Αφηρημένο

Ιστορικό

Νόσος ειδικό βιοδείκτες είναι ένα σημαντικό εργαλείο για την έγκαιρη και αποτελεσματική διαχείριση των παθολογικών καταστάσεων, συμπεριλαμβανομένου του καθορισμού της ευαισθησίας, τη διάγνωση, και την αποτελεσματικότητα παρακολούθηση των προληπτικών ή θεραπευτικών στρατηγικών . Τα απταμερή, που περιλαμβάνει μονόκλωνο ή δίκλωνο DNA ή RNA, μπορούν να χρησιμεύσουν ως βιοδείκτες της νόσου ή βιολογικές καταστάσεις. Τα απταμερή μπορεί να προσδεθεί σε ειδικά επίτοπα επί μακρομόρια δυνάμει των τρισδιάστατων δομών τους και, σαν αντισώματα, απταμερή μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να στοχεύσουν συγκεκριμένους επίτοπους επί τη βάσει του μοριακού σχήμα τους. Η Συστηματική εξέλιξη προσδεμάτων δι ‘εκθετικού εμπλουτισμού (SELEX) είναι η προσέγγιση που χρησιμοποιείται για την επιλογή απταμερών υψηλή συγγένεια για συγκεκριμένες μακρομοριακές στόχων μεταξύ του & gt? 10

13 ολιγομερή περιλαμβάνει τυπικές βιβλιοθήκες τυχαίων ολιγομερών. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε ζωντανό κύτταρο που βασίζεται SELEX για τον εντοπισμό απταμερή DNA τα οποία αναγνωρίζουν τις διαφορές κυτταρικής επιφάνειας μεταξύ HPV-μετασχηματισμένα τραχηλικού καρκινώματος καρκινικά κύτταρα και ισογονιδιακών, μη καρκινογενής, αναστροφής κυτταρικές σειρές.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

ολόκληρου κυττάρου μεθοδολογία SELEX προσαρμόστηκε για χρήση με τα προσκολλημένα κυτταρικές γραμμές (που θα ονομάζεται προσκολλητικού κυττάρου-SELEX (AC-SELEX)). Χρησιμοποιώντας αυτή την προσέγγιση, εντοπίσαμε απταμερή υψηλής συγγένειας (εύρος νανομοριακή K

δ) σε επίτοπα ειδικά για την κυτταρική επιφάνεια δύο μη καρκινογενής, μη καρκινογενής προϊόντα επαναφοράς που προέρχεται από το ανθρώπινο καρκίνο του τραχήλου κυτταρική σειρά HeLa, και κατέδειξε την απώλεια αυτών των επιτόπων σε μια άλλη των ανθρωπίνων θηλωμάτων μετασχηματισμένο καρκίνο του τραχήλου κυτταρική γραμμή (SiHa). Πραγματοποιήσαμε επίσης προκαταρκτική διερεύνηση των επιτόπων απταμερούς και τα χαρακτηριστικά τους σύνδεσης.

Συμπεράσματα /Σημασία

Χρησιμοποιώντας AC-SELEX έχουμε δημιουργήσει αρκετές απταμερών που έχουν υψηλή συγγένεια και ειδικότητα με την μη καρκινογενής, αναστροφής της HPV-μετασχηματισμένα τραχήλου καρκινικά κύτταρα. Αυτά τα απταμερή μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον εντοπισμό νέων βιοδεικτών που σχετίζονται με την καρκινογένεση. Πάνελ των απταμερών, όπως αυτές μπορεί να είναι χρήσιμη στην πρόβλεψη της ογκογόνο δυναμικό και τις ιδιότητες των βιοψιών καρκίνου και των ενισχύσεων για την αποτελεσματική διαχείριση των παθολογικών καταστάσεων (διάγνωση, προβλεπόμενη έκβαση, και τις επιλογές θεραπείας)

Παράθεση:. Graham JC , Zarbl η (2012) Χρήση των κυττάρων-SELEX για να παραγάγει DNA απταμερή ως Molecular Probes Πυρήνων HPV-Associated καρκίνο του τραχήλου. PLoS ONE 7 (4): e36103. doi: 10.1371 /journal.pone.0036103

Συντάκτης: Eric Deutsch, Institut Gustave Roussy, Γαλλία

Ελήφθη: 26η Ιανουαρίου, 2012? Αποδεκτές: 28 Μάρτη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 20 Απριλίου 2012

Copyright: © 2012 Graham, Zarbl. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Υποστηρίζεται από δημόσιες Υπηρεσίες Υγείας Grant # NIEHS P30ES005022 (HZ), μια υποτροφία για να ΚΣΟ από το New Jersey της Επιτροπής για την Έρευνα του Καρκίνου, Βραβείο #: 09-1962-CCR-ΕΟ και θεσμική υποστήριξη από το Robert Wood Johnson Medical School, UMDNJ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του τραχήλου της μήτρας είναι ο δεύτερος συχνότερος καρκίνος που πλήττει τις γυναίκες σε όλο τον κόσμο [1]. Περισσότερο από το 90% των καρκίνων του τραχήλου προκαλούνται από HPV, και περίπου 10.800 νέες περιπτώσεις καρκίνου του τραχήλου σχετιζόμενων με τον HPV διάγνωση στις Ηνωμένες Πολιτείες (US) ετησίως [2]. Περισσότερα από 100 είδη HPV έχουν ταξινομηθεί, η πιο ογκογόνο των οποίων είναι HPV16 και HPV18. HPV τύπος 16 (HPV-16) σχετίζεται με περισσότερο από το 50% των καρκίνων του τραχήλου παγκοσμίως [3]. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η μόλυνση από HPV συνδέεται επίσης με τη σεξουαλική δραστηριότητα και είναι η κύρια αιτία της αυξανόμενης συχνότητας του καρκίνου στοματοφαρυγγική στις ΗΠΑ [4]. Έτσι, παρά τη διαθεσιμότητα μιας προληπτικού εμβολίου για τη μόλυνση από HPV [5], παραμένει μία σημαντική ανάγκη για την ανάπτυξη των βιολογικών δεικτών που σχετίζονται ειδικά με τον HPV καρκινογένεση παρά απλά μόλυνση. Αυτές μετασχηματισμός ειδικών βιοδεικτών θα ήταν χρήσιμα για μελέτες της εξέλιξης της νόσου, την πρόληψη, και /ή την ανταπόκριση στη θεραπεία. Εδώ περιγράφουμε την ανάπτυξη μιας προσέγγισης απταμερούς που βασίζεται στον εντοπισμό βιοδείκτες του μετασχηματισμού κυττάρων HPV-μεσολάβηση.

