Αφηρημένο

Ο πίδακας πλάσματος έχει προταθεί ως μια νέα θεραπευτική μέθοδο για τον καρκίνο. Αντικαρκινική δραστικότητα του πλάσματος έχει αναφερθεί ότι συμμετέχουν μιτοχονδριακή δυσλειτουργία. Ωστόσο, ποια συστατικά που παράγονται από το πλάσμα είναι συνδεδεμένη με αυτή τη διαδικασία αντικαρκινικές και ο μηχανισμός δράσης της παραμένει ασαφής. Εδώ, αναφέρουμε ότι τα θεραπευτικά αποτελέσματα του αποτελέσματος πλάσματος αέρα από την παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου /αζώτου (ROS /RNS), συμπεριλαμβανομένων H

2O

2, Βόδι, ΟΗ

-, • O

2 , NOx, που οδηγεί σε αποπόλωση του δυναμικού μιτοχονδριακής μεμβράνης και μιτοχονδριακή συσσώρευση ROS. Ταυτόχρονα, ROS /RNS ενεργοποίηση c-Jun NH

2-τερματικής κινάσης (JNK) και ρ38 κινάσης. Κατά συνέπεια, η θεραπεία με πίδακες πλάσματος αέρα επάγει αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του τραχήλου HeLa. Προκατεργασία των κυττάρων με αντιοξειδωτικά, JNK και ρ38 αναστολείς, ή JNK και ρ38 siRNA καταργεί την αποπόλωση της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικού και εξασθενίζει τον αέρα πλάσματος που προκαλείται από αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ROS /RNS που δημιουργούνται από μονοπάτια σηματοδότησης σκανδάλη πλάσματος που περιλαμβάνουν JNK και ρ38 και την προώθηση της μιτοχονδριακής διαταραχή, που οδηγεί σε απόπτωση. Ως εκ τούτου, η χορήγηση του πλάσματος του αέρα μπορεί να είναι μια εφικτή στρατηγική για την εξάλειψη των καρκινικών κυττάρων

Παράθεση:. Ahn HJ, Kim ΚΙ, Hoan NN, Kim CH, Σελήνη Ε, Choi KS, et al. (2014) Στόχευση καρκινικών κυττάρων Αντιδραστική οξυγόνου και αζώτου είδη που παράγονται από την ατμοσφαιρική πίεση του αέρα-Plasma. PLoS ONE 9 (1): e86173. doi: 10.1371 /journal.pone.0086173

Επιμέλεια: Xianglin Shi, το Πανεπιστήμιο του Κεντάκι, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27 του Σεπτεμβρίου του 2013? Αποδεκτές: έκτης Δεκεμβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 21 Ιανουαρίου, 2014

Copyright: © 2014 Ahn et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τις επιχορηγήσεις Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών της Κορέας που χρηματοδοτείται από την κυβέρνηση της Κορέας (MSIP) (2012M3A9B2052871, 2.010 έως 0.018.546, 2011-0030043). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Plasma αναφέρεται συχνά ως η τέταρτη κατάσταση της ύλης εκτός από στερεό, υγρό και αέριο. Πλάσματος είναι αρκετά παρόμοια με αέριο στην οποία ένα ποσοστό των σωματιδίων είναι ιονισμένο και φορτισμένα, κάποια σωματίδια είναι ηλεκτρικά ουδέτερα, και μερικά είναι χημικώς ενεργοποιημένα ρίζες. Πλάσμα μπορεί να χαρακτηριστεί είτε ως «θερμική (ή ζεστό) πλάσμα» ή «μη θερμικές (ή κρύο) στο πλάσμα.» Πολλές τεχνικές που χρησιμοποιούν πλάσμα έχουν διερευνηθεί και εφαρμοστεί με επιτυχία σε ορισμένες βιομηχανικές εφαρμογές. Πρόσφατα, οι αιτήσεις πλάσματος έχουν χρησιμοποιηθεί σε βιολογικές και ιατρικές επιστήμες, συμπεριλαμβανομένων της πήξης του αίματος [1], η θεραπεία του καρκίνου [2], επιφάνεια αποστείρωση [3], και οδοντιατρική θεραπεία κοιλότητα [4]. Ειδικότερα, η αύξηση του πλάσματος μεταγραφική έρευνα στη θεραπεία του καρκίνου μπορεί να υπόσχονται τα νέα θεραπευτικά αποτελέσματα. Επιπλέον, είναι ενδιαφέρον ότι κρύου πλάσματος που παράγεται σε ατμοσφαιρική πίεση αυξάνει την σκοπιμότητα των ιατρικών εφαρμογών.

Αν και το βιολογικώς αποτελεσματικό υλικό (-α) που παράγεται από το πλάσμα και κυτταρικών στόχων του παραμένουν άγνωστα, πολλές γραμμές σύνδεσης αποδείξεων αντιδραστικού οξυγόνου είδη /αζώτου (ROS /RNS) στις βιολογικές επιδράσεις της. Η θεραπεία με πλάσμα προκάλεσε την αποπόλωση της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικού και την παραγωγή των ROS σε ανθρώπινα κύτταρα [2]. Επιπλέον, τα αντιοξειδωτικά που βελτιώνεται πλάσματος που προκαλείται από μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, υποστηρίζοντας την ιδέα ότι οξειδωτικά είδη όπως ROS μπορεί να μεσολαβεί επιδράσεις πλάσματος που επάγεται σε κύτταρα θηλαστικών [2]. Ένα ευρύ φάσμα των φαινομενικά άσχετες και σύνθετες αιτίες δυσλειτουργίας των μιτοχονδρίων έχουν κοινά υποκείμενων παθοφυσιολογικών μηχανισμών: την παραγωγή και τη συσσώρευση των μιτοχονδριακές βλάβες ROS, που οδηγεί σε αυξημένο οξειδωτικό στρες, η απώλεια της ATP, mitophagy για τον ποιοτικό έλεγχο και την εξάλειψη των κατεστραμμένων μιτοχονδρίων, και τελικά κυτταρικό θάνατο [5].

