρωτεΐνες συχνά θα είναι παρόμοιου μεγέθους με φυσιολογικές πρωτεΐνες. Το γεγονός αυτό καθιστά την επικύρωση αυτών των μεταλλαγμένων ζωνών πρωτεΐνης με τεχνικές που χρησιμοποιούνται για την επιβεβαίωση της CREBBP και EP300 μπάντες πιο δύσκολη.

(Α) κηλίδα Western αναλύσεις σε προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου εντόπισε μπάντα δυναμικό μεταλλαγμένη πρωτεΐνη TTK (μαύρο βέλος) σε πολλαπλές μεταλλαγμένες κυτταρικές σειρές και φυσιολογική πρωτεΐνη TTK (λευκό βέλος) μόνο σε μη-μεταλλαγμένες γραμμές: 1. LIM1863 (κ.β.), 2. HCA7 (κ.β.), 3. LIM1899 (-1, κβ), 4. HCT116 (-1, κ.β. ), 5. LoVo (-1, wt), 6. LIM2537 (-1, wt), 7. LIM2551 (-1, κ.β.). TTK MW (kDa): βάρος 97, mut 101. (Β) κηλίδα Western αναλύσεις σε ανοσοϊζήματα από λύματα ολόκληρων κυττάρων προσδιορίσει μια ζώνη πρωτεΐνης AIM2 (μαύρο βέλος) σε όλες τις κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένης της ομόζυγο μεταλλαγμένο LoVo κυτταρική σειρά: 1. SW480 ( κβ), 2. LoVo (-1), 3. HCT116 (-1, κ.β.). 4, LS174T (κ.β.). AIM2 MW (kDa):. Κβ 39.0, mut 40,4

Η

Μεταλλαγμένα ζώνες πρωτεΐνης δεν ανιχνεύθηκαν για όλα NMD ανθεκτικά μεταγραφές αξιολογηθεί. Στην περίπτωση των ACVR2A, ζώνες πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν στο αναμενόμενο μοριακό βάρος, τόσο για την κανονική και μεταλλαγμένη πρωτεΐνη, αλλά κατά μη ειδικό τρόπο που δεν συσχετίζονται με τα δεδομένα μετάλλαξη. Πολλαπλές ζώνες πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν σε στυπώματα για TCF7L2, ένα γονίδιο με πολυάριθμες εναλλακτικά ματισμένες μεταγραφές [29], αλλά δεν μεταλλαγμένες πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν που συσχετίζονται με τα δεδομένα μετάλλαξη.

Genome ολόκληρη αναζήτηση για NMD ανθεκτικά μεταγραφές ως μια πηγή δυνατότητα στόχευσης πρωτεϊνών

Αφού διαπιστώθηκε ότι NMD ανθεκτικά μεταγραφές μπορεί να οδηγήσει σε εκφράζεται MSI που προέρχονται από μεταλλαγμένες πρωτεΐνες, επιδιώξαμε να προσδιορίσει πρόσθετα γονίδια CMS που περιέχουν πιθανό να δημιουργήσει εκφράζεται μεταλλαγμένες πρωτεΐνες σε MSI-High καρκίνων του παχέος εντέρου ότι θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως θεραπευτικοί στόχοι. Χρησιμοποιώντας ένα βιοπληροφορικής στρατηγική, πραγματοποιήσαμε μια έρευνα του γονιδιώματος κλίμακα για CMS που περιέχουν γονίδια που βασίζονται σε κριτήρια προβλέπεται ότι κωδικοποιεί για την NMD-άσχετη μετάλλαξη μεταγραφές [24], το οποίο είναι εγγενώς NMD ανθεκτικά (Πίνακας S2). Εντοπίσαμε 1511 μη απολυμένους μονονουκλεοτιδίου CMS επαναλαμβάνει ≥7 mer σε μήκος (συμπεριλαμβανομένων των υποθετικών γονιδίων) προβλέπεται να δημιουργήσει NMD ανθεκτικά μεταλλαγμένα μεταγραφές. Αυτό συγκρίνεται με 17.654 μονονουκλεοτίδιο CMS (≥6 mer) προσδιορίζονται (ανεξάρτητα από το NMD κατάσταση) σε μια προηγούμενη μελέτη [17].

