Αφηρημένο

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο στον κόσμο σήμερα. Αν και έχουν κάποιες προόδους στη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα έγιναν, η επιβίωση των ασθενών εξακολουθεί να είναι κακή. Τα microRNAs (miRNAs) μπορούν να δράσουν ως ογκογονίδια ή γονίδια καταστολής όγκων σε ανθρώπινη κακοήθεια. Η οικογένεια miR-34 αποτελείται από όγκο-κατασταλτικής miRNAs, και μειωμένη έκφραση της έχει αναφερθεί σε διάφορους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι miR-34a και στόχος miR-34c που προέρχεται από αιμοπετάλια άλφα υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα και βήτα (ΡϋΟΡΡ-α και ΡϋΟΡΡ-β), κυτταρική επιφάνεια υποδοχέων κινάσης τυροσίνης που επάγουν τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή στον καρκίνο. MiR-34α και miR-34γ ρυθμίστηκαν προς τα κάτω σε όγκους του πνεύμονα σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς. Επιπλέον, ταυτοποιήσαμε μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ ΡϋΟΡΡ-α /β και miR-34a /έκφραση c σε δείγματα όγκου πνεύμονος. Τέλος, miR-34a /c υπερέκφραση ή προς τα κάτω ρύθμιση του ΡϋΟΡΡ-α /β από siRNAs, εμπλουτίζεται έντονα την απόκριση σε TNF που σχετίζονται με την απόπτωση που επάγει συνδέτη (TRAIL), ενώ η μείωση της μεταναστευτικής και επεμβατική ικανότητα των κυττάρων NSCLC.

Citation : Garofalo Μ, Jeon YJ, Nuovo GJ, Middleton J, Secchiero P, Joshi P, et al. (2013) MiR-34α /c-Dependent ΡϋΟΡΡ-α /β Προς τα κάτω ρύθμιση Αναστέλλει Ογκογένεση και ενισχύει TRAIL απόπτωση που επάγεται στον καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 8 (6): e67581. doi: 10.1371 /journal.pone.0067581

Επιμέλεια: Noriko Gotoh, Ινστιτούτο Ιατρικών Επιστημών, Πανεπιστήμιο του Τόκιο, Ιαπωνία

Ελήφθη: 10 Νοεμβρίου, 2012? Αποδεκτές: 23η Μαΐου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 21, Ιούνη 2013

Copyright: © 2013 Garofalo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας CA152758. Οι συγγραφείς είναι ευγνώμονες για την υποστήριξη της έρευνας από το Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο στοχοθετημένες επενδύσεις σε Βραβείο Αριστείας. MG είναι ο αποδέκτης του βραβείου Kimmel Μελετητής 2011. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. GJN είναι υπάλληλος της Phylogeny , Inc. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο σε όλο τον κόσμο [1]. Παρά τα χρόνια της έρευνας, η πρόγνωση για τους ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα παραμένει ζοφερή. Ο πιο συχνός τύπος, μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) (85%), δείχνει συνολική πενταετούς επιβίωσης 15%. Ισομορφές του υποδοχέα αυξητικού παράγοντα από αιμοπετάλια (PDGFR) και συνδέτη, PDGF, αποτελούν μία οικογένεια υποδοχέων και συνδετήρων που εμπλέκονται στην πολλαπλασιαστική και prosurvival σηματοδότησης εντός των κυττάρων. Το σύστημα /PDGF ΡϋΘΡΡ περιλαμβάνει δύο υποδοχείς (PDGFR-α και PDGFR-β) και τέσσερις συνδέτες (PDGFA, PDGFB, PDGFC και PDGFD). διμερισμό πρόσδεσης επάγει τον υποδοχέα ρίζας συνδέσεως, επιτρέποντας αυτοφωσφορυλίωση των συγκεκριμένων υπολειμμάτων τυροσίνης και μεταγενέστερη πρόσληψη του μια ποικιλία μορίων μεταγωγής σήματος. PDGFR ρυθμίζει φυσιολογική κυτταρική ανάπτυξη και διαφοροποίηση [2] και η έκφραση του ενεργοποιημένου PDGFR προάγει ογκογόνο μετασχηματισμό [3]. Πολυάριθμες

in vitro

και

in vivo

μελέτες έδειξαν ότι η αναστολή της σηματοδότησης ΡϋΟΡΡ-α διαταράσσει επιβίωση των καρκινικών κυττάρων στο υποσύνολο των γαστρεντερικών στρωματικών όγκων (GISTs) με την ενεργοποίηση ΡϋΟΡΡ-α μεταλλάξεις [4, 5]. Σε μια πρόσφατη μελέτη 150 NSCLC δειγμάτων ασθενών, ενεργοποιημένα ΡϋΟΡΡ-α ανιχνεύθηκε στο 13% των περιπτώσεων [6], γεγονός που υποδηλώνει ότι ένα υποσύνολο αυτών των ασθενών θα μπορούσαν να επωφεληθούν από τις θεραπείες που κατευθύνονται έναντι ΡϋΟΡΡ-α. Επιπλέον, ΡϋΟΡΡ-α υπερέκφραση έχει παρατηρηθεί σε μεταστατικό έναντι δείγματα μη μεταστατικό μυελοβλάστωμα ασθενούς και διαταράσσοντας τη λειτουργία ΡϋΟΡΡ-α παρεμπόδισε την μεταστατικό δυναμικό των κυττάρων μυελοβλάστωμα in vitro [7]. Δεδομένου progrowth ρόλο της στην κυτταρική σηματοδότηση, ΡϋΟΡΡ-α έχει γίνει ένας ελκυστικός θεραπευτικός στόχος σε μια σειρά ανθρώπινων κακοηθειών. Σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, κυτταροπλασματική έκφραση ΡϋΟΡΡ-α από όγκος είναι ένας αρνητικός προγνωστικός δείκτης [8], επιβεβαιώνοντας ότι ο άξονας PDGF μπορεί να είναι βιολογικά σημαντική. Όλα τα μέλη της οικογένειας εμφανίζουν PDGF ισχυρή αγγειογενετική δραστηριότητα