είναι πλέον σαφές ότι οι ROS έχουν ένα ρόλο κυτταρικής σηματοδότησης σε πολλά βιολογικά συστήματα από βακτήρια στα κύτταρα των θηλαστικών [6]. ROS μπορεί να ενεργοποιεί το κύτταρο σηματοδότησης καταρράκτες, όπως εκείνες που αφορούν πολλές διαφορετικές ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεϊνική κινάση (ΜΑΡΚ) καταρράκτες [7], [8]. Αυτά περιλαμβάνουν τα κινάσες στρες, η c-Jun Ν-τερματικές κινάσες (JNK) και στρες-ενεργοποιημένης κινάσης πρωτεΐνης (SAPK). JNKs ταυτοποιήθηκαν ως μία κινάση που δεσμεύει και φωσφορυλιώνει c-Jun επί Ser-63 και Ser-73 εντός του τομέα μεταγραφικής ενεργοποίησης της. JNK ενεργοποιείται από την επεξεργασία των κυττάρων με κυτοκίνες (π.χ., παράγοντας νέκρωσης όγκων (TNF) και ιντερλευκίνη (IL) -1) και από την έκθεση των κυττάρων σε πολλές μορφές περιβαλλοντικού στρες (π.χ. οσμωτικό στρες, στρες οξειδοαναγωγής, και ακτινοβολία ) [9]. Έχει επίσης αποδειχθεί ότι ROS είναι ισχυροί επαγωγείς της JNK. Οι περισσότερες εκθέσεις για ROS που προκαλείται λόγω της ενεργοποίησης της JNK από εξωγενείς ROS, ως επί το πλείστον H

2O

2. Επιπλέον, ROS συσσώρευση που προκαλείται από αποπτωτικά ερεθίσματα μπορεί να ενεργοποιήσει την SAPK p38 [10]. Τα μονοπάτια ΜΑΡΚ JNK και p38 μοιράζονται αρκετές ανάντη ρυθμιστικές αρχές, και ως εκ τούτου υπάρχουν πολλαπλά ερεθίσματα που ενεργοποιούν ταυτόχρονα και τις δύο οδούς. Οι

Οι δεσμοί μεταξύ ROS σηματοδότησης και της απόπτωσης προτείνεται να διαμεσολαβείται από τα μιτοχόνδρια. Επί του παρόντος, πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι τα μιτοχόνδρια είναι η κύρια περιοχή δράσης για την JNK στην απόπτωση. Τόσο JNK1- και JNK-διαγράφονται πρωτογενείς εμβρυϊκούς ινοβλάστες ποντικού έχουν δείξει αντοχή στην ακτινοβολία UV-επαγόμενη απόπτωση λόγω ελαττώματος στη μιτοχονδριακή θάνατο μονοπάτι σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένης της μη απελευθέρωση του κυτοχρώματος c [11]. Μιτοχονδριακή μετατόπιση της JNK παρατηρείται σε συνθήκες στρες, όπως η έκθεση σε UV, ιονίζουσα ακτινοβολία, ROS και RNS, και έτσι μιτοχόνδρια εντοπισμένη JNK παρέχει εγγύτητα προς μιτοχόνδρια που δημιουργείται ROS [12], [13]. Επιπλέον, αποπτωτικά ερεθίσματα μερικές φορές να προκαλέσουν ρ38α ενεργοποίηση από μία δευτερεύουσα οδό, όπως η παραγωγή των ROS [13]

και αρκετές άλλες ομάδες έχουν αναφέρει ότι η ατμοσφαιρική πίεση του πλάσματος [2], [14]. – [19] και πίδακες πλάσματος αζώτου από μία συστοιχία μικρο-ακροφύσιο [20] επάγουν απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα. Πρόσφατα, στο πλάσμα έχει αποδειχθεί ότι προάγει την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων από την παραγωγή ROS, η διατάραξη του δυναμικού μιτοχονδριακής μεμβράνης, και την ενεργοποίηση της οικογένειας κασπάσης πρωτεϊνών [2]. Ωστόσο, ποια συνιστώσα (ες) που παράγεται από το πλάσμα του αέρα παράγει αντικαρκινικές επιδράσεις του και ο μοριακός μηχανισμός με τον οποίο το πλάσμα επάγει απόπτωση παραμένουν ασαφείς. Για την έκθεση αυτή, προσπαθήσαμε να βρούμε το στοιχείο (α) τελεστή που παράγεται από το πλάσμα του αέρα και το στόχο της και να διευκρινίσει το μοριακό μηχανισμό και βιοχημικού μονοπατιού με το οποίο προκαλεί αντικαρκινικά θεραπευτικά οφέλη. Έχουμε εντοπίσει το ROS /RNS ως βασικοί δράστες της στο πλάσμα του αέρα, τα οποία στοχεύουν τα μιτοχόνδρια και οδηγεί στην ενεργοποίηση της JNK και σηματοδότησης ρ38 μονοπάτια.

Αποτελέσματα

jet Air μικρο πλάσμα μπορεί να δημιουργήσει αντιδραστικά οξυγόνου και είδος άζωτο

Η μικρο σύστημα πίδακας πλάσματος που λειτουργεί σε ατμοσφαιρική πίεση μπορεί να παράγει χημικώς ενεργά είδη, ιδιαίτερα άτομα οξυγόνου και αζώτου [21]. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε πρώτη ανάλυση οπτικού φάσματος εκπομπής για τον προσδιορισμό των σωματιδίων και ρίζες που παράγονται από το σύστημα πλάσμα του αέρα (Σχήμα 1 Α-Β), η οποία μπορεί να μεσολαβήσει τις επιπτώσεις της στο πλάσμα του αέρα σε καρκινικά κύτταρα [2], [22]. Οπτική φασματοσκοπία εκπομπής (OES) έγινε σε ένα ευρύ φάσμα μηκών κύματος από 280 nm έως 920 nm με μία οπτική φασματοσκόπιο εκπομπών (SV 2100, Κ-MAC) (Σχήμα 1γ). Οι κυρίαρχες γραμμές εκπομπής απεικονίζουν την παρουσία ενθουσιασμένοι ιόντων οξυγόνου (O

2

+) στα 500-600 nm και ατομικό οξυγόνο (O Ι) σε 777 και 844 nm (Σχήμα 1γ). Επιπλέον, οι ανιχνεύονται αντιδραστικά είδη που σχετίζονται με άζωτο είναι ενθουσιασμένοι μόρια αζώτου (N

2 δεύτερο θετικό σύστημα και Ν

2 πρώτα θετικά συστήματος) στις περιοχές 300-390 και 610-710 nm και ιονισμένα μόρια αζώτου (N

2

+ πρώτη αρνητική συστήματος) στην περιοχή των 390-480 nm, και ατομικό άζωτο (ΝΙ) σε 747, 822, και 868 nm (Σχήμα 1γ). Αυτά τα αποτελέσματα OES δείχνουν ότι η εκτόξευση μικρο αέρα πλάσματος μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην παραγωγή διαφόρων αντιδραστικά είδη οξυγόνου και αζώτου (ROS και RNS, αντίστοιχα).