επιλέχθηκαν Γονίδια για ανάλυση μετάλλαξης CMS με βάση τα κριτήρια επιλογής ενδέχεται να είναι σημαντική για την χρησιμότητα ως στόχευσης πρωτεϊνών. Εμείς περιόρισε τη μελέτη στο 316 μονονουκλεοτίδιο CMS επαναλαμβάνει ≥8 mer σε μήκος, δεδομένου ότι υπάρχει ένας συσχετισμός ανάμεσα στο μήκος μικροδορυφορικών και πιθανή συχνότητα μετάλλαξης. Σημαντικά ποσοστά μετάλλαξης (& gt? 40%) έχουν αναφερθεί για περίπου 8 επαναλήψεις mer [16]. Γονίδια με μικρή προβλεπόμενη νεο-C-τερματικές αλληλουχίες πρωτεΐνης (& lt? 10 αμινοξέα) αποκλείστηκαν, καθώς αυτά είναι απίθανο να παράγουν χρήσιμα επιτόπια Τ κυττάρων για μια σειρά κοινών τύπων HLA, όπως απαιτείται για να ξεπεραστεί MHC περιορισμού. Εξαιρουμένων των υποθετικών γονιδίων (πρόθεμα LOC ​​ή KIAA), 179 CMS που περιέχουν γονίδια εκπλήρωσε τα κριτήρια επιλογής μας (Πίνακας S3). Αποδεικτικά στοιχεία για την έκφραση της πρωτεΐνης σε καρκίνους του παχέος εντέρου από τις προεπιλεγείσες γονιδίων Ζητήθηκε επίσης ως πρόσθετο κριτήριο επιλογής για να υποδείξει πιθανή έκφραση των μεταλλαγμένων πρωτεϊνών. Η ανθρώπινη πρωτεΐνη Atlas [30] περιλαμβάνει την έκφραση της πρωτεΐνης που δείχνει στοιχεία του παχέος εντέρου με ανοσοϊστοχημεία. Ωστόσο, τα δεδομένα αυτά δεν είναι διαθέσιμη για πολλά γονίδια, λόγω εξάρτηση του IHC από τη διαθεσιμότητα των κατάλληλων αντισωμάτων. Ως εκ τούτου, η έκφραση γονιδίου προφίλ δεδομένων χρησιμοποιήθηκε επίσης για την ταυτοποίηση γονιδίων με τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του mRNA με βάση δεδομένα από δύο μελέτες [31], [32] του MSI και MSS καρκίνους του κόλου (Σχήμα S2).

επιλεγμένων γονιδίων (Πίνακας 4) υποβλήθηκαν σε διαλογή για μεταλλάξεις CMS σε ένα πάνελ 5 MSI και 1 κυτταρικές σειρές MSS και επακόλουθη πάνελ 6 κυτταρικές σειρές MSI ελέγχθηκε αν η αρχική οθόνη αποκάλυψε οποιεσδήποτε μεταλλάξεις CMS. Τρία γονίδια (SFRS12IP1, MED8 και ASXL1) έχουν μεταλλαχθεί σε 6/11 (55%) του MSI-High κυτταρικές γραμμές και δυο γονίδια (FBXL3 και RGS12) έχουν μεταλλαχθεί σε 5/11 (45%). Αρκετά γονίδια με μικρότερο ποσοστά μετάλλαξη εντοπίστηκαν επίσης (Πίνακας S4).

Η

Στο silico

ανάλυσης επιτόπου για την NMD ανθεκτικά μεταγραφή που προέρχονται μεταλλαγμένες πρωτεΐνες

Για να είναι χρήσιμη ως θεραπευτικοί στόχοι εμβόλιο /ανοσοθεραπεία, οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες που προσδιορίζονται ανάγκη δημιουργίας CTL επιτόπων για κοινούς τύπους HLA.

