Αφηρημένο

Η υπερέκφραση του peroxiredoxin 1 (PRX1) έχει παρατηρηθεί σε πολλές καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων στοματικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (OSCC). Ο ακριβής μοριακός μηχανισμός του άνω ρύθμιση του PRX1 στην καρκινογένεση, ωστόσο, είναι ακόμη πλήρως κατανοητό. Ο στόχος της παρούσας μελέτης είναι να διερευνηθεί η σχέση μεταξύ PRX1 και υποξία, και πιθανός μηχανισμός (ες) PRX1 σε OSCC κυτταρική σειρά SCC15 και το μοντέλο ξενομοσχεύματος. Εμείς αντιμετωπίζεται άγριου τύπου και PRX1 νοκ ντάουν SCC15 κύτταρα με παροδική υποξία που ακολουθείται από επανοξυγόνωση. Έχουμε ανιχνεύσει την κατάσταση υποξίας, η παραγωγή αντιδραστικών μορφών οξυγόνου (ROS), και η έκφραση και /ή δραστικότητα του PRX1, οξυγονάσης αίμης 1 (ΗΟ-1) και του πυρηνικού παράγοντα κάππα-Β (ΝΡ-κΒ). Βρήκαμε ότι η υποξία επάγει τη συσσώρευση των ROS, up-ρυθμίζει PRX1, αυξάνει NF-κΒ μετατόπιση και τη δραστηριότητα δέσμευσης DNA και ρυθμίζει προς τα κάτω ΗΟ-1

in vitro

. Σε PRX1 knockdown κυττάρων, το επίπεδο έκφρασης της ΗΟ-1 αυξήθηκε, ενώ ΝΡκΒ μετάθεσης και δραστικότητα δέσμευσης του DNA μειώθηκαν μετά την υποξία ή κατεργασία υποξίας /επανοξυγόνωση. Επιπλέον, μιμήθηκε τη δυναμική μικροπεριβάλλον οξυγόνωση του όγκου σε μοντέλο ξενομοσχεύματος και αξιολόγησε τις παραπάνω δείκτες σε όγκους με τη μέγιστη διάμετρο 2 mm, 5 mm, 10 mm ή 15 mm, αντίστοιχα. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι ο όγκος υποξική κατάσταση και η έκφραση του PRX1 σχετίζονται σημαντικά με την ανάπτυξη του όγκου. Η έκφραση της ΗΟ-1 και ΝΡ-κΒ, και η δραστικότητα δέσμευσης του ΝΡ-κΒ DNA ήταν σημαντικά αυξημένα σε όγκους 15 mm, και το επίπεδο των 8-hydroxydeoxyguanosine αυξήθηκε σε όγκους 10 mm και 15 mm, που σε σύγκριση με εκείνες σε μέγεθος από 2 mm. Τα αποτελέσματα από αυτή τη μελέτη παρέχει πειραματική απόδειξη ότι η υπερέκφραση του PRX1 σχετίζεται με υποξία, και PRX1 /ΝΡ-κΒ /ΗΟ-1 μονοπάτι σηματοδότησης μπορεί να εμπλέκεται σε καρκινογένεση του στόματος

Παράθεση:. Zhang Μ, Χου Μ, ge L, Miao C, Zhang J, Jing Χ, et al. (2014) Πρόκληση Peroxiredoxin 1 από υποξία Ρυθμίζει οξυγενάση της αίμης-1 μέσω ΝΡ-κΒ σε καρκίνο του στόματος. PLoS ONE 9 (8): e105994. doi: 10.1371 /journal.pone.0105994

Επιμέλεια: Xin Yuan-Γκουάν, το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Κίνα

Ελήφθη: May 20, 2014? Αποδεκτές: 25 Ιουλίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 27 Αυγούστου, 2014

Copyright: © 2014 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Το ερευνητικό έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών (81070836), το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών του Πεκίνου (7102065) και ZYLX201407, το Πεκίνο Δημοτική Διοίκηση νοσοκομείο βασικό έργο Ιατρική Ανάπτυξης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Στοματική ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (OSCC) είναι η πιο κοινή καρκίνο κεφαλής και τραχήλου σε όλο τον κόσμο. Παρά τα πλεονεκτήματα της χειρουργικής επέμβασης, χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία, το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών OSCC δεν έχει βελτιωθεί σημαντικά κατά τα τελευταία 30 χρόνια [1] – [3]. Μετάσταση και τη χημειοθεραπεία αντίσταση /ακτινοθεραπεία είναι ακόμη κύριες ανησυχίες στη θεραπεία των κλινικών του καρκίνου. Η υποξία, ένα κοινό χαρακτηριστικό του καρκίνου, προάγει κυττάρου όγκου εισβολή και τη μετάσταση σε μικροπεριβάλλον του όγκου που οδηγεί στην αντίσταση των καρκινικών κυττάρων στη χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία [4], [5]. Έχει αναφερθεί ότι οι παθολογικά χαρακτηριστικά συμπεριλαμβανομένων των δραστικών διεισδυτικότητας, μετάσταση λεμφαδένα και αγγειακός πολλαπλασιασμός που σχετίζεται με υποξία των ιστών του όγκου σε OSCC [6], [7]. Η έκθεση σε υποβαρικού υποξία οδηγεί σε σημαντική αύξηση στην παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) σε ζώα. Η συσσώρευση των ROS που επάγεται από υποξία μπορεί να οδηγήσει σε οξειδωτικό στρες και την εξέλιξη του όγκου [8]. Το ROS μεσολάβηση απόκριση μπορεί να ρυθμίζεται με αντιοξειδωτικά και αντιοξειδωτικά ενζυμικά συστήματα, όπως η υπεροξειδική δισμουτάση, η καταλάση και θειορεδοξίνη /peroxiredoxin [9].

