Αφηρημένο

Ιστορικό

Προέρχονται από αρχέγονα γεννητικά κύτταρα /γονοκύτταρα και την ανάπτυξη μέσω ενός πρόδρομου βλάβη που ονομάζεται καρκίνωμα

In Situ

(CIS), καρκίνοι των γεννητικών κυττάρων (GCC) είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου σε νέους άνδρες, υποδιαιρούνται σε σεμίνωμα (SE) και μη σεμίνωμα (NS). Κατά τη διάρκεια της φυσιολογικής γεννητικών κυττάρων σχηματισμό /ωρίμανση, επιγενετικές διεργασίες προφυλαχθεί ομοιόσταση ρυθμίζοντας την προσβασιμότητα του DNA για τη διευκόλυνση της μεταγραφής. Επιγενετικές απορρύθμιση μέσω γενετικών και περιβαλλοντικών παραμέτρων (δηλαδή genvironment) θα μπορούσε να διαταράξει την ανάπτυξη εμβρυϊκών γεννητικών κυττάρων, με αποτέλεσμα την καθυστερημένη ή μπλοκαριστεί ωρίμανσης. Αυτό ενδεχομένως να διευκολύνει το σχηματισμό της ΚΑΚ και της εξέλιξης σε επεμβατικές GCC. Ως εκ τούτου, τον καθορισμό της επιγενετικής και λειτουργικής γονιδιωματικής τοπίο σε κυτταρικές σειρές ΣΣΚ θα μπορούσε να παρέχει γνώσεις σχετικά με την παθοφυσιολογία και αιτιολογία της GCC και παρέχουν καθοδήγηση για στοχευμένη λειτουργικά πειράματα.

Αποτελέσματα

Αυτή η μελέτη στοχεύει στον εντοπισμό επιγενετικών πατημασιές σε κυτταρικές σειρές SE και ΕΚ στο προφίλ γονιδίωμα-ευρεία μελετώντας την αλληλεπίδραση μεταξύ της γονιδιακής έκφρασης, το DNA CpG μεθυλίωση και τροποποιήσεις των ιστονών, καθώς και τη λειτουργία τους στην παθοφυσιολογία και αιτιολογία της GCC. Δύο καλά χαρακτηρισμένες GCC που προέρχονται από κυτταρικές σειρές συγκρίθηκαν, ένας εκπρόσωπος για την SE (TCAM-2) και το άλλο για την ΕΚ (NCCIT). Τα δεδομένα αποκτήθηκαν με τη χρήση της Illumina HumanHT-12-v4 (γονιδιακή έκφραση) και HumanMethylation450 BeadChip (μεθυλίωση) μικροσυστοιχίες καθώς και τσιπ αλληλουχίας (ενεργοποίηση τροποποιήσεις των ιστονών (H3K4me3, H3K27ac)). Τα αποτελέσματα δείχνουν γνωστό δείκτες των γεννητικών κυττάρων, όχι μόνο για να γίνεται διάκριση μεταξύ SE και NS σε επίπεδο έκφρασης, αλλά και στην επιγενετική τοπίο.

Συμπέρασμα

Η συνολική ομοιότητα μεταξύ TCAM-2 /υποστήριξη NCCIT μια διαγράφονται εμβρυϊκά γεννητικά κύτταρα που συνελήφθησαν στις αρχές των γονάδων ανάπτυξη ως κοινό κελί προέλευσης, αν και το ακριβές στάδιο ανάπτυξης από την οποία τα καρκινικά κύτταρα που προέρχονται ενδέχεται να διαφέρουν. Πράγματι, λεπτή διαφορά στις (ολοκληρωμένη) προφίλ επιγενετική και της έκφρασης δείχνουν TCAM-2 να παρουσιάζουν μια πιο γεννητικών κυττάρων που μοιάζουν με το προφίλ, ενώ NCCIT δείχνει μια πιο πολυδύναμα φαινότυπο. Τα αποτελέσματα παρέχουν πληροφορίες για τη λειτουργική γονιδίωμα σε κυτταρικές σειρές GCC

Παράθεση:. Van der Zwan YG, Rijlaarsdam MA, Rossello FJ, Notini AJ, de Boer S, Watkins DN, et al. (2014) Seminoma και εμβρυϊκό καρκίνωμα Footprints ταυτοποιήθηκαν με ανάλυση της Ολοκληρωμένης Genome-Wide Επιγενετική και προφίλ έκφρασης του καρκίνου των γεννητικών κυττάρων Γραμμές κυττάρων. PLoS ONE 9 (6): e98330. doi: 10.1371 /journal.pone.0098330

Επιμέλεια: Amr H. Sawalha, Πανεπιστήμιο του Michigan, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 του Μαρτίου 2014? Αποδεκτές: 30 Απριλίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: δεύτερης, Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 van der Zwan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Array και αλληλουχίας ChIP δεδομένα είναι διαθέσιμα στο Omnibus γονιδιακής έκφρασης υπό τον αριθμό ένταξης GSE56454

Χρηματοδότηση:. Το έργο αυτό υποστηρίζεται από τη χρηματοδότηση από την Ευρωπαϊκή Εταιρεία Παιδιατρικής Ενδοκρινολογίας Research Fellowship (YZ). MR υποστηρίζεται από μια Μεταγραφική Grant, Erasmus MC. SB υποστηρίζεται από το APA και ΔΔΙ υποτροφίες από το Πανεπιστήμιο Monash. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τη χρηματοδότηση από το Πανεπιστήμιο Monash (ΝΔ). MIMR λαμβάνει στήριξη από το Επιχειρησιακό Πρόγραμμα Ενίσχυσης της Υποδομής της Βικτωριανής Κυβέρνησης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τύπος ΙΙ (όρχεων) όγκους γεννητικών κυττάρων, που αναφέρεται εδώ ως καρκίνοι των γεννητικών κυττάρων (GCC), είναι η πιο κοινή κακοήθεια σε Καυκάσιους εφήβους και νεαρούς ενήλικες, και η συχνότητά τους εξακολουθεί να αυξάνεται [1] – [3 ]. GCC προέρχονται από αρχέγονα γεννητικά κύτταρα ή γονοκύτταρα, και υποδιαιρούνται σε σεμινώματα (SE) και μη-σεμινώματα (NS), με καρκίνωμα

