Αφηρημένο

Οι μελέτες έχουν δείξει ότι η συγκαταστολέας πυρηνικού υποδοχέα 1 (NCOR1) θα μπορούσε να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο σε ανθρώπινους καρκίνους. Ωστόσο, οι λεπτομερείς μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους λειτουργεί

in vivo

να επηρεάσουν την εξέλιξη του καρκίνου δεν είναι σαφείς. Η παρούσα μελέτη διευκρινιστεί στο

in vivo

δράσεις NCOR1 στην καρκινογένεση χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ποντικού (

thrB

PV /PV

ποντίκια) που αναπτύσσει αυθόρμητα καρκίνο του θυρεοειδούς.

thrB

PV /PV

ποντίκια λιμάνι υπερισχύον αρνητικό υποδοχέα θυρεοειδούς ορμόνης β (ΤΡβ) μεταλλαγμένα (συμβολίζεται ως PV). Υιοθετήσαμε την προσέγγιση απώλειας της λειτουργίας διασχίζοντας

thrB

PV

ποντίκια με ποντίκια που σε παγκόσμιο επίπεδο εκφράζουν μια NCOR1 μεταλλαγμένη πρωτεΐνη (NCOR1ΔID), στην οποία οι περιοχές αλληλεπίδρασης υποδοχέα έχουν τροποποιηθεί έτσι ώστε να μην μπορούν να αλληλεπιδράσουν με το ΤΡβ, ή PV, σε ποντίκια. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η έκφραση της ανάπτυξης NCOR1ΔID πρωτεΐνης μειώνεται θυρεοειδούς όγκου, καθυστερεί σημαντικά την εξέλιξη του όγκου και παρατεταμένη επιβίωση του

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια. πολλαπλασιασμός καρκινικών κυττάρων ανεστάλη με αυξημένη έκφραση της κυκλίνης-εξαρτώμενη αναστολέα κινάσης 1 (ρ21

WAF1 /Cip1?

Cdkn1A

), και η απόπτωση ενεργοποιήθηκε με αυξημένη έκφραση των προ-αποπτωτικών BCL-Associated X (

Bax

). Περαιτέρω αναλύσεις έδειξαν ότι η p53 είχε προσληφθεί στην ιστοσελίδα p53-δεσμευτικές για το εγγύς υποκινητή του

Cdkn1A

και το

Bax

γονίδιο ως ένα σύνθετο συν-καταστολέα με PV /NCOR1 /ιστόνης deacetylas- 3 (HDAC-3), που οδηγεί σε καταστολή του

Cdkn1A

καθώς και το

Bax

γονιδίου σε thyroids του

thrB

PV /PV

ποντίκια. Σε thyroids του

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια, η p53 /PV συγκρότημα δεν μπορούσε να προσλάβει NCOR1ΔID και HDAC-3, οδηγεί σε απο-καταστολή αμφότερα τα γονίδια να παρεμποδίζει την πρόοδο του καρκίνου. Οι παρούσες μελέτες που προβλέπονται άμεσες αποδείξεις

in vivo

που NCOR1 θα μπορούσε να λειτουργήσει ως ένα ογκογονίδιο μέσω της ρύθμισης της μεταγραφής σε ένα μοντέλο ποντικού του καρκίνου του θυρεοειδούς

Παράθεση:. Fozzatti L, Πάρκο JW, Zhao L, Willingham MC, Cheng Σάι (2013) τον ογκογόνο Δράσεις του πυρηνικού υποδοχέα συγκαταστολέας (NCOR1) σε ένα μοντέλο ποντικού από καρκίνο του θυρεοειδούς. PLoS ONE 8 (6): e67954. doi: 10.1371 /journal.pone.0067954

Επιμέλεια: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28 του Μάρτη 2013? Αποδεκτές: 23η Μαΐου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 26 του Ιούνη του 2013

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Η παρούσα έρευνα υποστηρίχθηκε από το Πρόγραμμα Τειχών Ερευνών στο Κέντρο Έρευνας για τον Καρκίνο, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

υποδοχείς θυρεοειδούς ορμόνης (TRs) είναι κρίσιμα στη διαμεσολάβηση των δράσεων γενωμική του θυρεοειδούς ορμόνης (Τ3) στην αύξηση, την ανάπτυξη, διαφοροποίηση και διατήρηση της μεταβολικής ομοιόστασης. Δύο γονίδια TR, α και β, που βρίσκονται σε δύο διαφορετικά χρωμοσώματα, κωδικοποιούν τρεις κύριες ισομορφές TR δέσμευσης Τ3 (α1, β1, β2 και). Μελέτες που χρησιμοποίησαν γενετικά τροποποιημένα ποντίκια έδειξαν ότι,

in vivo

, TR ισομορφές έχουν κοινές λειτουργίες, αλλά μπορεί επίσης να ασκήσει ισομορφή που εξαρτάται από ενέργειες σε ιστούς στόχους [1], [2]. Η δραστηριότητα μεταγραφή του TR ρυθμίζεται σε πολλαπλά επίπεδα. Εκτός από τη ρύθμιση από Τ3 και τους τύπους των στοιχείων στις υποκινητές των γονιδίων στόχων δέσμευσης του DNA, η μεταγραφική δραστικότητα του TR είναι τελειοποιηθεί από ένα πλήθος πυρηνικών συνενεργοποιητές και συγκαταστολείς [3], [4]. Σε περίπτωση απουσίας του Τ3, ο unliganded TR στρατολογεί την συγκαταστολέας πυρηνικού υποδοχέα 1 (NCOR1) και τον πυρηνικό υποδοχέα συγκαταστολέας 2 /σίγηση μεσολαβητής για υποδοχείς ρετινοειδούς και θυρεοειδούς ορμόνης (NCOR2 /SMRT) για μεταγραφική καταστολή. Η πρόσδεση του Τ3 οδηγεί σε μια διαμορφωτική αλλαγή στο TR που απελευθερώνει το NCOR1 /NCOR2 πολύπλοκη και επιτρέπει την πρόσληψη πολυπρωτεϊνικό σύμπλεγμα συνενεργοποιητή για μεταγραφική ενεργοποίηση [5].