Peroxiredoxins (Prxs) είναι μια υπεροικογένεια πολυλειτουργικό αντιοξειδωτικό θειορεδοξίνης-εξαρτώμενη υπεροξειδάσες. Peroxiredoxin 1 (PRX1) είναι ένα σημαντικό μέλος της οικογένειας Prxs και δρα ως αντιοξειδωτικό για να σκουπίζω ROS σε ένα ευρύ φάσμα οργανισμών. PRX1 εμπλέκεται σε πολλαπλές βιολογικές συνθήκες /δραστηριότητες όπως το οξειδωτικό στρες, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την κυτταρική απόπτωση [9]. PRX1 υπερεκφράζεται σε πολλές κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένων του οισοφάγου, του πνεύμονα, του μαστού και του παγκρέατος. Αυξημένα έκφραση PRX1 συσχετίζεται με μειωμένη συνολική επιβίωση και την κακή κλινική έκβαση [10], [11]. Η υπερέκφραση του PRX1 έχει επίσης αναφερθεί σε OSCC, αλλά ο ακριβής μοριακός μηχανισμός του PRX1 σε στοματική καρκινογένεση παραμένει ασαφής [12]. Η έκφραση του πυρηνικού παράγοντα κάππα-Β (ΝΡ-κΒ) και αίμη oxygenease-1 (ΗΟ-1) αυξάνονται σε OSCC [13], [14]. Πολυάριθμες μελέτες έδειξαν ότι η ΝΡ-κΒ αποκρίσεις σε υποξία-επανοξυγόνωση

in vitro

[15]. NF-κΒ μπορεί να ρυθμιστεί από PRX1, μέσω της αρχικής ενεργοποίησης της στο κυτταρόπλασμα [16] ή με μεταβολή της συγκέντρωσης του οξειδωτικού που οδηγεί στην οξειδωτική απενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ [17]. ΗΟ-1, ένα 32-kDa πρωτεΐνη θερμικού σοκ, μπορεί να καταλύει την οξειδωτική αποδόμηση της αίμης προς χολοπρασίνης, η οποία στη συνέχεια ανάγεται σε χολερυθρίνη. ΗΟ-1 μπορεί να διεγείρεται από υποξία, θερμικό σοκ και κυτταροτοξικά οξειδωτικά [18], [19]. ΗΟ-1 είναι ένας από τους στόχους της NF-κΒ υπό συνθήκες στρες [20] – [23]. Αν και ο μηχανισμός του PRX1 σε οξειδωτικό στρες δεν είναι σαφής, πολλαπλές ενδείξεις υποδηλώνουν ότι PRX1 μπορεί απόκριση σε υποξία και τη ρύθμιση του NF-κΒ οδού καταρράκτη. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την αλλοίωση του PRX1 σε απόκριση σε υποξία και αξιολογήθηκαν τα πιθανά συσχετίσεις μεταξύ PRX1 και NF-κΒ /ΗΟ-1 με τη χρήση του συστήματος από το στόμα των καρκινικών κυττάρων και μοντέλο ξενομοσχεύματος.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινα κύτταρα OSCC, SCC15, (ATCC, Manassas, VA) διατηρήθηκαν σε DMEM-F12 συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) ορό εμβρύου μόσχου (FBS) (Gibco, USA) που περιέχει 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη. κύτταρα SCC15 αναπτύχθηκαν στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO

2 και 95% αέρα. Να χτυπήσει κάτω PRX1, SCC15 κύτταρα επιμολύνθηκαν με PRX1 shRNA πλασμίδιο (Santa Cruza Biotechnology) χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Έλεγχος shRNA πλασμίδιο-Α (Santa Cruza Biotechnology) επιμολύνθηκε ως έλεγχος. Η αποτελεσματικότητα του PRX1 shRNA knockdown προσδιορίστηκε με qRT-PCR και αναλύσεις κηλίδος western.

χρώση πιμονιδαζόλη σε SCC15 κύτταρα

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν επί καλυπτρίδων επί 24 ώρες πριν από τη θεραπεία υποξίας. Κατά τη θεραπεία υποξίας, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε επωαστήρα υποξία με αέριο που περιέχει 1% O

2, 5% CO

2 και 94% Ν

2 στους 37 ° C για διαφορετικές χρονικές περιόδους. 200 μΜ από πιμονιδαζόλη προστέθηκαν στο μέσο και επωάστηκαν για 30 λεπτά. Μετά πλύση με PBS, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με παραφορμαλδεϋδη (3%) σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά και στη συνέχεια πλύθηκε και πάλι με PBS. Μετά μπλοκαρίστηκαν με BSA, καλυπτρίδες επωάστηκαν με hypoxyprobe-1 Mab1 ποντικού μονοκλωνικό αντίσωμα (1:100) στην Hypoxyprobe-1 kit Plus (Chemicon Int., Temecula, CA) όλη τη νύχτα. Ένα δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με FITC αντι-ποντικού χρησιμοποιήθηκε. Οι καλυπτρίδες στερεώθηκαν και ανοσοχρωματίστηκαν κύτταρα εξετάστηκαν σε ένα μικροσκόπιο Olympus IX71 (Tokyo, Japan).