in situ

(CIS) του όρχεως ως κοινό πρόδρομο βλάβη τους [1], επίσης γνωστή ως ενδοσωληναριακό γεννητικών κυττάρων νεοπλασία Λοιποί κλάδοι (IGCNU) [3]. Σε αντίθεση με CIS και SE, το συστατικό των βλαστικών κυττάρων του NS (δηλαδή, εμβρυονικό καρκίνωμα, ΕΚ) χαρακτηρίζεται από πολυδύναμα δυναμικό [4]. ΕΚ μπορούν να διαφοροποιηθούν σε σωματικές συγγενικές σειρές και εξω-εμβρυονικούς ιστούς (τεράτωμα vs λεκιθικό σάκο του όγκου και χοριοκαρκίνωμα, αντίστοιχα), συμπεριλαμβανομένης της γεννητικών κυττάρων γενεαλογία [4]. Διάφορες κλινικές, περιβαλλοντικούς και γενετικούς παράγοντες κινδύνου για GCC έχουν προσδιοριστεί, αν και ο ακριβής ρόλος αυτών των παραγόντων δεν είναι απολύτως σαφής. Κλινικούς παράγοντες κινδύνου αποτελούν ουρολογικά /ανδρολογικά /γονάδων εκτροπές [5] – [8], ενώ οι περιβαλλοντικοί παράγοντες επικεντρώνονται στην ενδοκρινικοί διαταράκτες και ανδρογόνων – οιστρογόνων ισορροπία [9] – [11]. Γενετικοί παράγοντες κινδύνου περιλαμβάνουν μια σειρά από ευαισθησία ενός νουκλεοτιδίου πολυμορφισμοί, πιθανόν σχετίζονται με την πρώιμη ανάπτυξη των γονάδων [12] – [15] και μια ένωση με οικογενή προδιάθεση [16]. Οι σωματικές μεταλλάξεις σπάνια βρίσκονται σε GCC [17]. Υπάρχουν ισχυρές ενδείξεις ότι η μικρο-περιβάλλον του αναπτυσσόμενου όρχεων έχει μεγάλη σημασία στην παθογένεια του ΣΣΚ. Ασθενείς με όρχεων Σύνδρομο δυσγενεσίας (TDS) και ειδικών μορφών Διαταραχές του σεξ Ανάπτυξης (DSD) είναι γνωστό ότι έχουν αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης GCC οφείλεται στην ανώμαλη ανάπτυξη των γονάδων, δηλαδή hypovirilization [18].

Επιγενετική διαδικασίες έχουν ένα σαφή ρόλο τόσο στην έναρξη και την προστασία των πλειοδυναμίας [19]. Απορρύθμιση αυτών ελέγχονται αυστηρά διεργασίες είναι γνωστό ότι εμπλέκεται στο σχηματισμό και την εξέλιξη των διαφόρων τύπων καρκίνου [20] – [24], συμπεριλαμβανομένων GCC [25]. Κατά τη διάρκεια του σχηματισμού φυσιολογικών γεννητικών κυττάρων και ωρίμανσης, επιγενετικές διεργασίες (π.χ. μεθυλίωση του DNA, οι τροποποιήσεις των ιστονών) ομοιόσταση φρουράς με τη ρύθμιση της προσβασιμότητας του DNA για τη διευκόλυνση της μεταγραφής [25], [26]. Η επιγονιδιώματος είναι ιδιαίτερα δυναμική, και οι αλλαγές συμβαίνουν ανάλογα με τον τύπο των κυττάρων και το αναπτυξιακό στάδιο, επηρεάζεται από /αντανακλώντας την (μικρο) περιβάλλον. Παρά αυτή τη γνώση, λίγα είναι γνωστά για τον ρόλο των τροποποιήσεων ιστόνης και μεθυλίωση του DNA για την έκφραση γονιδίων σε GCC γενικά, και τις πιθανές ομοιότητες και διαφορές μεταξύ SE και ΕΚ [25], [27]. Επιγενετικές απορρύθμιση μέσω γενετικών και περιβαλλοντικών παραμέτρων (αναφέρεται ως genvironment) θα μπορούσε να διαταράξει φυσιολογική ανάπτυξη εμβρυϊκών γεννητικών κυττάρων, με αποτέλεσμα να καθυστερήσει ή να μπλοκάρει την ωρίμανση, διευκολύνοντας έτσι το σχηματισμό της ΚΑΚ, και ενδεχομένως εξέλιξης σε μια επεμβατική ΣΣΚ [25], [28] – [30]. Ως εκ τούτου, τον καθορισμό της επιγενετικής και λειτουργικής γονιδιωματικής τοπίο σε κυτταρικές σειρές ΣΣΚ θα μπορούσε να παρέχει γνώσεις σχετικά με την παθοφυσιολογία και αιτιολογία της GCC. Τα αποτελέσματα θα μπορούσαν να παρέχουν καθοδήγηση για στοχευμένη λειτουργική πειράματα.

Σε αυτή τη μελέτη, επιγενετική χνάρια των κυτταρικών σειρών SE και ΕΚ εντοπίστηκαν από τη μελέτη της αλληλεπίδρασης μεταξύ της γονιδιακής έκφρασης, μεθυλίωση του DNA και τροποποιήσεις των ιστονών. Δύο καλά χαρακτηρισμένες GCC που προέρχονται από κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν, ένας εκπρόσωπος για την SE (TCAM-2) [31], [32] και η άλλη για την ΕΚ (NCCIT) [33]. Δύο τύποι επιγενετικές τροποποιήσεις ερευνήθηκαν και που σχετίζονται με την γονιδιώματος ευρεία ανάλυση της έκφρασης:. CpG κατάσταση μεθυλίωσης του DNA, και τον εμπλουτισμό της ενεργοποίησης σημάτων ιστόνης (H3K4me3, H3K27ac)

Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

TCAM-2 [31], [32], [34] και NCCIT [33] κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο DMEM (# 31966-021, Thermo Fisher Scientific /Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS, GE Healthcare Life Sciences, HyClone Laboratories, Γιούτα, ΗΠΑ) σε T75 cm

2 φιάλες σε 75-90% συρροή. Για την παρασκευή του RNA, φρέσκο ​​μέσο προστέθηκε 24 ώρες πριν από τη συγκομιδή. Τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με ισορροπημένο διάλυμα αλάτων Hanks (HBSS, # 14175-053, Thermo Fisher Scientific /Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), και λύθηκαν με 7 ml παγωμένου RNA-Bee (# Cs-105Β, TEL • Δοκιμή Inc, Friendswood, Texas, USA). Για μεθυλίωση, τη γονιδιακή έκφραση (βιολογική εις διπλούν) και αναλύσεις chip-επόμενα, διάφορες καλλιέργειες κυττάρων από μία μόνο πηγή χρησιμοποιήθηκαν (Lepo εργαστήριο, Τμήμα Παθολογίας, Erasmus MC Ρότερνταμ). Βιολογικά επαναλήψεις ξεκίνησε ως ανεξάρτητες καλλιέργειες σε διαφορετικές ημέρες και υποβάλλονται σε επεξεργασία με παρόμοιο τρόπο.

