Αφηρημένο

Πολλά γονίδια μακροζωίας έχουν ανακαλυφθεί στο μοντέλο οργανισμούς και μεταβάλλοντας τα αποτελέσματα της λειτουργίας τους σε παρατεταμένη διάρκεια ζωής. Στα θηλαστικά, κάποιοι έχουν σκεφτεί ότι τυχόν οφέλη για την υγεία που προκύπτουν από το χειρισμό αυτών των ίδιων οδών μπορεί να αντισταθμιστεί με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου λόγω της τάσης τους να ενισχύσουν την επιβίωση των κυττάρων. Η οικογένεια Sir2 /SIRT1 του NAD

+ – εξαρτώμενη από αποακετυλάσες προτείνεται να διέπουν τα οφέλη για την υγεία του περιορισμού των θερμίδων (CR), μια δίαιτα που καταστέλλει σε μεγάλο βαθμό καρκίνου σε θηλαστικά. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι CR επάγει διπλάσια έκφραση SIRT1 αύξηση στο έντερο των τρωκτικών και ότι η έκτοπη επαγωγή SIRT1 σε ένα β-κατενίνης με γνώμονα μοντέλο ποντικού καρκίνου του παχέος εντέρου μειώνει σημαντικά το σχηματισμό όγκων, τον πολλαπλασιασμό και τη νοσηρότητα των ζώων σε απουσία CR. Δείχνουμε ότι SIRT1 αποακετυλιώνει β-κατενίνης και καταστέλλει την ικανότητα του να ενεργοποιεί τη μεταγραφή και την οδήγηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Επιπλέον, SIRT1 προωθεί κυτταροπλασματική εντόπιση της αλλιώς πυρηνικά εντοπισμένη ογκογόνο μορφή β-κατενίνης. Σε συμφωνία με αυτό, μια σημαντική αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας των πυρηνικών SIRT1 και το ογκογόνο μορφή β-κατενίνης σε 81 ανθρώπινα δείγματα όγκου κόλου αναλύθηκαν. Στο σύνολό τους, αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι η SIRT1 καταστέλλει εντερικό σχηματισμό όγκων

in vivo

και να αυξήσει την προοπτική ότι οι θεραπείες που στοχεύουν SIRT1 μπορεί να είναι κλινικής χρήσης σε β-κατενίνης με γνώμονα κακοήθειες

Παράθεση:. Firestein R, Blander G, Μιχάν S, Oberdoerffer Ρ, Ogino S, Campbell J, et al. (2008) Η SIRT1 Αποακετυλάση Καταστέλλει Εντερική Ογκογένεση και καρκίνου του παχέος εντέρου Ανάπτυξης. PLoS ONE 3 (4): E2020. doi: 10.1371 /journal.pone.0002020

Επιμέλεια: Μιχαήλ Β Blagosklonny, Ordway Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 5, Μαρτίου, 2008? Αποδεκτές: 11 του Μάρτη 2008? Δημοσιεύθηκε: 16 Απρ του 2008

Copyright: © 2008 Firestein et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. RF ήταν υποστηρίζεται από το ΝΙΗ Τ32 Grant. GB από μεταδιδακτορικός υπότροφος Estee Lauder. ΔΠ από ένα Εθνικό Διαστημικό Ινστιτούτο Βιοϊατρικών Ερευνών Grant. DAS, SO, ΚΠΣ και LG με επιχορηγήσεις από ΝΙΗ? RD εν μέρει από το εσωτερικό ερευνητικό πρόγραμμα του ΝΙΗ /ΝΙΑ. DS υποστηρίζεται επίσης από ένα δώρο από το Ίδρυμα Παύλου ΣΤ Glenn

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Leonard Guarente και David Sinclair είναι σύμβουλοι Sirtris Pharmaceuticals. William Hahn είναι ένας σύμβουλος της Novartis Pharmaceuticals.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος είναι η δεύτερη κύρια αιτία θνησιμότητας σχετίζεται με την ηλικία στους ανθρώπους. περιορισμός θερμίδων παρατείνει τη διάρκεια ζωής όλων των οργανισμών δοκιμαστεί και σε θηλαστικά ασκεί ισχυρή όγκου κατασταλτικά αποτελέσματα [1]. Σε κατώτερα ευκαρυωτικά, η

SIR2

γονίδιο προτείνεται να μεσολαβήσει τα οφέλη για την υγεία του CR [2], [3]. SIRT1, το ορθόλογο του θηλαστικού

SIR2

, επάγεται από CR σε πολλαπλούς ιστούς των θηλαστικών, και έχει αποδειχθεί ότι βελτιώνει εκφυλιστικών νόσων που σχετίζονται με τη γήρανση, όπως νευροεκφύλιση και μεταβολικές παρακμή [4]. Ενώ CR είναι γνωστό ότι αναστέλλουν το σχηματισμό τόσο αυθόρμητη και επαγόμενη όγκου, ένας ρόλος για SIRT1 σε αυτή τη διαδικασία πρέπει να αποδειχθεί [5]. Υπάρχουν αντικρουόμενα στοιχεία

in vitro

ως προς το αν SIRT1 θα βρεθεί να δρα ως ένα ογκογονίδιο ή ως καταστολέας των όγκων, αλλά μέχρι σήμερα δεν έχει υπάρξει καμία

in vivo

μελέτες που εξετάζουν αυτό το ερώτημα. Από τη μία πλευρά, SIRT1 υπερεκφράζεται σε όγκους και καρκινικά κύτταρα στερούνται το ογκοκατασταλτικό γονίδιο, HIC1 [6], μπορεί να αναστέλλει την απόπτωση [7], [8], [9], [10] και ρυθμίζει προς τα κάτω την έκφραση του όγκου γονίδια καταστολής [11], που οδηγεί πολλούς στο συμπέρασμα ότι SIRT1 θα αποδειχθεί ότι είναι ένα ογκογονίδιο