in vivo

, και από αυτή την άποψη, PDGF-Β άξονας /PDGFRβ ήταν η πιο εκτεταμένη αξιολογείται. Στα null ποντίκια δείχθηκε ότι PDGF-Β και PDGFRβ είναι κρίσιμο ρόλο στην αγγειακή ανάπτυξη. Ο ρόλος του PDGF /PDGFR σε αγγειακή ανάπτυξη υποστηρίζεται από πειράματα knockout [9,10]. Τα microRNAs (miRNAs), μια κατηγορία ~ 22 nt ενδογενή RNAs, είναι σημαντικοί ρυθμιστές της έκφρασης του γονιδίου και έχουν εμπλακεί στη ρύθμιση των κρίσιμων διεργασιών που απορυθμισμένη σε καρκινικά κύτταρα, όπως ο πολλαπλασιασμός [11] διαφοροποίηση [12] και την απόπτωση [13 ]. Οι μεταβολές στην έκφραση miRNA στον καρκίνο έχουν τεκμηριωθεί σε πολλές μελέτες και δείχνουν ότι miRNAs συμβάλουν κριτικά στο φαινότυπο των καρκινικών κυττάρων [14,15]. Επιπλέον, έχουν ορισμένα γονίδια miRNA-κωδικοποιούν έχουν ταξινομηθεί ως ογκογόνο ή όγκου γονίδια καταστολής σύμφωνα με τη λειτουργία τους σε κυτταρικό μετασχηματισμό και αλλοιωμένη έκφραση σε όγκους.

Το 2007, αναφορές από διάφορα εργαστήρια έδειξαν ότι τα μέλη του miR-34 οικογένειας είναι άμεσοι στόχοι p53, και ότι προς τα πάνω ρύθμιση που προκαλείται απόπτωση και του κυτταρικού κύκλου σύλληψή τους [16,17]. Σε θηλαστικά, η οικογένεια του miR-34 περιλαμβάνει τρεις επεξεργασία miRNAs που κωδικοποιούνται από δύο διαφορετικά γονίδια: miR-34a κωδικοποιείται από τη δική μεταγραφή του, ενώ miR-34b και το μερίδιο miR-34γ μια κοινή πρωτογενή μεταγραφή. Επιπλέον, η περιοχή του υποκινητή του miR-34a, miR-34b και miR-34c περιέχει CpG νησίδων και παρεκκλίνουσα CpG μεθυλίωση μειώνει miR-34 έκφρασης της οικογένειας σε πολλαπλούς τύπους καρκίνου [18,19,20].

αυτή η μελέτη, δείχνουμε ότι miR-34a και miR-34c, έντονα μειωτικά σε κύτταρα NSCLC και όγκους του πνεύμονα, ενώ είναι εντόνως εκφρασμένα σε φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων. Επιπλέον, miR-34a και miR-34c, στοχεύοντας PDGFR-α και PDGFR-β, αυξάνουν TRAIL επαγόμενη απόπτωση και να μειώσει εισβολής του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν, για πρώτη φορά, ότι συνδυαστική θεραπεία αναστολέων TRAIL και PDGFR μπορούσε να είναι αποτελεσματική για την αντι-NSCLC αγωγή.

Αποτελέσματα

MiR-34α και miR-34c PDGFR στόχος -α και PDGFR-β 3 ‘UTRs

Μεταξύ των miRNAs, τα μέλη του miR-34 της οικογένειας παίζουν σημαντικό όγκο κατασταλτικό ρόλο, όπως αυτές ρυθμίζονται απευθείας από p53 και συνθέτουν το δίκτυο p53 [16,17]. Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι το miR-34 μεθυλίωση ήταν παρούσα σε NSCLC και σημαντικά που σχετίζονται με δυσμενή κλινική έκβαση [20]. Κατ ‘αρχάς, θα αναλυθούν από Real Time PCR (qRT-PCR) miR-34a, -34b και -34c έκφραση σε 5 διαφορετικές NSCLC κυτταρικές σειρές με p53 WT, μεταλλαγμένο ή μηδενική (Σχήμα S1a στο S1 αρχείου). MiR-34α, -34b και -34c είχαν χαμηλή ή απούσα έκφραση σε όλες τις πέντε κυτταρικές σειρές (Σχήμα S1b στο αρχείο S1). Για τον προσδιορισμό των miR-34a, -34b, και -34c στόχους, πραγματοποιήσαμε μια έρευνα βιοπληροφορική (Targetscan, Pictar) για πιθανούς στόχους του mRNA. Μεταξύ των υποψήφιων στόχων, 3 ‘UTR της ανθρώπινης PDGFR-α και PDGFR-β που περιέχονται περιοχές (PDGFR-α νουκλεοτίδια 2670-2676? 2699-2705? PDGFR-β νουκλεοτίδια 1535-1541) που ταιριάζει τις ακολουθίες σπόρο της HSA-ΜΙΚ 34α, -34b και -34c (Σχήμα 1α). ΡϋΟΡΡ-α και ΡϋΟΡΡ-β έχουν αναφερθεί ότι υπερεκφράζεται και σχετίζεται με κακή πρόγνωση στον καρκίνο του πνεύμονα [21]. Για να επαληθευθεί αν PDGFR-α και PDGFR-β ήταν άμεσοι στόχοι του miR-34a, -34b και -34c, PDGFR-α 3 ‘UTR, που περιέχει δύο miR-34a, -34b και -34c θέσεις πρόσδεσης και PDGFR-β 3’ UTR, που περιέχουν μία miR-34a, -34b και θέση δέσμευσης -34c (σχήμα 1α, β), κλωνοποιήθηκαν προς τα κάτω του λουσιφεράσης ανοικτού πλαισίου ανάγνωσης. Είναι ενδιαφέρον ότι, η αυξημένη έκφραση του miR-34a και miR-34c, και όχι miR-34b, κατά την επιμόλυνση, επιβεβαιώθηκε με qRT-PCR (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), μειώθηκαν σημαντικά δραστικότητα λουσιφεράσης, υποδεικνύοντας μία άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ των miRNAs και PDGFRα και PDGFRβ 3 ‘UTRs (σχήμα 1γ, δ). γονιδίου στόχου καταστολή διασώθηκε από μεταλλάξεις στα συμπληρωματικές θέσεις των σπόρων (Εικόνα 1 b, c, d). Στο σύνολό τους τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-34a και miR-34c και όχι miR-34b στοχεύουν άμεσα PDGFR-α και PDGFR-β.