Η μεθυλίωση profiling

DNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ DNeasy σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (# 69504, QIAGEN, Hilden, Germany). Όξινο θειώδες μετατροπής (ΕΖ μεθυλίωσης του DNA Gold Kit, Zymo Research, Irvine, CA, USA) και η ανίχνευση μεθυλίωσης διεξήχθη σε ServiceXS (ServiceXS B.V., Leiden, Ολλανδία). Illumina του HumanMethylation450 BeadChip χρησιμοποιήθηκε (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA, την επεξεργασία και υβριδισμό σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή). επεξεργασία εικόνας έγινε στις iScan σύστημα και τα δεδομένα εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας GenomeStudio, χρησιμοποιώντας τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις ανάλυσης (συμπεριλαμβανομένης της διόρθωσης υποβάθρου και την κανονικοποίηση με βάση τους εσωτερικούς ελέγχους) και v 1.2 του σχολιασμού δηλωτικό (https://support.illumina.com/downloads /humanmethylation450_15017482_v12.ilmn). Περαιτέρω επεξεργασία πραγματοποιήθηκε σε Ε χρησιμοποιώντας την (https://www.bioconductor.org/) πακέτο LUMI [35] μετά τη βελτιστοποιημένη «lumi: QN + BMIQ» αγωγού [36] Αυτό περιλαμβάνει αποκλεισμό χαμηλές επιδόσεις ανιχνευτές (p & lt? 0.01), ρύθμιση του χρώματος, ποσοστημόριο εξομάλυνση και διόρθωση για τον τύπο καθετήρα προκατάληψη (Infinium I vs II) χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο BMIQ [37]. Όλα τα αρχεία ακατέργαστα και επεξεργασμένα στοιχεία που υποβάλλονται ως GEO SuperSeries και προσβάσιμο μέσω GSE56454 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Διαφορικά μεθυλιωμένα περιοχές ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο DMRforPairs χρησιμοποιώντας τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις [38]. DMRforPairs είναι διαθέσιμη μέσω Bioconductor: (https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DMRforPairs.html). Εν συντομία, DMRforPairs ορίζει περιοχές του γονιδιώματος που χρησιμοποιούν τοπική πυκνότητα καθετήρα και προαιρετικά λειτουργική ομοιογένεια (π.χ. όλοι οι ανιχνευτές σε μια περιοχή θα πρέπει να του γονιδίου σχετίζεται). Ποσοτικοποιεί, δοκιμές και οπτικοποιεί μοντέλα (διαφορικό) μεθυλίωση μεταξύ μοναδικά δείγματα. Οι διαφορές υπολογίστηκαν ως NCCIT έναντι TCAM-2.

Gene έκφραση προφίλ

Περίπου 20 μg του RNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία με RNase-free DNaseI (# 2238, Ambion, Ambion Inc., Austin, TX , USA) για 30 λεπτά στους 37 ° C και στη συνέχεια καθαρίζεται χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy μίνι (# 74104, Qiagen, Hilden, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Καθαρό RNA εκλούστηκε σε 50 μΐ νερού, και ποσοτικά με τη χρήση Nanodrop (Thermo Scientific). τον έλεγχο της ποιότητας, την επισήμανση RNA, υβριδισμό και την εξόρυξη δεδομένων πραγματοποιήθηκαν σε ServiceXS B.V. (Leiden, Ολλανδία), σύμφωνα με τους πρωτόκολλο in-house. Βιοτινυλιωμένο cRNA παρασκευάσθηκε χρησιμοποιώντας την Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (# AMIL1791, Ambion Inc., Austin, TX, USA) σύμφωνα με τις προδιαγραφές του κατασκευαστή με μια είσοδο των 200 ng ολικού RNA. Ανά δείγμα, 750 ng του βιοτινυλιωμένου cRNA υβριδοποιήθηκε επί της Illumina HumanHT-12 V4 (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA) σύμφωνα με το εγχειρίδιο Illumina «άμεση υβριδοποίηση Guide Δοκιμασία». επεξεργασία εικόνας έγινε στις iScan σύστημα και τα δεδομένα εξήχθη χρησιμοποιώντας GenomeStudio (προεπιλεγμένες ρυθμίσεις). Περαιτέρω επεξεργασία πραγματοποιήθηκε σε R χρησιμοποιώντας το πακέτο LUMI (https://www.bioconductor.org/) [35]. Ακολουθώντας τις κατευθυντήριες γραμμές που παρουσιάζονται στο [39], ισχυρή κανονικοποίηση spline εφαρμόστηκε στις log2 μετατραπεί τιμές έντασης. Ανιχνευτές με ρ

ανίχνευση & gt? 0,05 σε & gt? 50% των δειγμάτων αποκλείστηκαν από την ανάλυση (n = 27.964 από 47.323). Μέσος όρος log2 εντάσεις των βιολογικών επαναλήψεις και ανά γονίδιο χρησιμοποιήθηκαν για την εκτίμηση των επιπέδων έκφρασης (αριθμός ένταξης GEO GSE56454). αναλογίες Log2 (R) του μέσου όρου των εντάσεων στα δύο κυτταρικές σειρές (NCCIT /TCAM-2) χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό σημαντικά διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων. Γονίδια με τα επίπεδα έκφρασης έξω από το διάστημα εμπιστοσύνης 99% (CI) αυτού του λόγου καταγραφής ταυτοποιήθηκαν ως διαφορικά εκφρασμένων μεταξύ NCCIT και TCAM-2.