Η έννοια της απταμερών προέκυψε μέσα από την παρατήρηση ότι τα μακρομόρια με διαφορετική μοριακή δομές θα καθένα υιοθετήσει μια μοναδική, τριών διαστάσεων διαμόρφωση, καθένα από τα οποία θα έχουν μοναδικές συγγένειες για σύνδεση προς, και να σχηματίζουν σύμπλοκα με άλλα μόρια [6]. Είναι στην πραγματικότητα το ίδιο είδος δομικές παραλλαγές αλληλουχίας που εξαρτάται από το οποίο είναι η βάση για την δέσμευση αντισωμάτων στο αντιγόνο επιτόπων ειδικών. Κατά τα τελευταία χρόνια ~ 20, η έννοια της δομής που βασίζεται πρόσδεσης έχει αξιοποιηθεί για την ανάπτυξη βιβλιοθηκών απταμερές, σύνολα μακρομορίων με τυχαιοποιημένες αλληλουχίες νουκλεϊκών οξέων (RNA ή DNA). Οι βιβλιοθήκες απταμερές τότε σε διαλογή για την ικανότητά τους να συνδέονται κατά προτίμηση προς συγκεκριμένα μόρια ή μακρομόρια χρησιμοποιώντας SELEX (Συστηματική εξέλιξη προσδεμάτων δι ‘εκθετικού εμπλουτισμού), το οποίο συνδυάζει τον εμπλουτισμό απταμερές μέσω επαναληπτικής επιλογής με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) συγγένεια δέσμευσης και, για να ανακαλύψει υψηλής συγγένειας , χαρακτηριστικό ειδικά δίκλωνο ή μονόκλωνο RNA ή DNA [6], [7]. Ενώ απταμερή μπορούν να έχουν συγγένειες συγκρίσιμες με αυτές των μονοκλωνικών αντισωμάτων έχουν πολλά πλεονεκτήματα. Τα απταμερή μπορεί να παραχθεί

in vitro

και ως εκ τούτου δεν απαιτούν ανοσοποίηση, κυτταρικής σύντηξης, ή ζύμωση για την παραγωγή μάζα ποσότητες. Μόλις η αλληλουχία νουκλεϊκού οξέος ενός λειτουργικού απταμερούς προσδιορίζεται, μεγάλες ποσότητες του συγκεκριμένου ολιγομερούς μπορεί να παραχθεί με χημική ή ενζυματική σύνθεση με χαμηλό κόστος και υψηλή απόδοση.

Μια πιο πρόσφατη εφαρμογή είναι κύτταρο-SELEX, όπου απταμερή ότι αναγνωρίζουν ειδικά μόρια στην επιφάνεια των κυττάρων εξελιχθεί από την επανειλημμένη ενίσχυση και δέσμευση σε ζωντανά κύτταρα [8]. Σε αυτήν την προσέγγιση απταμερή μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την αναγνώριση μιας ευρείας ποικιλίας μορίων συμπεριλαμβανομένων των νουκλεϊκών οξέων, των πρωτεϊνών λιπίδια, υδατάνθρακες, καθώς και μετα-μεταφραστική τροποποίηση αυτών των μορίων που βρίσκονται στην επιφάνεια των εκτεθειμένων κυττάρων. Σημαντικά, κύτταρο-SELEX προσφέρει τη μοναδική δυνατότητα να ανακαλύψουν άγνωστες ή αγνώστων βιοδεικτών που σχετίζονται με ένα συγκεκριμένο τύπο κυττάρων, αναπτυξιακό στάδιο, η έκθεση, η μόλυνση, η βιολογική κατάσταση ή ασθένεια. Κυττάρου-SELEX έχει χρησιμοποιηθεί επιτυχώς σε καλλιέργειες μη-προσκολλημένα κύτταρο να προσδιορίσει απταμερή τα οποία μπορούν να αναγνωρίζουν τα κύτταρα λευχαιμίας σε βιολογικά δείγματα [8], [9]. Στην παρούσα μελέτη έχουμε προσαρμοστεί ολικού κυττάρου-SELEX για χρήση σε προσφυόμενων κυτταρικών σειρών (στοχευόμενων και μη στόχου), μια διαδικασία η οποία θα ονομάζεται προσκολλητικού κυττάρου-SELEX (AC-SELEX) για λόγους απλότητας. Χρησιμοποιώντας AC-SELEX, θα εξελιχθεί απταμερή που μπορεί να διακρίνει ανθρωπίνων θηλωμάτων (HPV)-μεταμορφωμένων κυττάρων τραχηλικού καρκινώματος HeLa από μη ογκογόνα προϊόντα επαναφοράς των κυττάρων HeLa (HF) που διατηρούν ένα λειτουργικό, ολοκληρωμένο HPV γονιδιώματος [10], [11]. Η κυτταρική γραμμή HF ανάστροφων προηγουμένως προέρχεται στο εργαστήριο μας από κύτταρα HeLa που εκτίθενται σε μία μόνο μεταλλαξιογόνο δόση, ethylmethylsulfonate (EMS), που ακολουθείται από επιλογή των κλώνων από κύτταρα τα οποία έχασαν την παρατεταμένη Rhodamine 123 χρόνος κατακράτησης χαρακτηριστικό των περισσότερων κυττάρων καρκίνου [12] . Σε σχέση με τα μητρικά κύτταρα HeLa, κύτταρα HF έχουν ένα μη-μετασχηματισμένο φαινότυπο, μειωμένη αποτελεσματικότητα κλωνοποίησης σε μαλακό άγαρ και είναι μη-ογκογόνα σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς [11]. HF × HeLa κύτταρο υβριδικά κύτταρα που παράγονται από σύντηξη κυττάρων έδειξε σημαντική μείωση της αποτελεσματικότητας κλωνοποίησης σε μαλακό άγαρ, γεγονός που υποδηλώνει την ενεργοποίηση της δεσπόζουσας ογκοκατασταλτικό γονίδιο στα κύτταρα ΗΡ και μοριακή ανάλυση έδειξε επανενεργοποίηση του ογκοκατασταλτικού γονιδίου ρ53 σε κύτταρα HF, αλλά χωρίς η απώλεια, αναδιάταξη, ή μείωση στην έκφραση των ογκοπρωτεϊνών HPV Ε6 /Ε7 [10], [11]. Δεδομένου ότι τα κύτταρα HF είναι ισογονικά με κύτταρα HeLa, οι διαφορές στα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης τους είναι πιθανό να σχετίζεται με την απώλεια του ογκογόνου φαινοτύπου, καθιστώντας αυτό το ιδανικό ζεύγος κύτταρο στο οποίο να ψάξετε βιοδείκτες του κυτταρικού μετασχηματισμού HPV μεσολάβηση.