Ο σημαντικός ρυθμιστικός ρόλος του NCOR1 στις δράσεις των υποδοχέων είναι προφανές σε παρεκκλίνουσα την αλληλεπίδρασή του με τους υποδοχείς υποκείμενες ανθρώπινες ασθένειες όπως η αντίσταση στην ορμόνη του θυρεοειδούς (RTH) [6], [7] και lipodystrophic σοβαρή αντοχή στην ινσουλίνη [8]. RTH προκαλείται από μεταλλάξεις στο

thrB

γονίδιο [9], [10]. Μεταλλάξεις των γ του υποδοχέα ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή περοξυσώματος (

PPARγ)

οδηγήσει σε lipodystrophic σοβαρή αντοχή στην ινσουλίνη [8]. Επιπλέον, παρεκκλίνουσα αλληλεπίδραση του NCOR1 /SMRT με τα συντηγμένα γονιδιακά προϊόντα του υποδοχέα ρετινοϊκού οξέος α γονίδιο (

ΡΑΡα)

ή με την προμυελοκυτταρική λευχαιμία γονίδιο (

PML

) (PML-τύπου ΚΑΚ α) είτε με την προμυελοκυτταρική λευχαιμία γονίδιο δακτύλου ψευδαργύρου (

PLZF

) (PLZF-RAR-α) έχει ως αποτέλεσμα τον αποκλεισμό μυελοειδή διαφοροποίηση [11]. Η συμμετοχή των NCOR1 σε άλλους ανθρώπινους καρκίνους όπως καρκίνοι του μαστού και της ουροδόχου κύστης καταδείχθηκε από μια στενή σύνδεση της NCOR1 ανώμαλη έκφραση με την ανάπτυξη του καρκίνου [12], [13], [14], [15]. Πρόσφατες μελέτες από τον καρκίνο Genome Atlas (TCGA) Δίκτυο Έρευνας αποκάλυψε επίσης ομόζυγη διαγραφή του γονιδίου της NCOR1 σε ορισμένους ασθενείς με άνω και κάτω τελεία και το αδενοκαρκίνωμα του ορθού [16], αδενοκαρκίνωμα του προστάτη [17], καρκίνωμα των ωοθηκών [18] ή καρκίνωμα του ήπατος στο ήπαρ (αδημοσίευτη-Προσωρινή στη βάση δεδομένων TCGA). Επιπλέον, μεταλλάξεις ανοησία και παραλλαγές ματίσματος του

NCOR1

βρέθηκαν επίσης σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού [19]. Αν και αυτές οι μελέτες συσχέτισης εγείρει την πιθανότητα ότι NCOR1 θα μπορούσε να δράσει για να επηρεάσει την εξέλιξη του καρκίνου, άμεση απόδειξη του ρόλου της στην καρκινογένεση

in vivo

εξακολουθεί να απουσιάζει.

Η διαθεσιμότητα του ένα μοντέλο ποντικού που αναπτύσσεται αυθόρμητα μεταστατικό καρκίνο του θυρεοειδούς ωοθυλακίων (FTC) μας έδωσε ένα ισχυρό εργαλείο για την αξιολόγηση του ρόλου της NCOR1 στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου. Η

thrB

PV /PV

ποντίκι φιλοξενεί ένα knockin κυρίαρχη αρνητική μετάλλαξη, γνωστή ως φωτοβολταϊκών, στο

thrB

γονιδιακό τόπο [20]. Η φωτοβολταϊκή μετάλλαξη ταυτοποιήθηκε σε έναν ασθενή που υποφέρει από αντοχή σε ορμόνη του θυρεοειδούς [21]. Ως

thrB

PV /PV

ηλικία ποντίκια, thyroids τους υποβάλλονται σε παθολογικές αλλαγές από υπερπλασία σε κάψας και αγγειακή εισβολή, ανάπλαση, και η ενδεχόμενη μετάσταση στον πνεύμονα [22]. Η παθολογική εξέλιξη, την οδό και τη συχνότητα της μετάστασης σε

thrB

PV /PV

ποντίκια είναι παρόμοια με εκείνη στο ανθρώπινο FTC. Εκτεταμένες μοριακές αναλύσεις αλλαγμένη οδών σηματοδότησης δείχνουν ότι, όπως διαπιστώθηκε στην ανθρώπινη FTC,

thrB

PV /PV

ποντίκια παρουσιάζουν ανώμαλα μονοπάτια σηματοδότησης που περιλαμβάνουν συστατική ενεργοποίηση της φωσφατιδυλο ινοσιτόλη 3-κινάση (PI3K) /Akt [ ,,,0],23], [24] και της ιντεγκρίνης Src-ΜΑΡΚ σηματοδότηση [25] και παρεκκλίνουσα συσσώρευση του ογκογόνου υπόφυσης όγκου μετασχηματισμού πρωτεΐνη γονιδίου (PTTG) [26], [27] και β-κατενίνης [28]. Έτσι, η

thrB

PV /PV

μοντέλο ποντικού ανακεφαλαιώνει πιστά τις μοριακές ανωμαλίες που βρέθηκαν σε ανθρώπινο καρκίνο του θυρεοειδούς και είναι πράγματι ένα προκλινικό μοντέλο ποντικού της FTC.