in vivo

. Από την άλλη πλευρά, SIRT1 μπορεί να είναι προ-αποπτωτικά [12] και αντι-πολλαπλασιαστική [13], [14], και κατά συνέπεια έχει προταθεί να συμπεριφέρεται ως καταστολέας όγκου

in vivo

. Επιπλέον, ορισμένοι υποστηρίζουν ότι τα γονίδια μακροζωίας θηλαστικών που καθυστερούν την ηλικία που σχετίζονται με ατροφική ασθένειες μπορεί αντιθέτως να προδιαθέτουν τους ανθρώπους σε μια υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης καρκίνου λόγω της αντι-αποπτωτική λειτουργία τους [15]. Αυτή η μελέτη αντιμετωπίζει αυτό το αμφιλεγόμενο ζήτημα με εξέταση των επιπτώσεων της SIRT1 επί του σχηματισμού όγκων και την ανάπτυξη.

Εμείς επιλέξαμε να ελεγχθεί η επίδραση της SIRT1 στην + μοντέλο APC

min /του καρκίνου του παχέος εντέρου για διάφορους λόγους : αυτό ανακεφαλαιώνει φυσιολογικά τα πρώιμα γεγονότα του καρκίνου του παχέος εντέρου στον άνθρωπο, ο μηχανισμός της ογκογένεσης είναι καλά χαρακτηρισμένη και CR έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι μειώνει τον ρυθμό της ογκογένεσης σε αυτό το μοντέλο [16]. Η APC

min /+ ποντικό περιέχει μια μετάλλαξη βλαστικής σειράς στην αδενωματώδη πολυποδίαση coli (APC) ογκοκατασταλτικό γονίδιο [17]. Σωματικά απώλεια του δεύτερου αλληλόμορφου οδηγεί σε συστατική πυρηνικό εντοπισμό του β-κατενίνης και σχηματισμού αδένωμα [18], [19].

β-κατενίνης είναι η κεντρική τελεστής στην κανονική μονοπάτι σηματοδότησης Wnt που ελέγχει βλαστικών κυττάρων συντήρηση , την ανάπτυξη και την καρκινογένεση [20]. Συστατική ενεργοποίηση του μονοπατιού β-κατενίνης έχει βρεθεί στο 90% των καρκίνων του παχέος [21], [22]. Επιπλέον, αυτή η οδός παρεκκλίνοντα ενεργοποιείται σε πολλούς άλλους καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του προστάτη, του μαστού, των ωοθηκών και του μελανώματος. Είναι ενδιαφέρον ότι δύο πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η αυξημένη σηματοδότηση Wnt σχετίζεται με επιταχυνόμενη γήρανση, υποδηλώνοντας ότι μια εξασθένηση του σηματοδότηση Wnt μπορούσε διέπουν CR και να είναι ευεργετική όχι μόνο για τη θεραπεία του καρκίνου, αλλά για ευρύτερα εξασθένιση ασθενειών της γήρανσης [23], [24] .

Αναφέρουμε εδώ ότι SIRT1 καταστέλλει εντερική ογκογένεση στο APC

μοντέλο min /+ ποντίκι και αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου. Παρέχουμε ουσιαστικές αποδείξεις ότι τα αντι-ογκογόνο επιδράσεις της SIRT1 εξαρτώνται από δεακετυλάσης τη δραστηριότητά της και μέσω της αναστολής της β-κατενίνης. Τα ευρήματα αυτά προσδιορίζουν μια λειτουργία καταστολής όγκου για SIRT1, παρέχουν μηχανιστική αντίληψη, και να προτείνει ένα θεραπευτικό ρόλο για ενεργοποιητές SIRT1 δεακετυλάσης στον καρκίνο του παχέος εντέρου.

Αποτελέσματα

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει μια δραματική όγκου κατασταλτική δράση της CR αλλά ο μοριακός μηχανισμός (ες) είναι προς το παρόν άγνωστη. Παρατηρήσαμε ότι οι αρουραίοι σε δίαιτα CR έχουν ~ 2-φορές υψηλότερα επίπεδα SIRT1 στο έντερο σε σχέση με επιθήλιο

ad lib

-fed ελέγχους (Σχ. 1Α). Για να ελεγχθεί η επίδραση της αύξησης της έκφρασης SIRT1 στα εντερικά επιθηλιακά κύτταρα, δημιουργήσαμε ένα floxed SIRT1 διαγονιδιακό ποντικό (Σχ. 1Β). SIRT1 διαγονιδιακά ποντίκια διασταυρώθηκαν με APC

min /+ ποντίκια που ακολουθείται από την αναπαραγωγή με το στέλεχος βιλλίνη-Cre [25]. Έτσι, δημιουργήσαμε τριπλά διαγονιδιακά ποντίκια (SIRT1

ΔSTOP? Vil-Cre? APC

min /+) που υπερεκφράζουν SIRT1 συγκεκριμένα στην λάχνες του εντέρου (που αναφέρεται ως SIRT1

ΔSTOP). Τα επίπεδα SIRT1 στο έντερο του SIRT1

ποντίκια ΔSTOP ήταν περίπου 7-φορές (Σχ. 1 Ε) και η μορφολογία των λαχνών εμφανίστηκαν άλλα φυσιολογική (Σχ. 1 F).