(α) Η φωτογραφία του κατασκευασμένου συστήματος jet μικροπλάσμα. Το ένθετο είναι μια σχηματική παρουσίαση της μικρο ακροφύσιο πίδακα πλάσματος. (Β) Η φωτογραφία του μικρο αέρα πίδακα πλάσματος που παράγεται σε ατμοσφαιρική πίεση. (Γ) οπτικό φάσμα εκπομπής του jet μικρο αέρα πλάσματος κατά τη διάρκεια της εκκένωσης.

Η

εξωκυτταρικών και ενδοκυτταρικών ROS και RNS παρήχθησαν από την έκθεση στο πλάσμα του αέρα

Ένας υπαινιγμός ότι ROS και RNS μπορεί να μεσολαβεί η αντικαρκινικές επιδράσεις του πλάσματος αέρα είχε προταθεί από προηγούμενη μελέτη μας αναφέρει ότι το πλάσμα του αέρα που προκαλείται από απόπτωση, συνοδεύεται από την παραγωγή των ROS και RNS και μειώνοντας το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΜΜΡ) σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα [2]. Επιπλέον, η παραγωγή των ROS και RNS με πίδακα πλάσματος έχει μελετηθεί πρόσφατα [23], και είναι σύμφωνο με τα φάσματα εκπομπής που προκαλείται από το πλάσμα του αέρα (Σχήμα 1γ). Ως εκ τούτου, βιοχημικά αναλύσαμε την παραγωγή των ROS και RNS, την παράδοσή τους στην υγρή φάση του μέσου κυτταρικής καλλιέργειας, και την διαδοχική μετανάστευση των ROS και RNS σε κύτταρα (Σχήμα 2).

(α) Επίπεδα εξωκυττάρια H

2O

2 προσδιορίστηκαν σε καλλιέργεια ή μη-πολιτισμός (Medium μόνο) υπερκείμενα, με (AP) ή χωρίς αγωγή (αγωγή για μη) στο πλάσμα του αέρα. Το υπερκείμενο καλλιέργειας συλλέχθηκε στους υποδεικνυόμενους χρόνους μετά από αγωγή πλάσματος αέρα (AP). AP 0 (min) δείχνει υπερκείμενο συλλέγεται αμέσως μετά τη θεραπεία πλάσματος. Η συγκέντρωση του H

2O

2 στο υπερκείμενο της καλλιέργειας προσδιορίστηκε με σύγκριση με ένα H

2O

2 πρότυπης καμπύλης βαθμονόμησης, μετά από επώαση με αντιδραστήριο Amplex UltraRed (

n =

5). (Β) Παραγωγή ή /και η διείσδυση δια μέσου της μεμβράνης πλάσματος των ROS συμπεριλαμβανομένων H

2O

2, ΟΗ

-, και • O

2 στην ενδοκυτταρική μήτρα εξής πίδακα πλάσματος αέρα (AP) ήταν προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας τον ανιχνευτή ROS ευαίσθητο H

2DCFDA (

n

= 5). Ο φθορισμός των μη κατεργασμένων κυττάρων (Μη επεξεργασμένα) αυθαίρετα την τιμή 1. (γ) τα επίπεδα εξωκυτταρικού ΝΟ προσδιορίσθηκαν σε μη καλλιέργεια (σε απουσία των κυττάρων HeLa, άνω) και καλλιέργειας (με την παρουσία HeLa κύτταρα, κάτω ) υπερκείμενα στους αναγραφόμενους χρόνους μετά την έκθεση πίδακα πλάσματος του αέρα από τη δοκιμασία Griess (

n

= 10). (Δ) επίπεδα ενδοκυτταρικού ΝΟ αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας DAF-FM. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± S.E.M. (

n

= 10).

Η

Θα εξεταστεί, πρώτον, αν η θεραπεία με το πλάσμα του αέρα θα προκαλέσει την παραγωγή H

2O

2 στο υπερκείμενο της καλλιέργειας (Σχήμα 2α ). Το υπερκείμενο καλλιέργειας συλλέχθηκε στους υποδεικνυόμενους χρόνους μετά από τη θεραπεία του πλάσματος αέρα και η συγκέντρωση του H

2O

2 στο υπερκείμενο καλλιέργειας αναλύθηκε με σύγκριση με H

2O

2 πρότυπη καμπύλη βαθμονόμησης. H

2O

2 παράχθηκε σε περίπου 26,93 μΜ αμέσως μετά τη θεραπεία με πίδακες πλάσματος αέρα και η συγκέντρωση στο υπερκείμενο της καλλιέργειας ταχέως μειώθηκε μέσα σε 1 ώρα. Ωστόσο, H

2O

2 σε μέσο καλλιέργειας μη μόνος μειώθηκε πιο αργά μέχρι 1 ώρα μετά τη θεραπεία στο πλάσμα, σε σύγκριση με το επίπεδο στο υπερκείμενο της καλλιέργειας. Σε 3 ώρες, τα επίπεδα του H

2O

2 ήταν παρόμοιες σε υπερκείμενα από καλλιέργεια κυττάρων HeLa και σε μέσο μόνο. H

2O

2 μόλις ανιχνεύθηκε στο υπερκείμενο καλλιέργειας, σε 3 ώρες μετά την επεξεργασία με πλάσμα (Σχήμα 2α). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το πλάσμα του αέρα μπορεί να δημιουργήσει και να παραδώσει διαδοχικά H

2O

2 στο μέσο. Επιπλέον, ο λόγος για την αρχική ταχεία μείωση του H

2O

2 που παράγονται από το πλάσμα του αέρα στο υπερκείμενο της καλλιέργειας σε σύγκριση με εκείνη σε μέσο μη-καλλιέργειας θα μπορούσε να είναι ότι τα κύτταρα προάγουν παγίδευσης H

2O

2. Για να δοκιμάσει αυτή τη δυνατότητα, θα παρακολουθούνται τα επίπεδα του H

2O

2 στο υπερκείμενο της καλλιέργειας και μεσαίες μη καλλιέργειας μόνα τους ακόλουθους H

2O

2 θεραπεία (Σχήμα S1a). Όταν τα κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2 mM H

2O

2, Η

2O

2 παρομοίως ανιχνεύθηκε σε αμφότερα υπερκείμενο καλλιέργειας και μέσο μη καλλιέργειας αμέσως μετά τη θεραπεία. Ωστόσο, σε 3 ώρες μετά H

2O

2 θεραπεία, H

2O

2 μόλις ανιχνεύθηκε (περίπου 100 μΜ) στο υπερκείμενο καλλιέργειας, αλλά το επίπεδο παρέμεινε περίπου 670 μΜ σε μη μέσο καλλιέργειας (Σχήμα S1a). Με βάση αυτό το αποτέλεσμα, πιθανολογείται ότι τα κύτταρα μπορούν να σαρώνουν H

2O

2 που παράγονται από το πλάσμα του αέρα, οδηγώντας σε μια επιταχυνόμενη μείωση της H

2O

2 στο υπερκείμενο της καλλιέργειας.