Στις παρούσες μελέτες, που υιοθέτησε την προσέγγιση απώλειας της λειτουργίας διασχίζοντας

thrB

PV

με ποντίκια που σε παγκόσμιο επίπεδο εκφράζουν μια μεταλλαγμένη πρωτεΐνη NCOR1 (NCOR1ΔID). Σε αυτήν την μεταλλαγμένη πρωτεΐνη NCOR1ΔID, δύο πιο αμινοτερματική περιοχές αλληλεπίδρασης υποδοχέα ονομάζονται RID 3 και RID2, λείπουν. Αυτή η μετάλλαξη δεν μπορεί να συνδεθεί με TR, όπως RID3 είναι απολύτως απαραίτητη για την αλληλεπίδραση NCOR1-TR [29], [30], [31]. Σταθερά, δείξαμε επίσης ότι μεταλλαγμένη πρωτεΐνη NCOR1ΔID δεν μπορούν να αλληλεπιδράσουν με TRβPV

in vivo

[32]. Η έλλειψη αλληλεπίδρασης της TRβPV με NCOR1ΔID έχει ως αποτέλεσμα την βελτίωση των συμπτωμάτων της αντίστασης στην θυρεοειδικών ορμονών στο

thrB

PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια, ενδεικτικό ότι NCOR1 ρυθμίζει την κυρίαρχη αρνητική δράση των μεταλλαγμένων ΤΡβ

in vivo

[32].

Οι παρούσες μελέτες δείχνουν ότι η έκφραση του NCOR1ΔID στον θυρεοειδή του

thrB

PV /PV

ποντίκια ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου, παρατεταμένη επιβίωση, και καθυστερημένη εξέλιξη του καρκίνου. πολλαπλασιασμός καρκινικών κυττάρων ανεστάλη από την αυξημένη έκφραση της κυκλίνης-εξαρτώμενη αναστολέα κινάσης 1 (ρ21 /WAF1?

Cdkn1A

), και το απόπτωση που επάγεται από την ενεργοποιημένη έκφραση του Bcl-2 σχετίζεται Χ πρωτεΐνη (

ΒΑΧ

). Τόσο το

Cdkn1A

και το

ΒΑΧ

γονίδια είναι άμεση κατάντη γονίδια στόχους της καταστολής του όγκου, p53. Λεπτομερής μοριακές αναλύσεις έδειξαν ότι η έλλειψη χώρου αλληλεπίδρασης υποδοχέα σε NCOR1ΔID οδήγησε σε αδυναμία του ρ53 /PV πολύπλοκο να προσλάβει τον NCOR1 /ιστόνης συγκρότημα αποακετυλάσης-3 καταστολέα στους υποκινητές αυτών των γονιδίων-στόχων, με αποτέλεσμα την αυξημένη καταστολή αυτών των γονιδίων σε αναστέλλουν την πρόοδο του καρκίνου. Η παρούσα μελέτη παρείχε άμεση απόδειξη

in vivo

να αποδείξει ότι η NCOR1 θα μπορούσε να λειτουργήσει ως ένα ογκογονίδιο μέσω της ρύθμισης της μεταγραφής στο θυρεοειδή καρκινογένεση σε ένα μοντέλο ποντικού.

Υλικά και Μέθοδοι

ποντίκι Στελέχη

Η μελέτη των ζώων διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από την Εθνική Επιτροπή Cancer Institute Animal Care και Χρήση. Τα ποντίκια που φέρουν το

thrB

PV

γονίδιο (

thrB

PV

ποντίκια) παρασκευάστηκαν και ο γονότυπος όπως περιγράφεται παραπάνω [20].

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια είχαν εκτραφεί από την πρώτη διέλευση

thrB

+ /+ Ncor1

ΔID /+

ποντίκια [29] με

thrB

PV /+

ποντίκια και στη συνέχεια διασχίζοντας

thrB

PV /+ Ncor1

ΔID /ΔID

ποντίκια με

thrB

PV /+ Ncor1

ΔID /ΔID

ποντίκια [32]. Ποντίκια με διαφορετικούς γονότυπους που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη ήταν διασταυρωθεί όσο αρκετές γενιές, και νεογνά με ένα παρόμοιο γενετικό υπόβαθρο χρησιμοποιήθηκαν σε όλα τα πειράματα. Οι ποντικοί παρακολουθούνται έως ότου έγιναν ετοιμοθάνατα και ως εκ τούτου ευθανασία. Thyroids και άλλοι ιστοί συλλέχθηκαν από

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

ποντίκια και

thrB

PVPVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια για ζύγιση, ιστολογική ανάλυση, και μοριακές και βιοχημικές μελέτες.

Απομόνωση RNA και ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR

Ολικό RNA εξήχθη από θυρεοειδείς ποντικών χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR πραγματοποιήθηκε με ένα Quantitect SYBR Green RT-PCR κιτ (Qiagen, Valencia, CA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και χρησιμοποιώντας μια LightCycler θερμικό ανακυκλωτή (Roche Diagnostics). Ολικό RNA (200 ng) χρησιμοποιήθηκε σε προσδιορισμούς RT-PCR όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33]. Οι ειδικοί εκκινητές ήταν ως εξής:

mp21

εμπρός, 5′-CGCCGCGGTGTCAGAGTC-3 ‘και αντίστροφος, 5′-GCAGCAGGGCAGAGGAAG-3’?

mBax

προς τα εμπρός, «-CCACCAGCTCTGAACAGATC-3 ‘και να αντιστραφεί, 5′-CAGCTTCTTGGTGGACGCAT-3’?

mp53

προς τα εμπρός, 5′-AGAGACCGCCGTACAGAAGA-3 ‘και να αντιστραφεί, 5′-CTGTAGCATGGGCATCCTTT-3’.

