Αφηρημένο

Ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η δεύτερη κύρια αιτία θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο, μετά τον καρκίνο του πνεύμονα, στους άνδρες από τις ανεπτυγμένες χώρες. Στα πρώιμα στάδια της, πρωταρχικός ανάπτυξη του όγκου εξαρτάται από την ανδρογόνα, έτσι γενικά μπορεί να ελεγχθεί με θεραπεία στέρησης ανδρογόνων (ADT). Τελικά όμως, η νόσος εξελίσσεται σε ευνουχισμό ανθεκτικά καρκίνου του προστάτη (CRPC), ένα θανατηφόρο μορφή που έχει ανάγκη μιας πιο αποτελεσματικές θεραπείες. υποδοχείς που συνδέονται με G-πρωτεΐνη (GPCRs) περιλαμβάνουν ένα μεγάλο φυλή των πρωτεϊνών επιφανείας κυττάρου που έχουν ενοχοποιηθεί ως θεραπευτικοί στόχοι στην ανάπτυξη και εξέλιξη PCa. Τα ευρήματα που αναφέρονται εδώ παρέχουν ενδιαφέρουσες ενδείξεις ενός ρόλου για το νέο χαρακτηρίζεται GPR158 μέλος της οικογένειας του γλουταμινικού στην ανάπτυξη και εξέλιξη του προστάτη. Βρήκαμε ότι GPR158 προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του προστάτη ανεξάρτητη από υποδοχέα ανδρογόνων (AR) λειτουργικότητα και ότι αυτό απαιτεί τον εντοπισμό του στον πυρήνα του κυττάρου. Αυτό υποδηλώνει ότι GPR158 δρα με μηχανισμούς διαφορετικούς από άλλους GPCRs. έκφραση GPR158 διεγείρεται από τα ανδρογόνα και GPR158 διεγείρει την έκφραση AR, υποδηλώνοντας μια πιθανή να ευαισθητοποιήσει τους όγκους σε συνθήκες χαμηλού ανδρογόνων κατά τη διάρκεια ADT μέσω μιας θετικής ανάδρασης. Περαιτέρω, βρήκαμε έκφραση GPR158 συσχετίζεται με ένα νευροενδοκρινή (ΝΕ) φαινότυπο διαφοροποίησης και προάγει σχηματισμό αποικίας ανεξάρτητη από προσκόλληση υποδηλώνοντας ένα ρόλο για GPR158 στη θεραπευτική εξέλιξη και ο σχηματισμός όγκων. έκφραση GPR158 αυξήθηκε στο μπροστινό εισβολή των όγκων του προστάτη που σχηματίστηκε στο γενετικά ορίζεται υπό όρους

ΡΤΕΝ

knockout μοντέλο ποντικού, και συν-εντοπισμένη με αυξημένη έκφραση AR στον πυρήνα του κυττάρου. Ανάλυση Kaplan-Meier σε ένα σύνολο δεδομένων από την πύλη του γονιδιώματος του καρκίνου Memorial Sloan Kettering έδειξε ότι η αυξημένη έκφραση GPR158 σε όγκους συνδέεται με χαμηλότερη ελεύθερη νόσου επιβίωση. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν έντονα ότι τα φαρμακευτικά προϊόντα που στοχεύουν δραστηριότητες GPR158 θα μπορούσε να αποτελέσει μια νέα και καινοτόμο προσέγγιση για την πρόληψη και τη διαχείριση των CRPC

Παράθεση:. Patel Ν, ΙίακιίΓα Τ, Jeong S, Liao CP, Roy-Burman P, Zandi Ε, et al. (2015) Έκφραση και λειτουργικό ρόλο των ορφανών υποδοχέων GPR158 στον προστάτη ανάπτυξη του καρκίνου και της προόδου. PLoS ONE 10 (2): e0117758. doi: 10.1371 /journal.pone.0117758

Ακαδημαϊκό Συντάκτης: Craig Ν Robson, Βόρεια Ινστιτούτο για την Έρευνα του Καρκίνου, ΗΝΩΜΕΝΟ ΒΑΣΙΛΕΙΟ

Ελήφθη: 7, Αυγούστου 2014? Αποδεκτές: 23 Δεκεμβρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 18 του Φλεβάρη 2015

Copyright: © 2015 Patel et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας επιχορηγήσεων [R01-EY09828] για να ΥΠΟΙΟ και [R01-CA136924] στο GAC. Το βραβείο Robert E. και τον Μάιο του R. Ίδρυμα Ράιτ να NP και ΥΠΟΙΟ παρείχε επίσης υποστήριξη για τη διεξαγωγή αυτής της μελέτης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχει τα ακόλουθα ανταγωνιστικά συμφέροντα. Nitin Patel και Μ Elizabeth Fini είναι συν-εφευρέτες σε προσωρινή αίτηση διπλώματος ευρεσιτεχνίας των ΗΠΑ με τίτλο «GPR158 ως νέο στόχο για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη», που εφαρμόζεται από το Πανεπιστήμιο της Νότιας Καλιφόρνιας (USC). Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