ROS

ανίχνευση

Η παραγωγή ενδοκυτταρικής ROS στα κύτταρα μετρήθηκε με 2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein διοξεικό (DCF-DA) χρησιμοποιώντας ανάλυση FACS. Τα κύτταρα SCC15 συλλέχθηκαν και εναιωρήθηκαν σε 500 μL αραιωμένου DCF-DA. Το μίγμα επωάστηκε στους 37 ° C για 20 λεπτά και στη συνέχεια πλένονται δύο φορές με PBS. Τα δείγματα αναλύθηκαν με κυτταρόμετρο ροής μέσα σε 1 ώρα. Δεδομένα ομαλοποιήθηκε με τις τιμές από τους ελέγχους. Η μέση ένταση φθορισμού DCF μετρήθηκε με διέγερση στα 488 nm και εκπομπή στα 525 nm. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

ανοσοφθορισμού

κύτταρα αναπτύσσονται σε καλυπτρίδες ξεπλύθηκαν με PBS, σταθεροποιήθηκαν και κατέστησαν διαπερατά σε ακετόνη στους -20 ° C για 10 λεπτά. Μετά την επώαση με PBS που περιέχει 5% BSA για 1 ώρα, το μονοκλωνικό αντι-ΝΡ-κΒ αντίσωμα (Cell Signaling Technology, 1:100 σε PBS-BSA) προστέθηκε σε 4 ° C και επωάστηκε για όλη τη νύχτα. Οι καλυπτρίδες πλύθηκαν με PBS, επωάστηκαν με Alexa Fluor 546 αντι-λαγού (Molecular Probes, 1:500) δευτερεύον αντίσωμα σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα, και τοποθετημένα σε Dako Cytomation φθορισμού μέσο στερέωσης. Ομοεστιακή εικόνες συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας μια Leica SP2 ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ είναι εξοπλισμένα με UV διέγερση, ένα λέιζερ αργού, ένα στόχο OIL ΡΗ3 CS 633 /1.32, και συνεστιακή pinhole σετ σε 1 μονάδα Airy. Όλα τα ομοεστιακό εικόνες ήταν μόνο οπτικό τμήματα.

Ξενομοσχεύματος μοντέλο

Σαράντα αρσενικά BALB /c γυμνά ποντίκια (Πεκίνο Vital River Laboratories, Κίνα) χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή ογκογενετικότητας της SCC15 κυττάρων

in vivo

. Το πρωτόκολλο πείραμα εγκρίθηκε από την τοπική επιτροπή δεοντολογίας για τη χρήση των ζώων. Τα κύτταρα SCC15 (6 × 10

6) εναιωρήθηκαν σε 100 μλ αλατόνερου ρυθμισμένου με φωσφορικό και μεταμοσχεύθηκαν υποδορίως στο δεξιό και αριστερό πλευρά των 4 εβδομάδων γυμνούς ποντικούς. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε κάθε 3 ημέρες μετά τη μεταμόσχευση. Οι όγκοι συλλέχθηκαν όταν η μέγιστη διάμετρος των όγκων έφθασε 2 mm, 5 mm, 10 mm ή 15 mm, αντίστοιχα. Να επισημαίνουν υποξικά κύτταρα, τα γυμνά ποντίκια ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά με 0,1 ml αλατούχου διαλύματος που περιέχει υδροχλωρική πιμονιδαζόλη (1 – [(2-υδροξυλ-3-πιπεριδινυλ) προπυλ) -2-νιτροϊμιδαζόλη) σε δοσολογία 60 mg /kg σωματικού βάρους 1 ώρα πριν την εκτομή του όγκου. Οι ποντικοί τέθηκαν σε εφαρμογή ευθανασία και τα δείγματα όγκου αφαιρέθηκαν και αποθηκεύτηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο για μοριακή /κυτταρική ανάλυση, ή σε φορμόλη για να κάνει μπλοκ ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη. Σύνολο 80 όγκοι χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες ανάλογα με τη διάμετρο του όγκου (20 όγκοι /μέγεθος).

χρώση πιμονιδαζόλη σε όγκους

Οι ενσωματωμένες σε παραφίνη μπλοκ με τα δείγματα όγκων κόπηκαν για πιμονιδαζόλη χρώση. Οι τομές επωάστηκαν με αντι-πιμονιδαζόλη αντιορό hypoxyprobe-1 Mab1 πρωτογενούς κουνελιού (αραίωση: δύο παρα δέκα? Chemicon, USA) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Για να αξιολογήσει την κατάσταση της υποξίας, με πέντε αντιπροσωπευτικούς φως μικροσκοπικές περιοχές υπολογίστηκαν σε κάθε τμήμα (μεγέθυνση × 200) και η μέση οπτική πυκνότητα (MOD) υπολογίστηκε με τη χρήση του Image Pro Plus 7.0 αναλυτή, MOD = IOD /περιοχή.

qRT-PCR

Ολικό RNA εξήχθη από καλλιεργημένα κύτταρα και ιστούς όγκων χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ (Invitrogen Life Technologies, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. cDNA συντέθηκε με αντίστροφη μεταγραφή 2 μg RNA με την υψηλής χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, USA). Κλάσματα One-μικρολίτρων του cDNA χρησιμοποιήθηκαν ως πρότυπα. Οι FAMTM Dye /MGB ανιχνευτές του PRX1, ΗΟ-1 και β-ακτίνη συντέθηκαν από ΑΒΙ (Δοκιμασία ID: PRX1, HS0060202? ΗΟ-1, HS00015796? Ανθρώπινο ACTB, 4352935E). Για την ανάλυση των δεδομένων, η -ΔΔCT μέθοδος 2