Εδώ αναφέρουμε στην ανακάλυψη απταμερών μονόκλωνου DNA με υψηλή συγγένεια για επίτοπους που είναι εμπλουτισμένα στην επιφάνεια του προσκολλημένη, μη καρκινογενής HF κυτταρική γραμμή σε σχέση με την ογκογόνο κυτταρική σειρά HeLa. Η ικανότητα των απταμερών για την ανίχνευση βιοδεικτών χάνονται κατά τη διάρκεια μετασχηματισμό κυττάρων HPV-διαμεσολαβούμενη ελέγχθηκε στην αυχενική κυτταρική γραμμή καρκινώματος SiHa. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης δείχνουν ότι τα απταμερή μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη διαλεύκανση υποψήφιος βιοδείκτες για κυτταρικές αλλαγές που σχετίζονται με ή /και συμβάλλουν στην παραγωγή ενός μη ογκογόνων φαινότυπο σε κύτταρα που έχουν μολυνθεί από HPV-.

Αποτελέσματα

προσκολλητικού κυττάρου-SELEX και ταυτοποίηση της Target-Cell Ειδικές απταμερές υποψήφιοι

για να προσαρμοστεί το ολικού κυττάρου-SELEX να προσκολλημένα κύτταρα σε καλλιέργεια, εμείς utlized τη διαδικασία που περιγράφεται στο Σχήμα 1. τα απταμερή στόχευσαν στην μη καρκινογενής κύτταρο HF γραμμή, χρησιμοποιώντας ισογονιδιακές κύτταρα HeLa για αρνητική αντι-επιλογής. Μετά από δεκαοκτώ κύκλους θετικής /αρνητικής επιλογής εντοπίσαμε μοριακοί ανιχνευτές που ήταν πολύ ειδική για την ανάστροφων HF κυτταρική γραμμή (Πίνακας 1). Εμείς αλληλουχία έντεκα υποψηφίων απταμερούς και από αυτά, τέσσερα επελέγησαν τυχαία για περαιτέρω ανάλυση αλληλουχίας του DNA και μελέτες δέσμευσης (bold στον Πίνακα 1). Δεδομένου ότι τα απταμερή μπορεί να θεωρηθεί ως περιλαμβάνουσα βιβλιοθηκών «σχήμα», δημιουργήσαμε πιθανή δευτερογενή δομές για καθένα από τα επιλεγμένα απταμερών και υπολογίζονται οι σχετικές ελεύθερες ενέργειες για κάθε μία από τις προβλεπόμενες δομές [13] (Σχήμα 2).

Μια αρχική βιβλιοθήκη του & gt? 10

15 απταμερή χρησιμοποιήθηκε και δεκαοκτώ κύκλους AC-SELEX διεξήχθησαν για τον καθαρισμό και την ενίσχυση των απταμερών που αναγνωρίζονται επιτόπων που υπάρχουν επί των κυττάρων HF και δεν υπάρχει στα κύτταρα HeLa Η αρχική βιβλιοθήκη επωάστηκε πρώτα. με την κυτταρική γραμμή HeLa και τα μη συνδεδεμένα απταμερή ανακτήθηκαν και χρησιμοποιούνται για τη διαδικασία AC-SELEX.

Η

Οι δευτεροταγείς δομές για κάθε ένα από τα απταμερών διερευνώνται. Η δομή (ες) με τη χαμηλότερη ελεύθερη ενέργεια ( ΓΔ) παρουσιάζονται. Δευτεροβάθμια προβλέψεις δομής καθορίστηκαν χρησιμοποιώντας UNAfold λογισμικού και είναι sir_graph ® εξόδου [13].

Η

τοποθεσίες Δεσμευτική απταμερές στα κύτταρα στόχους

Μόλις λάβαμε οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες για συγκεκριμένες απταμερή κυττάρου-στόχου μας, τα αντίστοιχα DNA ολιγονουκλεοτίδια μονόκλωνου συντέθηκαν με φθορίζουσες ετικέτες FAM. Τα σημασμένα απταμερή στη συνέχεια επωάστηκαν με τα κύτταρα ΗΡ για να προσδιοριστεί η κυτταρική εντόπιση των θέσεων δέσμευσης τους (Σχήμα 3). Οι FAM συζευγμένα απταμερών επωάστηκαν επίσης με τα γονικά κύτταρα HeLa για την επαλήθευση διαφορικής πρόσδεσης.

Εικόνες HF και HeLa κύτταρα επωάζονται με φθορισμό tagged απταμερή. Τα απταμερή είναι ειδικά για το μη ογκογόνων HF κυτταρική γραμμή. Αναγνωρίζουν επίτοπα επί ή στα κύτταρα HF και δεν αναγνωρίζουν θέσεις δέσμευσης τους για τα ογκογονικά κύτταρα HeLa. Όλες οι εικόνες είναι 40 × και των κυττάρων μέσα σε 24 ώρες μετά την επώαση με 2000 απταμερή ηΜ και η επακόλουθη καθήλωση και coverslipping με Aquamount.