(α) PDGFR-α και PDGFR-β 3 ‘UTRs περιέχουν, αντίστοιχα , δύο και προέβλεψε miR-34a, -34b και θέσεις πρόσδεσης -34c. Στο σχήμα η ευθυγράμμιση των περιοχών του σπόρου miR-34a /c με ΡϋΟΡΡ-α και 3 ‘UTRs ΡϋΟΡΡ-β παρουσιάζεται. Οι θέσεις μεταλλαξογένεσης στόχο που καθορίζεται στο κόκκινο. _deleted νουκλεοτίδια. (Β) κατασκευές pGL3 ελέγχου-ΡϋΟΡΡ-α που περιέχει δύο θέσεις πρόσδεσης-α PDGFR (σε κόκκινο). Η διαγραφή ενός εκ των δύο θέσεων ΡϋΟΡΡ-α χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργήσει τα μεταλλαγμένα λουσιφεράσης palsmids. (Γ-δ) PDGFR-α και PDGFR-β 3 ‘UTRs είναι άμεσοι στόχοι του miR-34a και miR-34c. pGL3-ΡϋΟΡΡ-α και λουσιφεράσης pGL3-ΡϋΟΡΡ-β κατασκευάσματα, που περιέχει ένα αγρίου τύπου (αριστερή πλευρά των ιστογράμματα) ή μεταλλαγμένες (δεξιά πλευρά των ιστογράμματα) ΡϋΟΡΡ-α και ΡϋΟΡΡ-β 3 ‘UTRs, διαμολύνθηκαν σε Calu -6 κύτταρα. Σχετική καταστολή της έκφρασης λουσιφεράσης πυγολαμπίδας τυποποιήθηκε σε έλεγχος επιμόλυνσης. Οι δοκιμασίες ανταποκριτού διεξήχθησαν τρεις φορές με ουσιαστικά ίδια αποτελέσματα. * P & lt? 0,0001, ** P & lt?. 0.05 από t-test δύο ουρά του Student

Η

MiR-34α και miR-34c είναι αντιστρόφως ανάλογη με PDGFR-α /β έκφραση

in vitro

και

in vivo

η

στη συνέχεια, ανέλυσε τις συνέπειες της έκτοπη έκφραση του miR-34a και -34c σε Calu-6 και H1703 κυττάρων. Επιλέξαμε αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές λόγω των υψηλών επιπέδων έκφρασης του ΡϋΟΡΡ-α (H1703 και Calu-6) και ΡϋΟΡΡ-β (Calu-6) (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυξημένη έκφραση του miR-34a και miR-34c κατά την επιμόλυνση επιβεβαιώθηκε με qRT-PCR (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα) και, στη συνέχεια, τα αποτελέσματα επί ΡϋΟΡΡ-α και ΡϋΟΡΡ-β mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης αναλύθηκαν με qRT-PCR και κηλίδος western. MiR-34α και -34c (και όχι miR-34b) υπερέκφραση μείωσε σημαντικά ΡϋΟΡΡ-α και ΡϋΟΡΡ-β mRNAs (Σχήμα 2α) και τα ενδογενή επίπεδα πρωτεΐνης, σε σύγκριση με τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με ένα περιπλεγμένο προ-miR (Σχήμα 2β). Τα επίπεδα έκφρασης των τεσσάρων PDGF προσδέματα (PDGFA, PDGFB, PDGFC, PDGFD) μετά miR-34a και miR-34c εκτελεστεί έκφρασης αξιολογήθηκαν επίσης σε δύο κύτταρα Calu-6 και H1703. PDGFD ήταν μόλις εκφράζεται και στις δύο κυτταρικές γραμμές? δεν βρήκαμε καμία μεταβολή της έκφρασης PDGFA, PDGFB και PDGFC (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συνοπτικά, αυτά τα αποτελέσματα υποστήριξαν τις βιοπληροφορική προβλέψεις υποδεικνύοντας ΡϋΟΡΡ-α και ΡϋΟΡΡ-β 3 ‘UTRs ως στόχοι του miR-34a και -34c.

(α) qRT-PCR δείχνει ΡϋΟΡΡ-α και ΡϋΟΡΡ-β mRNAs ρύθμιση προς τα κάτω σε Calu-6 και H1703 κυττάρων μετά από miR-34 και miR-34γ αλλά όχι miR-34b επιβάλλεται έκφρασης (β) miR-34a και miR-34γ επιβάλλεται έκφραση μειώνει τα επίπεδα ενδογενών επιπέδων πρωτεΐνης /β PDGFR-α σε H1703 και Calu-6 NSCLC. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με ομελέτα, miR-34a ή miR-34c για 72 ώρες. ΡϋΟΡΡ-α και η έκφραση ΡϋΟΡΡ-β αξιολογήθηκε με κηλίδα western. έλεγχος φόρτωσης ελήφθη χρησιμοποιώντας GAPDH αντισώματος. * P & lt? 0.05, ** P & lt?. 0.001 από t-test δύο ουρά του Student

Η

Για να επαληθεύσετε τη ρύθμιση προς τα κάτω του miR-34a και -34c και

in vivo

, 9 όγκων του πνεύμονα (μεταξύ αδενοκαρκίνωμα και καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων) και τα παρακείμενα ιστολογικά φυσιολογικούς ιστούς πνεύμονα αναλύθηκαν για miR-34a και έκφραση -34c. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 3Α και Β, miR-34a και έκφραση miR-34c ήταν χαμηλότερη στον όγκο σε σύγκριση με τα κανονικά δείγματα (Σχήμα 3α, β).