χρησιμοποιήθηκε με κανονικοποίηση των δεδομένων των ενδιαφερόμενων γονιδίων σε γονιδιακή καθαριότητας β-ακτίνης. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Western ανάλυση κηλίδος

Κύτταρα και ιστοί όγκου λύθηκαν σε ρυθμιστικό δοκιμασίας ανοσοκαταβύθισης (50 mM Tris-CI [ρΗ 7,4], 1% ΝΡ40, 150 mM NaCl , 1 mM EDTA, 1 Μ φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο, 10 μg από κάθε απροτινίνη και λευπεπτίνη, και 1 mM Na3VO4). Μετά φυγοκεντρήθηκε στα 12.000 g για 30 λεπτά, το υπερκείμενο συλλέχθηκε και η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Lowry. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σε 12% γέλες SDS-PAGE και στυπώθηκαν πάνω σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Τα στυπώματα επωάστηκαν με αντι-PRX1 (1:5000, Upstate, USA) και αντι-ΗΟ-1 (1:2000, Abcam, USA) αντίσωμα. Αντίσωμα της β-ακτίνης (Sigma, St. Louis, ΜΟ) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Ανοσοαντιδραστικές ζώνες ανιχνεύθηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας και ενισχύεται από τα αντιδραστήρια χημειοφωταύγειας (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

ΝΡ-κΒ DNA δραστικότητα δέσμευσης

ανίχνευση

Η πυρηνική πρωτείνη εκχυλίζεται από τα κύτταρα και τους ιστούς όγκου χρησιμοποιώντας NE-PER Πυρηνικής και κυτταροπλασματικά Εκχύλιση Αντιδραστήρια (Thermo, USA) . Εν συντομία, τα κύτταρα και οι ιστοί αιωρήθηκαν σε υποτονικό ρυθμιστικό διάλυμα και επωάστηκαν σε πάγο για 10 λεπτά που ακολουθήθηκε από φυγοκεντρήθηκε στα 12.000 g και 4 ° C για 10 λεπτά για να καθιζάνουν οι πυρήνες. Μετά πλένονται στο υποτονικό ρυθμιστικό, οι πυρήνες υποβλήθηκαν σε λύση σε ένα ρυθμιστικό λύσης για να πάρει τους πυρήνες εκχυλισμάτων. δραστικότητα δέσμευσης του ΝΡ-κΒ DNA ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας το ΝΡ-κΒ (ρ65) Transcription Factor Assay Kit (Cayman Chemical Company, USA).

Ανοσοϊστοχημεία

Τα μπλοκ εγκλεισμένο σε παραφίνη κόπηκαν σε τομές για ανοσοϊστοχημεία ανάλυση. Τα τμήματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 mg /L πρωτεϊνάση Κ (αραίωση: 1:1000? Sigma-Aldrich, USA) στους 37 ° C για 30 λεπτά για ανάκτηση αντιγόνου. Μετά τον αποκλεισμό της ενδογενούς δραστικότητας της υπεροξειδάσης με υπεροξειδάση υδρογόνου 0,3% για 15 λεπτά, οι τομές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG? 1:8000? Abcam, USA) ή ΝΡ-κΒ (Cell Signaling Technology, 1:100) πρωτογενής αντίσωμα σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Οι πλάκες επωάστηκαν σε βιοτινυλιωμένο δευτερογενές IgG αντισώματα στους 37 ° C για 30 λεπτά, και στη συνέχεια ορατή χρησιμοποιώντας DAB για 2-5 λεπτά. αιματοξυλίνη Mayer χρησιμοποιήθηκε αιματοξυλίνης τα τμήματα, τα οποία ήταν τότε αφυδατωμένο και να τοποθετηθεί. Για αρνητικό έλεγχο, PBS χρησιμοποιήθηκε στη θέση του πρωτεύοντα αντισώματα. Τα κύτταρα με θετική χρώση προσδιορίστηκαν μετρώντας το ποσοστό των χρωματισμένων κυττάρων χρησιμοποιώντας το Pro Εικόνα Plus 7.0 αναλυτή. Ένα ελάχιστο 1.000 κύτταρα μετρήθηκαν για κάθε δείγμα όγκου.

Στατιστική ανάλυση

Τα επίπεδα έκφρασης του PRX1, ΗΟ-1, NF-κΒ και 8-OHdG, και τα δεδομένα από την παραγωγή ROS, πιμονιδαζόλη χρώση, ανοσοφθορισμό και δραστικότητα δέσμευσης του ΝΡ-κΒ DNA αναλύθηκαν και συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA). Όλες οι στατιστικές αναλύσεις διεξήχθη χρησιμοποιώντας SPSS Λογισμικό για Windows 17.0. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές σε

P

& lt? 0,05. Όλες τις φωτογραφίες

P

τιμές ήταν δύο όψεων.