Η

συνεστιακή απεικόνιση και ανακατασκευή εικόνας με τη χρήση z-στοίβες χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η κυτταρική εντοπισμός των συμπλοκών απταμερούς-επίτοπο (Σχήμα 4). Οι θέσεις σύνδεσης των απταμερών 13, 14, 20, και 28 φάνηκε να βρίσκεται στην επιφάνεια των κυττάρων. Το απταμερές 14, ωστόσο, φαίνεται επίσης να είναι δεσμευτική για περιπυρηνική περιοχή εντός του κυττάρου, η οποία είναι συνεπής με την σύνδεση του απταμερούς 14 έως επίτοπους επί της επιφανείας κυττάρου που ακολουθείται από τη μεταφορά στην περιπυρηνική περιοχή. Αν και ο μηχανισμός με τον οποίο αυτό το ολιγομερές εισήλθε στο κύτταρο είναι ασαφής, προ-επώαση των κυττάρων HF με πρωτεϊνάσες (πρωτεϊνάση Κ ή θρυψίνη για 2 ή 10 λεπτά πριν από την απταμερές δεσμευτικός) δεν επηρέασε την ικανότητα των κυττάρων να εσωτερικεύουν το FAM σημασμένο απταμερή. Αντίθετα, η θεραπεία με πρωτεϊνάση μείωσε σημαντικά την ικανότητα των απταμερών 13, 20 και 28 να συνδεθούν με τα κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι συνδέθηκαν με επιτόπια πρωτεϊνών επιφανείας κυττάρου.

Εικόνες κυττάρων HF με σημασμένο FAM απταμερή. Απταμερή 13, 20 και 28 φαίνεται να είναι δεσμευτική μόνο στις κυτταρικές επιφάνειες, ενώ απταμερές 14 επίσης εσωτερικοποιείται στο κυτταρόπλασμα του κυττάρου. Όλες οι εικόνες είναι 40 × και των κυττάρων μέσα σε 24 ώρες μετά την επώαση με το 2000 απταμερή nM και η επακόλουθη καθήλωση και coverslipping με Aquamount.

Η

Χαρακτηριστικά Δεσμευτική Απταμερές

Για τον προσδιορισμό της δέσμευσης ισορροπίας της οι απταμερών με επιτόπια HF τους, επωάσαμε τα κύτταρα με HF αυξητική συγκεντρώσεις του FAM ετικέτα απταμερή και μετρήθηκε ο φθορισμός των μεμονωμένων κυττάρων (Σχήμα 5). Με βάση την ανάλυση μας, όλα τα απταμερή αξιολογήθηκαν έδειξαν σύνδεση προς επιτόπους τους υψηλής συγγένειας: Το απταμερές 13 (Κ

d = 2.5 ± 0.5 ηΜ)? Το απταμερές 14 (Κ

d = 7.1 ± 0.4 ηΜ)? απταμερές 20 (Κ

d = 1.6 ± 0.4 ηΜ)? και απταμερές 28 (Κ

d = 6.9 ± 0.2 nM).

φθορισμού ποσοτικοποίηση των FAM σημασμένο απταμερή δεσμεύεται στα κύτταρα HF. καμπύλες δέσμευσης απταμερές (γραμμή και σημεία δεδομένων) δημιουργήθηκαν με γραφικά το μέσο φθορισμό με τις ράβδους σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα του μέσου για κάθε σημείο δεδομένων (n = 4 ανά σημείο δεδομένων). Αυτά τα δεδομένα προσαρμόστηκαν με το μοντέλο Y = Bmax * X (Kd + Χ) (συνεχής γραμμή), το οποίο δημιουργήθηκε με τη χρήση ανάλυσης μη γραμμικής παλινδρόμησης για την πρόσδεση ενός ειδικού site: απταμερές 13 (Κ

d = 2.5 ± 0.5 ηΜ)? απταμερές 14 (Κ

d = 7.1 ± 0.4 ηΜ)? απταμερές 20 (Κ

d = 1.6 ± 0.4 ηΜ)? και απταμερές 28 (Κ

d = 6.9 ± 0.2 nM).

Η

Απταμερές ειδικότητα για το μη-ογκογόνο, HPV-μετασχηματιστεί Καρκίνου του Τραχήλου της Μήτρας γραμμή κυττάρων

Για να διερευνήσουν κατά πόσον η απταμερή εξελιχθεί για σύνδεση προς μη ογκογόνα κύτταρα HF αναγνώριζαν διαφορές κυτταρικής επιφάνειας ειδικό για μη ογκογόνα αναστροφών, εξετάσαμε επίσης δέσμευση σε ένα ανεξάρτητο κλώνο του μη ογκογόνων προϊόντα επαναφοράς των κυττάρων HeLa (ΗΑ) και σε ένα άλλο καρκίνωμα τραχήλου HPV-μετασχηματισμένα κυτταρική σειρά (SiHa). Επωάσεις της FAM ετικέτα απταμερών με τις κυτταρικές γραμμές ΗΑ και SiHa (Σχήμα 6) δείχνει ότι το απταμερή ειδικά για τα μη μετασχηματισμένα κύτταρα HF δεσμεύονται επίσης στην ανάστροφων κλώνο ΗΑ, αλλά δεν προσδένονται στα μετασχηματισμένα κύτταρα SiHa. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα απταμερή εξελιχθεί κατά HF ανάστροφων κύτταρα είναι ειδικά για επίτοπα που χάθηκαν κατά τη διάρκεια της HPV-επαγόμενη μεταμόρφωση των τραχηλικών κυττάρων. Μελέτες που χρησιμοποιούν τα αντιδραστήρια απταμερούς για χρωματογραφία συγγένειας βρίσκονται σε εξέλιξη για τον καθαρισμό και την ταυτοποίηση των μακρομορίων που φιλοξενούν τα επιτόπια.