Στο silico

ανάλυση με τη χρήση της διαθέσιμης στο κοινό λογισμικό όπως SYFPEITHI έχει προηγουμένως εντοπιστεί νέα επιτόπια CTL τα οποία στη συνέχεια επικυρώθηκε σε λειτουργικές δοκιμασίες [26]. Για να προσδιορίσετε ποια MSI προερχόμενο μεταλλαγμένες πρωτεΐνες είναι πιθανόν να είναι ανοσογόνα, αξιολογήσαμε μεταλλαγμένες πρωτεΐνες που προκύπτουν από NMD ανθεκτικά μεταγραφές για πιθανές HLA-A * 0201 επιτόπια. HLA-Α * 0201 είναι ο πιο κοινός τύπος HLA, παρούσα σε περίπου 50% του πληθυσμού [33]. Οι βαθμολογίες SYFPEITHI βασιζόμενη στην δέσμευση μοτίβα που είναι κοινές στα γνωστά φυσικά επιτόπια. Σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές βαθμολόγησης SYFPEITHI, ένα φυσικώς εκφράζεται επίτοπο θα πρέπει να είναι μεταξύ των κορυφαίων 2% όλων των βαθμολογιών πεπτιδίου αξιολογήθηκε σε 80% των περιπτώσεων [26]. Εκτιμήσαμε το μετάλλαγμα C-άκρα που προκύπτουν από την κοινή μεταλλάξεις NMD-R (Πίνακας S5) και την κορυφή 2% του HLA-A * 0201 SYFPEITHI βαθμολογίες που παράγεται από τις μεταλλαγμένες πρωτεΐνες δέσμευσης προσδιορίστηκαν (Πίνακας 5). Οι κορυφαίοι πεπτίδια είχαν βαθμολογίες που κυμαίνονται 23-31 δεσμευτική SYFPEITHI. Αυτά τα αποτελέσματα είναι συγκρίσιμα με τα δεσμευτικά αποτελέσματα των 135 γνωστά HLA-A * 0201 επίτοποι CTL του καρκίνου [26], συμπεριλαμβανομένων των 4 δημοσιεύθηκε MSI προερχόμενο επίτοπα, τα οποία έχουν μέση βαθμολογία του 24 και κατά μέσο όρο 23,4 (Πίνακας S6).

Βάσει των διαθέσιμων αναφερόμενα ποσοστά μετάλλαξης CMS για ΕΡΗΒ2, TTK και RGS12 (C8), ένα εμβόλιο συμπεριλαμβανομένων αυτών των τριών μεταλλαγμένες πρωτεΐνες θα περιλαμβάνουν τουλάχιστον έναν πιθανό HLA-A * 0201 επιτόπιο για το 69% των ασθενών ( 1- (1-41%) x (1-27%) x (1-28%)). Περαιτέρω HLA-A * 0201 επίτοποι ταυτοποιήθηκαν για αρκετά γονίδια (TMEM97, ASXL1, SFRS12IP1, RGS12 (Α9), RTKN2) με κοινές μεταλλάξεις σε αυτή τη μελέτη, υποδεικνύοντας ότι επίσης στοχεύουν αυτά τα γονίδια θα μπορούσαν να διευρύνουν HLA-A * 0201 κάλυψη. Κάποιες σπάνιες μεταλλάξεις (π.χ. NTAN1, RAPH1) παράγουν επίσης ανοσογόνα επιτόπια που δεν θα παρέχει ευρεία κάλυψη του πληθυσμού, αλλά μπορεί επίσης να αξίζει στόχευση σε επιλεγμένους ασθενείς.