Ανάλυση Western Blot και συνανοσοκαθίζησης

Πυρηνική εκχυλίσματα thyroids παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [32]. Τα δείγματα πρωτεΐνης (25 μg) αναλύθηκαν με στύπωμα Western, όπως περιγράφεται προηγουμένως [28]. Anti-φωσφορυλιωμένη ρετινοβλάστωμα πρωτεΐνη (pRb) (Ser780, # 9307) και PUMA (# 7467) ήταν από τη Cell Signaling Technologies (Beverly, ΜΑ) (1:500 αραίωση), αντι-κυκλίνης D1 (sc-450), ΒΑΧ (sc -7480), Rb (sc-50), ρ21 (sc-6246) και p27 (sc-1641) αντισώματα αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) και χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:200. αντισώματα αντι-p53 (OP03) ήταν από την Calbiochem (1:500 αραίωση). εντάσεις μπάντα ποσοτικά με τη χρήση του λογισμικού IMAGE ΝΙΗ (ImageJ 1,34 s? Wayne Rasband, ΝΙΗ).

Για συνανοσοκαθίζησης να δείξει την φυσική αλληλεπίδραση των p53 με PV, 0,5 mg του συνόλου των εκχυλισμάτων του θυρεοειδούς επωάστηκε πρώτα διάρκεια της νύχτας με κουνελιού αντι-TR (Κωδικός 600-401-Α96, Rockland) σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα 0,6% ΝΡ-40 με αναστολείς πρωτεάσης (Roche) στους 4 ° C. Τα δείγματα στη συνέχεια αναμιγνύονται με 20 μΙ πρωτεΐνης Α-αγαρόζης (Roche) στους 4 ° C για 2 ώρες, και τα σφαιρίδια πλύθηκαν πέντε φορές με TBS-0.6% ΝΡ-40 που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης. Οι δεσμευμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν με ανάλυση κηλίδος Western χρησιμοποιώντας αντισώματα για ρ53 (OP03? Millipore, Inc.,) σε αραίωση 1:500 και αντι-NCOR1 (PHQQ? 2 μg /mL). [32]

Ιστολογική Ανάλυση

θυρεοειδούς αδένα, πνεύμονα, και καρδιάς αποκόπηκαν, μονιμοποιήθηκαν σε 10% ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ), και στη συνέχεια ενσωματωμένων σε παραφίνη. Τμήματα πάχους 5-μm παρασκευάστηκαν και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε). Για κάθε ζώο, εξετάστηκαν και μόνο τυχαία τομές διαμέσου του θυρεοειδούς, μέσω του πνεύμονα, και μέσα από την καρδιά.

Ανοσοϊστοχημεία

IHC διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως με κάποια τροποποίηση [25]. τμήματα του θυρεοειδούς παραφίνη σταθεροποιημένα με φορμαλίνη αποπαραφινοποιήθηκαν, επανυδατώθηκαν, θερμαίνεται στους 98 ° C σε 0.05% κιτρακονικό ανυδρίτη, ρΗ 7.4 (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ), για 1 ώρα και στη συνέχεια δεσμεύτηκαν για 1 ώρα σε 2% κανονικό γίδινο ορού σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από έκπλυση σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό, τα πλακίδια επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύχτα με Ki-67 πρωτογενές αντίσωμα (αραίωση 1:300? Thermo Scientific, Fremont, CA? # RB-9043-P0). Μετά την πλύση, τα πλακίδια επωάστηκαν με δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και ξεπλένονται σε αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικό. Τα πλακίδια επωάστηκαν στη συνέχεια σε 3,3′-διαμινοβενζιδένιο (DAB κιτ υπόστρωμα για την υπεροξειδάση? Vector Laboratories, Burlingame, CA? SK-4100), και μετά από χρώση ανάπτυξη, αυτά βάφτηκαν αντίθετα σε Αιματοξυλίνη του Gill, ξεπλένονται και τοποθετούνται σε Permount (Fisher Scientific , Pittsburgh, PA). Η πολλαπλασιαστική δείκτης υπολογίστηκε ως το ποσοστό του Ki-67-θετικών πυρήνων με το συνολικό αριθμό των πυρήνων στο τμήμα του θυρεοειδούς. Μετρώντας πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH), το λογισμικό IMAGE (ImageJ 1,34 s? Wayne Rasband, ΝΙΗ, Bethesda, MD).

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (μάρκας) Δοκιμασία

Ο προσδιορισμός τσιπ πραγματοποιείται με τη χρήση της χρωματίνης του DNA που παρασκευάζεται από όγκους του θυρεοειδούς (50 mg /δοκιμή) του

Thrb1

PV /PVNcor1

+ /+

ποντίκια και

Thrb1

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34]. Το ανοσοκαταβυθισμένο-DNA σε 50 μΐ ΤΕ και ποσοτική PCR διεξήχθη με 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) με τη χρήση κιτ QuantiFast SYBR Green RT-PCR (204154, Qiagen). Ο εμπλουτισμός των σημάτων υπολογίστηκε ως σήματα ανοσοκαθίζησης έναντι ολόκληρη εισόδους λύματος κυττάρων. Οι αλλαγές πτυχή του θυρεοειδούς όγκων του