G-πρωτεΐνες υποδοχείς (GPCRs) αποτελούνται από μια μεγάλη φυλή των πρωτεϊνών κυτταρικής επιφάνειας που εκτελούν ποικίλες κυτταρικές λειτουργίες. GPCRs ανιχνεύει πληροφορίες σχετικά με το περιβάλλον και τυπικά μετάγουν ένα σήμα στο κύτταρο μέσω δέσμευσης και ενεργοποίηση των ετεροτριμερών G πρωτεϊνών κατόπιν εξωκυττάριας δέσμευσης συνδέτη [1]. Τα μέλη αυτής της φυλής έχουν μεγάλο βαθμό αξιοποιηθεί για την ανακάλυψη φαρμάκων και ένα μεγάλο κλάσμα που χρησιμοποιούνται σήμερα ναρκωτικών στις στόχων αγορά GPCRs [2]. GPCRs ταξινομούνται σε επτά οικογένειες μέσω φυλογενετική ανάλυση των καθοριστικό χαρακτηριστικό τους: το domain επτά διαμεμβρανικές (7ΤΜ) [1]. Η οικογένεια γλουταμινικό GPCR περιέχει 7 ορφανοί υποδοχείς, τρεις ανήκουν στον κλάδο υποδοχέα οξύ γάμμα-αμινοβουτυρικό: GPR156, GPR158, και GPR179 [3,4]. GPR179 δείχθηκε πρόσφατα να απαιτείται για αποπόλωσης λειτουργία διπολική κυττάρων στον αμφιβληστροειδή, και οι μεταλλάξεις προκαλούν αυτοσωμική υπολειπόμενη πλήρης συγγενής σταθμευμένο τύφλωση νύχτας [5,6]. Δύο πολύ πρόσφατες δημοσιεύσεις παρέχουν την πρώτη χαρακτηρισμό GPR158 [7,8]. Η πρώτη προσδιορίζονται έκφραση GPR158 σε αμφιβληστροειδούς διπολική νευρώνες και επέδειξε μια ασυνήθιστη ρόλο ως πρωτεΐνη ικρίωμα μεμβράνης του πλάσματος, που λειτουργούν για να αναστέλλουν σηματοδότηση από GPCRs που συνδέουν με την ανασταλτική οικογένεια πρωτεϊνών Galpha με σύνδεση προς Gbeta5 και στρατολόγηση μελών της οικογένειας R7 της ΟΤΡάσης Ενεργοποίηση Πρωτεΐνες (διάκενα) με τη μεμβράνη του πλάσματος [7]. Η δεύτερη έκδοση ήταν από το εργαστήριο μας [8]. Προσδιορίσαμε έκφραση GPR158 σε κύτταρα δοκιδωτού (ΤΒΜ) σε υδατικό οδούς εκροής του ματιού και του ρόλου της στη ρύθμιση της λειτουργίας του φραγμού των κυττάρων, ενδεχομένως συμβάλλουν στην παθοφυσιολογία των στεροειδών που προκαλείται από οφθαλμική υπερτονία και γλαύκωμα.

Ψάχνοντας για άλλα πιθανούς ρόλους για GPR158, έχουμε προσδιορίσει μια δημοσιευμένη μελέτη μικροσυστοιχίας δείχνει GPR158 ως ένα από τα γονίδια ρυθμίζεται αυξητικά σε ανδρογόνων ανθεκτικά μεταστατικού όγκου σε σύγκριση με πρωτογενείς όγκους του προστάτη [9]. Μια άλλη μελέτη μικροσυστοιχίας γονιδιακής έκφρασης έδειξε ρύθμιση προς τα κάτω του GPR158 με απόσυρση των οιστρογόνων σε ανθρώπινα οιστρογόνα ευαίσθητα κύτταρα καρκίνου του στήθους, ή με ταμοξιφένη (αντι-οιστρογόνο) θεραπεία [10]. Ίσως δεν είναι τυχαίο ότι και οι δύο τύποι καρκίνου περιλαμβάνουν μεταβληθεί απάντηση σε στεροειδείς ορμόνες. Ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η δεύτερη κύρια αιτία θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο μετά τον καρκίνο του πνεύμονα στους άνδρες από τις ανεπτυγμένες χώρες [11]. Αρχικά, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων του προστάτη εξαρτάται από τα ανδρογόνα, έτσι η θεραπεία αποστέρησης ανδρογόνων (ADT) είναι η κύρια θεραπεία για τους ασθενείς με τοπικά προχωρημένο προστάτη. ADT παρέχει ύφεση της νόσου σε περισσότερα από 90% των ασθενών, ωστόσο η διάρκεια της ανταπόκρισης είναι συνήθως 2-3 έτη. Παρά ADT θεραπεία, μεταστατικό προστάτη και επαναλαμβανόμενες δηλώσεις της νόσου μετά την αποτυχία των εντοπισμένων θεραπείες [12], μια διαδικασία γνωστή ως ευνουχισμός ανθεκτικά προστάτη (CRPC). Συνολικά, μεταστατικό CRPC ασθενείς έχουν ένα διάμεσο χρόνο επιβίωσης μόνο 16-18 μήνες και η νόσος παραμένει ανίατη [13].

Είναι ευρέως αποδεκτό ότι CRPC αναπτύσσεται μέσω πολλαπλών μηχανισμών, συμπεριλαμβανομένων των υποδοχέων των ανδρογόνων (AR) εξαρτώμενη οδών όπως ενίσχυση AR και υπερέκφραση [14]? σύνθεση τοπικές ανδρογόνων [15]? αλλοιωμένη έκφραση πρωτεϊνών AR συν-ενεργοποιητή και συν-καταστολέα? και AR-ανεξάρτητες πορείες, όπως οι εναλλακτικές οδούς επιβίωσης [16]. Στοχεύοντας στο μονοπάτι AR έχει αποδειχθεί ότι προσφέρουν την πιο εφικτή προσέγγιση για νέους θεραπευτικούς παράγοντες επειδή AR παραμένει ενεργή σε CRPC [17]. Μια άλλη πιθανή θεραπευτική εστίαση για τη θεραπεία του προστάτη είναι ο φαινότυπος των κυττάρων νευροενδοκρινείς (ΝΕ). Αυτός ο τύπος κυττάρου συμβαίνει σε διάσπαρτες εστίες εντός προστατικού αδενοκαρκινώματος, παρόμοια με την κατανομή του εντός του πόρου επιθηλιακά κύτταρα του φυσιολογικού προστάτη. Ωστόσο, η πυκνότητα των κυττάρων ΝΕ είναι συχνά μεγαλύτερη στα καρκινώματα του προστάτη από ό, τι σε κανονικό ιστό, και μελέτες έχουν δείξει ότι η διαφοροποίηση ΝΕ (NED) είναι εμπλουτισμένη σε υψηλής ποιότητας και υψηλής στάδιο όγκους, και συνδέεται στενά με την εμφάνιση των CRPC [18 -20]. Τα επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη πιστεύεται ότι transdifferentiate σε κύτταρα ΝΕ, οι οποίες φαίνονται να είναι διαφορετική από την ελάσσονα πληθυσμό κυττάρων ΝΕ παρόν σε φυσιολογικό προστάτη [18-20]. κύτταρα ΝΕ μπορεί να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό των γειτονικών κυττάρων αδενοκαρκινώματος σε κατάσταση ανδρογόνου πεινασμένο, οδηγώντας σε CRPC [21], η οποία υποστηρίζεται από τις παρατηρήσεις των υψηλότερων πολλαπλασιαστικής δείκτη εγγύς κυττάρων προστάτη σε κύτταρα ΝΕ σε σύγκριση με απώτερο καρκινικών κυττάρων [22, 23]. Επιπλέον, μελέτες καλλιέργειας κυττάρων έχουν αποδείξει ότι νευρορμονών και νευροπεπτίδια που εκκρίνονται από τα κύτταρα ΝΕ μπορεί να υποστηρίξει ανδρογόνων-ανεξάρτητη ανάπτυξη των κυττάρων του προστάτη [24,25]. Ωστόσο, η ακριβής προέλευση και οι αιτιολογικοί παράγοντες του NED παραμένουν άγνωστες. Ως εκ τούτου, η ταυτοποίηση νέων γονιδίων και μοριακών μηχανισμών στη σύνδεση αυτών πολλαπλές οδούς υπεύθυνες για παθογένεση του CRPC είναι κριτικά χρειάζεται για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων.