τροποποίηση της ιστόνης προφίλ (H3K27ac, H3K4me3)

Η δοκιμασία ChIP διεξήχθη σύμφωνα με τον αριθμό των κυττάρων πρωτόκολλο χαμηλής μάρκα από Diagenode (Λιέγη, Βέλγιο), με μικρές τροποποιήσεις. Εν συντομία, 1 χ 10

6 κύτταρα ήταν εγκάρσια συνδεδεμένα επί οκτώ λεπτά με την προσθήκη φορμαλδεΰδης προς τελική συγκέντρωση 1%, ακολουθούμενη από εξουδετέρωση με 1.25 Μ γλυκίνη. Τα κύτταρα στη συνέχεια λύθηκαν και χρωματίνη είχε κοπεί σε -500 bp θραύσματα χρησιμοποιώντας την συσκευή υπερήχων Covaris υπό τις ακόλουθες συνθήκες? κύκλος 20%, μέγιστη ισχύ που προσπίπτει 200 ​​watts, κύκλοι /ριπή 200, χρόνος 5 λεπτά, θερμοκρασία 4 ° C. Πρωτεΐνη Dynabeads Α-επικάλυψη (# 10002D, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific /Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) επωάστηκαν με 7 μg από τα ακόλουθα αντισώματα: H3K4me3 (Diagenode pAb-003-050) ή H3K27ac (Ab4729, Abcam, Cambridge, UK). Τα σφαιρίδια συνδυάζονται με χρωματίνη από 1 × 10

6 κύτταρα όλη τη νύκτα επί ενός περιστρεφόμενου τροχού. Τα ανοσοσφαιρία πλύθηκαν, και το DNA καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ καθαρισμού iPure DNA (AL-100 έως 0100, Diagenode, Liege, Belgium), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. θραύσματα DNA διατέμνεται για δεύτερη φορά χρησιμοποιώντας συσκευή υπερήχων Covaris (κύκλος 10%, μέγιστη ισχύς 175 watts επίπτωση, κύκλοι /ριπή 200, χρόνος 5 λεπτά, θερμοκρασία 4 ° C). Μαζικά παράλληλη αλληλουχίας του DNA τσιπ (τσιπ Seq) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του 5500xl σταθερή πλατφόρμα αλληλουχίας ™ (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) στη διευκόλυνση του Monash Υγείας Μετάφραση Αστυνομικό Τμήμα Ιατρικής Genomics. Τα πειράματα αλληλουχίας ήταν ενιαίο τέλος με 50 nt διαβάσει μήκους (300 nt μέσο μέγεθος κομμάτι). Αλληλουχίας διαβάζει ευθυγραμμίστηκαν με την πλήρη hg19 ανθρώπινο γονιδίωμα (UCSC έκδοση, Φεβρουάριος 2009) χρησιμοποιώντας LifeScope ™ Genomic Λογισμικό Ανάλυσης v2.5 (https://www.lifetechnologies.com/lifescope). Τσιπ Seq πειραματικά δείγματα κανονικοποιήθηκαν σε ένα σύνολο 10

7 μοναδικά χαρτογραφηθεί ετικέτες προσδιορισμού αλληλουχίας. Η επεξεργασία τους στο HOMER ([40], https://homer.salk.edu/homer/chipseq/) για την ανίχνευση κορυφών και εμπλουτισμοί μοτίβο χρησιμοποιώντας τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις (εκτός από «φορές εμπλουτισμός πάνω εισόδου»? Χρησιμοποιήθηκαν 2? Όριο για την π -τιμή 0,01) (αριθμός ένταξης GEO GSE56454). Τα ύψη των κορυφών από τον Όμηρο διορθώθηκαν για φόντο (χαμηλότερο ύψος κορυφής ανιχνεύσιμο). Ύψη στη συνέχεια αθροίζονται ανά γονίδιο (ΣP) όπως σχολιασμένη από τον Όμηρο και τα γονίδια χωρίς καμία ανιχνεύσιμη κορυφή τέθηκαν στο 0. Η διαφορά στην αθροίζονται τα ύψη των κορυφών (ΔΣP = ΣP

TCAM-2-ΣP

NCCIT) χρησιμοποιήθηκε για να ποσοτικοποιηθεί διαφορές μεταξύ των κυτταρικών σειρών. Γονιδίων με διαφορική σημαντικά σχέδια τροποποίησης των ιστονών εντοπίστηκαν και για τα δύο σήματα ξεχωριστά (εκτός 99% CI των ΔΣP). Σύλλογος μιας κορυφής με TSS χρησιμοποιήθηκε ως σχολιασμένο από τον Όμηρο (1 kb ανάντη του TSS – 100 bp καθοδικά)

MLPA-DNaseI ανάλυση

MLPA ανιχνευτές σχεδιάστηκαν μετά από περιγράφηκε προηγουμένως κριτήρια [. ,,,0],41]. Βασίζονται σε διαφορετικά πρότυπα τροποποίηση NCCIT και TCAM-2 ανιχνευτές σχεδιάστηκαν για τις επόμενες θέσεις: NCCIT: CHR3: 181.425.532000000-181.425.720000000 εκατομμύρια, CHR5: 146.699.813 έως 146699953, CHR3: 181.577.755 με 181.577.830, CHR6: 15240050 με 15240160, CHR15: 93.191.596 με 93.191.696 , CHR3: 178.908.801000000-178.908.966000000 εκατομμύρια, CHR5: 101.550.991000000-101.551.125000000 εκατομμύρια, TCAM-2: CHR11: 10613134 έως 10.613.220, CHR1: 201278163 έως 201278251, CHR12: 3.091.402 με 3.091.483, CHR19: 13985162 έως 13.985.322, CHR2: 38.323.813 με 38323931, CHR9: 843018 -843110, CHR5: 140762378 έως 140.762.475. MLPA-DNaseI διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [42], με μικρές τροποποιήσεις. Εν συντομία, οι πυρήνες από 1 × 10

6 κύτταρα απομονώθηκαν, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ένα εύρος συγκεντρώσεων DNaseI (0? 2 και 5 μονάδες). Γονιδιακό DNA χωνευμένο καθαρίστηκε, και 50-100 ng χρησιμοποιήθηκε σε μία αντίδραση MLPA. Μετά την ενίσχυση PCR του συνδεδεμένων ιχνηθετών, προϊόντα διαχωρίστηκαν επί αλληλουχητή ABI3700 DNA. Τα δεδομένα αναλύθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως, με μείωση έως 75% του ύψους της κορυφής σε αχώνευτος DNA που χρησιμοποιείται ως κατώφλι για τον ορισμό DNaseI-υπερευαισθησίας [43].

Κατεβάστε

Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε Ε 3.0.1 (Windows 7 × 64) και 2.15.2 (Redhat Linux × 64). Τα δίκτυα /εμπλουτισμό αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε ΙΡΑ (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com). Οι γονιδιωματικές θέσεις που αναφέρονται σε αυτό το χειρόγραφο με βάση τη συναρμολόγηση /hg19 GRch37.