Thrb1

PV /PVNcor1

+ /+

ή

Thrb1

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ChIP ομαλοποιήθηκαν με αρνητικό μάρτυρα (IgG ποντικού). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ChIP

Cdkn1A

προς τα εμπρός, 5′-TTTCTATCAGCCCCAGAGGA-3 ‘? και να αντιστραφεί, 5’-TCACCCCACAGCTGGTAGTT-3 »και

Bax

προς τα εμπρός, 5′-GGGGCGCGCGGATCCATTCC-3 ‘? και να αντιστραφεί, 5’-GCTTCTGATGGACAGGGGGC-3 ‘.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM του. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων εξετάστηκαν για στατιστική σημασία χρησιμοποιώντας

t

δοκιμή Student με τη χρήση GraphPad Prism 4.0a (GraphPad Software)? p & lt? 0,05 θεωρείται στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

NCOR1ΔID παρατείνει την επιβίωση και καθυστερήσεις θυρεοειδούς Καρκινογένεση του

thrB

PV /PV

Ποντίκια

. έχουν δείξει στο παρελθόν ότι

thrB

PV /PV

ποντίκια έχουν υψηλή θνησιμότητα που προκαλείται από FTC [22]. Παρακολουθήσαμε τα αποτελέσματα της έκφρασης των NCOR1ΔID στο θυρεοειδή καρκινογένεση από την πρώτη σύγκριση της επιβίωσης των

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια με εκείνη του

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

ποντίκια. Οι ποντικοί παρακολουθούνται έως ότου έγιναν ετοιμοθάνατα με τα σημάδια των ψηλαφητών όγκων, γρήγορη απώλεια βάρους, καμπούρα στάσεις, και δυσκολία στην αναπνοή. Σχήμα 1Α δείχνει ότι

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια επέζησαν σημαντικά μεγαλύτερη (p & lt? 0,01? 50% ηλικίας επιβίωση: 11,3 μήνες, n = 29) από ό, τι

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

ποντίκια (50% ηλικίας επιβίωσης: 9,3 μηνών, n = 58) κατά τη διάρκεια της περιόδου παρατήρησης 15 μηνών. Εικόνα 1Β δείχνει ότι η έκφραση του NCOR1ΔID οδήγησε σε σημαντική μείωση 35% σε βάρος του θυρεοειδούς σε

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια (σετ δεδομένων 2 έναντι 1? P & lt? 0,0001 ).

(Α) καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier για

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

και

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια μέχρι 15 μηνών.

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

(n = 29) επιβίωσαν σημαντικά μεγαλύτερη από ό, τι

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

ποντίκια (n = 58) (

σ

& lt? 0,0001). (Β) thyroids του

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

και

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια στην ηλικία των 5 -15 μήνες ήταν αποκόπηκαν και ζυγίστηκαν. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως οι αναλογίες βάρους του θυρεοειδούς με το σωματικό βάρος. Οι διαφορές μεταξύ των θυρεοειδικών βάρη

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

και

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια ήταν σημαντικές (

σ

& lt? 0,0001), όπως καθορίζεται από Φοιτητών

t-test

ανάλυση

Η

Η επίδραση της NCOR1ΔID στην παθολογική εξέλιξη εκτιμήθηκε με ιστοπαθολογική ανάλυση όπως. η

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ηλικιωμένα ποντίκια. Σχήμα 2Α δείχνει αντιπροσωπευτικά παθολογικά χαρακτηριστικά των θυρεοειδών και τους πνεύμονες από το 3 έως 15 μηνών

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

και

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια (αριστερά και δεξιά στήλη, αντίστοιχα). Στα thyroids του

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

ποντίκια στην ηλικία των επτά μηνών, προηγμένη αγγειακή εισβολή και εστιακό ανάπλαση παρατηρήθηκαν συχνά (βέλη στο σχήμα 2Αα και 2Αγ, αντίστοιχα) . Επιπλέον, οι μεταστάσεις στους πνεύμονες (Σχήμα 2Ae, βέλη) ήταν συχνές σε

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

ποντίκια. Σε

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια, όμως, αγγειακή εισβολή σπάνια παρατηρείται (Σχήμα 2αβ), αλλά χωρίς ανιχνεύσιμη ανάπλαση (Σχήμα 2Ad) και σημαντική μείωση στην εμφάνιση μετάστασης πνεύμονα (Σχήμα 2Af). Αυτές οι παρατηρήσεις παθολογοϊστολογικά συνοψίζονται στο Σχήμα 2Β. Κατά τη νεότερη ηλικία των 3-5 μηνών, μια χαμηλότερη εμφάνιση της κάψας εισβολής (~ 20%) παρατηρήθηκε για

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια από ό, τι για

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

ποντίκια (Σχήμα 2β α), αλλά μια παρόμοια συχνότητα εμφάνισης της κάψας εισβολής ανιχνεύθηκε τόσο για τα μεταλλαγμένα ποντίκια σε μεγαλύτερη ηλικία (& gt? 7 μήνες της ηλικίας). Δεν αγγειακή εισβολή, ανάπλαση, ή μεταστάσεις στους πνεύμονες βρέθηκαν στο

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια (Σχήμα 2Bb, γ, και δ) σε νεαρότερες ηλικίες των 3-5 μηνών. Για τους ποντικούς ηλικίας άνω των 7 μηνών, η συχνότητα εμφάνισης των αγγειακών εισβολής, ανάπλαση, και η μετάσταση πνεύμονα ήταν 80%, 15%, και 60%, αντίστοιχα, για το

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

ποντίκια (Εικόνα 2Bb, c, και d). Ωστόσο, η εμφάνιση των αγγειακών εισβολής και μετάσταση στους πνεύμονες ήταν 14% και 10%, αντίστοιχα, για το

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια, χωρίς εμφάνιση ανάπλαση. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η έκφραση του NCOR1ΔID καθυστέρηση εξέλιξης του καρκίνου του θυρεοειδούς και μπλοκάρει απώλεια διαφοροποίησης (ανάπλαση) σε

thrB

PV /PV

ποντίκια.