Συζήτηση

Μικροδορυφορικοί αστάθεια οδηγεί σε προβλέψιμες πλαισίου μεταλλάξεις που αφορούν το CMS πολλών γονιδίων. Μεταλλαγμένες πρωτεΐνες που προκύπτουν από αυτές τις μεταλλάξεις είναι μια λογική πηγή όγκου-ειδικά αντιγόνα που θα μπορούσαν να αντιπροσωπεύουν τόσο για την παρουσία αυξημένων TILs και την καλύτερη πρόγνωση σχετίζεται με MSI-High φαινότυπο. Αυτή η έννοια υποστηρίζεται από ένα πρόσφατο εύρημα ενός συσχετισμού μεταξύ του ανοσοποιητικού πυκνότητα διήθηση και ο αριθμός των CMS οι μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου ανιχνεύεται σε ένα σύνολο καρκίνων MSI-High κόλον [34]. Έχουμε επικυρωθεί τουλάχιστον δύο παραδείγματα (CREBBP και EP300) φυσικώς εκφράζονται μεταλλαγμένων πρωτεϊνών σε κυτταρικές σειρές καρκίνου MSI-High κόλον, που προκύπτουν από NMD ανθεκτικά μεταγραφές. Αυτά τα ευρήματα επιβεβαιώνουν ότι NMD ανθεκτικά μεταγραφές μπορεί να παράγει με φυσικό τρόπο εκφράστηκε MSI που προέρχονται από μεταλλαγμένες πρωτεΐνες [34], [35]. Το CMS επαναλαμβάνει σε CREBBP και EP300 είναι μικρή και είναι απίθανο να μεταλλαχθεί σε ένα υψηλό ποσοστό της MSI-High όγκους. Ωστόσο, είναι πιθανό ότι ορισμένες κοινές NMD ανθεκτικά μεταλλάξεις όπως TTK θα δημιουργήσει επίσης δυνατότητα στόχευσης πρωτεϊνών μεταλλάκτη σε MSI-High καρκίνους. γονιδίωμα-ευρεία στρατηγική μας για την αναγνώριση ανοσογονικά NMD ανθεκτικά μεταγραφές έχει εντοπίσει πέντε νέα CMS μεταλλάξεις (SFRS12IP1, MED8, ASXL1, FBXL3, RGS12) σε τουλάχιστον 45% των κυτταρικών σειρών καρκίνου έντεκα MSI-High παχέος εντέρου δοκιμαστεί. ανάλυση μετάλλαξης σε μια μεγαλύτερη σειρά των πρωτογενών καρκίνων MSI-High παχέος εντέρου θα επιτρέψει στις συχνότητες μετάλλαξης αυτών των πιθανών θεραπευτικών στόχων που πρέπει να προσδιοριστεί με μεγαλύτερη ακρίβεια.

In vitro

μελέτες έχουν προσδιορίσει CTL απαντήσεις σε συνθετικά μεταλλαγμένα πεπτίδια που προκύπτουν από την κοινή μεταλλάξεις CMS, χρησιμοποιώντας μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος από ασθενείς με MSI καρκίνων του παχέος εντέρου [10], [11], [12], [13], [14], [36] και κατά περίεργο τρόπο, ακόμη και σε υγιή άτομα με HNPCC [15]. Αυτές οι μελέτες έχουν δείξει ότι όγκου-ειδικά μεταλλαγμένες πρωτεΐνες μπορούν να διεγείρουν

in vitro

Τ κυτταρική ανοσία και υποστηρίζουν την ιδέα μιας στρατηγικής εμβολιασμού. Η δημοσιευμένη HLA-A * 0201 CTL επιτόπων για TGFBR2 [10], [11], CASP5 [12], OGT [13] και U79260 (FTO) [14] όλων προκύπτουν από NMD ευαίσθητα μεταλλαγμένο μεταγραφές. NMD αναστολής πειράματα έχουν δείξει ότι μεταλλαγμένο TGFBR2 είναι ένα από τα πιο ρυθμίζεται προς τα πάνω μεταγραφές, με 10-φορές αυξημένη έκφραση mRNA σε μία μελέτη [27], [37]. Το Τ-κυττάρων απαντήσεις σύγκρουση με τον αναμενόμενο αντίκτυπο της NMD κατά μεταλλαγμένων έκφραση της πρωτεΐνης. Μια μελέτη έδειξε ότι μορφομετατροπή μεταλλαγμένη πρωτεΐνη TGFBR2 είναι ανιχνεύσιμη σε επιμολυντές του μεταλλαγμένου cDNA (NMD ανθεκτικά), αλλά όχι μεταλλαγμένη gDNA (NMD ευαίσθητο) [35]. Δεν εντοπίσαμε μεταλλαγμένες πρωτεΐνες από NMD ευαίσθητα μεταγραφές (ΒΑΧ, CASP5 και MSH3). Ωστόσο, NMD είναι μετάφραση εξαρτώμενη διαδικασία [24] και χαμηλού επιπέδου έκφραση μεταλλαγμένης πρωτεΐνης από το αρχικό γύρο της μετάφρασης μπορεί να είναι επαρκής για να διεγείρει ανοσοαποκρίσεις. CTL μπορεί να δείξει εξαιρετική ευαισθησία σε ένα ειδικό συνδέτη πεπτιδίου /HLA, με τόσο λίγα όσο 3 στόχος πεπτιδίου /ΜΗΟ είναι επαρκής για CTL-ειδική κυτταρική λύση