PCA είναι κατά κανόνα συνδέονται με γενετικές αλλοιώσεις που περιλαμβάνουν ανδρογόνων ευαισθησία και το AR [26] . Στην έκθεση αυτή, ερευνήσαμε την έκφραση, μοριακή ρύθμιση, υποκυτταρικό εντοπισμό και λειτουργικό ρόλο του GPR158 χρησιμοποιώντας ένα σύνολο τεσσάρων ανθρώπινων κυτταρικών σειρών προστάτη με διαφορετικές μεταβολές στην AR με αποτέλεσμα διάφορους βαθμούς ανδρογόνων-ανταπόκρισης, ανδρογόνο-ευαισθησία και έκφραση AR. Συνδυάζουμε αυτό με ένα μοντέλο και βιοπληροφορική ποντίκι προστάτη ανάλυση του ανθρώπινου συνόλων δεδομένων προστάτη. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η αύξηση της έκφρασης GPR158 είναι ένα σημαντικό ογκογόνος γεγονός που διεγείρει τον πολλαπλασιασμό και πρόοδο PCa κυττάρου και έτσι μπορεί να αντιπροσωπεύει μια καινοτόμο θεραπευτικό στόχο.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια

Πρωτογενή ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα προστάτη (PHPECs) αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) και διατηρήθηκαν, σύμφωνα με τις οδηγίες τους, χρησιμοποιώντας βασικό μέσο του προστάτη επιθηλιακό κύτταρο που περιέχει το κιτ ανάπτυξης των κυττάρων. Τέσσερις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές προστάτη διατηρήθηκαν σε ένα από τα εργαστήριά μας (Coetzee) χρησιμοποιήθηκαν σε αυτές τις μελέτες: LNCaP, C4-2B, PC-3 και DU145, όλα λαμβάνονται αρχικά από την ATCC. LNCaP και C4-2B κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο RPMI, ενώ DU145 και τα κύτταρα PC-3 αναπτύχθηκαν σε μέσο DMEM (Gibco-BRL, Bethesda, ΜΑ), και τα δύο περιέχουν 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) σε 5% CO

2 στους 37 ° C. Τα κύτταρα χωρίστηκαν κάθε 3 ημέρες.

Η κυτταρική γραμμή LNCaP καθιερώθηκε από ανθρώπινο λεμφαδένα μεταστατικής αλλοιώσεως προστατικού αδενοκαρκινώματος. LNCaP κύτταρα εκφράζουν το AR που φέρουν την κοινή μετάλλαξη T877A στο πεδίο σύνδεσης συνδετήρα, δημιουργώντας ευρεία στεροειδές ειδικότητα σύνδεσης. Έχουν αποκρίνονται στο ανδρογόνο, εμφανίζοντας διέγερση της ανάπτυξης όταν έλαβαν θεραπεία με ανδρογόνα, και είναι επίσης εξαρτώμενων από ανδρογόνα, που υποβάλλονται σε διακοπή της ανάπτυξης κατά την απόσυρση των ανδρογόνων [27-29]. Τα κύτταρα C4-2B προήλθαν από μια μετάσταση στα οστά που μεγάλωσε σε γυμνά ποντίκια μετά τον εμβολιασμό με τα LNCaP προερχόμενα, C4-2 κύτταρα ευνουχισμός ανθεκτικά [30,31]. Όπως και τα κύτταρα LNCaP, τα C4-2B κύτταρα που αποκρίνονται στο ανδρογόνο. Σε συμφωνία με αυτό, διατηρούν μια λειτουργική AR, αν και εμφανίζει χαμηλότερη συγγένεια για τα ανδρογόνα από την AR σε κύτταρα LNCaP [32]. Ωστόσο, σε αντίθεση με τα κύτταρα LNCaP, τα C4-2B κύτταρα ανδρογόνων-ευαίσθητο, διότι αμέσως μετά την απόσυρση των ανδρογόνων δεν υφίστανται διακοπή της ανάπτυξης [33]. Οι κυτταρικές γραμμές DU145 PC-3 και καθιερώθηκαν από προστατικού αδενοκαρκινώματος άνθρωπο, μεταστατικό στον εγκέφαλο ή των οστών, αντίστοιχα. Τα PC-3 και DU145 κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται σε αυτήν τη μελέτη είχαν προηγουμένως που χαρακτηρίζεται από ένα από τα εργαστήριά μας (Coetzee) [34]. Και οι δύο γραμμές ανδρογόνων-αποκρίνονται σε ανδρογόνο-αναίσθητη. Το PC-3

AR + υπο-γραμμή που χρησιμοποιείται σε αυτή τη μελέτη εκφράζει χαμηλά επίπεδα του mRNA και της πρωτεΐνης AR. Αν και αυτό δεν οδηγεί σε επαρκή λειτουργική πρωτεΐνη για να προσδώσει ανδρογόνων-ανταπόκρισης, έκτοπη έκφραση AR προκάλεσε σταθερά μια πολύ μεγαλύτερη ανταπόκριση μετενεργοποίηση σε αυτή την υπο-γραμμή σε σχέση με το PC-3

AR-υπο-line. Τα κύτταρα DU145 είναι AR αρνητικά. Πραγματοποιήσαμε δική μας κηλίδα western για να επιβεβαιωθεί η απουσία ή παρουσία πρωτεΐνης AR σε αυτές τις δύο σειρές (S1 Εικ.).