(Α) κηλίδα Western ανάλυση δείχνει επίπεδα έκφρασης στο έντερο επιθήλιο της SIRT1 στη βούληση που τρέφονται (AL) ή περιορισμένες θερμίδες (ΚΟ) ποντίκια διαφήμισης. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης σε όλες τις λωρίδες. (Β) Σχηματική απεικόνιση της στρατηγικής που χρησιμοποιείται για την παραγωγή του εμβρυϊκών βλαστικών floxed SIRT1 ποντικού (MES) κύτταρα. SIRT1 κλωνοποιήθηκε καθοδικά ενός ιδιοσυστατικού υποκινητή CAGGS ακολουθείται από μια μεταγραφική κασέτα ΙοχΡ-STOP-ΙοχΡ. Αυτό το κατασκεύασμα που στοχεύουν ειδικά στην 3 ‘UTR του τόπου κολλαγόνου Α1 (ColA1) του εμβρυονικά βλαστικά κύτταρα ποντικού (MES) κύτταρα με FLP ανασυνδυασμό. Οι στοχευμένες MES κύτταρα ενέθηκαν σε βλαστοκύστες. Red βέλη δείχνουν την τοποθεσία των εναρκτών προσδιορισμού του γονότυπου SIRT1-Tg. (C) κατά Southern δείχνει την επιβεβαίωση της SIRT1

STOP ενιαία ένταξη στην θέση Col1A των κυττάρων MES. (D) PCR επιβεβαιώνοντας την μετάδοση βλαστικής σειράς του SIRT1

STOP διαγονιδίου σε απογόνους των χίμαιρες ». (Ε) κηλίδα Western που δείχνει τα επίπεδα της SIRT1 στην τριπλή διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν SIRT1 (SIRT1

ΔSTOP) και ελέγχων (SIRT1

STOP). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης σε όλες τις λωρίδες. (F) Βλεννίνης λεκέ και ανοσοϊστοχημεία της SIRT1 στο λεπτό έντερο των πειραματικών (SIRT1

ΔSTOP) και ελέγχων (SIRT1

STOP) ζώα.

Η

APC

min /+, SIRT1

ποντίκια ελέγχου ΣΤΟΠ που δεν υπερεκφράζουν το SIRT1 (αναφέρεται ως SIRT1

STOP) έδειξε τα τυπικά συμπτώματα της νοσηρότητας των όγκων σε ηλικία των 16 εβδομάδων, όπως αποδεικνύεται από τις εμφανείς αναιμία και καχεξία, ενώ APC

min /+ ποντικοί που υπερεκφράζουν SIRT1 (SIRT1

ΔSTOP) εμφανίζεται κανένα εμφανή σημεία που σχετίζονται με όγκους νοσηρότητας (Σχ. S1A, Β). Η εξέταση του εντέρου επένδυσης σε ηλικία τεσσάρων μηνών έδειξαν ότι η SIRT1

ΔSTOP διαγονιδιακά ποντίκια είχαν σημαντικά μικρότερες και λιγότερους όγκους κατά μήκος του εντερικού σωλήνα (Εικ. 2Α). Ποσοτικοποίηση του βάρους του όγκου αποκάλυψε μια 3 έως 4-πλάσια μείωση του αριθμού και του μεγέθους των αδενωμάτων εντός του λεπτού εντέρου και του παχέος εντέρου των SIRT1

ποντίκια ΔSTOP (Σχ. 2Β). Ki-67 είναι ένα κοκκώδες συστατικό του πυρηνίσκου που εκφράζεται αποκλειστικά στα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα και χρησιμοποιείται ως προγνωστικός δείκτης στα ανθρώπινα νεοπλασιών. Αδενώματα των SIRT1

ποντίκια ΔSTOP είχαν σημαντική μείωση του αριθμού των μιτώσεων (ανά πεδίο υψηλής ισχύος) και χρώση Κί-67, καταδεικνύοντας ότι υπήρχε μία μείωση στον πολλαπλασιασμό αδένωμα (Σχ. 2C). Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι η υπερέκφραση της SIRT1 στο έντερο σε παρόμοια επίπεδα με αυτά που προκαλούνται από CR είναι αρκετή για να μιμούνται την επίδραση καταστολής του όγκου του CR στον λεπτά APC

/+ ποντίκι.

(Α) Φωτογραφίες σύνολό του δωδεκαδακτύλου και ειλεού τμήματα δείχνουν ακαθάριστο εντερική όγκων σε ποντίκια που υπερεκφράζουν SIRT1 (SIRT1

ΔSTOP) και ελέγχων (SIRT1

STOP). Στερεών γραμμή δείχνει γαστρο-δωδεκαδακτυλικό διασταύρωση. Τα βέλη δείχνουν αδενώματα. Λευκή γραμμή δηλώνει κλίμακας 1 mm. (Β) Μέσος αριθμός όγκων σύμφωνα με την εντερική τοποθεσία στο SIRT1

Διακοπή ελέγχου (n = 8) και SIRT1

ΔSTOP πειραματικά ποντίκια (η = 11). (C) Ki-67 χρώση των αδενωμάτων και τα ποσοστά πολλαπλασιασμού. Εικόνες δείχνουν Ki-67 ανοσοϊστοχημική χρώση των αδενωμάτων από SIRT1

STOP και SIRT1

ΔSTOP. δείκτης πολλαπλασιασμού εκφράζεται ως το ποσοστό του Ki-67 κύτταρα χρωματίζονται αδένωμα (κατά μέσο όρο για τουλάχιστον 10 αδενώματα ανά κοόρτη). Μιτωτικό ρυθμό υπολογίζεται ως ο αριθμός των ιστολογικά αναγνωρίσιμων μιτωτικών σχημάτων ανά 10 πεδία υψηλής ισχύος (400 Χ). Οι τιμές στο Β και Γ είναι τα μέσα ± Τ.Α.