in vitro

[38]. έχουν χυμική απαντήσεις σε μεταλλαγμένες TGFBR2 πρωτεΐνη έχουν ταυτοποιηθεί με ELISA, αλλά μόνο σε μια μειοψηφία (10%) των ασθενών MSI-High καρκίνου του παχέος εντέρου [39].

Ένα όφελος της NMD ανθεκτικό μεταγραφές ως πηγή δυνατότητα στόχευσης μεταλλαγμένες πρωτεΐνες είναι ότι εκφράζονται σταθερά αντιγόνα όγκου μπορεί να είναι εγκάρσια παρουσιάζονται στο ανοσοποιητικό σύστημα από δενδριτικά κύτταρα να διεγείρουν CTL και Τ βοηθητικών κυττάρων [40]. Cross-παρουσίαση είναι πιθανό να οδηγήσει σε ανώτερη ανοσία κατά του όγκου και NMD ανθεκτικών μεταγραφές ως πηγή στοχεύσιμο μεταλλαγμένων πρωτεϊνών. Μία δοκιμασία σύντηξης γονίδιο ανέφεραν σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης επιμολύνθηκαν MSI προερχόμενων μεταλλαγμένες πρωτεΐνες και διασταυρούμενη παρουσίαση του συν-εκφραζόμενο αντιγόνο ωοαλβουμίνη [18]. Για τα γονίδια με αμελητέα ανιχνεύσιμη πρωτεΐνη, μερικοί μέτριες έως ισχυρές αποκρίσεις CTL ανιχνεύθηκαν, αλλά χωρίς διασταυρούμενη παρουσίαση [18]. Ένας περιορισμός της δοκιμασίας επιμόλυνσης είναι ότι μεταλλαγμένα κατασκευάσματα cDNA χρησιμοποιήθηκαν και ως εκ τούτου, τα πειράματα δεν αξιολόγησε τον αντίκτυπο της NMD κατά μεταλλαγμένων έκφραση της πρωτεΐνης. Η προσέγγισή μας υπερνικά αυτό μέσω απευθείας ανίχνευση μεταλλαγμένων έκφρασης πρωτεΐνης. Μια τροποποιημένη δοκιμασία επιμόλυνσης που απαιτούν φυσική μάτισμα του C-τελικού άκρου θα μπορούσε επίσης να προσδιορίσει βιολογικά σχετικούς στόχους εμβολιασμό.

NMD αναστολής πειράματα έχουν εντοπίσει κάποια «NMD-διαφυγής» μεταγραφές που αντιστέκονται μερικώς υποβάθμιση οφείλεται στην NMD [27], . MBD4 προβλέπεται παράγει ένα NMD ευαίσθητη μεταγραφή, αλλά ένα αχνό ανώμαλη πρωτεϊνική ζώνη έχει αναφερθεί σε αναλύσεις Western blot μεταλλαγμένη κυτταρικών σειρών MBD4. Αυτό μπορεί να αντιπροσωπεύει μεταλλαγμένη πρωτεϊνική έκφραση MBD4 λόγω NMD-διαφυγής [23]. μεταγραφές NMD-διαφυγής μπορεί να είναι μια χρήσιμη πηγή στόχων πρωτεΐνης, αλλά αυτά δεν είναι σε θέση να προβλέψει και περαιτέρω εργασία είναι απαραίτητη για να καθοριστεί ποια μεταγραφές NMD-διαφυγής παράγουν δυνατότητα στόχευσης μεταλλαγμένες πρωτεΐνες. Στρατηγικές που παρεμβαίνουν NMD χωρίς να αναστέλλει την μετάφραση πρωτεΐνης θα πρέπει να προκαλέσει μια γενικευμένη αυξητική ρύθμιση σε NMD ευαίσθητα μεταλλαγμένο μεταγραφές, αποκάλυψη μιας σειράς αντιγόνων όγκου. Αυτή η προσέγγιση θα μπορούσε να συμπληρώσει ένα εμβόλιο στοχεύει MSI-High όγκων, διευρύνοντας το φάσμα των διαθέσιμων ανοσοποιητικό στόχους πέρα ​​από NMD ανθεκτικά μεταγραφές. NMD-αναστολή από siRNA που στοχεύει της NMD ρυθμιστικών γονιδίων SMG1 ή UPF2 έχει πρόσφατα αποδειχθεί ικανή να επάγει προστατευτική