Αποτελέσματα

Για να διερευνήσουν επιγενετική χαρακτηριστικά της SE και της ΕΚ και τη σχέση τους με την έκφραση του γονιδίου, γονιδιώματος-ευρεία τροποποίηση των ιστονών και DNA προτύπων μεθυλίωσης διερευνήθηκαν στις κυτταρικές γραμμές TCAM-2 (SE) και NCCIT (EC), και ταιριάζει με τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης. Οι διαφορές μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών όσον αφορά την τροποποίηση της ιστόνης και την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA πρώτα διερευνήθηκαν ξεχωριστά. Στη συνέχεια, τα προκύπτοντα σύνολα δεδομένων ενσωματώθηκαν για την ταυτοποίηση γονιδίων (στόχος) με ένα ισχυρό σχέση μεταξύ γεμάτοι διαμόρφωση DNA και τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης.

τροποποίηση ιστόνης

μοτίβα τροποποίηση ιστόνης αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας χρωματίνης ανοσοκαθίζηση σε συνδυασμό με υψηλή ανάλυση αλληλουχίας απόδοσης (τσιπ seq). Η ανάλυση των δεδομένων έγινε όπως περιγράφεται στην ενότητα υλικά και μέθοδοι. Μεταβολές στα H3K4me3 και H3K27ac ερευνήθηκαν, οι οποίες είναι δείκτες που σχετίζονται με την ενεργοποίηση προαγωγέα (θέση έναρξης της μεταγραφής (TSS), H3K4me3 και H3K27ac) και ενεργοποίηση ενισχυτή (κυρίως H3K27ac) [44], [45]. Εκτός από την ανάλυση του (διαφορική) μοτίβα τροποποίηση, μοτίβο εμπλουτισμό των τροποποιημένων περιοχών ερευνήθηκε και συγκρίθηκε μεταξύ των κυτταρικών σειρών.

H3K4me3 και H3K27ac δεν παρουσιάζουν απόκλιση εμπλουτισμού κοντά θέσεις έναρξης μεταγραφής και τα ύψη των κορυφών τους συσχετίζονται εντός γονίδια.

Ανάλογα με την κυτταρική γραμμή, 10,2 /11,3% της H3K27ac εμπλουτισμένου loci βρίσκονταν εντός 1 kb του TSS κατά ένα συγκρίσιμο 14,7 /16,8% των τόπων H3K4me3 (TCAM-2 /NCCIT) . Αυτό είναι σύμφωνο με τις παρατηρήσεις σε άλλους τύπους κυττάρων που δείχνουν ότι, ακόμη και αν H3K4me3 έχει άμεση σχέση με την ενεργοποίηση υποκινητή, η μεγάλη πλειονότητα των τόπων H3K4me3 βρίσκονται περιφερικά του TSS [46]. H3K27ac δεν έχει αναφερθεί επιλεκτική εντόπιση στο TSS [47]. Το επίπεδο των συνόψισε κορυφές ανά γονίδιο (ΣP, βλέπε Μέθοδοι) χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνετε μοτίβα τροποποίηση των ιστονών μεταξύ των δύο σημάτων της ιστόνης. Υπήρξε σημαντική συσχέτιση στις δύο κυτταρικές σειρές μεταξύ των επιπέδων κορυφής στο γονίδια, όπου και οι δύο ήταν παρόντες (ρ

TCAM-2 = 0,62, p

TCAM-2 & lt? 0.001, n

TCAM-2 = 1837? ρ

NCCIT = 0,37, p

NCCIT & lt? 0.001, n

NCCIT = 746? ρ του Spearman). Αυτό είναι σύμφωνο με επικάλυψη λειτουργία τους: ανοιχτό χρωματίνης διαμόρφωση συνδέεται με τα δύο σήματα [19], [22] και

H3K4me3 και H3K27ac μοτίβα μας επέτρεψε να συνδυάσει τα αποτελέσματα τροποποίηση των ιστονών στη μετέπειτα ανάλυση εμπλουτισμού στο. TCAM-2 και NCCIT είναι σύμφωνα με γνωστές δείκτες ειδικότητα SE /ΕΚ.

Είμαστε στο παρελθόν έδειξαν ότι οι δραστικές μορφές χρωματίνης τροποποίηση για

SOX17

και

SOX2

στις κυτταρικές σειρές TCAM-2 και NCCIT ταιριάζει με το αναμενόμενο πρότυπο, που βασίζεται στην γονιδιακή έκφραση της πρωτεΐνης και ιστολογική σύνταγμα (

SOX17

δραστηριοποιούνται στην TCAM-2,

SOX2

δραστηριοποιούνται στην NCCIT) [25]. Σύμφωνα με αυτή,

SOX17

και

SOX2

ήταν διαφορικά εμπλουτίζεται τόσο για H3K4me3 και H3K27ac στο TCAM-2 και NCCIT αντίστοιχα (Σχήμα 1).

OCT3 /4

δεν έδειξε εμπλουτισμό εντός της ακολουθίας κωδικοποίησης, ωστόσο υπήρξε εμπλουτισμός και των δύο δεικτών κοντά στο TSS σε NCCIT και TCAM-2. Αυτό είναι σύμφωνο με τις γνωστές 4 mRNA OCT3 /και την έκφραση της πρωτεΐνης και στις δύο κυτταρικές σειρές [31], [48]. Nanog ήταν πιο εμπλουτισμένη και για τους δύο δείκτες σε TCAM-2, σύμφωνα με τις διαφορές στο επίπεδο έκφρασης (βλέπε παρακάτω).

Τα βέλη δείχνουν την κατεύθυνση της μεταγραφής. Πράσινο πλαίσια δείχνουν δείκτες ειδικούς για την ιστολογική υπότυπο που αντιπροσωπεύεται από την κυτταρική γραμμή. Μαύρα κουτιά = καμία διαφορά μεταξύ των κυτταρικών σειρών? κόκκινα κουτιά = όχι ένας δείκτης για αυτόν τον τύπο κυττάρου. Σημειώστε τις διαφορετικές σειρές στον άξονα y για H3K4me3 και H3K27ac.