Η

Για να αποκτήσουν γνώσεις σχετικά με τους μηχανισμούς με τους οποίους SIRT1 μειώνει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, εξετάσαμε την επίδραση της SIRT1 στο ρυθμό ανάπτυξης αρκετών καλά χαρακτηρισμένα καρκινικές κυτταρικές σειρές. Ο πολλαπλασιασμός των LNCaP κυττάρων καρκίνου του προστάτη μειώθηκε σημαντικά από υπερέκφραση του SIRT1 και το αποτέλεσμα ήταν παρόμοιο με την καταστολή εαυτό β-κατενίνης (Εικ. 3Α). Αυτή η παρατήρηση προτείνει ότι SIRT1 και λειτουργία β-κατενίνης στο ίδιο κυτταρικό περιβάλλον. Για να διερευνηθεί περαιτέρω αυτή η πιθανότητα, υπερεκφράσαμε SIRT1 και καταλυτικά ανενεργό μεταλλαγμένη SIRT1 (SIRT1

ΔHY) σε διάφορες κυτταρικές σειρές καρκίνου ανθρώπινου κόλον των οποίων η ανάπτυξη οδηγείται από συστατικώς δραστική β-κατενίνης (HCT116 και DLD1). Ένα ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή στην οποία β-κατενίνη είναι ανενεργό (RKO) χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος. Αυξημένη έκφραση SIRT1 μείωσε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό και στις δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου με ιδιοσυστατικά ενεργή β-κατενίνης, αλλά όχι στην κυτταρική σειρά β-κατενίνης ανενεργό (Σχ. 3Α-D). Η SIRT1

ΔHY καταλυτικό μεταλλάκτη δεν είχε σημαντική επίδραση επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε οποιαδήποτε από τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 3Β-D). Έτσι, SIRT1 καταστέλλει β-κατενίνης με γνώμονα τον πολλαπλασιασμό και την καταλυτική δραστικότητα του είναι προφανώς απαιτείται για το σκοπό αυτό.

(Α-Δ) Σταθερό LN-CAP, κυτταρικές γραμμές DLD1, HCT116 και RKO εκφράζουν το υποδεικνυόμενο προϊόν σπάρθηκαν και ο αριθμός των κυττάρων παρακολουθήθηκε σε διάφορα χρονικά σημεία. κηλίδα Western διεξήχθησαν με αντισώματα SIRT1, ακτίνης ή β-κατενίνης. (Ε) DLD1 σταθερές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν Topflash-LuciferasePEST μολύνθηκαν με τους υποδεικνυόμενους κατασκευάσματα. Τα κύτταρα αναλύθηκαν με western blot με αντισώματα έναντι SIRT1 και β-κατενίνης. δραστηριότητα λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκε για ολική πρωτεΐνη του δείγματος και αντιπροσωπεύει τρία ανεξάρτητα πειράματα γίνονται εις τετραπλούν.

Η

Για την περαιτέρω κατανόηση του μηχανισμού με τον οποίο SIRT1 καταστέλλει β-κατενίνης με γνώμονα τον πολλαπλασιασμό, έχουμε μηχανικής της κυτταρικής σειράς DLD1 να περιέχει μια σταθερά ενσωματωμένα δημοσιογράφος με β-κατενίνης στοιχεία απόκρισης (Super8XTopflash-λουσιφεράσης

PEST). Knockdown του β-κατενίνης μειωθεί δραματικά δραστηριότητα ανταποκριτή, αποδεικνύοντας την εξάρτηση της ρεπόρτερ στην ενδογενή δραστικότητα β-κατενίνης (Εικ. 3Ε). Η υπερέκφραση του SIRT1 μειωμένη δραστικότητα ανταποκριτού από ~ 2-φορές, ενώ η SIRT1

ΔHY καταλυτικό μεταλλάκτη δεν είχε καμία επίδραση (Εικ. 3Ε), γεγονός που υποδηλώνει ότι οι αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις της SIRT1 διαμεσολαβείται από την ικανότητά της να καταστέλλει την μεταγραφική δραστικότητα του ενδογενούς β-κατενίνης και ότι αυτό απαιτεί δράση SIRT1 δεακετυλάσης.

η ακετυλίωση της β-κατενίνης με p300 /CBP ενισχύει ογκογένεσης με την αύξηση της β-κατενίνης /TCF απληστία σε υποστηρικτές του γονιδίου-στόχου [26]. Για να ελεγχθεί αν SIRT1 τροποποιεί β-κατενίνης, κύτταρα ΗΕΚ293Τ επιμολύνθηκαν με μια μεταλλαγμένη μορφή του β-κατενίνης που εντοπίζεται ιδιοσυστατικά προς τον πυρήνα (S33Y-β-κατενίνης) [27]. Σε αυτά τα κύτταρα SIRT1 συν-ανοσοκαταβυθίστηκε με β-κατενίνη (Εικ. 4Α) και αντιστρόφως (Εικ. 4Β). Μια αλληλεπίδραση μεταξύ ενδογενούς SIRT1 και β-κατενίνης ήταν επίσης εμφανής (Εικ. 4C).