in vivo

ανοσοαποκρίσεων σε καρκινικά κύτταρα επιμολυσμένα με ένα NMD ευαίσθητο αντιγόνο στόχο [41].

επιβεβαίωση μας μεταλλαγμένων έκφραση της πρωτεΐνης από MSI-High όγκοι μπορεί να έχουν σημαντικές κλινικές εφαρμογές. Ένα εμβόλιο που στοχεύουν συνήθως εκφράζεται μεταλλαγμένες πρωτεΐνες έχει προταθεί ως μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για την θεραπεία της MSI-High όγκους [15], [18], [34], [42]. Με επαρκή στόχων, ο εμβολιασμός μπορεί να είναι εφικτή υπό τον όρο ότι οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες εκφράζονται, τα αντιγονικά επιτόπια δημιουργούνται και παρουσίαση αντιγόνου είναι λειτουργική. Απαιτείται περαιτέρω εργασία για να καθοριστεί ποια μεταλλαγμένη πρωτεΐνη ανοσολογικές αποκρίσεις μπορούν να αποφέρουν όφελος επιβίωσης σε ασθενείς με MSI-High όγκους. Μεταλλαγμένες πρωτεΐνες που εκκρίνονται στο ορό θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως χρήσιμα βιοδείκτες για την πρώιμη ανίχνευση του MSI-High όγκων, ιδιαίτερα στο HNPCC επηρεάζονται πληθυσμό. Τέτοια βιοδείκτες θα ήταν ένα χρήσιμο συμπλήρωμα σε κολονοσκοπική εξέταση, αφού MSI-High παχέος εντέρου έχουν μια τάση για διάστημα αδενώματα και καρκινώματα ανάπτυξη κατά την περίοδο μεταξύ κολονοσκοπήσεις ελέγχου [43], [44]. Το κοινό, προβλέψιμη και όγκου-ειδική φύση της MSI που προέρχονται από μεταλλαγμένες πρωτεΐνες τα καθιστά ιδανικούς υποψηφίους ως θεραπευτικοί στόχοι ή διαγνωστικών δεικτών.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και τον πολιτισμό

LIM κυτταρικές σειρές ορθοκολικού καρκίνου καθιερώθηκαν από βιοψίες όγκων στο Ludwig Institute for Cancer Research (LICR) Melbourne Branch όπως περιγράφηκε προηγουμένως: LIM1215 [45], LIM1899 [46], LIM1863 [47], LIM2463 [48] και (LIM2099, LIM2405, LIM2408, LIM2537, LIM2550 και LIM2551) [49]. Οι κυτταρικές σειρές LIM καθιερώθηκαν από τόσο σποραδική και οικογενή του παχέος εντέρου [49] και μπορεί να ληφθεί από CellBank Αυστραλία (www.cellbankaustralia.com) ή από το LICR Μελβούρνη Υποκατάστημα με την ολοκλήρωση των τυποποιημένη συμφωνία μεταφοράς ακαδημαϊκών υλικών. SW1222 ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα που παρέχεται από το Ludwig Institute for Cancer Research, New York Branch, (New York, ΝΥ) και HCA7 ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα ελήφθησαν από την Ευρωπαϊκή Συλλογή Καλλιεργειών Κυττάρων (Porton Down, UK). σι. ντο. ρε.