Η

Σε μια κλίμακα γονιδίωμα-ευρεία, 29428 H3K4me3 εμπλουτισμένα τόποι εντοπίστηκαν στην TCAM-2 και 19.015 στην NCCIT. 25-41% περισσότερο εμπλουτισμένο τόποι εντοπίστηκαν για H3K27ac ό, τι για H3K4me3 (n

TCAM-2 = 41.569, n

NCCIT = 23.763). Επελέγησαν γονιδίων με σημαντικές διαφορές στο ύψος κορυφής αθροίζονται ανά γονίδιο (ΔΣP, βλέπε Μέθοδοι) για περαιτέρω ανάλυση. Για TCAM-2, γονίδια που δείχνουν απόκλιση τροποποιήσεις των ιστονών ήταν υψηλότερες σε αριθμό για H3K27ac (n

TCAM-2 = 433, Ν

NCCIT = 28). Για NCCIT, υπήρχαν πολύ περισσότερα γονίδια που επιλέγονται για H3K4me3 σε σύγκριση με H3K27ac (n

TCAM-2 = 215, Ν

NCCIT = 325). Και για τις δύο σήματα, 86/11 γονιδίων επικαλύπτονται μεταξύ των κορυφαίων λιστών διαφοροποίηση στο TCAM-2 και NCCIT αντίστοιχα. Αυτά περιλαμβάνονται στο δείκτη SE

SOX17

στο TCAM-2 και το δείκτη ΕΚ

SOX2

στο NCCIT (Σχήμα S1, Πίνακας S1). Λειτουργικά, οι κατάλογοι γονίδιο δύο κυτταρικές σειρές έδειξαν σημαντική εμπλουτισμό (εμβρυϊκών) βλαστικών κυττάρων συντήρησης /πλειοδυναμία (Πίνακας S2). Εμπλουτισμός των βιολογικών λειτουργιών στο TCAM-2 έδειξε ομοιότητα με πιο ώριμα βλαστικά κύτταρα, ο οποίος έλειπε από τη λίστα των NCCIT (GO κατηγορίες TCAM-2 περιλαμβάνονται ανάπτυξη της φυσιολογικής μορφολογίας όρχεων και συντήρηση των γεννητικών κυττάρων). Επιπλέον, δύο γεννητικών κυττάρων ειδικών σηματοδότηση κανονικών μονοπατιών IGF1 (log

p = 3,42) και των γεννητικών κυττάρων-κυττάρων Sertoli Junction Σηματοδοσίας (log

p = 2.11)) έδειξε εμπλουτισμό. Σε TCAM-2, δύο λειτουργικά δίκτυα εντοπίστηκαν ενσωματώνει το AR οδού και του μεταβολισμού των λιπιδίων (Πίνακας S2).

γεννητικών κυττάρων Σημάδια AP-2α και AP-2γ τα κορυφαία εμπλουτισμένα μοτίβα στο TCAM-2, ενώ τα εμβρυϊκά βλαστικά κυττάρου ειδικό μοτίβα SOX2 /Oct4 /TCF /Nanog εμπλουτίζονται και στις δύο κυτταρικές σειρές.

σημαντικά εμπλουτισμένη μοτίβα προσδιορίστηκαν για κάθε κυτταρική σειρά και το σήμα της ιστόνης (εργαλείο ΟΜΗΡΟΥ, βλέπε Μέθοδοι). Υπήρξε ισχυρή επικάλυψη μεταξύ των top-κατετάγη εμπλουτισμένο μοτίβα σε NCCIT και TCAM-2. Αυτό ήταν αληθές για αμφότερα τα ενεργοποίηση δείκτες. Για παράδειγμα, για H3K4me3 η κορυφή εμπλουτισμένο μοτίβο ήταν MAZ τόσο για TCAM-2 και NCCIT, έναν παράγοντα μεταγραφής που συνδέεται με MYC (προσδένεται σε δύο τοποθεσίες στην υποκινητή του) και είναι γνωστό ότι εμπλέκεται στην έναρξη της μεταγραφής, καθώς και τον τερματισμό [49] ( Σχήμα 2Α, Β?. πίνακα S3)

Όλα τα μοτίβα ήταν σημαντικά εμπλουτισμένη με στόχο πάνω από ακολουθίες φόντο (p & lt? 0,01). Φορές εμπλουτισμός ενδείκνυται σε σχέση με το φόντο. (A, B) Top κατάταξη μοτίβα και στις δύο κυτταρικές σειρές παρουσίασαν ισχυρή επικάλυψη (top 10). Επιλέχθηκαν (C, D) μοτίβα που διέφεραν σημαντικά μεταξύ των κυτταρικών σειρών όσον αφορά την εμπλουτισμούς τους. Ένα μοτίβο αξιολογήθηκε ευνοϊκά όταν η κατάταξη ήταν υψηλή (≤20) για μία κυτταρική σειρά και χαμηλά για την άλλη κυτταρική σειρά (ή απουσίαζε στην άλλη λίστα εμπλουτισμένου μοτίβα). Αποτέλεσμα: Η διαφορά στην κατάταξη εκτιμήθηκε με βάση τη διαφορά στη σχετική θέση στη λίστα (| 1- (r

TCAM-2 /n

TCAM-2) -1- (r

NCCIT /n

NCCIT) | ≥15%, n = nr εμπλουτισμένου μοτίβα, r είναι η κατάταξη ενός συγκεκριμένου μοτίβου στη λίστα εμπλουτισμένου μοτίβα είτε για κυτταρική γραμμή)

η

Ένας περιορισμένος αριθμός. δείκτες έδειξαν διαφορές στη εμπλουτισμό μεταξύ των κυτταρικών σειρών (Σχήμα 2C, D, Πίνακας S3). Για H3K4me3, πέντε μοτίβα εντοπίστηκαν οποία έδειξε αρκετή διαφορά. Τέσσερις ήταν υψηλότερα κατατάσσεται στην TCAM-2 και ένα υψηλότερο στις NCCIT. Η κορυφαία TCAM-2 μοτίβα που παρουσιάζονται σε αυτή την διαφοροποίηση λίστα ήταν EBF1 (ρόλο στις αναπτυξιακές διαδικασίες), ΑΡ-2α και AP-2γ (δείκτες γνωστό γεννητικά κύτταρα) και Oct4 /SOX2 /TCF /Nanog (πλειοδυναμίας μοτίβο). Για NCCIT, E2F1 (έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, η δράση των ογκοκατασταλτικών πρωτεϊνών, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων) κατετάγη υψηλότερο. Για H3K27ac, υπήρχαν τέσσερις διαφοροποίηση μοτίβα, των οποίων οι τρεις ήταν κατατάσσεται ψηλότερα στο TCAM-2 και ένα υψηλότερο στις NCCIT. Το μοτίβο Oct4 /SOX2 /TCF /Nanog ήταν η πιο σημαντικά εμπλουτισμένη μοτίβο για H3K27ac σε NCCIT (κατετάγη 20 στο TCAM-2). Αυτό το μοτίβο είναι γνωστό να εμπλουτιστεί κυρίως σε κύτταρα εμβρυϊκών βλαστικών (ES) [50], καθώς και τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα, η οποία είναι σύμφωνη με το κύτταρο-όπως προέλευση στέλεχος (ΕΚ) του NCCIT και φύτρου κύτταρο-σαν προέλευση της TCAM -2 αντίστοιχα. Επιπλέον, για H3K27ac, AP-2α και ΑΡ-2γ ταξινομήθηκαν ως 3