(Α) Ανθρώπινα κύτταρα 293Τ επιμολύνθηκαν παροδικά με HA-S33Y-β-κατενίνης σε συνδυασμό είτε με FLAG-tagged SIRT1 ή τον έλεγχο των φορέων. Δείγματα της συνολικής πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε ανοσοκαθίζηση με αντίσωμα αντι-ΡΕΑΟ (IP FLAG). Ανοσοκαταβυθισμένες πρωτεΐνες ανοσοστυπώθηκαν με αντι-ΗΑ (άνω πάνελ) και αντι-FLAG (κάτω πίνακας). Αριστερά λωρίδες, μη επεξεργασμένα εκχυλίσματα (input). (Β) Ανθρώπινα κύτταρα 293Τ διαμολύνθηκαν όπως στο πάνελ Α Πρωτεΐνες ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-ΗΑ αντίσωμα και ανοσοστυπώθηκαν με αντι-FLAG (άνω πάνελ), και αντι-ΗΑ (κάτω πίνακας). Αριστερά λωρίδες, μη επεξεργασμένα εκχυλίσματα (input). (C) Ανοσοκαταβύθιση του SIRT1 από εκχυλίσματα κυττάρων LN-CAP χρησιμοποιώντας αντι-SIRT1 αντίσωμα ή φυσιολογική IgG κουνελιού ως μάρτυρα (IgG). 10% της ανοσοκατακρημνίστηκε πρωτεΐνη ακολούθως στυπώθηκαν με αντι-SIRT1 (άνω πάνελ), ενώ το υπόλοιπο 90% κηλιδώθηκε με αντισώματα αντι-β-κατενίνης. (D) Κύτταρα 293Τ διαμολύνθηκαν όπως υποδεικνύεται και λύθηκαν 48 ώρες αργότερα. Συγκρίσιμα επίπεδα β-κατενίνης ανοσοκαταβυθίστηκαν και κηλιδώθηκαν για ακετυλιωμένης λυσίνης (IP: HA IB: Ac-K? Ανώτερο πλαίσιο). Η κηλίδωση επανελέγχθηκε για το ΗΑ να αποδείξει περίπου ίσα επίπεδα της ΗΑ-β-κατενίνης (IP: HA IB: HA? Κατώτερο πάνελ). (Ε-Ρ) Κύτταρα 293Τ διαμολύνθηκαν όπως υποδεικνύεται μαζί με την λουσιφεράση TOP-FLASH και κατασκεύασμα λουσιφεράσης PRL-ΤΚ Renilla. Νικοτιναμίδιο (ΝΑΜ) ή ρετροϊικής SIRT1 shRNA (RNAi) προστέθηκε όπως υποδεικνύεται. Τα δεδομένα κανονικοποιούνται σε σχέση με την δραστηριότητα της λουσιφεράσης της Renilla. Τα δεδομένα είναι μέσα ± Τ.Α. από δείγματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. (G) Έμμεση χρώση ανοσοφθορισμού των DLD-1 καρκίνος παχέος εντέρου κύτταρα μολυσμένα με άδειο ρετροϊό ή ιό που περιέχει SIRT1 shRNA (RNAi) ή SIRT1 cDNA (υπερέκφραση, Ο /Ε). Ποσοστό κυττάρων με υψηλής, μεσαίας ή τα χαμηλά επίπεδα χρώσης πυρηνικής β-κατενίνης για το μη επεξεργασμένο: 6.5, 80.6, 12.9? SIRT1 O /E: 0, 29.4, 70.5? SIRT1 RNAi: 60.0, 32.0, 0.8. Εικόνες ελήφθησαν σε 100 χ μεγέθυνση.

Η

Για να ελεγχθεί αν SIRT1 αναστέλλει β-κατενίνης με διαμόρφωση ακετυλίωση του, μπορούμε κύτταρα 293Τ με S33Y-β-κατενίνης, το p300 ακετυλοτρανσφεράση, και αυξανόμενες ποσότητες SIRT1 . Βρήκαμε ότι η ρ300 ακετυλιωμένη β-κατενίνης (Εικ. 4D) και ενίσχυσε μεταγραφική δραστηριότητα της, όπως έχει αναφερθεί προηγουμένως [27] (Σχ. 4Ε). Η προσθήκη του SIRT1, ωστόσο, κατάργησε την ακετυλιωμένη μορφή της β-κατενίνης και σημαντικά μειωμένη δραστικότητα β-κατενίνης όταν συν-επιμολύνθηκαν με ρ300 (Σχ. 4D, E). Αντιστρόφως, θεραπευτική αγωγή κυττάρων με τον αναστολέα νικοτιναμιδίου SIRT1 (ΝΑΜ) [28] ή την καταστολή SIRT1 με ρετροϊικό φορέα shRNA (Εικ. 4στ) αυξημένη δραστηριότητα αναφοράς λουσιφεράσης. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι SIRT1 προάγει την αποακετυλίωση της β-κατενίνης, μειώνοντας έτσι την ικανότητά της να δρα ως trans-ενεργοποιητής.

Η συστατική παρουσία β-κατενίνης στον πυρήνα συνδέεται με ογκογόνο λειτουργία της και κλινικά με μια φτωχή πρόγνωση των ασθενών [29]. Για να ελεγχθεί αν SIRT1 θα μπορούσε να καταστείλει β-κατενίνης με μεταβολή εντοπισμό του, ανοσοφθορισμός σε κύτταρα επιμολυσμένα με shRNA ή υπερέκφραση κατασκευάσματα για SIRT1. Καταστολή της SIRT1 στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου DLD1 αύξησε την ποσότητα της πυρηνικής β-κατενίνης, ενώ η υπερέκφραση του SIRT1 στην ίδια κυτταρική γραμμή οδήγησε σε δραματική μείωση στην πισίνα πυρηνικής β-κατενίνης (Εικ. 4G).

Για να αναλυθεί η κλινική σημασία των ευρημάτων μας, αναλύσαμε SIRT1 και β-κατενίνης υποκυτταρικές έκφραση σε μια μικροσυστοιχία ιστού που περιέχει 81 ανθρώπινα δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου. Βρήκαμε ότι ένα υποσύνολο των καρκίνων του παχέος εντέρου εκφράζουν SIRT1 στον πυρήνα (47/81 περιπτώσεις? 58%). Όταν η έκφραση της β-κατενίνης ήταν σκόραρε σε αυτούς τους ίδιους καρκίνους του παχέος εντέρου, μια ιδιαίτερα σημαντική αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου της έκφρασης SIRT1 και ο εντοπισμός των πυρηνικών β-κατενίνης έγινε εμφανής (αναλογία p≤0.003, οι πιθανότητες 0,24 με 95% διάστημα εμπιστοσύνης 0,093 έως 0,63) ( Σχ. 5Α, Β). Συλλογικά, αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι η διαφοροποίηση των β-κατενίνης υποκυτταρικός εντοπισμός είναι ένα σημαντικό συστατικό των αντι-ογκογόνο επιδράσεις της SIRT1 με πιθανούς διαγνωστικές και θεραπευτικές κλινική σημασία.