(Α) και αιματοξυλίνης ηωσίνη (Η & amp? ε) χρώση των τμημάτων του θυρεοειδούς (κορυφή και μεσαίες σειρές) και τα τμήματα του πνεύμονα (κάτω σειρά) του

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

(A, C, και ε ) και

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

(β, δ και στ) ποντίκια. Ιστολογικές τομές από ιστούς του

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

ποντίκια έδειξαν στοιχεία (α) αγγειακή εισβολή του θυρεοειδούς (βέλος), (γ) ανάπλαση στο θυρεοειδή (βέλη), και (ε) μεταστατικές αλλοιώσεις στον πνεύμονα (βέλη). Τμήματα των θυρεοειδών και τους πνεύμονες από το

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

έδειξε αιμοφόρα αγγεία (β) χωρίς αγγειακή διήθηση (βέλος), (δ) χωρίς ανάπλαση, και (στ) του πνεύμονα, χωρίς να μεταστατικές αλλοιώσεις. (Β) Σύγκριση εξαρτώμενη από την ηλικία ποσοστό εμφάνισης καψικού εισβολής (α), αγγειακή εισβολή (β), ανάπλαση (γ), και μετάσταση στους πνεύμονες (δ). Τα δεδομένα εκφράζονται ως το ποσοστό εμφάνισης της συνολικής μεταλλαγμένα ποντίκια που εξετάστηκαν. Το σύμβολο «#» δείχνει 0% εμφάνιση.

Η

NCOR1ΔID μειώνει την ανάπτυξη του θυρεοειδούς με αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού στο

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

Ποντίκια

Το γεγονός ότι η ανάπτυξη του θυρεοειδούς μειώθηκε στο

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια (Εικόνα 1Β) μας ώθησε να ρωτήσω αν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του θυρεοειδούς όγκου ανεστάλη. Ως εκ τούτου, εξέτασε την πρωτεΐνη αφθονία του δείκτη διάδοσης των πυρηνικών όπλων, Ki-67, με ανοσοϊστοχημική ανάλυση. Σχήμα 3A.I-Α και -Β δείχνουν αντιπροσωπευτικά παραδείγματα της εντατικής πυρηνική χρώση σε θυρεοειδείς δύο

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

ποντίκια. Αντίθετα, λιγότεροι πυρήνες ανοσο-χρώση με Ki-67 δείκτης πολλαπλασιασμού thyroids του

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια (Σχήμα 3A.Ic και -d, n = 2 ). Κύτταρα με Ki-67 ανοσο-χρώση πυρήνες μετρήθηκαν και τα ποσοτικά στοιχεία που φαίνεται στο Σχήμα 3A.II. Η ποσοτική ανάλυση δείχνει ότι ο αριθμός των κυττάρων του θυρεοειδούς με Ki-67 χρωματισμένο πυρήνες ήταν 50% χαμηλότερη σε

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια σε σχέση με το

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

ποντίκια, δείχνοντας μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων στον θυρεοειδή του

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια.

( AI) δύο αντιπροσωπευτικές μικροφωτογραφίες βάφονται Ki-67 σε τμήματα του θυρεοειδούς του

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

(α και β αντιπροσωπεύουν δύο διαφορετικά ποντίκια) και

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια (γ και δ αντιπροσωπεύουν δύο διαφορετικά ποντίκια). Στα thyroids του

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια, λιγότερα κύτταρα του θυρεοειδούς βάφτηκαν με Ki-67 σε σχέση με το thyroids του

thrB

PV /PVNcor1

+ /+ ποντίκια

(βέλη). (Α.ΙΙ) Θετικά πυρηνική Ki-67-βάφονται θυρεοειδικών κυττάρων από το

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

και

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

ποντίκια μετρήθηκαν και εκφράστηκαν ως ποσοστό των συνολικών κυττάρων. Το ποσοστό των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων ήταν σημαντικά χαμηλότερη στους thyroids του

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

από

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

ποντίκια. (BI) Πυρηνικά εκχυλίσματα πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν από θυρεοειδή όγκων του

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

(λωρίδες 1 και 2) ή

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

(λωρίδες 3 και 4) ποντίκια. Ανάλυση κηλίδας Western της κυκλίνης D1, φωσφορυλιωμένη Rb, σύνολο Rb, ρ21, και ρ27 είναι όπως σημειώνονται και ακτίνη (πίνακας στ) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (B.II) Ποσοτικοποίηση των εντάσεων μπάντας φαίνεται στο (B.I). Οι αφθονίες πρωτεΐνη της κυκλίνης D1 και φωσφορυλιωμένη Rb ήταν χαμηλότερα στα thyroids του

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια, ενώ η πρωτεΐνη αφθονία των p21 και p27 ήταν υψηλότερη στα thyroids της

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια.