επόμενο παρακολουθείται η γενιά των ενδοκυτταρικών ROS συμπεριλαμβανομένων H

2O

2, ρίζες υδροξυλίου (ΟΗ

-), και μονήρες οξυγόνο (• O

2), μετά από θεραπεία με πλάσμα, χρησιμοποιώντας H

2DCFDA (Σχήμα 2β). Μετά την επεξεργασία του αέρα στο πλάσμα, τα ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS αυξήθηκε κατά περίπου 2,7 φορές (2,73 ± 0,13). Αυτή η αυξημένη στάθμη μειώθηκε μέχρι 3 ώρες μετά την επεξεργασία με πλάσμα και ανακτάται σχεδόν στο μη επεξεργασμένο βασικό επίπεδο σε 24 h (Σχήμα 2β). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η θεραπεία πλάσμα επάγει την παραγωγή της ενδοκυτταρικής ROS.

Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε εάν πλάσμα του αέρα μπορεί να οδηγήσει στην παραγωγή εξωκυτταρικών και ενδοκυτταρικών RNS (Σχήμα 2c και d, αντίστοιχα). Αμέσως μετά τη θεραπεία πλάσμα, εξωκυττάρια επίπεδα ΝΟ ήταν αυξημένα σε περίπου 13,28 mm και στις δύο μη-κουλτούρα και τα μέσα καλλιέργειας (Σχήμα 2γ). Με 3 ώρες μετά τη θεραπεία στο πλάσμα, εξωκυττάρια επίπεδα ΝΟ σε μη καλλιέργεια και μέσα καλλιέργειας μειώθηκαν γρήγορα σε περίπου 8,26 ή 5,8 mM, αντίστοιχα (Σχήμα 2c). Σε χρονικά σημεία αργότερα από 3 ώρες, το εξωκυτταρικό ΝΟ επίπεδο σε μέσο μη καλλιέργειας διατηρήθηκε, ενώ το εξωκυτταρικό ΝΟ επίπεδο σε μέσο καλλιέργειας συνεχώς μειώνεται σε περίπου 1,28 mM σε 24 ώρες μετά την επεξεργασία με πλάσμα (Εικόνα 2c), υποδεικνύοντας ότι τα κύτταρα μπορεί πρόσληψη ή απομάκρυνση εξωκυτταρικό ΝΟ που παράγεται από το πλάσμα.

Ομοίως, τα ενδοκυτταρικά επίπεδα ΝΟ σε πλασματοκύτταρα επεξεργασμένα αυξήθηκαν κατά περίπου 1,8 φορές (1.75 ± 0.20) ή 2.3-φορές (2,28 ± 0,07) σε 1 ώρα και σε 18 ώρες μετά την επεξεργασία με πλάσμα του αέρα, αντίστοιχα, σε σύγκριση με εκείνες των μη-κατεργασμένα κύτταρα. Η υπερυψωμένη ενδοκυτταρική ΝΟ επίπεδο διατηρήθηκε μέχρι 24 ώρες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) μετά την επεξεργασία με πλάσμα και ανακτάται σχεδόν με το μη επεξεργασμένο βασικό επίπεδο σε 48 h (Σχήμα 2d και στο Σχήμα S1b), παρόμοια με τα επίπεδα ROS μετά από την επεξεργασία πλάσματος (Σχήμα 2β). Air πλάσματος που προκαλείται από μια μεγαλύτερη και πιο ανθεκτικά αύξηση ΝΟ από εκείνη που επάγεται από την H

2O

2 (Σχήμα 2d και στο Σχήμα S1b-c). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η θεραπεία πλάσμα επάγει την παραγωγή εξωκυτταρικών και ενδοκυτταρικών ΝΟ.

Για την υποστήριξη ότι το πλάσμα αέρα που παράγεται επίπεδα ROS και RNS σε κύτταρα θηλαστικών, εξετάσαμε αν τα αντιοξειδωτικά εξασθενούν το πλάσμα που προκαλείται από ROS /RNS γενιά με μέτρηση των επιπέδων ROS και RNS σε κύτταρα HeLa μετά από θεραπεία με πλάσμα παρουσία αντιοξειδωτικών. Πρώτον, ελέγξαμε εάν η γνωστή θειόλης αντιοξειδωτικό NAC [24] μπορεί να επηρεάσει τη συγκέντρωση του H

2O

2 σε υπερκείμενα καλλιέργειας μετά από αγωγή πλάσματος αέρα (Σχήμα 3α). Σε συνδυασμό με τον πίδακα πλάσματος, καλλιέργεια κυττάρων HeLa ή μέσο μόνο προκατεργάστηκε με NAC. NAC προκάλεσε την ταχεία μείωση του H

2O

2 έως περίπου λιγότερο από 4,13 ± 1,67 μΜ σε 15 λεπτά μετά την επεξεργασία με πλάσμα, παρόμοια με τα επίπεδα που παρατηρήθηκαν σε 2 ώρες μετά την αγωγή πλάσματος χωρίς NAC (σχήμα 3α), γεγονός που υποδηλώνει ότι NAC μπορεί να ανακουφίσει τον αέρα πλάσματος που προκαλείται H

2O

2 γενιάς. Στη συνέχεια εξετάσαμε εάν τα αντιοξειδωτικά μπορούν να μετριάσουν τον αέρα πλάσματος που προκαλείται από την παραγωγή ενδοκυτταρικών ROS (σχήμα 3β). Για να γίνει αυτό, θα αξιολογηθούν τα επίπεδα ROS μετά από προεπεξεργασία με αντιοξειδωτικές NAC ή cPTIO και έκθεση σε πλάσμα αέρα. Τόσο NAC και cPTIO θα μπορούσε να εξασθενήσει την παραγωγή ενδοκυτταρικής ROS που επάγεται από το πλάσμα του αέρα (σχήμα 3β). Είναι ενδιαφέρον ότι, η σαφής εξασθένηση ενδοκυτταρική παραγωγή ROS από cPTIO, ένα αποτελεσματικό αντιοξειδωτικό του RNS, όπως το μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ

•), οδήγησε σε εικασίες ότι το πλάσμα του αέρα μπορεί να δημιουργήσει RNS, καθώς και ROS και την ενδοκυτταρική παραγωγή των ROS μπορεί να είναι που συνδέονται με την παραγωγή του RNS.