Εικόνες που απεικονίζει την μη μετασχηματισμένα ανάστροφων, κυτταρική γραμμή ΗΑ και το καρκίνο του τραχήλου κυτταρική γραμμή HPV-μετασχηματισμένα, SiHa, μετά από επώαση με σημασμένο FAM απταμερή. Τα απταμερή δημιουργούνται για να στοχεύουν το μη-μετασχηματισμένο ανάστροφων, HF κυτταρική γραμμή αναγνωρίζουν επίσης την μη-μετασχηματισμένα ανάστροφων, ΗΑ κυτταρική γραμμή. Επίσης παρατηρήστε ότι αυτά τα απταμερή δεν αναγνωρίζουν επίτοπους επί του τραχηλικού κυτταρική σειρά καρκίνου SiHa, παρόμοια με τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν με το καρκίνο του τραχήλου κυτταρική γραμμή HeLa. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με την υπόθεση ότι αυτοί οι απταμερή αναγνωρίζουν επίτοπους που χάνονται ως αποτέλεσμα της μεταμόρφωση των επιθηλιακών κυττάρων του τραχήλου της μήτρας από HPV. Όλες οι εικόνες είναι 40 × και των κυττάρων μέσα σε 24 ώρες μετά την επώαση με το 2000 απταμερή nM και η επακόλουθη καθήλωση και coverslipping με Aquamount.

Η

Συζήτηση

Εξαιρετικά ευαίσθητη και ειδική βιοδείκτες είναι εξαιρετικά χρήσιμες για τη διάγνωση, τη θεραπεία και την πρόγνωση των περιπτώσεων καρκίνου. Κυττάρου-SELEX είναι ένα

in vitro

διαδικασία μέσω της οποίας τα απταμερή μπορούν να επιλέγονται από την ικανότητά τους να συνδέονται διαφορικά με κύτταρα [14], χωρίς καμία προηγούμενη γνώση του κυτταρικές αλλαγές. Τα απταμερή μπορεί να δεσμεύεται με υψηλή συγγένεια και ειδικότητα σε μία ποικιλία μορίων [15], [16], [17] και προσφέρουν μια μοναδική εναλλακτική λύση για αντισώματα τα οποία είναι πολύ μεγαλύτερα, εύκολα υποβαθμισμένη, δαπανηρή και χρονοβόρα για την ανάπτυξη, και απαιτούν ο χρήση ζώων [18]. Νουκλεϊκού οξέος με βάση-απταμερή συντίθενται εύκολα και μπορεί να υποστεί αναστρέψιμη μετουσίωση για ενίσχυση PCR. Μπορούν επίσης να αναγνωρίσουν μικρά μόρια όπως τοξίνες [19], [20] και μόρια τα οποία δεν είναι μη-ανοσογόνα σύμπλοκα [21] και απταμερή μπορεί εύκολα να τροποποιηθεί με μόρια ανταποκριτές ή άλλα μόρια για την ενίσχυση των ιδιοτήτων τους (δηλαδή ημιζωή) [18 ]. Τα απταμερή υιοθετούν επίσης μοναδική αλληλουχία-εξαρτώμενη τρισδιάστατα σχήματα, έτσι ώστε να είναι κατά μία έννοια, βιβλιοθήκες σχήμα και μπορεί να δεσμεύεται σε ένα κύτταρο με βάση την αλληλουχία, διαμόρφωση και /ή το φορτίο τους μέσω αλληλεπιδράσεων με θύλακες σύνδεσης, δεσμούς υδρογόνου, στοίβαξη των αρωματικών δαχτυλίδια, δυνάμεις van der Waals, ή ένας συνδυασμός αυτών [22]. Τα απταμερή μπορεί να παρεμβαίνουν με τις αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, ανταγωνίζονται για και παρεμβαίνει με θέσεις πρόσδεσης, να παρεμποδίσουν την προσκόλληση του ιού-κυττάρου, η μεταγραφή και η μετάφραση mRNA [23]. Λόγω του μικρού μεγέθους τους, απταμερή μπορεί επίσης να είναι σε θέση να έχουν πρόσβαση επιτόπων που είναι συνήθως μπλοκάρει /κρυμμένη σε άλλους ανιχνευτές /θεραπευτική. Αυτές οι επιθυμητές ιδιότητες, την πολυτέλεια απταμερή τη δυνατότητα να χρησιμεύσουν ως θεραπευτικοί παράγοντες [21], [24], [25], [26], [27].

Τα απταμερή έχουν ήδη χρησιμοποιηθεί στη βιολογία του καρκίνου και θεραπεία του καρκίνου [28], [29], [30]. Χρησιμοποιώντας κύτταρο-SELEX, οι ερευνητές έχουν εντοπίσει υψηλής συγγένειας απταμερών που αυξάνουν την ευαισθησία του καρκίνου του παγκρέατος σε χημειοθεραπευτικά [31], να παραδίδουν θεραπευτικά σε καρκινικά κύτταρα [32] ή να αναγνωρίσουν τα καρκινικά κύτταρα σε βιολογικά δείγματα [8], [9]. SELEX επέτρεψε επίσης ερευνητές να προσδιορίσουν απταμερή τα οποία στοχεύουν μετασχηματισμός-ειδικά αντιγόνα, όπως οι HPV-16 Ε6 και Ε7 ογκοπρωτεϊνών, σε εκχυλίσματα του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων [33], [34]. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι AC-SELEX μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό δεικτών κυτταρικής επιφάνειας που έχουν αλλοιωθεί κατά τη διάρκεια της μετατροπής των κυττάρων HPV-επαγόμενη.