Θεραπεία της PHPEC, LNCaP και C4-2B κυττάρων με το ανδρογόνο, διυδροτεστοστερόνη (DHT, 10ηΜ ), διεξήχθη σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει 10% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό (CSS) για να καταστρέφουν τα ανδρογόνα. Για ανδρογόνων μελέτες πείνα, LNCaP, PC-3, DU145 και τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 10% CSS

Αντιδραστήρια και εναύσματα ολιγονουκλεοτιδίων

Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αγοράστηκαν ως εξής:. Lipofectamine LTX με αντιδραστήριο PLUS (Invitrogen, Carlsbad, CA)? πρωτογενή αντισώματα κατά του AR, ειδικό προστατικό αντιγόνο (PSA), νευρώνα ενολάση (NSE), τον υποδοχέα επιδερμικού παράγοντα ανάπτυξης (EGFR) και παράγοντα μεταγραφής Sp1, και συζευγμένη με υπεροξειδάση χρόνου δευτερογενή αντισώματα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)? αντι-ενδοκυτταρικό τομέα (ICD) και αντι-εξωκυτταρική περιοχή (ECD) αντισωμάτων GPR158 και αντι-άλφα-τουμπουλίνης αντισώματα (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, ΜΟ)? αντι-βήτα-ακτίνης αντισώματος (Abcam, Cambridge, UK)? υψηλής πιστότητας πολυμεράση DNA, Phusion (Finnzymes Inc., Woburn, ΜΑ)? ολιγονουκλεοτίδια εκκινητές (Valuegene INC, San Diego, CA)? απογυμνωμένο από ξυλάνθρακα εμβρυϊκό βόειο ορό (Atlanta Biologicals Inc., Lawrenceville, GA). Όλα τα άλλα αντιδραστήρια αγοράστηκαν από την Sigma. Ο Πίνακας 1 παρέχει τις ακολουθίες όλων των ολιγονουκλεοτιδίων εκκινητών που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη. Για νοκ ντάουν πειράματα, χρησιμοποιήσαμε μια ομάδα τριών έθιμο σχεδιαστεί siRNA ολιγονουκλεοτίδια (GenePharma Co. Ltd, Shanghai, Κίνα), η δραστηριότητα της οποίας χαρακτηρίζεται παρελθόν [8].

Η

ποσοτική πραγματικού χρόνου Αντίστροφη μεταγραφή-PCR (qRT-PCR)

Το συνολικό RNA απομονώθηκε από τις κυτταρικές σειρές προστάτη με Aurum συνολικό RNA μίνι κιτ (Bio-Rad, Hercules, CA) υποβλήθηκε σε ανάλυση qRT-PCR χρησιμοποιώντας iScript ένα βήμα RT- κιτ PCR με SYBR Green (Bio-Rad) για CFX96 Touch Real-Time Σύστημα ανίχνευσης PCR (Bio-Rad), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σχετική τιμές ποσοτικοποίηση των ενδιαφερόντων γονιδίων υπολογίστηκαν ως 2

-ΔΔCt με τη συγκριτική μέθοδο Ct, όπου ΔΔCt = (mRNA επεξεργασμένων δείγματος- γονιδίου αναφοράς Ct του επεξεργασμένου δείγματος Ct στόχος) – (Ct στόχος mRNA του ελέγχου δείγματος Ct γονίδιο αναφοράς του δείγματος ελέγχου). Χρησιμοποιήσαμε βήτα-ακτίνη ή GAPDH ως γονίδιο αναφοράς. Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται για την εκτίμηση της GPR158, AR, PSA και NSE έκφραση φαίνεται στον Πίνακα 1.

Ανάλυση Western Blot

Το σύνολο κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA) ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% δεοξυχολικό νάτριο, 1% ΝΡ-40) εμπλουτίστηκε με ένα κοκτέιλ αναστολέων πρωτεάσης για 20 λεπτά, ακολουθούμενο από φυγοκέντρηση στα 10.000 g για 10 λεπτά. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και πρωτεϊνών στα εκχυλίσματα διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE χωρίς βρασμό των δειγμάτων και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με πρωτογενές αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης του ενδιαφέροντος και αναπτύχθηκαν με χημειοφωταύγεια με διάλυμα αντιδραστήρια λουμινόλη ενισχυτή και διάλυμα υπεροξειδίου (GE Healthcare UK περιορισμένη, Buckinghamshire, UK) και οι εικόνες συλλήφθηκαν με σύστημα απεικόνισης Fujifilm (LAS-4000? Fujifilm, Τόκιο, Ιαπωνία). Πρωτεΐνη φόρτωση παρακολουθήθηκε με απογύμνωση και επανανίχνευσης της μεμβράνης με βήτα-ακτίνης αντισώματος.

κατασκευές έκφρασης

Τρία κατασκευάσματα έκφρασης (GPR158-pcDNA 3.1 (+), GPR158-GFP και GPR158-NLS -m1 + 2-GFP) που χρησιμοποιούνται για αυτές τις μελέτες έχουν περιγραφεί προηγουμένως [8]. Δημιουργήσαμε επίσης ένα άλλο κατασκεύασμα σύντηξης GPR158-GFP, που ορίζεται ως GPR158: ΔΟ (ΑΑ 1-665), με το σύνολο της διαγραφής ICD χρησιμοποιώντας κατάλληλα εναύσματα που παρατίθενται στον Πίνακα 1.