(α-β) qRT-PCR επί 18 πνευμόνων όγκου και φυσιολογικών ιστών. MiR-34α και miR-34c είναι προς τα κάτω ρυθμισμένη σε όγκους σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων. οικόπεδα (γ) Box δείχνει miR-34a και την έκφραση του miR-34c σε 48 πνευμόνων φυσιολογικών και καρκινικών ιστών. οικόπεδα (δ) XY διασποράς δείχνει αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του miR-34a /c και PDGFR-α /β. Δύο-tailed t test Student χρησιμοποιήθηκε για την επαλήθευση της σημασία. P & lt?. 0.05

Η

Επίσης, αναλύσαμε miR-34a, 34c και η έκφραση του mRNA /β PDGFR-α σε 24 πρωτογενή δείγματα ανθρώπινου όγκου πνεύμονα σε σύγκριση με 24 φυσιολογικούς ιστούς. MiR-34α και -34c ήταν σχεδόν μη ανιχνεύσιμα στον όγκο και υψηλής έκφρασης στα δείγματα φυσιολογικού πνεύμονα δοκιμάστηκαν (Σχήμα 3c). Αξίζει να σημειωθεί, αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του miR-34a /c και PDGFR-α και PDGFR-β παρατηρήθηκε (Σχήμα 3δ). Για περαιτέρω επιβεβαίωση αυτών των ευρημάτων, in situ υβριδοποίηση ανάλυση (ISH) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας 5′-Dig-ιχνηθετημένων ανιχνευτών LNA σε όγκους του πνεύμονα και των φυσιολογικών ιστών, που ακολουθείται από ανοσοϊστοχημεία (IHC) για ΡϋΟΡΡ-α και PDGFRβ. Οι περισσότεροι πνεύμονα καρκινικά κύτταρα παρουσίασαν χαμηλή έκφραση του miR-34a και υψηλή έκφραση του ΡϋΟΡΡ-α /β, ενώ το παρακείμενο μη-κακοήθεις πνεύμονα εκφράζεται ΡϋΟΡΡ-α σπάνια και εκφράζεται σε αφθονία miR-34a. MiR-34α και έκφρασης /β PDGFR-α στην πλειονότητα των 107 διαφορετικούς όγκους που αναλύθηκαν ήταν βασικά αμοιβαία αποκλειόμενες (Σχήμα 4α, β και η Εικόνα S2 σε S1 File).

(α-β) Ανοσοϊστοχημεία και σε situ υβριδοποίηση σε 107 δείγματα ιστών καρκίνου του πνεύμονα. MiR-34α (μπλε) και ΡϋΟΡΡ-α /β (καφέ /κόκκινο, αντίστοιχα σε RGB και κάθε φθορίζον κόκκινο Nuance μετατρέπονται εικόνας) έκφραση σχετίζεται αντίστροφα σε καρκίνους του πνεύμονα και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών του πνεύμονα. Αυτές οι σειριακές τομές αναλύθηκαν για έκφραση miR-34a με in situ υβριδισμό, ακολουθούμενο από ανοσοϊστοχημεία για ΡϋΟΡΡ-α /β. (Α) Αντιπροσωπευτικό παράδειγμα: Ανάλυση Συν-έκφραση του miR-34a και PDGFR-α. Σημείωση έλλειψη της έκφρασης στην συγχωνευμένη εικόνα (πίνακας β) (φθορίζον κίτρινο = συν-έκφραση). (Β) Αντιπροσωπευτικό παράδειγμα: miR-34a = μπλε (ομάδα Α), PDGFR-β = κόκκινο (πίνακας β), συν-έκφραση = κίτρινο (πάνελ c). RGB = τακτική Πράσινο Μπλε εικόνα της αντίδρασης ISH /LHC φαίνεται στο πάνελ a-c. μπαρ κλίμακας δείχνει 50 μm. Η μεγέθυνση είναι η ίδια για όλους τους πίνακες.

Η

MiR-34α και miR-34γ αντίσταση ξεπεράσει TRAIL κυττάρων NSCLC μέσω PDGFR-α και PDGFR-β προς τα κάτω ρύθμιση

TNF-σχετικές συνδέτη που επάγει απόπτωση (TRAIL) είναι ένα μέλος της οικογένειας του παράγοντα νέκρωσης όγκου, που είναι γνωστό ότι επάγουν απόπτωση σε μια ποικιλία διαφορετικών τύπων όγκου. TRAIL είναι ικανό να επάγει ειδικά τον κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα ενώ διαφυλάσσει φυσιολογικά κύτταρα και αυτή τη στιγμή δοκιμάζεται ως μια πολλά υποσχόμενη παράγων κατά του όγκου σε κλινικές δοκιμές [22]. Ωστόσο, πολλοί όγκοι συμπεριλαμβανομένης NSCLC είναι ανθεκτικοί σε TRAIL περιορίζοντας έτσι τη θεραπευτική εφαρμογή της. Από ΡϋΟΡΡ-α και ΡϋΟΡΡ-β ρυθμίζει το ΡΙ3Κ /Akt και ERK1 /2 οδών [23,24,25], εξετάσαμε την επόμενη, με ανοσοχρώση, την έκφραση και /ή ενεργοποίηση μερικών από τις πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε αυτές τις οδούς εξής miR -34a και miR-34γ επιβάλλεται έκφραση ή PDGFR-α /β αποσιώπηση από τα siRNA. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5α, τα επίπεδα φωσφορυλίωσης των ERKs μειώθηκε μετά miR-34a και miR-34c εκτελεστεί έκφραση σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο miR. ΡϋΟΡΡ-α σίγηση μείωσε την ενεργοποίηση και των δύο Akt και ERK1 /2 (5β Σχήμα). Έχουμε προηγουμένως αποδείξει ότι η οδός ΡΙ3Κ /ΑΚΤ παίζει ένα ρόλο κλειδί σε TRAIL-επαγώμενη απόπτωση [26], επομένως εξετάστηκαν οι επιδράσεις της miR-34a και miR-34c υπερέκφραση για την επιβίωση των κυττάρων και την αντίσταση TRAIL του NSCLC. Πρώτον, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού για Calu-6 και H1703 TRAIL ημι-ανθεκτικά κύτταρα μετά την επιβολή έκφραση του miR-34a και miR-34c. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση τα κύτταρα εκτέθηκαν σε TRAIL για 24 ώρες και στη συνέχεια πολλαπλασιασμό των κυττάρων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία ΜΤΤ. Calu-6 και H1703 κύτταρα που υπερεκφράζουν miR-34a και -34c έδειξε σημαντική χαμηλότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα S3a σε File S1). Επιπλέον, κασπάσης 3/7 δοκιμασία αποκάλυψε μια αύξηση στην ευαισθησία TRAIL μετά miR-34a και -34c εκτελεστεί έκφραση ή ΡϋΟΡΡ-α /β σίγησης, σε σύγκριση με τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με ένα κωδικοποιημένο miR ή siRNA (Εικόνα 5c, d).