(Α) Εκπρόσωπος εικόνες που απεικονίζουν SIRT1 και β-κατενίνης υποκυτταρική έκφρασης σε ανθρώπινους όγκους του παχέος εντέρου. Για κάθε περίπτωση καρκίνου του παχέος εντέρου φαίνεται ένα ένθετο πλαίσιο κειμένου δηλώνει το ανιχνεύεται πρωτεΐνη (μεγέθυνση εικόνας 200 ×). (Β) Συσχέτιση της SIRT1 και β-κατενίνη έκφρασης σε ανθρώπινους όγκους του παχέος εντέρου. Το γράφημα ράβδων απεικονίζει σωρευτικά δεδομένα ανοσοχρώση από μικροσυστοιχιών ιστό των 81 περιπτώσεων καρκίνου του παχέος εντέρου. Πυρηνική έκφραση βαθμολογήθηκε ως είτε χωρίς έκφραση, αδύναμη έκφραση, ή μέτρια /ισχυρή έκφραση. Θετικότητα στον πυρήνα ορίστηκε ως μέτρια /strong έκφρασης. Όλα τα πλακίδια ερμηνεύεται από δύο σκάφους επικυρωμένο παθολόγο τυφλωμένος από οποιαδήποτε άλλα κλινικά και εργαστηριακά δεδομένα.

Η

Συζήτηση

Εδώ περιγράφουμε ένα φυσιολογικά σχετικό ρόλο κατασταλτικό όγκου για SIRT1 στο σχηματισμό του καρκίνου του παχέος εντέρου και ανάπτυξη. Παρατηρήσαμε ότι η έκφραση SIRT1 στην κανονική έντερο συμβαίνει ειδικά στις εντεροκύτταρα, τα πρόδρομα κύτταρα που υποβάλλονται σε νεοπλασματικό μετασχηματισμό σε καρκίνους του παχέος εντέρου, και ότι SIRT1 ρυθμίζεται αυξητικά στα έντερα τρωκτικών σε απόκριση σε CR. Δείχνουμε ότι η υπερέκφραση του SIRT1 μειώνει τον ρυθμό πολλαπλασιασμού σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου και ότι υπερεκφράζουν SIRT1 στα εντεροκύτταρα του APC

/+ ζώα min μιμείται τις όγκου κατασταλτικά αποτελέσματα του CR σε αυτό το μοντέλο καρκίνου του παχέος εντέρου. Αυτές οι παρατηρήσεις είναι συνεπείς με μια πρόσφατη

in vitro

μελέτη που εμπλέκει SIRT1 ως ένα θρεπτικό ευαίσθητο καταστολέα της ανάπτυξης [30]. Ενώ SIRT1 εκφράζεται σε διαγονιδιακά ποντίκια μας σε υψηλότερα επίπεδα από ό, τι φαίνεται στα έντερα του CR αντιμετωπίζονται τρωκτικά (7 φορές (SIRT1) έναντι 2 φορές (CR)), αυτό το επίπεδο υπερέκφραση είναι, παρ ‘όλα αυτά, σύμφωνα με τα ευρήματα ότι η SIRT1 μπορεί να είναι φυσιολογικά απορυθμίζεται 5-10 φορές

in vivo

[31]. Δεδομένου ότι τα καρκινικά κατασταλτικά αποτελέσματα που προκαλούνται από SIRT1 έκλειψη αυτές που παρατηρήθηκαν με CR (μείωση κατά 70% (SIRT1) έναντι 40% μείωση (CR)) [16] δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την πιθανότητα ότι SIRT1 αναστέλλει επίσης την ανάπτυξη όγκου από ένα CR-ανεξάρτητο μηχανισμό. Παρ ‘όλα αυτά, τα δεδομένα μας παρέχουν

in vivo

αποδείξεις ότι η υπερέκφραση της SIRT1 σε φυσιολογικά σημαντικά επίπεδα, μπορεί να καταστείλει το σχηματισμό όγκων και την ανάπτυξη.

Στη μελέτη αυτή, μπορούμε επίσης να παρουσιάσει αποδεικτικά στοιχεία ότι η SIRT1 αλληλεπιδρά με και καταστέλλει β-κατενίνης, ο παράγοντας μεταγραφής που οδηγεί όγκων στον /+ μοντέλο APC

min και μια ποικιλία ανθρώπινων όγκων. Βρίσκουμε ότι SIRT1 υπερέκφραση αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου εξαρτάται από την δραστικότητα β-κατενίνης, καταστέλλει τον εντοπισμό του β-κατενίνης στον πυρήνα, και εξασθενεί σημαντικά η ικανότητα του να ενεργοποιεί τη μεταγραφή. Αυτές οι επιδράσεις δεν παρατηρήθηκαν στο μεταλλαγμένο SIRT1-HY αποδεικνύοντας ότι απαιτείται δραστηριότητα SIRT1 αποακετυλάσης, και αυξάνοντας την πιθανότητα ότι SIRT1 στοχεύουν άμεσα β-κατενίνης για αποακετυλίωση.

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η β-κατενίνη είναι ακετυλιωμένο με p300 /CBP και την ακετυλιωμένη μορφή της πρωτεΐνης έχει αυξηθεί μεταγραφική δραστηριότητα. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι η θεωρούμενη αποακετυλάσης που παρεμποδίζουν p300 /CBP θα ήταν χρήσιμο ως θεραπευτικό του καρκίνου στόχου [32]. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε εντοπίσει SIRT1 ως δεακετυλάσης που ανταγωνίζεται p300 /CBP και αποακετυλιωμένα άλατα β-κατενίνης, επιβραδύνοντας έτσι τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

.