(α) Επίπεδα εξωκυτταρικών H

2O

2 προσδιορίστηκαν σε καλλιέργεια ή μη-καλλιέργεια (Medium μόνο) υπερκείμενα με κατεργασία πλάσματος αέρα με την παρουσία (AP + NAC) ή απουσία (AP) του αντιοξειδωτικού NAC (

n

= 5). NAC προστέθηκε 1 ώρα πριν από την κατεργασία του πλάσματος. Το υπερκείμενο καλλιέργειας συλλέχθηκε στους υποδεικνυόμενους χρόνους μετά από αγωγή πλάσματος αέρα. AP 0 (min) δείχνει υπερκείμενο συλλέγεται αμέσως μετά τη θεραπεία πλάσματος. (Β) Δημιουργία ROS συμπεριλαμβανομένων H

2O

2, ΟΗ

-, και • O

2 στην ενδοκυτταρική μήτρα παρακάτω πίδακα πλάσματος αέρα (AP) προσδιορίστηκαν με τη χρήση της ROS-ευαίσθητο ανιχνευτή H

2DCFDA (

n

= 5). Τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με τα αντιοξειδωτικά NAC ή cPTIO για 1 ώρα και στη συνέχεια εκτίθενται σε πλάσμα αέρα (ΑΡ + NAC ή AP + cPTIO) ή H

2O

2 (Η

2O

2 + NAC ή Η

2O

2 + cPTIO). Κατά υποδεικνυόμενους χρόνους μετά την αγωγή πλάσματος αέρα, τα κύτταρα συλλέχθηκαν. Ο φθορισμός των μη κατεργασμένων κυττάρων (Μη επεξεργασμένα) αυθαίρετα την τιμή 1. (γ) τα επίπεδα εξωκυτταρικού ΝΟ προσδιορίσθηκαν σε μη καλλιέργεια (σε απουσία των κυττάρων HeLa, άνω) και καλλιέργειας (με την παρουσία HeLa κύτταρα, κάτω ) υπερκείμενα στους αναγραφόμενους χρόνους μετά την έκθεση πίδακα πλάσματος του αέρα από τη δοκιμασία Griess (

n

= 10). Μέσο υπό την παρουσία ή απουσία κυττάρων HeLa προκατεργάστηκε με NAC ή cPTIO για 1 ώρα πριν από την έκθεση σε πλάσμα ή H

2O

2. (Δ) επίπεδα ενδοκυτταρικού ΝΟ αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας DAF-FM. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± S.E.M. (

n

= 10).

Η

εξετασθεί περαιτέρω κατά πόσον τα αντιοξειδωτικά μπορούν να μετριάσουν τον αέρα πλάσματος που προκαλείται από γενιά RNS. Βρήκαμε ότι το ΟΧΙ αντιοξειδωτική cPTIO προωθούνται μειώσεις στον εξωκυττάριο ΚΑΜΙΑ επίπεδο που προκαλείται από το πλάσμα τόσο υπερκείμενο της καλλιέργειας και μεσαίου μη καλλιέργειας (Σχήμα 3γ). Σε αντίθεση, NAC είχε μικρή επίδραση στις πλάσματος που προκαλείται από εξωκυττάρια επίπεδα ΝΟ σε δύο καλλιέργειας και μέσο μη-καλλιέργειας (Σχήμα 3c). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα εξωκυτταρικό ΝΟ, c-ΡΤΙΟ αλλά δεν μπορούσε να υποχωρήσουν NAC σημαντικά την παραγωγή της ενδοκυτταρικής RNS με πλάσμα αέρα (σχήμα 3d και το Σχήμα S1b). Η ειδική εξασθένιση των RNS αέρα πλάσματος που προκαλείται από cPTIO (η αποτελεσματική RNS αντιοξειδωτικό) και εξασθένηση των Η

2O

2 επαγόμενη RNS τόσο NAC (η αποτελεσματική ROS αντιοξειδωτικό) και cPTIO (σχήμα 3d) προτείνουν ότι το πλάσμα του αέρα μπορεί να δημιουργήσει RNS άμεσα, αλλά η H

2O

2 που προκαλείται από γενιά RNS μπορεί να διαμεσολαβείται μέσω της οδού (ες) που αφορούν ενδιάμεσα ROS. Σε συνδυασμό με τα δεδομένα παραγωγής ROS και RNS (Εικόνες 2-3), τα ευρήματά μας δείχνουν ότι το πλάσμα του αέρα μπορεί να δημιουργήσει εξωκυτταρικών και ενδοκυτταρικών ROS και RNS σε υπερκείμενα καλλιέργειας και το κυτταρικό περιβάλλον.

Air πλάσμα ενεργοποιεί JNK και p38 ΜΑΡΚ μεσολάβηση σηματοδότηση μονοπατιού

για να καθοριστεί εάν ROS και RNS που παράγονται από το πλάσμα του αέρα μπορεί να δράσουν ως μόρια σηματοδότησης και ποια μονοπάτια σήματος εμπλέκονται σε αυτήν την μεταγωγή, ψάξαμε για καταρράκτες ΜΑΡΚ που είναι γνωστό ότι εμπλέκονται σε μονοπάτια σηματοδότησης σε απόκριση σε οξειδωτικές καταπονήσεις όπως ROS, RNS, UV, και η ιονίζουσα ακτινοβολία. Για να γίνει αυτό, ελέγξαμε εάν η ROS /RNS που παράγεται από το πλάσμα του αέρα προκαλεί JNK, p38, και /ή την ενεργοποίηση ΕΚΚ. Ανοσοφθορισμός και ανοσοστύπωση αναλύσεις διεξήχθησαν για να αξιολογηθεί η φωσφορυλίωση αυτών των κινασών που επάγεται από H