παροδική επιμόλυνση

Η υποδεικνύεται κύτταρα μορφομετατράπηκαν είτε με πλασμίδια έκφρασης ή κατασκευάσματα siRNA ή πλασμίδια ανταποκριτές προαγωγό χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine LTX σύμφωνα με τις οδηγίες του προμηθευτή. Εν συντομία, 1-2 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε 2 κ.εκ. πλήρους μέσου σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων και αναπτύχθηκαν μέχρι 70-80% συρροή. DNA (2 μ§) αραιώθηκε σε 500 μι Ορίί-ΜΕΜ Ι + PLUS αντιδραστήριο (2 μL), επωάστηκαν για 5 λεπτά, Lipofectamine LTX (4,5 μί) προστέθηκε και επωάστηκε για 30 λεπτά. μέσο των κυττάρων αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​2 αντιβιοτικά mL μέσο ελεύθερο και προστέθηκε το μίγμα, και επωάζονται για 6 ώρες. Μετά την επώαση, τα σύμπλοκα αντικαταστάθηκαν με πλήρες μέσο ανάπτυξης. Στις 3 ημέρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση είτε qRT-PCR ή στύπωμα Western ή κύτταρο καταμέτρηση.

Lentivirus Παραγωγή και Κυττάρων Μεταγωγή

GPR158 cDNA υποκλωνοποιήθηκε από το pcDNA 3.1 (+), τον φορέα έκφρασης που περιγράφεται παραπάνω, εντός του φορέα έκφρασης λεντοϊού pSLIK (Addgene, Cambridge, ΜΑ). Η παραγωγή φακοϊού και μόλυνση διεξήχθη όπως περιγράφεται [35]. Εν συντομία, το ιικό συσκευασία πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα ΗΕΚ 293Τ μετά από συν-επιμόλυνση του pSLIK-GPR158, δύο συσκευασιών πλασμίδια pMDLg /pRRE και pRSVREV, και το πλασμίδιο φακέλου VSV G χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000. Οι ιοί συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, και ο τα ιικά σωματίδια συμπυκνώθηκε. LNCaP κύτταρα μολύνθηκαν σε χαμηλή ΜΟΙ για να εξασφαλιστεί & lt? 30% συχνότητα λοίμωξης και τα σταθερά κύτταρα (Lenti-GPR158) δημιουργήθηκαν με επιλογή υγρομυκίνη στα 400 μg /mL για 4-WKS. Για την επαγωγή της GPR158, τα σταθερά κύτταρα LNCaP υπέστησαν αγωγή με 100 και 500 ng /mL δοξυκυκλίνης (Dox) για 72 ώρες. Τα κύτταρα LNCaP μολύνθηκαν με ιικά σωματίδια που παράγονται με μόνο φορέα pSLIK (Lenti-φορέα) χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος. Μετά 3 ημέρες της επαγωγής Dox, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε είτε κηλίδωση Western ή κύτταρο μετρήσεως ή προσδιορισμού υποκυτταρική κλασματοποίηση πρωτεΐνη ή προσδιορισμού σχηματισμού αποικίας μαλακού agar.

Υποκυτταρική κλασματοποίηση

Υποκυτταρική κλασματοποίηση διεξήχθη χρησιμοποιώντας υποκυτταρική κιτ πρωτεΐνη κλασματοποίηση σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Thermo Scientific Inc, Rockford, IL). Αυτό το κιτ έχει αποδειχθεί για την απομόνωση κυτταροπλασματική μεμβράνη, πυρηνική διαλυτή, χρωματίνη δεσμεύεται και κυτταροσκελετού κλάσματα επαρκούς καθαρότητας για μελέτες εντοπισμού πρωτεΐνης και ανακατανομή [36]. Εν συντομία, μια κλιμακωτή διαχωρισμός των κυτταρικών διαμερισμάτων από 3 × 10

6 υποδεικνύεται κυττάρων πραγματοποιήθηκε μετά την εφαρμογή του παρεχόμενου κυτταροπλασματικής, μεμβράνη, πυρηνική διαλυτά, χρωματίνη δεσμευμένη και πρωτεΐνη του κυτταροσκελετού ρυθμιστικά εκχύλισης. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης σε κάθε κλάσμα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ εκτίμησης πρωτεΐνης BCA (Thermo Scientific Inc.) και την ενδεικνυόμενη ποσότητα πρωτεΐνης υποβλήθηκε σε κηλίδωση Western.

Αποικίας Δοκιμασία Σχηματισμού

Ο lenti- GPR158 ή lenti-φορέα κυτταρικές γραμμές LNCaP χρησιμοποιήθηκαν για την δοκιμασία σχηματισμού αποικίας. Εν συντομία, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκα 12 φρεατίων (5000 κύτταρα /φρεάτιο). Τα κύτταρα αιωρήθηκαν σε άνευ ερυθρού φαινόλης RPMI-1640 που περιείχε 10% FBS, και% άγαρ 0,48, και επιστρώνονται πάνω σε ένα στερεό στρώμα από το ίδιο μέσο που περιείχε 0.8% άγαρ. Τα κύτταρα είτε επάγονται στο ανωτέρω μέσο που περιέχει 100 ng /mL Dox, ή αφέθηκαν χωρίς θεραπεία, με ήπια αναπλήρωση των μέσων ενημέρωσης τους κάθε 3 ημέρες. Μετά από επώαση 2 εβδομάδων, η πλάκα χρωματίστηκε με 0,005% κρυσταλλικό ιώδες (EMD Chemicals Inc, Gibbstown, NJ), αποχρωματίστηκε όλη τη νύκτα με PBS και οι αποικίες μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο και φωτογραφήθηκαν σε μεγέθυνση χ 20.

Ανοσοϊστοχημική (IHC) Ανάλυση της υπό όρους

PTEN

knockout Mouse

Η υπό όρους

PTEN

μοντέλο knockout ποντικών δημιουργήθηκε στο Πανεπιστήμιο της Νότιας Καλιφόρνιας με δύο από τους συν-συγγραφείς Η μελέτη αυτή [37]. IHC ανάλυση του GPR158 και έκφραση AR διεξήχθη σε όλα τα τρία (κοιλιακή, dorsolateral και πρόσθια) λοβούς που προέρχονται από τον προστάτη ενός ηλικίας 10-μηνών υπό όρους ομόζυγη

ΡΤΕΝ

knockout ποντικού (

ΡΤΕΝ

– /-) και ένα αντίστοιχο ίδιας ηλικίας ελέγχου (

PTEN

+ /+

). Εν συντομία, οι ιστοί του προστάτη μονιμοποιήθηκαν σε 4% φορμαλδεΰδη και τα μπλοκ δειγμάτων κόπηκαν σε 5 μm πάχους τομές, αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο, και επανυδατώθηκαν χρησιμοποιώντας μία φθίνουσα κλίση αιθανόλη ακολουθούμενη από έκπλυση με διπλά αποσταγμένο H