η

το εύρημα αυτό υποστηρίχθηκε περαιτέρω από την βιοχημική ανάλυση στην οποία η πρωτεΐνη αφθονία βασικό ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου , κυκλίνη D1, ήταν σημαντικά χαμηλότερη στους thyroids του

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια (Σχήμα 3B.I, πίνακα α, διαδρομές 3 & amp? 4) σε σχέση με το

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

ποντίκια (λωρίδες 1 & amp? 2). Επιπλέον, η μειωμένη κυκλίνης D1 οδήγησε σε χαμηλότερη πρωτεΐνη αφθονία φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη ρετινοβλαστώματος (pRb) (Σχήμα 3B.I, πάνελ b, σύγκρινε κανάλια 1 &? 2 με λωρίδες 3 & amp? 4) χωρίς αλλαγή του συνολικού Rb επίπεδα πρωτεΐνης (πίνακας ντο). Η μείωση του φωσφορυλιωμένο Rb εμπόδισε την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου από τη G1 στη φάση S. Συνέπεια, η πρωτεΐνη αφθονία των εξαρτώμενων από κυκλίνη ρ21 αναστολέα της κινάσης και p27 (Σχήμα 3B.I, πίνακες δ και ε, αντίστοιχα) ήταν επίσης χαμηλότερη στα thyroids του

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια σε σχέση με το

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

ποντίκια (σύγκρινε κανάλια 3-4 με λωρίδες 1-2). Τα ποσοτικά δεδομένα των εντάσεων ζώνης φαίνεται στο Σχήμα 3B.II. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η έκφραση του NCOR1ΔID οδήγησε σε αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων, εν μέρει, από την καθυστέρηση της προόδου του κυτταρικού κύκλου G1-S.

Είτε απόπτωση συνέβαλε επίσης στη μειωμένη ανάπτυξη του όγκου του θυρεοειδούς που φαίνεται στο Σχήμα 1Β αξιολογήθηκε επίσης με εξέταση των βασικών ρυθμιστές της απόπτωσης. Η πρωτεΐνη αφθονία του Bcl-2 σχετίζεται Χ πρωτεΐνη (BAX), το οποίο προωθεί την απόπτωση, ήταν υψηλότερη σε θυρεοειδείς του

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια από ό, τι σε

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

ποντίκια (Σχήμα 4AA, συγκρίνετε διαδρομές 3 & amp? 4 με 1 & amp? 2). Puma, το οποίο είναι ένα BH3 (2-Bcl τομέα ομολογίας 3) -μόνο πρωτεΐνη που επάγει την απόπτωση μέσω του μονοπατιού μιτοχόνδρια, ήταν επίσης υψηλότερη σε θυρεοειδείς του

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια σε σχέση με το

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

ποντίκια (Σχήμα 4AB, συγκρίνετε διαδρομές 3 & amp? 4 με 1 & amp? 2). Οι ποσοτικές εντάσεις ζωνών που φαίνεται στο Σχήμα 4βα, υποδεικνύοντας μία αύξηση κατά 2-φορές σε επίπεδο πρωτεΐνης ΒΑΧ και PUMA. Επιπλέον, η αυξημένη διασπασμένη κασπάση 3 (Σχήμα 4Α, πάνελ b, λωρίδες 3 & amp? 4) και η μειωμένη συνολική πολυ ΑϋΡ-ριβόζη πολυμεράση (PARP), αλλά αυξήθηκε διασπασμένη PARP (πάνελ c, άνω ζώνη και κάτω ζώνη, αντίστοιχα, στις λωρίδες 3 & amp? 4) στο

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια σε σύγκριση με το

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

ποντίκια ήταν ενδεικτική της αυξημένα αποπτωτική δραστικότητα σε καρκινικά κύτταρα του θυρεοειδούς του

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια (βλέπε επίσης ποσοτικά δεδομένα στην Εικόνα 4BB). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι εκτός από την καθυστέρηση της προόδου του κυτταρικού κύκλου G1-S, την αυξημένη αποπτωτική δραστηριότητα thyroids του

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια συνέβαλε επίσης στη μείωση της ανάπτυξης του θυρεοειδούς.

(Α) Πυρηνικά εκχυλίσματα πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν από θυρεοειδή όγκων του

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

(λωρίδες 1 και 2) ή

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

(διαδρομές 3 και 4) ποντίκια. Ορατή είναι αναλύσεις Western blot ΒΑΧ (πάνελ Α), PUMA (πίνακας β), διασπασμένη κασπάση 3 (Πίνακας C), PARP και διασπασμένη PARP (πίνακας d), και τον έλεγχο φόρτωσης ακτίνης (πάνελ e). (Β) Ποσοτικοποίηση των εντάσεων ζώνης φαίνεται στο (Α). * Ρ & lt? 0,05 Protein αφθονία ΒΑΧ και PUMA (πάνελ Α), διασπασμένη κασπάση 3 και διασπασμένη PARP (πάνελ β) ήταν σημαντικά υψηλότερη και η συνολική PARP (πάνελ β) ήταν χαμηλότερη στα θυρεοειδείς του

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια.