(α) Western blot στον Calu-6 κυττάρων μετά miR-34a, -34b και -34c αναγκαστική έκφρασης. MiR-34α ή miR-34c και όχι miR-34b αναγκάζονται έκφραση μειώνει τα επίπεδα έκφρασης PDGFRβ και μειώνει την ενεργοποίηση του ERK1 /2. (Β) Κηλίδα Western που δείχνει την απενεργοποίηση των οδών Akt και ERKs μετά ΡϋΟΡΡ-α σίγηση. (Γ) Κασπάση 3/7 δοκιμασίας. MiR-34α και -34c εκτελεστεί έκφραση σε ημι-ανθεκτικά κύτταρα Calu-6 και H1703, αυξάνει την απόκριση σε TRAIL επαγόμενη απόπτωση. (Δ) Κασπάση 3/7 δοκιμασία δείχνει ότι ΡϋΟΡΡ-α ή ΡϋΟΡΡ-β σίγηση αυξάνει την απόκριση προς TRAIL επαγόμενη απόπτωση. (Ε) ΡϋΟΡΡ-α ή ΡϋΟΡΡ-β υπερέκφραση σε Η460 TRAIL-ευαίσθητα κύτταρα μειώνει την απόκριση στο φάρμακο. (Στ) Συνδυασμένη θεραπεία αναστολέα PDGFR (20 μΜ) και διαφορετικές συγκεντρώσεις TRAIL (0-100-150 ng /ml) για 24 ώρες ευαισθητοποιεί κύτταρα NSCLC να TRAIL επαγόμενη απόπτωση. * Ρ & lt? 0.001, ** Ρ & lt?. 0.05

Η

Επιπλέον, η υπερέκφραση του PDGFR-α και ΡϋΟΡΡ-β σε κύτταρα Η460 TRAIL-ευαίσθητα, αύξησε την αντίσταση στο φάρμακο (Σχήμα 5e και το Σχήμα S3C στο S1 αρχείου). Αντιστρόφως, θεραπευτική αγωγή Calu-6 κυττάρων με έναν αναστολέα PDGFR αύξησε σημαντικά την ευαισθησία σε TRAIL-επαγώμενη απόπτωση (Σχήμα 5F και το Σχήμα S3D σε S1 File). Περιέργως, η υπερέκφραση του PDGFR-α ή ΡϋΟΡΡ-β (χρησιμοποιώντας δύο πλασμίδια που περιέχουν μόνο τις αλληλουχίες κωδικοποίησης και όχι τα 3 ‘UTRs του ΡϋΟΡΡ-α /β) σε συνδυασμό με miR-34a ή miR-34c, μείωσε την ευαισθησία στο TRAIL επαγόμενη απόπτωση, όπως εκτιμήθηκε τόσο από ΜΤΤ και κασπάσης 3/7 δοκιμασίας (Σχήμα S4 στο S1 File). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ΡϋΟΡΡ-α και ΡϋΟΡΡ-β παίζουν σημαντικό ρόλο σε TRAIL-επαγώμενη απόπτωση και ότι αναστολέας PDGFR μπορεί να ευαισθητοποιήσει κύτταρα NSCLC να TRAIL με σημαντικές θεραπευτικές συνέπειες.

ΡϋΟΡΡ-α /β μειορύθμιση από ΜΙΚ 34α και miR-34c αναστέλλει τη μετανάστευση και εισβολής των κυττάρων NSCLC

Επειδή PDGFR-α /β ρυθμίζει το μονοπάτι PI3K /AKT, εμπλέκονται κυρίως στη μετανάστευση και την εισβολή των διαφορετικών όγκων [27,28], ερευνήσαμε αν miR -34a /c θα μπορούσε να επηρεάσει τη μετανάστευση NSCLC και την εισβολή μέσω PDGFR-α και PDGFR-β αρνητική ρύθμιση. Για να εξεταστεί άμεσα το λειτουργικό ρόλο του miR-34a /c στην ογκογένεση, υπερεκφράσαμε αυτά τα δύο miRNAs ή σιγήσει ΡϋΟΡΡ-α /β σε Calu-6 ή H1703 κύτταρα. Περιέργως, παρατηρήσαμε μια σημαντική μείωση των μεταναστευτικών και επεμβατικές δυνατότητες των Calu-6 και τα κύτταρα H1703 μετά miR-34a ή miR-34γ υπερέκφραση (Σχήμα 6α), καθώς και μετά από PDGFR-α και PDGFR-β ρύθμιση προς τα κάτω (Σχήμα 6β), επιβεβαίωσε επίσης, με τη δοκιμασία μηδέν-πληγή (Σχήμα 6γ). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ότι ΡϋΟΡΡ-α και ΡϋΟΡΡ-β ενεπλάκησαν στην ογκογένεση των κυττάρων NSCLC, miR-34a και -34c επιμολύνθηκαν σε Calu-6 κυττάρων μόνο ή σε συνδυασμό με ένα πλασμίδιο που υπερεκφράζουν μόνο την κωδικοποιητική αλληλουχία και όχι την 3 ‘UTR του ΡϋΟΡΡ-α και ΡϋΟΡΡ-β. MiR-34α /c επιβληθεί έκφραση μειωμένη μετανάστευση και την εισβολή των Calu-6 κυττάρων, αλλά η υπερέκφραση του PDGFR-α ή PDGFR-β, μαζί με τα δύο microRNAs, εν μέρει αποκατασταθεί τα μετανάστευση και την εισβολή των δυνατοτήτων, γεγονός που υποδηλώνει ότι miR-34a /C ρυθμίζουν NSCLC ογκογένεση, τουλάχιστον εν μέρει, μέσω της ΡϋΟΡΡ-α /β (Σχήμα 6 d, e).