20. Για να ανακτήσετε αντιγονικότητα, πλακίδια επωάστηκαν με 10 mM κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ 6.0), πλύθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα 0.1 Μ φωσφορικό, αποκλείστηκαν με υπεροξείδιο του υδρογόνου 0,3% εντός μεθανόλης επί 15 λεπτά και με 5% ορό κατσίκας σε PBS για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα πλακίδια επωάστηκαν με αντι ICD-GPR158 αντίσωμα (1: 100) ή αντίσωμα αντι-AR (1: 200) σε 1% ορό κατσίκας σε 4 ° C όλη τη νύκτα και ακολούθησε επώαση με δευτερογενές αντίσωμα βιοτινυλιωμένο αντι-κουνελιού (Vector Laboratories, Burlingame , CA) για 1 ώρα και υπεροξειδάση κοχλιαρίας στρεπταβιδίνη (Vector Laboratories) για 30 λεπτά, και στη συνέχεια οπτικοποιήθηκαν με κιτ DAB (Vector Laboratories). Οι πλάκες στη συνέχεια βάφτηκαν αντίθετα με 5% (w /v) Harris αιματοξυλίνη. Τα πλακίδια που περιέχουν τομές παραφίνης του προστάτη από την κανονική και PCa ανθρώπινα υποκείμενα δόθηκαν από τον πυρήνα και υποβάλλονται σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας την παραπάνω διαδικασία.

Στατιστική Ανάλυση

Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα του η μέση (SE) η σημασία των διαφορών στις μέσες τιμές μεταξύ μη επεξεργασμένων και επεξεργασμένων δειγμάτων προσδιορίστηκε με t-test του Student μετά τον προσδιορισμό ότι τα δεδομένα ταιριάζουν κανονική κατανομή.

Αποτελέσματα

GPR158 Επιδράσεις επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού

για να διερευνηθεί η σημασία της έκφρασης GPR158 να προστάτη, πραγματοποιήσαμε μία σειρά πειραμάτων με τη χρήση ανθρώπινων κυτταρικών σειρών προστάτη με διαφορετικές μεταβολές στην AR με αποτέλεσμα διάφορους βαθμούς ανδρογόνων-ανταπόκρισης, ανδρογόνο-ευαισθησία και AR έκφρασης, όπως περιγράφεται στο τμήμα Υλικά και Μέθοδοι. Πρώτα αξιολόγησε τα επίπεδα του mRNA ενδογενούς GPR158 και πρωτεΐνη με πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR και κηλίδωση Western, αντιστοίχως. Η ταχέως αναπτυσσόμενη, ανδρογόνο-αναίσθητη γραμμές DU145 και PC-3 (χρόνος διπλασιασμού 1.5-2 ημέρα) εξέφρασαν υψηλότερα επίπεδα mRNA GPR158 (Εικ. 1Α) και σε πρωτεΐνες (Εικ. 1 Β) σε σύγκριση με πιο αργή ανάπτυξη κυττάρων της γραμμής LNCaP και των παράγωγων C4-2B του (διπλασιασμός του χρόνου 2-3 ​​ημέρες). Το επίπεδο της πρωτεΐνης GPR158 στις πιο ταχέως αναπτυσσόμενα κύτταρα ήταν περίπου 2-3 ​​φορές υψηλότερη σε σύγκριση με πιο αργά αναπτυσσόμενα κύτταρα.

(Α) RT-PCR ανάλυση της έκφρασης mRNA σε GPR158 υποδεικνύεται κυτταρικές γραμμές προστάτη (Β) ανάλυση κηλίδας Western για την ανίχνευση του GPR158 πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας αντι-ICD GPR158 αντισώματος σε κυτταρικά λύματα των κυτταρικών γραμμών έδειξε PCa σύνολο. Η ίδια μεμβράνη διερευνήθηκε για βήτα-ακτίνη, η οποία χρησίμευσε ως μάρτυρας φόρτωσης. Η κάθετη γραμμή δείχνει επανατοποθετείται λωρίδες γέλης από την ίδια μεμβράνη για να ταιριάζει με τη σειρά δείγμα του σχ. 1Α. (C, D, E) Και οι τέσσερις κυτταρικές σειρές υποδεικνύεται προστάτη επιμολύνθηκαν σε 70% συρροή είτε με πλασμίδιο έκφρασης GPR158 ή κενό pcDNA3.1 (+) φορέα (C και D) ή είτε GPR158 siRNA ή ελέγχου κωδικοποιημένο siRNA (Ε) ως υποδεικνύεται χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine LTX και επωάστηκαν σε μέσο ανάπτυξης για 3 ημέρες σε τρυβλία καλλιέργειας 6 φρεατίων. (C και Ε) Μετά από 3 ημέρες, τα σε αγωγή με θρυψίνη κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας trypan μπλε χρωστική ουσία σε ένα θάλαμο αιμοκυτταρόμετρο. (D) κηλίδωση Western για την ανίχνευση του GPR158 σε προϊόντα λύσης ολόκληρου κυττάρου που απομονώνεται από κύτταρα επιμολυσμένα με πλασμίδια υποδεικνύονται χρησιμοποιώντας αντι-ICD αντίσωμα GPR158. (F) Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα DU145 που επιμολύνθηκαν με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση είτε GPR158 siRNA ή ελέγχου κωδικοποιημένα siRNA για την ανάλυση των επιπέδων mRNA με GPR158 qRT-PCR. GAPDH ήταν εσωτερικού ελέγχου αναφοράς. (C, E, F) Τα στοιχεία δείχνουν μέση ± SE από 3 ανεξάρτητα πειράματα, κάθε εκτελέστηκαν εις διπλούν. *** P & lt? .001? ** P & lt? 0,01? * P & lt? 0,05? ns, p & gt?. 0.05