Για να εξελιχθεί απταμερών που διαφοροποιούν τα κύτταρα HPV-μετασχηματισμένα από μη-μετασχηματισμένα τραχήλου κύτταρο χωρίς

προηγούμενη

επιλογή των επιτόπων ή στόχων, προσαρμόσαμε ολικού κυττάρου-SELEX για χρήση σε προσφυόμενων κυτταρικών σειρών (Εικόνα 1). Χρησιμοποιώντας αυτή την προσέγγιση, εντοπίσαμε και ανεξάρτητα επικυρωμένες απταμερή τα οποία έχουν υψηλή συγγένεια για πρωτεΐνες ή αντιγόνα κυτταρικής επιφάνειας που είναι ειδικά για και υπάρχουν επί της επιφανείας του μη καρκινογενής αναστροφών των κυττάρων HeLa, αλλά δεν είναι παρούσα στην HPV μετασχηματισμένο τραχηλικού κυτταρικές γραμμές καρκινώματος (Σχήμα 3 ). Είναι σημαντικό ότι, δύο ανεξαρτήτως που προέρχονται ανάστροφων κυτταρικές γραμμές (HF και ΗΑ) συνεχίζουν να εκφράζουν τις ογκοπρωτεΐνες HPV Ε6 και Ε7, αλλά σε αντίθεση με τα γονικά κύτταρα HeLa, οι γραμμές HF και ΗΑ κύτταρο έχει μια μη-μετασχηματισμένα μορφολογία, επαφή ανέστειλε ανάπτυξη, μείωσε σημαντικά την κλωνοποίηση αποδοτικότητα σε μαλακό άγαρ, και η αδυναμία να σχηματίζουν όγκους σε γυμνούς ποντικούς [10], [11]. Σε μία μόνο οθόνη, ήμασταν σε θέση να προσδιορίσει ένδεκα αλληλουχίες μοναδικές απταμερούς που αναγνωρίζουν ειδικά και δεσμεύονται με συνδέτες που υπάρχουν επί των μη μετασχηματισμένα κύτταρα ανάστροφων HF, αλλά όχι επί των κυττάρων HeLa (Πίνακας 1). Με βάση τα αποτελέσματά μας, απταμερή 13, 20 και 28 συνδέονται με HF επιτόπια ειδική επιφάνεια των κυττάρων, ενώ απταμερές 14 δεσμεύει την επιφάνεια του κυττάρου και να εσωτερικοποιείται στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων (Εικόνα 4). Η ικανότητα να καταργήσει πρόσδεση με προεπεξεργασία των κυττάρων με πρωτεάση απταμερές πρότεινε ότι τρεις από τους τέσσερις απταμερών ελέγχθηκαν αναγνωρίζονται επιτόπια πρωτεϊνών κυτταρικής επιφάνειας. Το απταμερές 14 ήταν σε θέση να εισέλθουν πρόσδεσης των κυττάρων ανεξάρτητα από πρωτεΐνη επιφανείας κυττάρου, ή ήταν αναγνωρίζοντας μια πρωτεάση ανθεκτική κυτταρικής επιφάνειας που εσωτερικοποιείται επίτοπο το σύμπλοκο απταμερές. Μαζί αυτά τα ευρήματα έδειξαν ότι AC-SELEX ήταν σε θέση να εξελιχθεί απταμερή, τα οποία αναγνωρίζουν τις μεταβολές των μακρομορίων κυτταρικής επιφάνειας που διαφοροποιούν την ογκογόνο από μη ογκογόνων HPV-μολυσμένα κύτταρα, υποδηλώνοντας χρησιμότητα ως διαγνωστικοί ανιχνευτές.

Για να διερευνήσουν το δυναμικό τους προγνωστικούς , απταμερή 13, 14, 20 και 28 ελέγχθηκαν με ένα ανεξάρτητο καρκίνο του τραχήλου κυτταρική σειρά HPV-θετικά, SiHa, και ένα πρόσθετο, μη ογκογόνων ανάστροφων κυτταρική γραμμή, ΗΑ. Σημαντικά, παρατηρήσαμε ότι οι απταμερή έκαναν αναγνωρίζουν επίτοπους τους στην μη ογκογόνα κύτταρα ΗΑ, αλλά δεν δεσμεύτηκε με τα ογκογόνα κύτταρα SiHa (σχήμα 6), υποστηρίζουν την υπόθεση ότι οι απταμερή αναγνωρίζουν δείκτες χάνονται κατά τη διάρκεια HPV μεσολάβηση μετασχηματισμό των επιθηλιακών κυττάρων του τραχήλου της μήτρας . Δεδομένου ότι οι κυτταρικές σειρές HF, ΗΑ και HeLa είναι ισογονικούς, αναμένουμε οι διαφορές στη γονιδιακή έκφραση που δεν σχετίζονται με το μετασχηματισμό να είναι ελάχιστες, και ως εκ τούτου, ότι οι απταμερή εξελιχθεί είναι πιθανό να αναγνωρίσει σημαντικές βιοδείκτες και επιτόπια ενδεικτικό του τραχήλου της μήτρας κυττάρων ογκογονικότητας. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα απταμερή δημιουργούνται από AC-SELEX έχουν την ικανότητα να αναγνωρίζουν κατά προτίμηση υψηλά ογκογόνα τραχήλου καρκινικές κυτταρικές γραμμές σε σχέση με μη ογκογόνα τραχήλου αναστροφών καρκινική κυτταρική γραμμή.

Εν περιλήψει, η παρούσα μελέτη κατέδειξε την σκοπιμότητα των προσκολλημένων Κυττάρου-SELEX καθώς και τη χρησιμότητά του στην ανίχνευση επιτόπων που χάνονται ως αποτέλεσμα της μεταμόρφωση των επιθηλιακών κυττάρων του τραχήλου της μήτρας από HPV. Πάνελ απταμερών όπως αυτές, εξελίχθηκε κατά διαφορετικών κυτταρικών γραμμών όγκου για τη διάκριση τύπους καρκίνου και υποτύπων μπορεί να είναι χρήσιμη χρησιμοποιηθούν για τη συσχέτιση διάγνωση και πρόγνωση και να καθορίσει τη χημειοθεραπεία και την ασθένεια επιδεκτικότητα (δηλαδή γενετικές διαφορές).

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Η πρώιμη δίοδος ATCC CCL2 κλώνο κυττάρων HeLa, καθώς και η κυτταρική γραμμή καρκινώματος του τραχήλου SiHa ελήφθησαν από την American Type Culture Collection. HF και ΗΑ κύτταρα ελήφθησαν από πειράματα που έγιναν προηγουμένως στα οποία η επιλογή του μη μεταμορφωμένες αναστροφών λήφθηκε με βάση την απώλεια της ροδαμίνης 123 από τα μιτοχόνδρια των κυττάρων [11]. HeLa, HF, ΗΑ και SiHa κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco Τροποποιημένο Μέσο Eagle (Gibco) με 10% ορό εμβρύου μόσχου και 1% διάλυμα πενικιλλίνης-στρεπτομυκίνης.