(α) MiR-34α και -34c εκτελεστεί έκφραση μειώνει μεταναστευτικών και επεμβατικές δυνατότητες του H1703 κυττάρων. (Β) PDGFR-α και PDGFR-β σίγηση μειώνει τις μεταναστευτικές και επεμβατικές δυνατότητες των Calu-6 κυττάρων. RFU = σχετικές μονάδες φθορισμού. (Γ) Εκπρόσωπος φωτογραφίες του γδαρμένο περιοχές της συρροής μονοστοιβάδας Calu-6 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-34a /c ή ελέγχου miRNA (miR-CTR) σε 0h, 12 ώρες και 24 ώρες μετά τον τραυματισμό με το ρύγχος μιας πιπέτας. μπαρ κλίμακα, 100 μm. Η μεγέθυνση είναι η ίδια για όλα τα πάνελ. (Δ-ε) PDGFR-α και PDGFR-β υπερέκφραση διασώζει μερικώς αποδημητικά και επεμβατικές δυνατότητες των Calu-6 κυττάρων. * P & lt?. 0.05

Η

Συζήτηση

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στους άνδρες και τις γυναίκες σε όλο τον κόσμο

1. Η Αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία εκτιμά 156.940 θάνατοι από καρκίνο του πνεύμονα στις Ηνωμένες Πολιτείες για το 2011 και μόνο [29]. Μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) αντιπροσωπεύει την πλειοψηφία του συνόλου των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα και είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο [30].

Το υψηλό ποσοστό θνησιμότητας που σχετίζεται με τον καρκίνο του πνεύμονα έχει προκαλέσει πολλές εξαντλητικές προσπάθειες για να ταυτοποίηση νέων θεραπευτικών στόχων και των τρόπων θεραπείας για αυτήν την θανάσιμη ασθένεια. υποδοχείς αιμοπεταλίων αυξητικό παράγοντα (PDGFRs) και τους συνδέτες τους, παράγοντες ανάπτυξης από αιμοπετάλια (PDGFs) παίζουν κρίσιμους ρόλους στην μεσεγχυματικά κυτταρική μετανάστευση και πολλαπλασιασμό. Οι ανωμαλίες της PDGFR /PDGF πιστεύεται ότι συμβάλλουν σε μια σειρά ασθενειών του ανθρώπου και ιδιαίτερα κακοήθειας [31].

Τα microRNAs είναι μικρά RNAs μη κωδικοποιητική που δείχνουν απορύθμιση στις περισσότερες μορφές καρκίνου. Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι παίζουν ουσιαστικό ρόλο στην παθογένεση και την πρόγνωση των ανθρώπινων κακοηθειών και στην αντίσταση σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα [32,33]. Νέκρωσης όγκου παράγοντα που σχετίζονται με συνδέτη που επάγει απόπτωση (TRAIL) πυροδοτεί απόπτωση σε κύτταρα όγκου, αλλά όταν χρησιμοποιείται μόνο του, είναι αναποτελεσματικό στην θεραπεία όγκων TRAIL-ανθεκτικά. Η αντίσταση αυτή πρόκληση για TRAIL-based αντικαρκινικές θεραπείες. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι miR-34a και miR-34c έντονα downmodulated στις δύο NSCLC κυττάρων και όγκων του πνεύμονα σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς. Επιβάλλεται η έκφραση του miR-34a και miR-34γ μειωτικά PDGFR-α και PDGFR-β mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης. Λουσιφεράσης και πειράματα κηλίδας western κατέδειξε ότι PDGFR-α και PDGFR-β είναι άμεσοι στόχοι του miR-34a και miR-34γ αλλά όχι των miR-34b. Η αντίσταση πολλών τύπων καρκίνου με τις συμβατικές χημειοθεραπείες είναι ένας σημαντικός παράγοντας υπονομεύει την επιτυχή θεραπεία του καρκίνου. ενεργοποίηση ΑΚΤ συμβάλλει επίσης στην ογκογένεση και τη μετάσταση του όγκου, και όπως φαίνεται πιο πρόσφατα, η αντίσταση στη χημειοθεραπεία [26,34]. Ως αποτέλεσμα, τόσο

in vitro

και

in vivo

μελέτες που συνδυάζουν μικρών μορίων αναστολέων της PI3K /Akt μονοπατιού με την κλασική χημειοθεραπεία έχουν αποδειχθεί επιτυχημένες στην εξασθένηση της αντοχής στα χημειοθεραπευτικά. Συγκεκριμένα, αναστολή δραστικότητας ΑΚΤ μπορεί να είναι μια έγκυρη προσέγγιση για τη θεραπεία του καρκίνου και να αυξήσει την αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας.