Αποτελέσματα

PRX1 νοκ ντάουν αυξάνει την υποξία και ενδοκυτταρική ROS παραγωγή

Συνηθίζαμε shRNA πλασμίδιο για να χτυπήσει κάτω PRX1 στην κυττάρων SCC15. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α και 1Β, τα επίπεδα του mRNA PRX1 και έκφρασης πρωτεΐνης μειώθηκαν σε 40-50% κατά shRNA επιμόλυνση σε SCC15 κύτταρα. Μετά PRX1 knockdown, ανιχνεύσαμε την υποξική κατάσταση και στις δύο PRX1 knockdown κύτταρα και κύτταρα ελέγχου, τα οποία επιμολύνθηκαν με άδειο φορέα. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι υποξική κατάσταση αυξήθηκε από υποξία ή υποξία /επανοξυγόνωση εκτός θεραπεία υποξίας 12 h σε κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 1 C, άνω πάνελ). Σε PRX1 νοκ ντάουν κύτταρα, η υποξική κατάσταση αυξηθεί περισσότερο σημαντικά σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 1C, κάτω pannel). Η υψηλότερη υποξία παρατηρήθηκε σε νοκ ντάουν κύτταρα PRX1 μετά από 24 ώρες υποξίας /2 ώρες θεραπείας επανοξυγόνωση, και τη θεραπεία επανοξυγόνωση 2 ώρες δεν μείωσε το επίπεδο υποξία αυξημένα κατά τη θεραπεία υποξίας. Διαπιστώσαμε επίσης την παραγωγή της ενδοκυτταρικής ROS. Παρόμοια με την κατάσταση υποξίας, η παραγωγή του ενδοκυτταρικού ROS αυξήθηκε με κατεργασία υποξίας εκτός 12 ώρες υποξίας και /2 αγωγή h επανοξυγόνωση 12 ώρες υποξία (Σχήμα 1 D). Η συσσώρευση των ενδοκυττάριων ROS είναι υψηλότερη σε PRX1 νοκ ντάουν κύτταρα σε σύγκριση με αυτό των κυττάρων ελέγχου.

Ένα, PRX1 πρωτεΐνη μειώθηκε σημαντικά από shRNA επιμόλυνση. Β, PRX1 mRNA μειώθηκε σημαντικά από shRNA διαμόλυνση. C, χρώση πιμονιδαζόλη έδειξε την αυξημένη κατάσταση υποξίας σε κύτταρα μετά από θεραπεία υποξίας /επανοξυγόνωση. επίπεδο D, ενδοκυτταρικής ROS προσδιορίζονται με κυτταρομετρία ροής σε κύτταρα μετά από θεραπεία υποξίας /επανοξυγόνωση. *

P

& lt? 0.05 έναντι WT κύτταρα SCC15?

#

P

& lt?. 0,05 έναντι υποξικά έλεγχο WT κύτταρα SCC15

Η

PRX1 ρυθμίζει αρνητικά HO-1 υπό συνθήκες υποξίας

Για να προσδιοριστεί αν PRX1 σχετιζόταν με ΗΟ-1 σε κύτταρα SCC15 υπό συνθήκες υποξίας, αξιολογήσαμε τα επίπεδα έκφρασης του PRX1 και ΗΟ-1 μετά από υποξική θεραπεία. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α (a, b), η έκφραση της πρωτεΐνης του PRX1 αυξήθηκε κατά υποξική θεραπεία. Ωστόσο, η έκφραση της πρωτεΐνης του ΗΟ-1 μειώθηκε στα αρχικά στάδια της υποξίας όταν αυξήθηκε έκφραση PRX1, και στη συνέχεια αυξήθηκε ενώ η έκφραση PRX1 μειώθηκε σε 12 ώρες υποξίας /2 h επανοξυγόνωση, 24 ώρες υποξίας και 24 ώρες υποξίας /2 h επανοξυγόνωση, όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 2Α (γ και δ). Στην ομάδα επανοξυγόνωση /2 h 4 ώρες υποξίας, το επίπεδο της πρωτεΐνης PRX1 αυξήθηκε κατά 50%, ενώ πρωτεΐνη ΗΟ-1 ρυθμίζεται προς τα κάτω κατά 30% σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 2Α-Β και D). Ωστόσο, σε PRX1 knockdown κυττάρων, ΗΟ-1 ήταν σημαντικά τα πάνω ρυθμισμένη μετά την υποξία ή υποξία /θεραπεία reoxygenantin εκτός από την ομάδα 24 ώρες. Η έκφραση της πρωτεΐνης του ΗΟ-1 αυξήθηκε κατά 30% (Σχήμα 2Α-δ), και το επίπεδο mRNA αυξήθηκε κατά 1,4 φορές σε PRX1 κύτταρα knockdown SCC15 αγωγή με 4 ώρες υποξία /2 h επανοξυγόνωση σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 2C) . Η έκφραση του mRNA του PRX1 αυξήθηκε κατά 2,7 φορές, ενώ η έκφραση της ΗΟ-1 mRNA ήταν ρυθμισμένη προς τα κάτω κατά 40% (Σχήμα 2Β και 2C).

A (α), πρωτεΐνη έκφραση του Prx-1 και ΗΟ-1 ανιχνεύθηκε με στύπωμα Western μετά την επεξεργασία υποξία /επανοξυγόνωση? A (b και d), PRX1 και ΗΟ-1 πρωτεΐνη ποσοτικοποίηση σε σχέση προς β-ακτίνη? Α (γ), συσχέτιση των Prx-1 και ΗΟ-1 μετά από θεραπεία υποξίας /επανοξυγόνωση. Β και C, η έκφραση του mRNA του Prx-1 και ΗΟ-1 ανιχνεύθηκε με qRT-PCR μετά από θεραπεία υποξίας /επανοξυγόνωση. *

P

& lt? 0.05 έναντι WT κύτταρα SCC15?