SELEX Βιβλιοθήκη και εκκινητές

Μονοκάναλες έλικος αλληλουχίες DNA με 52 τυχαία νουκλεοτίδια που πλαισιώνεται από γνωστές θέσεις εκκινητή 18-nt ελήφθησαν από Integrated DNA Technologies. Οι αλληλουχίες των εκκινητών ήταν 5′-ATACCAGCTTATTCAATT και 5′-AGA TAG ΤΑΑ ΟΤΟ CAA TCT. Η FAM ετικέτα εναύσματα δημιουργήθηκαν ως 5′-φώνων ATACCAGCTTATTCAATT και η βιοτίνη σεσημασμένων εναύσματα δημιουργήθηκαν ως 5′-Βιοτίνη-AGATTGCACTTACTATCT.

Διαδικασίες SELEX

Πριν ξεκινήσετε, μια αρχική βιβλιοθήκη περίπου 1,6 × 10

15 απταμερή επωάστηκε με το μη-στόχος κύτταρα HeLa και στη συνέχεια ανακτήθηκαν και προετοιμάστηκαν για τον πρώτο γύρο του AC-SELEX οι μη δεσμευμένο απταμερή. Πριν από κάθε γύρο, απταμερή μετουσιώθηκαν με θέρμανση στους 95 ° C για 5 λεπτά και στη συνέχεια εν συντομία ψύχθηκε σε πάγο για 2 λεπτά. Για κάθε γύρο επωάσεων, 3 × 10

5 HF κύτταρα ξεπλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν επί πάγου με τη βιβλιοθήκη απταμερές σε ρυθμιστικό (1% BSA σε PBS με άλατα) δέσμευση υπό ήπια ανάδευση. Τα κύτταρα στη συνέχεια ξεπλύθηκαν με PBS και τα απταμερή τα οποία δεσμεύονται με τα κύτταρα ΗΡ εκλούστηκαν με την προσθήκη του ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης (100 mM NaCl, 10 mM Tris 7.5, 1 mM EDTA και 1% SDS) και ανακτήθηκε με χρήση του prep Hirt DNA μέθοδο [35], η οποία εμπλέκεται από εκχύλιση με φαινόλη, εκχύλιση φαινόλης-χλωροφορμίου, εκχύλιση χλωροφορμίου. Έχουμε ενσωματωθεί επίσης ένα βήμα πίσω-εκχύλισης ώστε να εξασφαλιστεί επαρκής ανάκτηση απταμερούς. Το γονιδιωματικό ϋΝΑ στη συνέχεια απομακρύνθηκε από το διάλυμα αιθανόλης. Τα απταμερή ανακτήθηκαν από το διάλυμα με καταβύθιση με αιθανόλη (3 Μ NaOAc σε 100% αιθανόλη) και αφήνεται να κατακαθίσει όλη τη νύκτα στους -20 ° C. Το δείγμα που προέκυψε στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε και το σφαιρίδιο πλένεται δύο φορές με 70% αιθανόλη και αφήνονται να στεγνώσουν. Το δισκίο ακολούθως ανασυστάθηκε σε ρυθμιστικό σύνδεσης και επωάστηκαν με 10 κύτταρα

6 HeLa για απταμερούς αντι-επιλογής. Τα κύτταρα στη συνέχεια ξεπλύθηκαν με PBS και τα μη δεσμευόμενα απταμερή ανακτήθηκαν από αυτή τη έκπλυμα χρησιμοποιώντας και πάλι την μέθοδο Hirt, συμπεριλαμβανομένης μιας βήμα πίσω-εκχύλιση, που ακολουθείται από καταβύθιση αιθανόλης απταμερών. Οι προκύπτουσες βιβλιοθήκες απταμερές στη συνέχεια ενισχύθηκαν μέσω PCR με βιοτίνη σημασμένη αστάρι και ένα μη-βιοτίνης-tagged εκκινητή (Integrated DNA Technologies), και τα προκύπτοντα διπλού κλώνου απταμερή στη συνέχεια διαχωρίστηκαν με χρήση επικαλυμμένων με στρεπταβιδίνη σφαιριδίων και φυγοκέντρηση στήλη για να διαχωριστεί το ανεπιθύμητο βιοτίνη-tagged ακολουθία από την επιθυμητή ακολουθία απταμερούς (Βλέπε PCR και απταμερές Strand Διαχωρισμός). Τα προκύπτοντα μονόκλωνα απταμερή στη συνέχεια καταβυθίστηκε και χρησιμοποιούνται για τον επόμενο γύρο του AC-SELEX.

PCR και απταμερές Strand Διαχωρισμός

Τα απταμερή προκύπτει από το στάδιο αντι-επιλογής ανασυστάθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης (100 mM NaCl, 10 mM Tris 7.5, 1 mM EDTA και 1% SDS) και ενισχύθηκαν μέσω PCR με βιοτίνη-σημασμένη εκκινητές (94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 46 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 72 ° C για 30 sec) σε μια Eppendorf-AG 22331 θερμοκυκλωτή (Αμβούργο, Γερμανία). Οι συνθήκες για την ενίσχυση PCR του απταμερούς βιβλιοθηκών διαφέρει από εκείνη των ομοιογενών DNA. PCR βελτιστοποιήθηκε γύρω από την εκτέλεση 18 γύρους AC-SELEX. Η έρευνα με μια τυχαία νουκλεοτιδίων αυτού του παρόμοιου μήκους έδειξε ότι ο σχηματισμός του προϊόντος φθάνει ένα μέγιστο σε 18 γύρους και αν είναι πάνω από 20 γύρους PCR εκτελούνται, υποπροϊόντα αρχίζουν να διαμορφώνουν και υπάρχει κίνδυνος πλήρους απώλειας του προϊόντος απταμερούς [36 ]. Τα προκύπτοντα βιοτίνης-tagged δίκλωνο απταμερή κατόπιν έβρασαν για 5 λεπτά, ψύχθηκε στιγμιαία σε παγωμένο νερό για 3 λεπτά, και επωάζονται με στρεπταβιδίνη σφαιρίδια επικαλυμμένα σε ρυθμιστικό στήλη πρόσδεσης (20 mM Ν & ΡΟ4, 150 mM NaCl) πριν από την φυγοκέντρηση στήλη. Τα προκύπτοντα μονόκλωνα απταμερή κατακρημνίστηκαν από τη στήλη ρέει διαμέσου μέσω καταβύθιση αιθανόλης. Το σφαιρίδιο απταμερές ακολούθως ανασυστάθηκε σε PBS με 1% BSA και το διάλυμα αυτό απταμερούς χρησιμοποιήθηκε για τον επόμενο γύρο του AC-SELEX.