Μαζί, υπόστεγα δεδομένα μας φως για η ικανότητα του SIRT1 να αναστέλλουν δραστικότητα β-κατενίνης και παρέχει μηχανιστική κατανόηση των αντι-ογκογόνο επιδράσεις της SIRT1 σε ένα καλώς χαρακτηρισμένο μοντέλο καρκίνου του παχέος εντέρου. Δεδομένου ότι SIRT1 ανακαλύφθηκε ως ομόλογο ενός γονιδίου μακροζωίας, είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί η όλο και περισσότερες ενδείξεις για σύνδεση μεταξύ Wnt /σηματοδότηση β-κατενίνης και ασθενειών που σχετίζονται με την ηλικία. β-κατενίνης έχει συνδεθεί με άλλες κακοήθειες σχετιζόμενη με την ηλικία, όπως το μελάνωμα, πολλαπλό μυέλωμα, και καρκίνο του προστάτη. Υπάρχει επίσης η πρόσφατη ανακάλυψη ότι προς τα πάνω ρύθμιση του σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης επιταχύνει τη γήρανση σε ποντίκια [23], [24]. Έτσι, θα αξίζει να διερευνηθεί κατά πόσον SIRT1 μπορεί να παρέχει προστασία κατά άλλων ασθενειών που σχετίζονται με την ηλικία, λόγω της ικανότητάς της να καταστέλλει σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης.

Εν ολίγοις, χρησιμοποιώντας βιοχημεία, γενετική ποντίκι, και την κλινική του όγκου δείγματα έχουμε βρει ότι SIRT1, ένα γονίδιο δίαιτα αποκρίνεται, είναι ένας ρυθμιστής του β-κατενίνης και έχει μια λειτουργία κατασταλτική του όγκου. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι τα γονίδια μακροζωίας θηλαστικών με αντι-αποπτωτική λειτουργίες, παραδόξως δεν οδηγούν αναγκαστικά σε αύξηση της ογκογένεσης. Στην πραγματικότητα, θα βρείτε το αντίθετο είναι πιθανό η περίπτωση για SIRT1. Αυτές οι μελέτες αρχίζουν να απαντήσετε σε μια σημαντική βιολογική ερώτηση σχετικά με τη λειτουργία ενός πλήκτρου γονίδιο της μακροζωίας στην ανάπτυξη και την ανάπτυξη του καρκίνου και να προτείνουν μια προηγουμένως αγνώστων θεραπευτικές δυνατότητες για ενεργοποιητές SIRT1 στον καρκίνο.

Υλικά και Μέθοδοι

Τα τρωκτικά

μια Cre επαγόμενο κατασκεύασμα έκφρασης SIRT1 δημιουργήθηκε στο οποίο ένα

ΙοχΡ

πλαισιώνεται μεταγραφικό στοιχείο STOP εισήχθη μεταξύ ενός προαγωγού CAGGS και το cDNA SIRT1. Αυτό το κατασκεύασμα στόχευση στο ποντίκι Collagen Α1 τόπο χρησιμοποιώντας FLP ανασυνδυαστάση μεσολάβηση γενωμική ενσωμάτωση όπως περιγράφηκε προηγουμένως (1). MES κύτταρα που φέρουν ένα μόνο αντίγραφο του SIRT1

κατασκεύασμα STOP ταυτοποιήθηκαν με αντοχή στο αντιβιοτικό υγρομυκίνη δείκτη και κηλίδωση Southern. Εκκινητές PCR και να κατασκευάσει χάρτες είναι διαθέσιμα κατόπιν αιτήματος. Δύο κλώνοι ενέθηκαν σε βλαστοκύστες και τα δύο παράγονται νεογνά, των οποίων -90% εμφανίζεται μετάδοση βλαστικής σειράς. Όγκων ποντικών που έφεραν τα οποία αναλύθηκαν είχαν αναδιασταυρώθηκαν τουλάχιστον τέσσερις γενιές σε C57 /BL6. APC

στελέχη διαγονιδιακά ποντίκια min /+ και βιλλίνη-Cre ελήφθησαν στο παρασκήνιο C57 /BL6 από Jackson Labs (Bar Harbor, ΜΕ). SIRT1

STOP ζώα διασταυρώθηκαν δύο γενιές σε C57BL /6 ποντίκια πριν από τη διέλευση στην APC

min /+ για να δημιουργήσει SIRT1

STOP? APC

min /+ διπλά διαγονιδιακά. Αυτά τα ζώα είχαν εκτραφεί για να βιλλίνη-Cre διαγονιδιακά ποντίκια για να δημιουργήσει μια ομάδα της SIRT1

ΔSTOP? Vil-Cre? APC

min /+ ζώα. Τα ζώα διατηρήθηκαν στο Harvard Medical School και τα πειράματα έχουν εγκριθεί από την Επιτροπή Φροντίδας Ζώων της Ιατρικής Σχολής του Χάρβαρντ.

Άντρας Fischer-344 (F344) αρουραίοι που αναπαράγονται και εκτρέφονται σε ιχθυοτροφείο στο Ερευνητικό Κέντρο Γεροντολογίας (GRC, Baltimore, MD). Από τον απογαλακτισμό (2 εβδομάδες), οι αρουραίοι στεγάστηκαν ξεχωριστά σε πρότυπο πλαστικά κλουβιά με κλινοσκεπάσματα ξύλο βήτα τσιπ. Τα ζώα ελέγχου είχαν τραφεί μια ΝΙΗ-31 πρότυπο κατά βούληση διατροφή (AL). Στην ηλικία του 1 μηνός ο περιορισμένες θερμίδες (CR) ζώα παρέχεται μια βιταμίνες και ανόργανα ενισχυμένη έκδοση του την ίδια δίαιτα σε επίπεδο 40% λιγότερο φαγητό (κατά βάρος) από τους αρουραίους AL καταναλώνεται κατά τη διάρκεια της προηγούμενης εβδομάδας. Διηθήθηκε και οξινισμένο νερό ήταν διαθέσιμο κατά βούληση για τις δύο ομάδες. Το ιχθυοτροφείο διατηρήθηκε σε θερμοκρασία 25 ° C με σχετική υγρασία 50% σε ένα σκοτεινό κύκλο /12/12-ώρες φως (τα φώτα άναβαν στις 6:00 π.μ.) Όλα τα ζώα ήταν ηλικίας 6 μηνών και θανατώθηκαν 9:00 και τις 11:00 π.μ. Το έντερο απομακρύνθηκε γρήγορα και ξεπλυθούν καλά με παγωμένο PBS και τοποθετήθηκαν σε υγρό άζωτο και στη συνέχεια αποθηκεύεται στους -80 ° C μέχρι να υποβάλλονται σε επεξεργασία για κηλίδωση Western με τη χρήση τυποποιημένων διαδικασιών.