2O

2 και η ενεργοποίηση του σε απόκριση σε κατεργασία πλάσματος αέρα (Σχήμα 4 και Σχήμα S2). Η έκθεση σε πλάσμα αέρα υψηλά επαγόμενη ενεργοποίηση της JNK, σε σύγκριση με μέτρια ενεργοποίησή του από H

2O

2 (Σχήμα 4α και σχ S2a), γεγονός που υποδηλώνει ότι η σηματοδότηση μπορεί να προκαλείται από το πλάσμα του αέρα και κατά συνέπεια μπορεί να ενεργοποιήσει ένα JNK μεσολάβηση σήμα μονοπατιού μεταγωγής. Όταν κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με πλάσμα ή H

2O

2 παρουσία ενός αναστολέα JNK (SP600125), ενεργοποίηση JNK καταργήθηκε, όπως αναμενόταν, σε 1 ώρα μετά τη θεραπεία με πλάσμα ή H

2O

2 (Σχήμα 4α και σχ S2a). Επίσης, NAC ήταν σε θέση να μετριάσει την ενεργοποίηση JNK από πλάσμα ή H

2O

2 (Σχήμα 4α, χαμηλή πάνελ), δεικνύοντας ότι κάποιο είδος του οξειδωτικού σήματος στρες μπορεί να προκληθεί από το πλάσμα.

(α) Η φωσφορυλίωση της JNK μετά από θεραπεία με πίδακα πλάσματος αέρα ή H

2O

2 αναλύθηκε μέσω χρώσης ανοσοφθορισμού και ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας αντι-φωσφο-ΙΝΚ αντισώματος. Η ισοδύναμη ποσότητα ολικών πρωτεϊνών JNK εμφανίζεται ως ποσοτικός έλεγχος φόρτωσης για φωσφορυλίωση JNK. (Β) Η φωσφορυλίωση της ρ38 που προκαλείται από το πλάσμα του αέρα οπτικοποιήθηκε με ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-φωσφο-ρ38. Τα συγκρίσιμα συνολικών πρωτεϊνών ρ38 εμφανίζεται ως έλεγχος φόρτωσης για φωσφορυλίωση ρ38. (Γ) Μεταβολή της κατάστασης φωσφορυλίωσης της ERK δεν ανιχνεύθηκε μετά από θεραπεία με πλάσμα αέρα ή H

2O

2.

Η

Στη συνέχεια, εξετάσαμε την ενεργοποίηση της p38 από πλάσμα και αν NAC θα μπορούσαν να επηρεάσουν την ενεργοποίηση της ρ38 που προκαλείται από το πλάσμα. Με τρόπο ανάλογο με JNK, το πλάσμα του αέρα προκλητά τη φωσφορυλίωση της ρ38 και αυτό το πλάσμα που προκαλείται φωσφορυλίωση μερικώς βελτιώνεται με την NAC, υποδεικνύοντας ότι το σήμα του αέρα πλάσματος που προκαλείται μπορεί να ενεργοποιήσει το ρ38 μονοπάτι σήματος και μπορεί να είναι ένα είδος οξειδωτικού σήματος (Σχήμα 4β και Σχήμα S2B). Αντίθετα, το πλάσμα είχε μικρή επίδραση στην φωσφορυλίωση των ERK1 /2 (Σχήμα 4γ). Τα στοιχεία αυτά, μαζί, δείχνουν ότι το πλάσμα του αέρα μπορεί να προκαλέσει ενδοκυτταρικά σήματα και ενεργοποιούν διαδοχικά ενδοκυτταρικά μονοπάτια μεταγωγής σήματος προκαλείται μέσω JNK ή ρ38.

Air πλάσμα προκαλεί τη συσσώρευση των μιτοχονδρίων ROS και μιτοχονδριακή δυσλειτουργία

Τα μιτοχόνδρια είναι ένα σημαντική πηγή παραγωγής κυτταρικής ROS [25] και το οξειδωτικό στρες, συμπεριλαμβανομένων H

2O

2 μπορεί να ξεκινήσει την κατάρρευση της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό (Δψπι) [26]. Σε μια προηγούμενη έκθεση, βρήκαμε ότι η κατάρρευση της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό (Δψπι) προκαλείται από N

2 ή το πλάσμα του αέρα [2]. Για να δούμε αν το πλάσμα μπορεί να διεγείρει μιτοχονδριακή συσσώρευση ROS, μετρήσαμε μιτοχονδριακή δισμουτάση ακόλουθη επεξεργασία πλάσματος χρησιμοποιώντας MitoSox, ένα φθορογόνο βαφή για την επιλεκτική ανίχνευση του υπεροξειδίου στα μιτοχόνδρια των ζώντων κυττάρων (Σχήμα 5α). Μιτοχονδριακή υπεροξειδίου στα κύτταρα αυξάνεται κατά την κατεργασία με πλάσμα αέρα ή H

2O

2. Επιπλέον, το επίπεδο του μιτοχονδριακού υπεροξειδίου σε κύτταρα επεξεργασμένα με πλάσμα αέρος (4.32 ± 0.05) ήταν περίπου 2 φορές υψηλότερη από ό, τι σε H

2O

2-κατεργασμένα κύτταρα (2,36 ± 0,23) στις 6 ώρες μετά την αγωγή με πλάσματος (Σχήμα 5α). Μετά το χρόνο αυτό (δηλαδή, 6 ώρες μετά την αγωγή), η συσσωρευμένη μιτοχονδριακή υπεροξειδίου σε κύτταρα πλάσματος επεξεργασμένα μειώθηκε, ενώ η συσσωρευμένη δισμουτάσης στα μιτοχόνδρια των H

2O

2-κατεργασμένων κυττάρων συνεχίστηκε μέχρι 24 ώρες (2.45 ± 0,39) (Σχήμα 5α). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το πλάσμα του αέρα μπορεί να προκαλέσει τη συσσώρευση των ROS, συμπεριλαμβανομένων υπεροξειδίου στα μιτοχόνδρια.