#

P

& lt?. 0,05 έναντι υποξικά έλεγχο WT κύτταρα SCC15

Η

PRX1 νοκ ντάουν αναστέλλει NF-κΒ μετατόπιση και δραστηριότητα δέσμευσης DNA

Διαπιστώσαμε ο ενδογενείς έκφραση ΝΡ-κΒ σε κύτταρα μετά από κατεργασία υποξίας. Παρατηρήσαμε μια αυξημένη έκφραση πυρήνα του ΝΡ-κΒ σε κύτταρα SCC15 μετά τη θεραπεία, ειδικά σε 24 ώρες υποξίας ομάδα (Σχήμα 3Α, άνω πάνελ). Επιπλέον, σε PRX1 knockdown κυττάρων, NF-κΒ μετατόπιση από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα μειώθηκε σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 3Α, κάτω πάνελ). Στη συνέχεια ανιχνεύεται δραστικότητα ΝΡ-κΒ σε κύτταρα μετά από κατεργασία υποξίας. Βρήκαμε ότι η ικανότητα δέσμευσης του ΝΡ-κΒ ρ65 DNA μειώθηκε σημαντικά σε PRX1 knockdown κυττάρων μετά κατεργασία υποξίας σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 3Β).

Α, ενδογενής πυρήνες έκφραση του NF-κΒ. Β, δραστικότητα σύνδεσης του ΝΡ-κΒ DNA ανιχνεύθηκε με ELISA. *

P

& lt? 0.05 έναντι WT κύτταρα SCC15?

#

P

& lt? 0,05 έναντι υποξικά έλεγχο WT κύτταρα SCC15

Η

Η υποξία συνδέεται με την ανάπτυξη του όγκου στο μοντέλο ξενομοσχεύματος

Για την αξιολόγηση της αλλαγής. από τις υποξικές συνθήκες κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου, αξιολογήσαμε υποξία σε όγκους με μέγιστη διάμετρο 2 mm, 5 mm, 10 mm ή 15 mm. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, τα μικρά και διάσπαρτα θετικά κύτταρα παρατηρήθηκαν σε όγκους 2 mm. Σε 5 mm, 10 mm και οι όγκοι 15 mm, η υποξικά κύτταρα που βρίσκονται κυρίως στα κέντρα των φωλιών καρκίνου. Η υποξία σε 5 mm, 10 mm και 15 mm όγκους ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι σε όγκους 2 mm (Σχήμα 4Β). Διαπιστώσαμε επίσης το επίπεδο του 8-OHdG την εκτίμηση της ζημίας οξειδωτική DNA σε κύτταρα όγκου. Η έκφραση του 8-OHdG αυξήθηκε από 2 mm έως 15 όγκους mm (Σχήμα 4C). Θα ήταν σημαντικά υψηλότερη σε όγκους 10 mm και 15 mm σε σύγκριση με τους όγκους 2 mm (Εικόνα 4D).

Α, υποξία ανιχνεύτηκε σε 2 mm (α), 5 mm (β), 10 mm (γ) και 15 mm (δ) όγκους κατά πιμονιδαζόλη χρώση. Β, υποξία MOD αυξάνει σημαντικά σε 5 mm, 10 mm και 15 mm όγκων σε σύγκριση με τους όγκους 2 mm. C, 8-OHdG ανιχνεύτηκε με ανοσοϊστοχημεία σε 2 mm (α), 5 mm (β), 10 mm (γ) και 15 mm (δ) όγκους. D, το επίπεδο της 8-OHdG ήταν υψηλότερη σε 10 mm και 15 mm όγκων σε σύγκριση με τους όγκους 2 mm. *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt?. 0.01

Η

Η υπερέκφραση του PRX1 και ΗΟ-1 κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης στο μοντέλο ξενομοσχεύματος

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, η έκφραση του mRNA της PRX1 αυξήθηκε σημαντικά σε 5 mm, 10 mm και 15 mm όγκων σε σύγκριση με τους όγκους 2 mm. Η έκφραση της πρωτεΐνης του PRX1 επίσης αυξημένα σε 10 mm και 15 όγκους mm (Σχήμα 5Β). Η υπερέκφραση του ΗΟ-1 παρατηρήθηκε σε όγκους 15 mm όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 5C και 5D.

Α και C, έκφραση mRNA του PRX1 και ΗΟ-1 ανιχνεύθηκε με qRT-PCR. Β και D, η έκφραση πρωτεΐνης του PRX1 και ΗΟ-1 ανιχνεύθηκε με στύπωμα Western. *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01

Η

NF-κΒ μετατόπιση και δραστηριότητα δέσμευσης DNA αυξάνονται στο μοντέλο ξενομοσχεύματος

NF-κΒ μετατόπιση και DNA δεσμευτική δραστηριότητα και τα δύο. ήταν αυξημένα όταν αναπτύχθηκε όγκου. Η ανάλυση ανοσοϊστοχημείας έδειξαν ότι η έκφραση του ΝΡ-κΒ αυξήθηκε σημαντικά σε όγκους 15 mm σε σύγκριση με τους όγκους 2 mm (σχήμα 6Α και 6Β). Παρομοίως, δραστικότητα σύνδεσης του ΝΡ-κΒ DNA ήταν σημαντικά αυξημένα σε όγκους 15 mm από τους όγκους 2 mm (Σχήμα 6C).