Οι πρωτεϊνικές κινάσες αποτελούν κύριους ρυθμιστές των περισσότερων οδών κυτταρικής σηματοδότησης. Μεταξύ αυτών, οι κινάσες τυροσίνης υποδοχέα (RTKs), όπως PDGFR, παίζουν καθοριστικό ρόλο στην προώθηση κυτταρικής ανάπτυξης και του πολλαπλασιασμού με μεταγωγή εξωκυτταρικά ερεθίσματα σε ενδοκυτταρική σηματοδότηση κυκλώματα [35]. Ένα σημαντικό συστατικό της ενδοκυτταρικής σηματοδότησης μηχανημάτων είναι η PI3K /Akt (ΡΚΒ) /στόχο της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (PI3K /Akt [PKB] /mTOR) οδού [36,37]. Η ανώμαλη ενεργοποίηση αυτού του μονοπατιού με μετάλλαξη οποιοδήποτε από τα πολλαπλά γονίδια είναι γνωστό ότι συμβαίνει στην πλειονότητα των ανθρώπινων καρκίνων μέσω διαφόρων μηχανισμών [38,39]. Σε προηγούμενη εργασία [26], αποδείξαμε ότι το ΚΟΑ, μέσω της ενεργοποίησης του μονοπατιού ΡΙ3Κ /ΑΚΤ, προκαλούμενη ογκογένεσης και αντίσταση TRAIL στον NSCLC. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι ΡϋΟΡΡ-α /β, μέσω της ενεργοποίησης της οδού ΑΚΤ πρέπει να συμμετέχουν στην TRAIL-επαγώμενη απόπτωση. Πράγματι, η υπερέκφραση του miR-34a και miR-34γ ή προς τα κάτω ρύθμιση του ΡϋΟΡΡ-α /β από siRNAs, ιδιαίτερα αύξησε την απόκριση του ημι-ανθεκτικών κυττάρων NSCLC να TRAIL απόπτωση. Σημαντικά, συνδυασμένη θεραπεία ενός αναστολέα PDGFR με TRAIL, αυξημένη απόπτωση και μειωμένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό, όπως αξιολογείται με κασπάση 3/7 δοκιμασίες προσδιορισμού και ΜΤΤ. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η συνδυασμένη θεραπεία του TRAIL με αναστολείς PDGFR θα μπορούσε να ευαισθητοποιήσει ένα υποσύνολο των όγκων του πνεύμονα, που εκφράζουν τους υποδοχείς PDGF, στο φάρμακο. Επιπλέον, είναι γνωστό ότι η ΡΙ3Κ /ΑΚΤ, καθώς οι /2 μονοπάτια ERK1 ρυθμίζουν την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή των διαφόρων μορφών καρκίνου [40,41]. Εδώ, αναφέραμε ότι miR-34a και miR-34c υπερέκφραση ή ΡϋΟΡΡ-α /β σίγηση ανέστειλαν την μετανάστευση και την εισβολή χωρητικότητα Calu-6 και H1703 κυττάρων, συγκριτικά με κύτταρα διαμολυσμένα με περιπλεγμένο miR ή siRNA ελέγχου. Επιβάλλεται η έκφραση του PDGFR-α ή PDGFR-β εν μέρει αποκατασταθεί η μετανάστευση NSCLC και εισβολή υποστηρίζοντας ότι η ρύθμιση της έκφρασης αυτών των υποδοχέων από miR-34a /C παίζει σημαντικό ρόλο στην NSCLC ογκογένεση. Ωστόσο, αναγνωρίζουμε ότι και άλλοι στόχοι miR-34a /c, συμπεριλαμβανομένων c-Met [16] και AXL [42] θα μπορούσε επίσης να συμμετέχουν. Ενώ αυτό το χειρόγραφο ήταν στο πλαίσιο της προετοιμασίας Silber et al. ανέφεραν ότι η έκφραση miR-34a ήταν χαμηλότερη στην προνευρικών γλοιώματα σε σύγκριση με άλλους υπότυπους του όγκου και προσδιορίζονται ΡϋΟΡΡ-α ως άμεσο στόχο miR-34a [43]. Εδώ, αναφέρουμε ότι όχι μόνο miR-34a, αλλά miR-34γ ρυθμίζει προς τα κάτω και PDGFR-α σε κύτταρα NSCLC. Επιπλέον, έχουμε αποδείξει ότι PDGFR-β είναι a /c άμεσο στόχο miR-34a, ενώ δεν είδαμε καμία σημαντική επίδραση στην έκφραση του PDGFR-α και PDGFR-β μετά miR-34b επιβάλλεται έκφρασης. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η μελέτη μας δείχνει ότι η αναστολή ή προς τα κάτω ρύθμιση του ΡϋΟΡΡ-α και ΡϋΟΡΡ-β με miR-34a /c ανταγωνίζεται ογκογονικότητα και αυξάνει την ευαισθησία στην TRAIL-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο με σημαντική θεραπευτική εφαρμογή για τη μελλοντική θεραπεία κατά του όγκου του καρκίνου του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

πνεύμονα καρκινικές κυτταρικές γραμμές και δείγματα ιστών

Ανθρώπινο Η460, Α549, κυτταρικές γραμμές Η1299, H1703 αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI που περιέχει 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (FBS) και με 2 mM L-γλουταμίνη και 100Uml-1 πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη. Calu-6 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 2mM L-γλουταμίνη και 100Uml-1 πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη. 9 όγκους των πνευμόνων (συμπεριλαμβανομένων αδενοκαρκίνωμα και το καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων) και η κανονική τους ομολόγους τους ευγενικά από τον Dr. ΠΔ Nana-Sinkam, πνευμονική, Αλλεργία, Critical Care και Sleep Medicine, The State University του Οχάιο Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου, Columbus, OH. δείγματα φυσιολογικών και καρκινικών ιστών 48 πνεύμονα που παρέχονται από το Τμήμα Παθολογίας, Πανεπιστήμιο του Οχάιο. Όλες οι ανθρώπινοι ιστοί ελήφθησαν σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο εγκεκριμένο από το Ohio State Board Institutional Review.

Λουσιφεράσης

δοκιμασία

Οι 3 ‘UTRs των ανθρώπινων PDGFRA και PDGFRB γονίδια, ενισχύθηκαν με PCR χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εκκινητές:

PDGFR-α FW 5 ‘TCTAGACCG GCCTGAGAAACACTATTTGTG 3’

PDGFR-α RW 5 ‘TCTAGAACATGAACAGGGGCATTCGTAATACA 3 «

PDGFR-β FW 5′ TCTAGAAAAGAGGGCAAATGAGATCACCTCCTGCA 3 ‘

PDGFR-β RW 5 ‘TCTAGATATTGAGAACCCACTCTCCCTCCTTGGA 3’

η

και κλωνοποιήθηκε καθοδικά του κωδικονίου Renilla λουσιφεράσης στάση σε φορέα ελέγχου pGL3 (Promega). Αυτά τα κατασκευάσματα χρησιμοποιήθηκαν για να δημιουργήσουν, με αντίστροφη PCR, οι p3′-UTRs- μεταλλαγμένο-πλασμιδίων χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές:

ΡϋΟΡΡ-α Mut1 FW 5 ‘ACTGCCAAAACATTTATGACAAGCTGTATCGCCTCG 3’

ΡϋΟΡΡ-α Mut1 RW 5 ‘CGAGGCGATACAGCTTGTCATAAATGTTTTGGCAGT

PDGFR-αmut2 FW: 5′ ACTGCCAAAACATTTATGACAAGCTGTATGGTCGTTTATATTT 3 ‘

PDGFR-αmut2 RW: 5′ AAATATAAACGACCATACAGCTTGTCATAAATGTTTTGGCAGT 3 ‘

PDGFR-β Μουτ FW 5′ -ATGGGGGTATGGTTTTGTCAGACCTAGCAGTGAC-3 ‘

PDGFR-β Mut RW 5′-GTCACTGCTAGGTCTGACAAAACCATACCCCCAT-3′

Η

Calu-6 κύτταρα συνεπιμολύνθηκαν με 1 μg του p3’UTR-PDGFR-α, p3 ‘UTR-ΡϋΟΡΡ-β ή με p3’UTRmut-ΡϋΟΡΡ-α και p3’UTRmut-ΡϋΟΡΡ-β, 1 μg ενός έκφρασης λουσιφεράσης Renilla κατασκεύασμα ρΡΙ_-ΤΚ (Promega) με χρήση Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση και προσδιορίστηκε με διπλή δοκιμασία λουσιφεράσης (Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Ανάλυση Western Blot