(α) μιτοχονδριακή παραγωγή ROS αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τα μιτοχόνδρια-ειδικό ανιχνευτή Mitosox ακόλουθες H

2O

2 ή αέρα επεξεργασίας πλάσματος. Το μιτοχονδριακό ROS σε μη επεξεργασμένα κύτταρα (μη επεξεργασμένα) αυθαίρετα την τιμή 1. Τα κύτταρα συλλέχθηκε στους υποδεικνυόμενους χρόνους μετά από τη θεραπεία του πλάσματος αέρα και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με τα αντιοξειδωτικά (NAC ή cPTIO) ή αναστολείς κινάσης (SP600125 ή SB203580) για 1 ώρα και στη συνέχεια εκτίθενται σε πλάσμα αέρα (ΑΡ + NAC, AP + cPTIO, AP + SP ή AP + SB) ή Η

2O

2 (H

2O

2 + NAC, H

2O

2 + cPTIO, H

2O

2 + SP ή H

2O

2 + SB). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε υποδεικνυόμενους χρόνους μετά από τη θεραπεία του πλάσματος, και μετρήθηκαν τα επίπεδα της μιτοχονδριακής ROS (

n

= 5). Ο φθορισμός των μη κατεργασμένων κυττάρων (Μη επεξεργασμένα) αυθαίρετα την τιμή 1. (γ) Το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τα μιτοχόνδρια-ειδικό ανιχνευτή JC-1, με ή χωρίς το πλάσμα αέρα ή H

2O

2, (

n

= 5). Ο φθορισμός σε μη επεξεργασμένα κύτταρα HeLa αυθαίρετα την τιμή 1.

Η

Επιπλέον, εξετάσαμε αν τα αντιοξειδωτικά μπορεί να εξασθενήσει την μιτοχονδριακή συσσώρευση υπεροξειδίου που διεγείρεται από το πλάσμα του αέρα. NAC ή cPTIO ήταν σε θέση να υποχωρήσουν την παραγωγή των μιτοχονδριακών υπεροξειδίου (Σχήμα 5β). Καθώς το πλάσμα του αέρα ενεργοποιεί JNK και ρ38 μονοπατιών σηματοδότησης μεσολάβηση (Σχήμα 4α-b και Σχήμα S2), η πιθανότητα ότι οι διεργασίες μεταγωγής σήματος πλάσματος ενεργοποιούνται συμμετέχουν στην μιτοχονδριακή συσσώρευση ROS διερευνήθηκε. Βρήκαμε ότι ο αναστολείς κινάσης SB203580 και SP600125 ήταν σε θέση να υπονομεύουν πλάσματος που προκαλείται από μιτοχονδριακό δημιουργία υπεροξειδίου (Σχήμα 5b), υποδηλώνοντας ότι το πλάσμα μπορεί να επάγει την παραγωγή ROS σε μιτοχόνδρια κατά JNK- και ρ38-εξαρτώμενο τρόπο.

Επειδή πλάσμα του αέρα που προκαλείται από την παραγωγή κυτταρικής ROS /RNS (Σχήμα 2) και μιτοχονδριακή ROS (Σχήμα 5α) και την κατάρρευση του δυναμικού μιτοχονδριακής διαμεμβράνης (Δψπι) [2], εξετάσαμε αν ROS /RNS θα μπορούσε να συνδεθεί με το πλάσμα του αέρα προκαλούμενη δυσλειτουργία των μιτοχονδρίων με κατεργασία κύτταρα HeLa με το πλάσμα του αέρα με την παρουσία των αντιοξειδωτικών NAC ή cPTIO. Παρακολουθήσαμε την μιτοχονδριακή διαμεμβρανικό δυναμικό (Δψπι) μετά από αγωγή πλάσματος σε απουσία ή παρουσία του NAC ή cPTIO, χρησιμοποιώντας την μιτοχόνδρια-ειδικό ανιχνευτή JC-1. Air πλάσμα ή H

2O

2 θεραπεία επαγόμενης αυξανόμενη ένταση του πράσινου /κόκκινου φθορισμού (περίπου 3,3 φορές ή 2,1 φορές σε 12 ώρες και 2,9 φορές ή 3,6 φορές σε 24 ώρες, αντίστοιχα), επιβεβαιώνοντας ότι τόσο στο πλάσμα και H

2O

2 μπορεί να προκαλέσει μείωση της Δψπι (Σχήμα 5γ). NAC ή cPTIO έδειξαν μερικώς βελτιωτική επιδράσεις στην μείωση των Δψπι επάγεται από πλάσμα ή H

2O

2 θεραπεία (Σχήμα 5c), γεγονός που υποδηλώνει ότι ο αέρας του πλάσματος που προκαλείται από ROS /RNS μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην μιτοχονδριακή δυσλειτουργία. Επειδή οι διαδικασίες μεταγωγής σήματος που διέπουν το πλάσμα που προκαλείται μείωση της Δψπι είναι άγνωστη, προσδιορίσαμε αν οι αναστολείς της JNK και της p38 θα μπορούσε να μετριάσει το πλάσμα που προκαλείται από βλάβη των μιτοχονδρίων. Κατά παρόμοιο τρόπο, οι αναστολείς της ΙΝΚ και ρ38 (SP600125 ή SB203580) ήταν σε θέση να μετριάσει τα αποτελέσματα του πλάσματος και H

2O

2 για την μείωση Δψπι, ακόμη και αν δεν προκύπτει σε φυσιολογικά Δψπι (Σχήμα 5c). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το πλάσμα αέρα παράγει ROS /RNS, οδηγώντας σε ενεργοποίηση της μεταγωγής σήματος μέσω JNK ή ρ38. Ταυτόχρονα, ROS /RNS φαίνεται να επάγει την κατάρρευση της Δψπι, η οποία είναι εν μέρει προκαλείται μέσω JNK και ρ38 σήμα μεταγωγής

ROS /RNS γενιάς επάγει αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από το πλάσμα μέσω ενεργοποίησης της κυτταρικής JNK και ρ38 μεταγωγές σήματος και μιτοχονδριακή δυσλειτουργία

για να προσδιοριστεί ο κυτταρικός θάνατος αέρα πλάσματος που προκαλείται, δοκιμάσαμε πρώτα την πιθανότητα ότι οι ROS /RNS ήταν υπεύθυνος για το θάνατο των καρκινικών κυττάρων του πλάσματος που προκαλείται από τον αέρα με κατεργασία κύτταρα HeLa με το πλάσμα του αέρα με την παρουσία των αντιοξειδωτικών NAC ή cPTIO. Προεπεξεργασία με NAC και cPTIO εξασθενημένο κυτταρικό θάνατο που επάγεται από πλάσμα (49,5% ± 2,2% και 38,86% ± 4,2%, αντίστοιχα, Σχήμα 6a και το Σχήμα S3), που πιστοποιεί ότι ROS /RNS εμπλέκεται στον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από το πλάσμα. Επειδή δεν υπάρχει καλός έλεγχος για RNS παρόμοια με τη χρήση H