η

αναστολή της ανάπτυξης όγκου από την ενεργοποίηση του p53-μονοπάτι σηματοδότησης στην thyroids του

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

Ποντίκια

Τα ευρήματα ότι η πρωτεΐνη αφθονίες των p21 και ΒΑΧ άλλαξαν όπως φαίνεται από τα παραπάνω μας ώθησε να εξετάσει αν η έκφρασή τους σε επίπεδο mRNA επηρεάστηκε επίσης. Πράγματι, βρήκαμε ότι

Cdkn1A

(

p21

WAF1

) επίπεδα mRNA ήταν σημαντικά υψηλότερη στον θυρεοειδή του

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια σε σχέση με το

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

ποντίκια (Σχήμα 5Α, μπαρ 2 εναντίον γραμμή 1). Ομοίως,

Bax

επίπεδο mRNA ήταν υψηλότερη στον θυρεοειδή του

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια σε σχέση με το

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

ποντίκια (Σχήμα 5Β, γραμμή 4 εναντίον γραμμή 3). Αυτά τα δύο γονίδια που ρυθμίζονται απευθείας από p53 [35], [36]. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι η μεταβολή της δραστηριότητας του p53 σε thyroids του

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια θα οδηγούσε σε ενεργοποίηση της μεταγραφής του

Cdkn1A

και

Bax

γονίδια. Εξετάσαμε πρώτα εάν η έκφραση του mRNA p53 και της πρωτεΐνης αλλοιώθηκε, αλλάζοντας έτσι τη δραστηριότητα στον θυρεοειδή του

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια. Βρήκαμε ότι η έκφραση του NCOR1ΔID δεν είχαν αποτελέσματα της έκφρασης του p53 στο επίπεδο mRNA (ράβδοι 5 και 6, Σχήμα 5Α). Επιπλέον, βρήκαμε ότι η πρωτεΐνη αφθονία της p53 ήταν παρόμοια χαμηλά στον θυρεοειδή του

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

και

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντικούς (Σχήμα 5Β, άνω πάνελ, λωρίδες 3 και 4, αντίστοιχα). Ως εκ τούτου, το υψηλότερο

Cdkn1A

και

Βαχ

επίπεδα mRNA δεν ήταν λόγω της ενεργοποίησης της δραστηριότητας της μεταγραφής ρ53 με την έκφραση αυξημένης πρωτεΐνης ρ53. Επειδή έχει δειχθεί προηγουμένως ότι TRs άγριου τύπου φυσικώς αλληλεπιδρούν με ρ53 και αρνητικά ρυθμίζουν τη μεταγραφική δραστηριότητα της ρ53 [37], [38], από την επόμενη διερεύνησαν την πιθανότητα ότι η δραστηριότητα της ρ53 μπορεί να τροποποιηθεί μέσω αλληλεπίδρασης με PV σε thyroids των μεταλλαγμένων ποντικών. Ανάλυση Συν-ανοσοκατακρήμνιση έδειξε ότι PV συνδέθηκε με p53 στον θυρεοειδή του

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

ποντικούς (Σχήμα 5Β, άνω πάνελ, λωρίδα 1). PV επίσης ομοίως σχετίζεται με p53 στον θυρεοειδή του

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια (Σχήμα 5Β, άνω πάνελ, λωρίδα 2). Είναι σημαντικό, συνανοσοκαθίζησης έδειξε επίσης ότι PV συσχετίστηκε επίσης με NCOR1 στα θυρεοειδούς πυρηνικά εκχυλίσματα του

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

ποντίκια (Σχήμα 5Β, κάτω πάνελ, λωρίδα 1) , αλλά δεν αλληλεπιδρά με NCOR1ΔID στα θυρεοειδούς πυρηνικά εκχυλίσματα του

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια (γραμμή 2). Λωρίδες 3 και 4 δείχνουν ότι ένα παρόμοιο ποσό του NCOR1 και NCOR1ΔID, αντίστοιχα, ανιχνεύθηκε με άμεση ανάλυση κηλίδας Western (Σχήμα 5Β, κάτω πάνελ). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ΦΒ αλληλεπίδρασε με ρ53 και NCOR1 σε ένα τριμερές σύμπλοκο (ρ53 /PV /NCOR1) στον θυρεοειδή του

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

ποντικούς, αλλά σχηματίζονται μόνο ένα p53 /PV συγκρότημα στον θυρεοειδή του

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια.

(Α) Ενεργός έκφραση του

Cdkn1A

και οι

Bax

γονιδίων στον θυρεοειδή του

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια. Ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR διεξήχθη όπως περιγράφεται στις Μεθόδους και Υλικά. Κάθε δείγμα του θυρεοειδούς διεξήχθη εις τριπλούν με συνολικό αριθμό ποντικών 3-5. Οι διαφορές στην έκφραση είναι σημαντικές στην έκφραση των

Cdkn1A

(λωρίδες 1 και 2) και το

γονίδια Bax

(διαδρομές 3 και 4) μεταξύ των

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

και

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια (διαδρομές 5 και 6). (Β) συνανοσοκαθίζησης των φωτοβολταϊκών με την p53 και NCOR1 στον θυρεοειδή του

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

ποντίκια (διαδρομή 1), αλλά όχι με NCOR1ΔID σε εκχυλίσματα θυρεοειδή

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια (γραμμή 2). Λωρίδες 3 και 4 δείχνουν τη ζώνη p53 (άνω τμήμα) και NCOR1 και NCOR1ΔID από άμεση ανάλυση κηλίδας Western από τις θυρεοειδούς πυρηνικά εκχυλίσματα του

thrB

PV /PVNcor1

+ /+

και

thrB

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ποντίκια, αντίστοιχα. (Γ και Δ) Πρόσληψη των φωτοβολταϊκών και NCOR1 στους /θέσεις δέσμευσης DNA p53 στον υποκινητή του

Cdkn1A

γονίδιο (C) και το

Bax

γονίδιο (D). δοκιμασία ChIP διεξήχθη χρησιμοποιώντας IgG (μπάρες 1 και 6) ή αντι-p53 (μπάρες 2 και 7) ή αντι-PV (μπάρες 3 και 8) ή αντι-NCOR1 (ράβδοι 4 και 9) ή αντι-HDAC-3 ( ράβδοι 5 και 10) αντισώματα όπως περιγράφεται στο

Μέθοδοι και Υλικά