Σύνολο πρωτεΐνες από NSCLC εκχυλίστηκαν με δοκιμασία ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA) ρυθμιστικό (0.15 mM NaCl, 0.05 mM Tris-HCl, ρΗ 7,5, 1% Triton, 0,1% SDS, 0,1% δεοξυχολικό νάτριο και 1% Nonidet Ρ40). εκχύλισμα του δείγματος (50 μ§) διαχωρίστηκαν σε 7,5 με 12% SDS-πολυακρυλαμιδίου πηκτές (PAGE) χρησιμοποιώντας μία συσκευή mini-gel (Bio-Rad Laboratories) και μεταφέρθηκε σε Hybond-C έξτρα νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν για 1 ώρα με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε ρυθμισμένο με Tris αλατούχο διάλυμα που περιέχει 0.05% Tween 20, επωάζονται όλη τη νύχτα με πρωτεύον αντίσωμα, πλύθηκαν και επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα, και οπτικοποιήθηκε με χημειοφωταύγεια. Τα ακόλουθα πρωτεύοντα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: αντι-ΡϋΟΡΡ-α, αντι-ΡϋΟΡΡ-β, αντι-ERK1 /2, αντι-ρ-ERKs, αντι-ρΑΚΤ, αντι-ολική Akt, αντι-GAPDH αντισώματα (Cell Signaling). Χρησιμοποιήθηκε ένα δευτερεύον αντι-κουνελιού ή αντι-ποντικού ανοσοσφαιρίνης G (IgG) συζυγούς υπεροξειδάσης αντίσωμα (Chemicon).

Real-time PCR

σε πραγματικό χρόνο PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο TaqMan PCR πρωτόκολλο Kit σε ένα Applied Biosystems 7900HT Σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας (Applied Biosystems). Η 10 μΐ αντίδραση PCR περιλαμβάνεται 0.67 μΙ RT προϊόν, 1 μΐ TaqMan PCR καθολική Κύριο Μείγμα (Applied Biosystems), 0,2 mM ανιχνευτή TaqMan, 1,5 mm προς τα εμπρός εναρκτήρα και 0.7 mM αντίστροφο εκκινητή. Οι αντιδράσεις επωάστηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων στους 95

° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95

° C για 15 s και 60

° C για 1 λεπτό. Ολες οι αντιδράσεις έτρεξαν εις τριπλούν. Ο κύκλος κατωφλίου (CT) ορίζεται ως ο αριθμός κλασματικών κύκλος στον οποίο ο φθορισμός διέρχεται το σταθερό κατώφλι. Η συγκριτική μέθοδος CT για σχετική κβάντωση της γονιδιακής έκφρασης (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης miRNA. Ο άξονας γ αντιπροσωπεύει την 2 (-ΔCT), ή τη σχετική έκφραση των διαφορετικών Mirs. έκφραση Mirs υπολογίστηκε σε σχέση με U44 και U48 rRNA. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν για κάθε σημείο δεδομένων, και η ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη χρήση λογισμικού (βιο- Rad).

κυτταρικό θάνατο και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ποσοτικοποίηση

Για την ανίχνευση της κασπάσης 3/7 δραστηριότητα, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων εις τριπλούν, έλαβαν θεραπεία με TRAIL (100-150ng /ml) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κασπάση-Glo 3/7 Assay kit (Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Συνεχείς μεταβλητές εκφράζονται ως μέσες τιμές ± τυπική απόκλιση (S.D.). Η βιωσιμότητα των κυττάρων εξετάσθηκε με 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-dipheniltetrazolium Δοκιμασία (ΜΤΤ) Κυτταρικός Titer 96 Aqueous One Solution κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Promega), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μεταβολικά ενεργά κύτταρα ανιχνεύθηκαν με την προσθήκη 20 μΐ ΜΤΤ σε κάθε φρεάτιο. Μετά από 1 ώρα επώασης, οι πλάκες αναλύθηκαν σε Multilabel Counter (Bio-Rad Laboratories).

Anti-ΡϋΟΡΡ-α και αντι-ΡϋΟΡΡ-β siRNAs διαμόλυνση

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 50% συρροή και παροδικά επιμολυσμένα για 72 ώρες χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 με 100 ηΜ αντι-ΡϋΟΡΡ-α ή /και με 100 ηΜ αντι-ΡϋΟΡΡ-β SMARTpool siRNAs ή siRNAs ελέγχου (Dharmacon), μια ομάδα τεσσάρων ειδικών στόχων 20-25 nt siRNAs σχεδιάζονται να χτυπήσει κάτω της γονιδιακής έκφρασης.

mirna κλειδωμένο νουκλεϊκών οξέων in situ υβριδισμού της φορμόλης σταθερό, παραφίνη-ενσωματωμένες τμήμα ιστού

In situ υβριδισμού (ISH) πραγματοποιήθηκε σε αποπαραφινοποιούνται ιστούς ανθρώπινου πνεύμονα χρησιμοποιώντας προηγουμένως δημοσιευμένο πρωτόκολλο [44], η οποία περιλαμβάνει την πέψη σε πεψίνη (1,3 mg /ml) για 30 λεπτά. Η αλληλουχία του ανιχνευτή που περιέχει το διεσπαρμένο κλειδωμένο νουκλεϊκό οξύ (LNA) τροποποιημένες βάσεις με διγοξιγενίνη συζευγμένη με το 5 ‘άκρο ήταν: 5’ ACAACCAGCTAAGACACTGCCA 3 ‘. Τα κοκτέιλ και ιστών miRNA ανιχνευτή συν-μετουσιώθηκε στους 60

° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενο από υβριδοποίηση σε 37

° C όλη τη νύχτα και μια πλύση αυστηρότητας σε 0.2Χ SSC και 2% αλβουμίνη βόειου ορού σε 4

° C για 10 λεπτά.