2O

2 ως κανονικό έλεγχο για ROS, μπορούμε επίσης να ελεγχθεί κατά πόσον NaNO

3 θα μπορούσε να προκαλέσει την απόπτωση, εύλογα τη συμμετοχή NO και RNS που παράγεται από NaNO

3. NaNO

3 προωθείται θάνατο των κυττάρων σε υψηλότερες συγκεντρώσεις από ό, τι έκανα H

2O

2 (Σχήμα S3-S4). Σύμφωνα με αυτό το αποτέλεσμα, ο λόγος NaNO

3 δεν επάγει αποτελεσματική κυτταρικός θάνατος είναι ότι αποτυγχάνει να δημιουργήσει αποτελεσματική RNS /ROS σε αντίθεση με το πλάσμα αέρα ή H

2O

2 (Σχήμα S4).

(α) Antioxdizing παράγοντες (NAC και cPTIO) ή αναστολείς κινάσης (SP600125 και SB203580) διασώθηκαν μερικώς κυτταρικό θάνατο του πλάσματος που προκαλείται. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± S.E.M. (

n

= 10). (Β) Plasma-κυτταρικό θάνατο που επάγεται μερικώς καταργήθηκε το /2 (siJNK1 /2) ή ρ38 (sip38) κύτταρα knockdown ΙΝΚ1. Για την παρακολούθηση του κυτταρικού θανάτου που επάγεται από πλάσμα, δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας ΑΤΡ-based πραγματοποιήθηκε με την παρουσία του ελέγχου, JNK1 /2, ή ρ38 siRNA. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± S.E.M. εις τριπλούν από τρία ανεξάρτητα πειράματα (

n

= 3). Κυτταρική βιωσιμότητα των μη επεξεργασμένων κυττάρων HeLa πληθυσμού αυθαίρετα οριστεί στο 100%. Ανοσοαποτύπωση με αντι-JNK και ρ38 αντισωμάτων έγινε για να επιβεβαιώσετε νοκ ντάουν. * P & lt? 0,01, ** p & lt? 0,05. (Γ) – (δ) Air πλάσματος επάγεται Βαχ μετατόπιση προς τα μιτοχόνδρια. Το πλάσμα ή Η

2O

2-επεξεργασμένα κύτταρα επωάστηκαν περαιτέρω για 6-24 ώρες. Μετά από 6-24 ώρες επώασης, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 3,7% φορμαλδεΰδη. Βαχ (πράσινο) βάφτηκε αντίσωμα αντι-Βαχ και Mitotracker χρησιμοποιήθηκε για χρώση των μιτοχονδρίων (Κόκκινο). Βαχ (πράσινο) και μιτοχονδριακή (κόκκινο, Mitotracker) φθορισμού αξιολογήθηκαν, 6 h (δ) και 24 ώρες ((c) και (d)) μετά από έκθεση σε πλάσμα αέρα για 5 λεπτά με ομοεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού. Βαχ ήταν διάχυτα κατανεμημένα σε μη επεξεργασμένα κύτταρα (μη επεξεργασμένα). Ωστόσο, μετά από κατεργασία με πλάσμα, Βαχ ήταν εντοπισμένη σε μιτοχόνδρια, με βάση την επικάλυψη των εικόνων φθορισμού Βαχ και Mitotracker (Συγχώνευση, κίτρινο). DAPI χρησιμοποιήθηκε για την πυρηνική χρώση (μπλε). Λευκή γραμμή ήταν η μέση μεγέθυνση της εικόνας (10 μΜ). (Ε) Προσφορά σχημάτισε σύμπλοκο με προ-αποπτωτικών Bcl-xL θεραπεία ακόλουθη πλάσματος. (Στ) Η Air πλάσματος επάγεται απόκλιση θάνατο κυττάρου σε ανθρώπινα Α549 αδενοκαρκινώματος πνεύμονα και κανονικό MRC5 κυτταρικές σειρές ινοβλαστών πνεύμονος. Α549 και MRC5 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με πίδακες πλάσματος αέρα και στη συνέχεια επωάστηκαν περαιτέρω για 24 ώρες. Μετά τη συγκομιδή και τη χρώση κυττάρων με αντι-ανεξίνη V-FITC και ΡΙ, ο κυτταρικός θάνατος εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή (S.E.M) από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Ζ) Ένα προτεινόμενο μοντέλο για το πλάσμα του αέρα jet-επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα HeLa μέσω της παραγωγής ROS /RNS, καταπάτηση στα κύτταρα, την ενεργοποίηση των μονοπατιών μεταγωγής σήματος, και μιτοχονδριακές βλάβες.

Η

Για να διερευνήσουν το ρόλο της JNK και ρ38 ΜΑΡΚ μονοπάτια στον αέρα πλάσματος που προκαλείται από αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, χρησιμοποιήσαμε ειδικούς αναστολείς τους, SP600125 (αναστολέας της JNK) και SB203580 (αναστολέας του p38 ΜΑΡΚ). Όταν τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με SP600125 ή SB203580 πριν από την έκθεση πίδακας πλάσματος αέρα, ο αποπτωτικός κυτταρικός πληθυσμός θανάτου μειώθηκε σε 59,3% ± 2,3% και 52,0% ± 9,7%, αντίστοιχα, σε σύγκριση με το κυτταρικό θάνατο που επάγεται από μόνο του τον πίδακα πλάσματος (85,4 ± 3.4%) (Σχήμα 6Α και το Σχήμα S3), γεγονός που υποδηλώνει ότι μεταγωγή σήματος μέσω JNK και ρ38 εμπλέκεται μερικώς σε κυτταρικό θάνατο που επάγεται από πλάσμα. Για να πάρετε περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τους ρόλους των JNK και p38 κατά τη διάρκεια του κυτταρικού θανάτου του πλάσματος που προκαλείται, κυτταρικής βιωσιμότητας των JNK- ή κύτταρα p38-απεμπλουτισμένο αναλύθηκε μετά τη θεραπεία του πλάσματος με τη μέτρηση ΑΤΡ από βιώσιμα κύτταρα. Βρήκαμε ότι το πλάσμα που προκαλείται από μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων ήταν εξασθενημένος από JNK1 /2 siRNA ή ρ38 siRNA (Σχήμα 6β).