ου και 4

ου πιο εμπλουτισμένο μοτίβο στο TCAM-2 (σε σύγκριση με 29

ου και 31

ου στην NCCIT) αντανακλώντας (εμβρυϊκά) γεννητικών κυττάρων προέλευση τους (Σχήμα 2C, D). Για τα κύτταρα ES τον εμπλουτισμό βαθμολογίες για τα δύο αυτά μοτίβα ήταν 87

ου και 105

ου [50]. Οι παρατηρήσεις αυτές ταιριάζουν με την προτεινόμενη πιο διαφοροποιημένη (καταγωγή των γεννητικών κυττάρων) των κυττάρων της προέλευσης της SE σε σύγκριση με το ΕΚ [28], και είναι σύμφωνες με τα πορίσματα των σχετικών κορυφές των ιστονών (βλέπε ενότητα Συζήτηση).

επαλήθευσης της H3K4me3 & amp? H3K27ac εμπλουτισμός με βάση τη διαμόρφωση ανοικτού χρωματίνης ήταν ανεξάρτητα επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας ϋΝάση Ι-υπερευαισθησία

Καθώς οι διερευνηθεί σημάδια της χρωματίνης (H3K4me3 & amp? H3K27ac). Θεωρείται ότι σχετίζονται με την ενεργό χρωματίνης, διερευνήσαμε αν η παρουσία τους συνδέθηκε με ένα άλλο χαρακτηριστικό του δραστικού χρωματίνη: DNaseI-υπερευαισθησία [51]. Χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση DNaseI-MLPA [43] έχουμε στοχευμένες 14 περιοχές οι οποίες έδειξαν τις μεγαλύτερες διαφορές είτε H3K4me3 ή /και εμπλουτισμού H3K27ac μεταξύ των ίδιων δύο κυτταρικές σειρές. Έξι από τα επτά εμπλουτισμένο περιοχές NCCIT (Σχήμα S2A: Ν1, Ν2, Ν3, Ν4, Ν6, Ν7), και πέντε από επτά εμπλουτισμένο περιοχές της TCAM-2 (Σχήμα S2B: S1, S2, S5, S6, S7), έδειξε σημαντική DNaseI-υπερευαισθησία στις αντίστοιχες κυτταρικές γραμμές. Αντιθέτως, μόνο το ένα H3K27ac-αρνητικά τόπο σε NCCIT (Σχήμα S2A, S1), και καμία H3K27ac-αρνητικών θέσεων στο TCAM-2 (Σχήμα S2B), έδειξε DNaseI-υπερευαισθησία.

CpG μεθυλίωση

Ο αλγόριθμος DMRforPairs χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση διαφορικά μεθυλιωμένη περιοχές (DMR) [38]. Ο αλγόριθμος ορίστηκε να ανιχνεύει μεγάλες διαφορές, δηλαδή χρησιμοποιώντας αυστηρές ρυθμίσεις. Περιοχές που περιέχουν τουλάχιστον τέσσερις ανιχνευτές σε απόσταση 200 bp απόσταση μεταξύ τους θεωρήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση (n = 30.306). Περιοχές στις οποίες μέση επίπεδα μεθυλίωσης (Μ-τιμές) μεταξύ των δειγμάτων διέφερε τουλάχιστον | 1.4 | (N = 5.139) δοκιμάστηκαν για στατιστική σημαντικότητα (σημαντικό: p & lt? 0,05? Bonferroni ρυθμιστεί, δοκιμή Wilcoxon-rank-sum, n = 143) (DMRforPairs Έξοδος: S1 αρχείου)

μοτίβα μεθυλίωσης σε αιτήσεις συντήρησης δεδομένων. σύμφωνα με θετικότητα δείκτη σε SE και ΕΚ.

Λόγω της ενεργοποίησης τροποποιήσεις των ιστονών διερευνώνται, εστιάσαμε στην υπο- ή απουσίας της μεθυλίωσης του DNA. Παγκόσμια επίπεδα μεθυλίωσης ήταν σύμφωνες με την υπερ- και υπο-μεθυλιώνεται παγκόσμιο καθεστώς της NS και SE, αντίστοιχα, και το παρελθόν δείξει ενδιάμεσο καθεστώς της TCAM-2 (Σχήμα S3) [52], [53]. Μετά την ταυτοποίηση DMR χρησιμοποιώντας DMRforPairs, συνολικά 99 αιτήσεις συντήρησης δεδομένων (επισημείωση σε 170 μοναδικά σύμβολα γονιδίων) έχουν μεθυλιωμένος εις TCAM-2, σε σύγκριση με 44 το NCCIT (επισημείωση σε 64 μοναδικά σύμβολα γονιδίου) (Πίνακας S1). Σύμφωνα με τις τροποποιήσεις των ιστονών (βλέπε παραπάνω), η

SOX2

περιοχή του υποκινητή βρέθηκε να μεθυλιωμένος έντονα NCCIT (Εικόνα 3Α).

SOX2

ήταν εν μέρει μετουσιωμένο σε TCAM-2, σύμφωνα με τα ευρήματα δείχνουν ότι TCAM-2 μπορούν να διαφοροποιηθούν και να γίνουν

SOX2

θετικά μετά από εξω-γονάδων ένεση σε ποντίκια [54]. Μια περιοχή 220 bp άμεσα ανάντη του TSS του

SOX2

(CHR3: 181429712) έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι μεθυλιωμένος εντελώς στο TCAM-2 [55]. Αυτό είναι σύμφωνο με τα ευρήματά μας, ως συνέπεια μεθυλιωμένος περιοχή (CHR3: 181429233 με 181430485) εμφανίζεται αμέσως ανάντη του TSS, ενώ ένα 652 bp μακρύ DMR (CHR3: 181428046 με 181428697) μεταξύ NCCIT και TCAM-2 ανιχνεύεται από DMRforPairs στην μια περίπου περιοχή 800 bp ανοδικά της περιοχής αλληλουχήθηκαν με Nettersheim et al.