Η

Για να αξιολογηθεί η πιθανή βιολογικό ρόλο του GPR158 σε ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού των ανθρώπινων κυττάρων προστάτη, πραγματοποιήσαμε παροδικές επιμολύνσεις με τον φορέα έκφρασης θηλαστικού GPR158 περιγράφηκε προηγουμένως [8]. Οι κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν με φορέα μόνο χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. Η επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε μετά από 3 ημέρες από την επιμόλυνση. Παροδική υπερ-έκφραση του GPR158 σε κύτταρα του LNCaP, C4-2B και γραμμές DU145 οδήγησε σε σημαντικά υψηλότερο ποσοστό του κυτταρικού πολλαπλασιασμού από 3,88, 2,15 και 2,77 φορές αντίστοιχα, σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με τον κενό φορέα (Σχ. 1C ). Παροδική υπερ-έκφραση του GPR158 έδειξε μόνο οριακή αύξηση στον πολλαπλασιασμό του PC-3 κύτταρα, ωστόσο, αυτή ήταν η πιο ταχέως πολλαπλασιαζόμενα από τις τέσσερις κυτταρικές σειρές χωρίς GPR158 υπερέκφραση, αυξάνοντας την πιθανότητα ότι ο ρυθμός πολλαπλασιασμού θα μπορούσε ήδη να είναι μέγιστη . Η υπερέκφραση του GPR158 σε 3 ημέρες μετά την επιμόλυνση επιβεβαιώθηκε σε κυτταρολύματα ολόκληρο με κηλίδωση Western? μια σαφής αύξηση των επιπέδων πρωτεΐνης GPR158 παρατηρήθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 1D).

Για να αξιολογηθεί ο ρόλος του ενδογενούς GPR158 στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό PCa, εκτελέσαμε το αντίστροφο πείραμα με ρύθμιση προς τα κάτω του GPR158 μέσω της προσέγγισης siRNA. Αναφέραμε προηγουμένως το χαρακτηρισμό μιας ομάδας τριών ολιγονουκλεοτιδίων siRNA, επιδεικνύοντας 80-90% knockdown έκφρασης πρωτεΐνης GPR158 σε PC-3 κύτταρα σε 100 ηΜ, με αναπαραγώγιμο τρόπο [8]. Εμείς επιμολυσμένα καθεμία από τις τέσσερις κυτταρικές σειρές προστάτη με 100 ηΜ της παρούσας πισίνα siRNA. Μετά από 3 ημέρες από την επιμόλυνση, σημαντική αναστολή της ανάπτυξης (περίπου 50%) παρατηρήθηκε σε όλες τις τέσσερις από τις κυτταρικές γραμμές, σε σύγκριση με τις αντίστοιχες περιπλεγμένο siRNA τους επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 1Ε). Επιβεβαιώσαμε τη δοσοεξαρτώμενη knockdown έκφρασης GPR158 mRNA με επιμόλυνση της πισίνας siRNA, με περίπου το 90% αναστολή στα 100 ηΜ siRNA σε κύτταρα DU145 (Εικ. 1 F) και περίπου 75-90% στις άλλες κυτταρικές γραμμές (δεδομένα που δεν φαίνεται).

Μαζί αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το επίπεδο έκφρασης του ενδογενούς πρωτεΐνης GPR158 ελέγχει τον ρυθμό του κυτταρικού πολλαπλασιασμού προστάτη, ανεξάρτητα από το ανδρογόνο ανταπόκρισης, ανδρογόνο-ευαισθησίας ή κατάσταση AR-έκφραση της ανθρώπινης κυτταρικής σειράς προστάτη μεταχειρισμένα.

Εφέ ενός ανδρογόνων στο έκφραση GPR158

για να ανακαλύψετε παράγοντες που ρυθμίζουν την έκφραση GPR158, ψάξαμε την εφαρμογή NextBio «Φαρμακο Άτλας» [38] που βρίσκει ενώσεις και θεραπείες σημαντικά συσχετίζεται με ένα γονίδιο με τα αποτελέσματα κατατάσσονται κατά σειρά στατιστικής σημαντικότητας. αναζήτηση χρησιμοποιώντας μας «GPR158», όπως το ερώτημα προσδιόρισε το ανδρογόνα, DHT ως το πιο σημαντικό και το πρώτο στη λίστα των συσχετισμένων ενώσεων. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν 7 ανεξάρτητες μελέτες διεξάγεται χρησιμοποιώντας κύτταρα LNCaP και όλες τις μελέτες έδειξαν αυξημένη έκφραση του mRNA GPR158 με θεραπεία DHT στο εύρος από 1,28 έως 3,57 φορές (S2 Εικ.).

Για να προσδιοριστεί πειραματικά αν GPR158 είναι ένας γονίδιο που αποκρίνονται στο ανδρογόνο, πραγματοποιήσαμε πειράματα χρονικής πορείας της θεραπείας DHT συγκρίνοντας αποκρίνονται στο ανδρογόνο και ανδρογόνο ευαίσθητα PHPECs και τα κύτταρα LNCaP, και αποκρίνονται στο ανδρογόνο, αλλά ανδρογόνα

αναίσθητος

C4-2B κύτταρα. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα φαίνονται στο Σχ. 2. Στο PHPECs και LNCaP κύτταρα, GPR158 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης αυξήθηκε κατά 3-4 φορές με τη θεραπεία DHT στις 24 ώρες (Σχ. 2, Α, Β, Ε και F). Αντίθετα, η θεραπεία DHT δεν είχε επίδραση επί GPR158 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης σε κύτταρα C4-2B (Εικ. 2, C και G). Και τα δύο επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης για ειδικό προστατικό αντιγόνο (PSA), μια καλά μελετηθεί γονιδίου στόχου AR, αυξήθηκε σημαντικά σε PHPEC, LNCaP και C4-2B κύτταρα επεξεργασμένα με DHT. Παρόμοια με τις δημοσιευμένες εκθέσεις, παρατηρήσαμε επίσης σταθεροποίηση πρωτεΐνης AR σε κύτταρα LNCaP DHT διεγερμένα σε 12 ώρες στα κύτταρα PHPEC και LNCaP [39], αλλά όχι σε κύτταρα C4-2B (Σχ. 2, Ε, F και G). Είναι σημαντικό ότι, βρήκαμε ότι ο ανταγωνιστής AR, βικαλουταμίδη ανέστειλε την DHT μεσολάβηση αύξηση GPR158 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης και παρατηρήσαμε επίσης μία πλήρη αναστολή της έκφρασης PSA σε PHPEC (Εικ. 2, D και Η). GPR158 mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης μειώθηκαν κατά ανδρογόνων ασιτία με επώαση του PHPEC σε μέσα που περιέχουν 10% CSS όλη τη νύκτα. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι GPR158 είναι ένα γονίδιο που αποκρίνονται στο ανδρογόνο.