απταμερές Cloning

Μετά από 18 γύρους SELEX AC-η προκύπτον πισίνα απταμερούς ενισχύθηκε με PCR με μη τροποποιημένο εκκινητές. Η προκύπτουσα βιβλιοθήκη απταμερές στη συνέχεια συνδέθηκε σε πλασμίδια και κλωνοποιήθηκε σε Escherichia coli χρησιμοποιώντας το κιτ

ΤΟΡΟ ΤΑ

κλωνοποίησης

περιέχουν pCR®2.1-

ΤΟΡΟ

® (

Invitrogen

, K4500-01). Τα πλασμίδια καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN, 27106). Οι συγκεντρώσεις του προκύπτοντος καθαρισμένου πλασμίδια προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το Nanodrop ΤΜ 1000 Φασματοφωτόμετρο (Thermo Scientific). PCR ακολουθούμενη από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή στη συνέχεια διεξήχθη επί των καθαρισμένων δειγμάτων πλασμίδιο για να εξασφαλιστεί ένα ένθετο του κατάλληλου μήκους.

απταμερές Sequencing

δίκλωνο απταμερή αλληλουχήθηκαν χρησιμοποιώντας το Μ13 προς τα εμπρός και αντίστροφοι ενάρκτες παρέχονται η TOPO 10 κιτ κλωνοποίησης. Πλασμίδια αλληλουχία από το Πανεπιστήμιο Ιατρικής και Οδοντιατρικής του Νιου Τζέρσεϋ DNA πυρήνα Διευκόλυνσης (Piscataway, NJ).

Πτυσσόμενα DNA Προγνωστικά

Οι δευτερεύουσες δομές των απταμερών μονόκλωνου DNA είχαν προβλεφθεί χρησιμοποιώντας UNAfold λογισμικού mfold (https://mfold.rna.albany.edu). Οι δομές που παρουσιάζονται είναι έξοδος από sir_graph ® αναπτύχθηκε από τον Δ Steward και Μ Zuker [13].

Απεικόνιση των κυττάρων-Απταμερές Συγκροτήματα

FAM 5′-tagged απταμερή συντέθηκαν από το Ολοκληρωμένο DNA τεχνολογίες. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλακίδια θαλάμου, αναπτύχθηκαν επί μία νύκτα, πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια αφέθηκε να επωαστεί με το σημασμένο με φθορισμό απταμερές (ες) σε PBS με 1% BSA σε πάγο για 45 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια ξεπλύθηκαν με PBS πριν από τη μονιμοποίηση με 4% παραφορμαλδεΰδη. Τα σταθερά κύτταρα στη συνέχεια ξεπλύθηκαν με PBS και γρήγορα με ϋΝάση ελεύθερη νερό και τα συναρμολογημένα χρησιμοποιώντας Aquamount (Polysciences, Inc.). Cell-bound απταμερή στη συνέχεια απεικονίζονται χρησιμοποιώντας ένα Leica μικροσκόπιο συνεστιακό.

φθορισμού Ποσοτικοποίηση Ανάλυση

Ο φθορισμός των συμπλοκών απταμερούς-κυττάρων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Leica Lite. Τα κύτταρα απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα Leica μικροσκόπιο συνεστιακό και ατομικά ποσοτικά με τη χρήση του λογισμικού Leica Lite. Τέσσερις κύτταρα προσδιορίστηκαν ποσοτικά ανά σημείο δεδομένων μετά την αφαίρεση του υποβάθρου. Ο μέσος φθορισμός γράφημα με τις μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα του μέσου για κάθε σημείο δεδομένων. Φαινόμενες τιμές Kd για κάθε απταμερές προσδιορίστηκαν με μη γραμμική παλινδρόμηση για την επί τόπου πρόσδεσης σύμφωνα με την εξίσωση: Y = Bmax * X /(Kd + Χ) χρησιμοποιώντας GraphPad Prism version 5.04 για Windows (GraphPad Software, La Jolla California USA, www. graphpad.com [37].

πρωτεϊνάση Κατεργασία Κυττάρων

Σχεδιάσαμε διαδικασία μας AC-SELEX για να επιτρέψει για την πρόσδεση στην επιφάνεια επίτοπους πρωτεΐνης η οποία μπορεί να είναι ευαίσθητα σε πρωτεϊνάσες απταμερές. προκειμένου να προσδιοριστεί η οποία επιτόπων απταμερούς ήταν ευαίσθητα στις πρωτεάσες, υποβάλλαμε σε αγωγή τα κύτταρα στόχους με πρωτεάσες τουλάχιστον 4 φορές για κάθε πρωτεϊνάσης και απταμερούς και προσδιορίζεται δεσμευτικός απταμερούς. τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,05% θρυψίνη και 0,53 mM EDTA σε HBSS ή 0,1 mg /ml πρωτεϊνάση Κ σε PBS στους 37 ° C για 2 άτομα και 10 λεπτά. Τα κύτταρα στόχοι αντιμετωπίζονται πρωτεϊνάση χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια για τη σύνδεση με φθορισμό επισημασμένο απταμερούς όπως περιγράφεται παραπάνω.

Ευχαριστίες

θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε τον Δρ Denise Galloway για τον καρκίνο του τραχήλου γραμμή κυττάρων SiHa, ο Δρ Πολ Τόμας και ο Δρ Κάρολ Gardner για βοήθεια σχετικά με τον εξοπλισμό και τα πρωτόκολλα, και Christal Lewis για τη βοήθειά της με τη βελτιστοποίηση της PCR.