SOX17

δεν δείχνουν σημαντική απόκλιση πρότυπο μεθυλίωσης, υποδεικνύοντας ότι είναι, κατ ‘αρχήν, προσβάσιμο για μεταγραφή σε δύο τύπους κυττάρων (Σχήμα 3Β). Πράγματι,

SOX17

έκφραση μπορεί να επαχθεί σε NCCIT (αδημοσίευτη παρατήρηση). Σύμφωνα με γνωστές γονιδιακής έκφρασης σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές,

OCT3 /4

έδειξε μία ασυνεπής, αλλά πρότυπο μη-διαφορικό μεθυλίωσης (Σχήμα 3C). Το TSS του

Nanog

ήταν μεθυλιωμένος στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3D), σύμφωνα με τα στοιχεία έκφρασης και προηγούμενες εκθέσεις [56]. Στη λίστα των κορυφαίων αιτήσεις συντήρησης δεδομένων, το σύμπλεγμα του miR-371/2/3 ξεχώρισε με σημαντική διαφορά υπερμεθυλίωση στο NCCIT (Σχήμα 3Ε). Η περιοχή του υποκινητή του

GATA4

ήταν σημαντικά υπερμεθυλίωση στο TCAM-2 (Σχήμα 3F). Σε γενικές γραμμές, το 33% (47/143) αιτήσεις συντήρησης δεδομένων σχολιάστηκαν σε TSSs (File S1, σύμφωνα με το δηλωτικό Illumina του), το οποίο είναι παρόμοιο με το κλάσμα που συνδέεται TSS περιοχές που προσδιορίζονται από DMRforPairs (12.652 /30.306). Λειτουργικά, ο κατάλογος DMR των δύο κυτταρικές σειρές έδειξαν εμπλουτισμό (εμβρυϊκών) βλαστικών κυττάρων συντήρησης /πλειοδυναμίας. Βιολογικές λειτουργίες που δείχνει ομοιότητα με πιο ώριμα βλαστικά κύτταρα εμπλουτίστηκαν στο TCAM-2 (Πίνακας S2).

Dots απεικονίζουν ατομική CpGs και μαύρα κουτιά υποδηλώνουν αιτήσεις συντήρησης δεδομένων που προσδιορίζονται από DMRforPairs. παρακάτω ποσοστά δείχνουν μέση πυκνότητα CG στις απεικονίζονται περιοχές (υπολογίζεται με βάση το πακέτο Repitools R, η λειτουργία gcContentCalc (https://www.bioconductor.org/)). (Α)

SOX2

[44%], (Β)

SOX17

[46%], (C)

OCT3 /4

(

POU5F1

), [52%] (D)

Nanog

, [44%] (Ε)

miR-371/2/3

σύμπλεγμα, [49%] (F)

GATA4

[53%].

Η

αιτήσεις συντήρησης δεδομένων ήταν σημαντικά εμπλουτισμένη για αποτυπωμένα γονίδια, και 59% (51/86) όλων των αποτυπωμένα γονίδια έδειξαν απώλεια της μεθυλίωσης γύρω TSS τους σε μία ή και στις δύο κυτταρικές σειρές .

από τη λίστα των εξακριβωμένων αποτυπώνεται ανθρώπινα γονίδια (n = 88 ανακτηθεί από geneimprint.com), 82 είχαν επίσης σχολιασμένο πρόδηλη Illumina της (συνολικά 21.243 μοναδικά σύμβολα γονίδιο σχολιασμένη) και 10 ήταν παρόντες στην κορυφή αιτήσεις συντήρησης δεδομένων μεταξύ TCAM-2 και NCCIT. Αυτή η υπερεκπροσώπηση των αποτυπωμένα γονίδια στη λίστα αιτήσεις συντήρησης δεδομένων ήταν σημαντική (p & lt? 0,0001, χ

2 τεστ). Κατά τη διερεύνηση της περιοχής γύρω από το TSS των 86 αποτυπωμένα γονίδια με γνωστή γονιδιωματική εντοπισμού, 14 παρουσίασαν απόκλιση κατάσταση μεταξύ των κυτταρικών σειρών (8/6 μεθυλιωμένος εις NCCIT και TCAM-2 αντίστοιχα). Συνολικά, 37 αποτυπωμένα γονίδια επέδειξαν μεθυλιωμένος κατάσταση στις δύο κυτταρικές σειρές, σε σύγκριση με 12 υπερμεθυλιωμένο γονίδια (Σχήμα 4). Συνοπτικά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν μια συνολική διαγράφονται καθεστώς των αποτυπωμένα περιοχών στις δύο κυτταρικές σειρές. Αναφορικά με τα γονίδια με κατάσταση απόκλιση μεθυλίωση, δεν υπάρχει σαφής διαφορά στον αριθμό των υπερμεθυλιωμένων γονιδίων που θα δείχνουν τη διαφορά στην κατάσταση ωρίμανσης ή περιβαλλοντική διάσπαση.

Ο εντοπισμός του TSS ανακτήθηκε από Ensembl και διορθώνονται με το χέρι για τα γονίδια με πολλαπλά μεταγραφές για να επιλέξετε μια περιοχή με αντιπροσωπευτική κάλυψη για την Illumina BeadChip (n

ανιχνευτές κυμαινόταν μεταξύ των γονιδίων: διάμεση τιμή = 10, ενδοτεταρτημοριακό εύρος 6-21). περιοχή του υποκινητή ορίστηκε ως TSS-1000-TSS + 100 (ή απέναντι σε αντίστροφη σκέλος). Γονίδια με & gt? 0,25 διαφορά στο μέσο β και ένα συνεπές μοτίβο (σταθερή) μεθυλίωση προσδιορίστηκαν ως διαφορικά μεθυλιώνεται στην TSS μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών. Διάμεση μεθυλίωση & lt? 25% και για τις δύο κυτταρικές σειρές ερμηνεύτηκε ως μεθυλιωμένος κατάσταση και στις δύο κυτταρική σειρά. Διάμεση μεθυλίωση & gt? 75% ερμηνεύτηκε ως υπερμεθυλίωση.