Α, η έκφραση του ΝΡ-κΒ ανιχνεύτηκε με ανοσοϊστοχημεία σε 2 mm (α), 5 mm ( β), 10 mm (γ) και 15 mm (δ) όγκους. Β, το ποσοστό των θετικών κυττάρων πυρηνικής NF-κΒ αυξάνεται σημαντικά σε 15 mm των όγκων σε σχέση με αυτό σε όγκους 2 mm. C, η δραστικότητα δέσμευσης του ΝΡ-κΒ DNA ήταν σημαντικά υψηλότερη σε όγκους 15 mm σε σύγκριση με τους όγκους 2 mm. *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt?. 0.01

Η

Συζήτηση

Ο γενικός στόχος αυτής της μελέτης είναι να διερευνήσει το ρόλο των PRX1 στην υποξία στο OSCC. Πρώτον, χρησιμοποιήσαμε shRNA να χτυπήσει κάτω PRX1 σε SCC15 κύτταρα και κατόπιν ανιχνεύεται PRX1, NF-κΒ και ΗΟ-1 σε υποξία. Ερευνήσαμε επίσης την PRX1 με υποξία κατά την ανάπτυξη των όγκων στο μοντέλο ξενομοσχεύματος. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι μετά από έκθεση σε υποξία ή υποξία /επανοξυγόνωση, ενδοκυτταρικά υποξία και τα επίπεδα ROS επιδεινώθηκαν. Βρήκαμε επίσης ότι η ΗΟ-1 έκφραση ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε PRX1 knockdown κύτταρα, ενώ ΝΡ-κΒ μετατόπιση και η δραστικότητα δέσμευσης του DNA μειώθηκαν. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η αυξημένη συσσώρευση των ROS που επάγεται από υποξία μπορεί πλειορύθμιση PRX1, η οποία μπορεί να ενεργοποιεί NF-κΒ και αρνητικά ρυθμίζει ΗΟ-1 σε καρκίνο του στόματος κύτταρα που προκαλείται από υποξία. Μας

in vivo

δεδομένα έδειξαν ότι η υπερέκφραση του PRX1 σχετίζεται με υποξία και την ανάπτυξη του όγκου. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι PRX1 /NF-κΒ /ΗΟ-1 μονοπάτι σηματοδότησης μπορεί να διαδραματίσει καίριο ρόλο στην καρκινογένεση του στόματος του καρκίνου που προκαλείται από υποξία.

Ένα από τα σημαντικότερα καθήκοντα της PRX1 είναι θειορεδοξίνης-εξαρτώμενη δραστικότητα υπεροξειδάσης στηριζόμενη αποκλειστικά σχετικά με την κυστεΐνη στο Ν-τερματική περιοχή [24]. Είναι σαρώνει επιπλέον ROS ως αντιοξειδωτικό. Υποξία αυξάνει μεσοκυττάρια επίπεδα ROS μέσω της μιτοχονδριακής αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων. Η υποξία είναι ένας από τους βασικούς παράγοντες που επηρεάζουν την έναρξη και την εξέλιξη του όγκου μέσω της αύξησης οξειδωτική βλάβη του DNA [25]. Τα τελευταία χρόνια, η υπερέκφραση του PRX1 αναφέρθηκε ότι παίζουν σημαντικό ρόλο σε πολλές κακοήθειες, λόγω του κρίσιμου ρόλου της στην παθογένεση της υποξίας. Στον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων, υποξία /επανοξυγόνωση μπορεί να αυξήσει την έκφραση PRX1 με την ενεργοποίηση του παράγοντα ερυθροειδή πυρηνικό 2 που σχετίζονται με συντελεστή 2 (Nrf2), ένας σημαντικός παράγοντας μεταγραφής που εμπλέκονται στην οξειδωτικό στρες [26]. Η απώλεια της έκφρασης PRX1 μπορεί να ενισχύσει την ευαισθησία σε οξειδωτικά και ως εκ τούτου, να αυξήσει ROS βλάβη παραγωγή και οξειδωτική DNA [27]. Στην παρούσα μελέτη, η έκφραση mRNA και πρωτεΐνης του PRX1 ήταν up-ρυθμίζονται SCC15 κύτταρα είτε υποξία (4 h, 12 h) μόνο ή ακολουθείται από επανοξυγόνωση (2 ώρες). Σε μια άλλη μελέτη που αναφέρθηκε από τον Kim

et al.,

PRX1 ήταν μόνο up-ρυθμίζεται από υποξία /επανοξυγόνωση, αλλά όχι από την υποξία και μόνο [27]. Βρήκαμε ότι τα κύτταρα είναι ακόμη SCC15 υποξική μετά την επεξεργασία επανοξυγόνωση 2 h, το οποίο δείχνει ότι PRX1 μπορούσε ακόμη να προκληθεί από υποξία, ακόμη και μετά τη θεραπεία επανοξυγόνωση 2 ώρες. αποτέλεσμα μας δείχνει ότι η υποξία είναι στενά συνδεδεμένη με την υπερέκφραση του PRX1 σε OSCC. Η αυξητική ρύθμιση του PRX1 αυξάνει την ικανότητα των κυττάρων για να απομακρυνθεί επιπλέον ROS και προστατεύουν τα κύτταρα του όγκου, η οποία μπορεί να ενισχύσει την εξέλιξη του όγκου και να μειώσει τις αποτελεσματικότητες των χημείο- και radiotherapies.

Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι σε κύτταρα HeLa , κυτταροπλασματική PRX1 μεταβληθεί κυτταροπλασματική μετατόπιση του ΝΡ-κΒ στον πυρήνα. Πυρηνική PRX1 ρυθμίζει NF-κΒ /DNA δεσμευτική μέσω της εξάλειψης των H

2O

2 [23]. Wang

et al.

Ανέφεραν ότι PRX1 αλληλεπιδρά με ΝΡ-κΒ στο επίπεδο του DNA και πιθανώς ρυθμίζει μεταγραφική δραστηριότητα της σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [10]. Ως ισχυρό αντιοξειδωτικό, ΗΟ-1 διευκολύνει την εξέλιξη του όγκου σε ένα ιστό ειδικό τρόπο. Μελέτες έχουν δείξει ότι ο ΝΡ-κΒ επάγει έκφραση της ΗΟ-1 σε καρκινικούς ιστούς [28] – [31]. Επιπλέον, πολυάριθμες μελέτες πρότειναν μια άμεση σχέση μεταξύ του NF-κΒ και ΗΟ-1, αλλά η λειτουργία του ΝΡ-κΒ στη ρύθμιση ΗΟ-1 σε ανθρώπινα κύτταρα είναι αμφιλεγόμενη [32] – [35]. Σε αυτή τη μελέτη, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι η υποξία επάγει PRX1 και NF-κΒ, και PRX1 ρυθμίζει ΗΟ-1 μέσω ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ.

PRX1 έχει πρόσφατα αναγνωριστεί ως ένας ενδογενής συνδετήρας για υποδοχέα ΤοΙΙ (TLR ) συνδέτες [36]. Σε ορθοξικές συνθήκες, PRX1 μπορεί να ενισχύσει την έκφραση του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) μέσω επαγωγής της δραστηριότητας προαγωγού 1-άλφα παράγοντας υποξία μέσω PRX1: TLR4 αλληλεπίδραση. Αυτή η διαδικασία προκαλείται από ΝΡ-κΒ. ΝΡ-κΒ αλληλεπιδρά με τον υποκινητή του VEGF, ωστόσο, δεν απαιτείται για PRX1, γεγονός που υποδηλώνει ότι η NF-κΒ μπορεί να ρυθμίσει VEGF χωρίς επαγωγή PRX1 [37]. PRX1 και ΗΟ-1 και οι δύο χαρακτηρίζονται ως οξειδωτικό στρες επαγόμενο και πρωτεΐνες αίμης σχετίζονται. PRX1 έχει δραστικότητα σύνδεσης αίμης. Η θειόλη-ειδική αντιοξειδωτική δράση του PRX1 μπορεί να ανασταλεί από την αίμη. Συν-έκφραση ή συν-διέγερση PRX1 και ΗΟ-1 έχει παρατηρηθεί σε ορισμένους ιστούς ή κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι PRX1 και πρωτεΐνες ΗΟ-1 μπορεί συν-εντοπίζονται και να αλληλεπιδρούν για να παρουσιάζουν αντιοξειδωτικές δραστηριότητες [15]. Μελέτες έχουν δείξει ότι η έκφραση της ΗΟ-1 είναι κυρίως up-ρυθμίζεται από Nrf2. Nrf2 είναι επίσης ένας από τους βασικούς παράγοντες μεταγραφής για την έκφραση του γονιδίου PRX1 σε υποξικά καρκινικά κύτταρα. Για πρώτη φορά, αναφέρουμε ότι PRX1 και ΗΟ-1 θα μπορούσε να έχει αρνητική ρυθμιστική σχέση με έμμεσο τρόπο. Οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί, όμως, πρέπει να επιβεβαιωθεί και να διερευνηθεί στο μέλλον μελέτη.

Στο μοντέλο ξενομοσχεύματος OSCC, βρήκαμε παρόμοια αποτελέσματα ότι η σημαντική αύξηση της ΗΟ-1 υστερεί σε σχέση με εκείνη των PRX1. Υπό υποξικές συνθήκες βλάβης και οξειδωτικού DNA, PRX1 και ΗΟ-1 αυξορυθμίζονται και δραστικότητα δέσμευσης του ΝΡ-κΒ DNA ενισχύεται. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι PRX1 παίζει ρόλο αντιοξειδωτικές ενεργοποιώντας ΝΡ-κΒ και ρύθμιση ΗΟ-1 σε υποξία που σχετίζονται με την εξέλιξη OSCC. Συμπερασματικά, βρήκαμε ότι η υποξία παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της OSCC μέσω PRX1 /ΝΡ-κΒ /ΗΟ-1 μονοπάτι σηματοδότησης. Η μελέτη μας παρέχει μια συστηματική εξέταση των PRX1 σε συστήματα κυττάρων και μοντέλο ξενομοσχεύματος του OSCC, το καθένα έχει συγκεκριμένα πλεονεκτήματα για την έρευνα βιοδείκτη. Περαιτέρω μελέτες για λειτουργικό ρόλο της PRX1 στην προφορική καρκινογένεση δικαιολογημένη. Πληροφορίες από τη μελέτη αυτή μπορεί να είναι χρήσιμη στην ανάπτυξη chemopreventive /θεραπευτικών παραγόντων που στοχεύουν PRX1.