(AC και EG) Κύτταρα των υποδεικνυόμενων γραμμών επωάστηκαν σε μέσο που περιείχε 10% CSS για ανδρογόνων ασιτία τη διάρκεια της νύχτας (0 χρονικό σημείο), που ακολουθείται από κατεργασία με DHT (10 ηΜ) για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα. Ολικό RNA (Α-Ο) ή προϊόντα λύσης κυττάρου (E-G) απομονώθηκαν και υποβλήθηκαν σε qRT-PCR και κηλίδωση Western, αντιστοίχως για την εκτίμηση AR, PSA, GPR158 και την έκφραση βήτα-ακτίνης. (D και Η) PHPEC αναπτύχθηκαν σε μέσα που περιέχουν 10% FCS ή 10% CSS, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DHT (10 ηΜ) μόνη επί 24 ώρες ή προ-επωάστηκαν με βικαλουταμίδη (10 μΜ) για 1-ώρα πριν από την DHT θεραπεία σε μέσα που περιέχουν 10 % CSS. Ολικό RNA ή το σύνολο κυτταρολύματα απομονώθηκαν και qRT-PCR και κηλίδωση Western Διεξήχθη, αντίστοιχα για την ανίχνευση GPR158, AR, PSA και βήτα-ακτίνης επίπεδα (D) Το επίπεδο του mRNA του ανωτέρω αναφερθέντος γονίδια θεωρήθηκε 1 σε κύτταρα που αναπτύσσονται σε 10% FCS για τον υπολογισμό της σχετικής διαφοράς φορές αυτών των γονιδίων σε άλλες πειραματικές συνθήκες. (AH) Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

GPR158 Επιδράσεις στην έκφραση AR

Τα χαρακτηριστικά της οθόνης ανθρώπινο προστάτη μοντέλο εξέλιξης LNCaP /C4-2B της μετάβασης από ανδρογόνα-εξάρτηση στην έλλειψης ευαισθησίας στα ανδρογόνα [32,40], και το AR διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στη διαδικασία αυτή [41]. Σύκο. 3 δείχνει τα αποτελέσματα της ανάλυσης των επιδράσεων επί της έκφρασης GPR158 AR. Παροδική υπερ-έκφραση του GPR158 σε κύτταρα LNCaP αυξήθηκε και σίγηση του ενδογενούς GPR158 μειωθεί, mRNA για τον AR, καθώς και για το PSA (εικ. 3Α). Σε κύτταρα τόσο LNCaP και C4-2B, υπερ-έκφραση του GPR158 σημαντικά αυξημένα επίπεδα AR και πρωτεΐνη PSA, ενώ knockdown του GPR158 (μείωση 90%) μείωσε σημαντικά AR και τα επίπεδα πρωτεΐνης PSA (εικ. 3, Β και C). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι GPR158 διεγείρει την έκφραση AR και PSA.

LNCaP (A, B, C) και C4-2B (Β και C) διαμολύνθηκαν παροδικά χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine LTX είτε με GPR158 πλασμίδιο έκφρασης ή φορέας (Α και Β) ή είτε GPR158 siRNA ή τον έλεγχο ομελέτα siRNA (Α και C). Μετά από 3 ημέρες επιμόλυνσης, συνολικής απομονωμένο RNA και πρωτεΐνη κυτταρικής προϊόντα λύσης χρησιμοποιήθηκαν για qRT-PCR (Α) και κηλίδωση Western (Β και C), αντίστοιχα, για την ανάλυση της έκφρασης του GPR158, AR, PSA και του mRNA β-ακτίνης και πρωτεϊνών. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν δύο ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν.

Η

δοσοεξαρτώμενη Επιδράσεις GPR158

Για να διερευνήσουν περαιτέρω το ρόλο του GPR158 στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της έκφρασης του γονιδίου AR, δημιουργήσαμε η κυτταρική σειρά lenti-GPR158 LNCaP. Αυτή είναι μια υποσειρά των κυττάρων LNCaP σταθερά μετασχηματισμένα με ένα φακοϊό που εκφράζει GPR158 υπό τον έλεγχο της Dox. Η Dox-διεγέρσιμο lentivirus σύστημα επιτρέπει την σφιχτή ρύθμιση της έκφρασης GPR158 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. LNCaP κύτταρα επιλέχθηκαν για το συγκεκριμένο μοντέλο, επειδή εκφράζουν τα χαμηλότερα επίπεδα ενδογενούς GPR158. Δείχθηκε πρόσφατα ότι Dox μεταβάλλει τα προφίλ μεταβολικές και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων LNCaP σε υψηλότερες συγκεντρώσεις [42], μια επίδραση που επιβεβαιώθηκε (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έτσι, σε όλα τα πειράματα με αυτή την κυτταρική γραμμή, συγκρίνουμε τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με το lenti-GPR158 κυτταρική σειρά LNCaP με εκείνα που λαμβάνονται χρησιμοποιώντας παράλληλες καλλιέργειες των γονικών κυττάρων LNCaP σε επεξεργασία με τις ίδιες δόσεις Dox.

Το Σχ. 4 δείχνει αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα των πειραμάτων με τη χρήση της κυτταρικής σειράς lenti-GPR158 LNCaP. Θεραπεία της lenti-GPR158 LNCaP με Dox για 3 ημέρες επαγόμενη έκφραση GPR158 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 4Α). Παρατηρήσαμε με συνέπεια μια περίπου 3-φορές και 6-πλάσια αύξηση στα επίπεδα της πρωτεΐνης GPR158 μετά την κατεργασία με Dox στα 100 ng /mL και 500 ng /mL, αντίστοιχα, για 3 ημέρες (σχ. 4Α).