Animal Pathology, Ιστοπαθολογία και ανοσοϊστοχημικές ανάλυση

Για ακαθάριστο ανάλυση του όγκου, όλο το έντερο υποβλήθηκε σε εκτομή αμέσως μετά τη θυσία, διανοίγονται κατά μήκος και πλύθηκε με ψυχρό ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS), ενώ καθηλώθηκαν ένα στερεό υπόστρωμα. Αδενώματα μεγαλύτερα από 0,5 χιλιοστά από το εγγύς (10 εκατ άπω του πυλωρού), άπω (10 cm κοντά στο τυφλό έντερο) και μέση (-50% του συνολικού μήκους εντερικών) λεπτό έντερο καθώς και στο κόλον βαθμολογήθηκαν. Τα έντερα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Ελβετικό ρολό με περιστροφή τους γύρω από ένα ρύγχος πιπέτας γυαλί. Οι ιστοί μονιμοποιήθηκαν και εγκλείστηκαν σε παραφίνη χρησιμοποιώντας πρότυπο πρωτόκολλο ιστολογία. Ακριβές μέγεθος του όγκου βαθμολογήθηκε μικροσκοπικά σε αιματοξυλίνη /ηωσίνη χρώση των εντέρων ποντίκι με τη χρήση μικροσκοπίου με μικρόμετρο. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση των ιστών τρωκτικών διεξήχθη με αντι-SIRT1 αντίσωμα κουνελιού (Upstate Biotechnology, cat # 07-131), αντι-β κατενίνη (Abcam # 2982), ποντικού αντι-β-κατενίνης (Κλώνος 14, BD εργαστήρια μεταγωγή) και αρουραίου αντι-ποντικού Ki-67 (Dako).

Ανοσοϊστοχημική και Στατιστικές αναλύσεις

ιστός μικροσυστοιχίες (TMAs) κατασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33] χρησιμοποιώντας το αυτοματοποιημένο arrayer (Beecher Instruments, Sun Prairie , WI USA). Για το β-κατενίνης και SIRT1 ανοσοϊστοχημεία, ανάκτηση αντιγόνου έγινε? τμήματα αποπαραφινωθείσες ιστού υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ένα φούρνο μικροκυμάτων για 15 λεπτά σε διάλυμα κιτρικού οξέος (BioGenex, San Ramon, CA) σε μια χύτρα ταχύτητας. Οι τομές ιστού επωάσθηκαν με 3% Η

2O

2 (15 λεπτά) για να εμποδίσει ενδογενούς υπεροξειδάσης, κατόπιν επωάστηκαν με 10% φυσιολογικό ορό κατσίκας (Vector Laboratories, Burlingame, CA) σε PBS (10 λεπτά), ακολουθούμενη από 10 λεπτά επώασης σε μπλοκ ελεύθερη πρωτεΐνη ορού (DAKO, Carpinteria, CA). Πρωτογενής αντίσωμα έναντι β-κατενίνης (κλώνος 14, BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ) (αραίωση 1:400) ή SIRT1 (# 1104? Epitomics) (αραίωση 1:100) εφαρμόστηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Δευτερεύον αντίσωμα (BioGenex) (20 λεπτά), και στη συνέχεια στρεπταβιδίνης υπεροξειδάσης (BioGenex) εφαρμόστηκαν (20 λεπτά). Οι τομές ορατές με διαμινοβενζιδίνη (DAB) (2 λεπτά) και μεθυλ-πράσινο επίχρωση. Πυρηνική έκφραση καταγράφηκε ως είτε χωρίς έκφραση, αδύναμη έκφραση, ή μέτρια /ισχυρή έκφραση. Θετικότητα στον πυρήνα ορίστηκε ως μέτρια /strong έκφρασης. Όλα τα β-κατενίνης-βάφονται ΤΜΑ πλάκες ερμηνεύεται από έναν παθολόγο (S. Ο) τυφλωμένος από οποιαδήποτε άλλα κλινικά και εργαστηριακά δεδομένα. Όλα SIRT1-βάφονται ΤΜΑ πλάκες ερμηνεύεται από έναν παθολόγο (Ρ.Ρ.) τυφλωμένος από οποιαδήποτε άλλα κλινικά και εργαστηριακά δεδομένα. Για τη στατιστική ανάλυση, chi-square test εκτελέστηκε για κατηγορικά δεδομένα χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα λογισμικού SAS (έκδοση 9.1, SAS Institute, Cary, NC). Η τιμή p ήταν δύο όψεων, και η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε στο p ≤ 0.05.

πλασμίδια

pcDNA3-FLAG-SIRT1, ρΒΑΒΕ-Puro-hSir2 (SIRT1), ρΒΑΒΕ-Puro -SIRT1

ΔHY, pcDNA-HA-S33Y-β-κατενίνης και ρΒΑΒΕ-Puro-S33Y- β-κατενίνης έχουν περιγραφεί προηγουμένως. SIRT1 RNAi πλασμίδια κατασκευάστηκαν με κλωνοποίηση των αλληλουχιών στο πλασμίδιο pSUPER.retro (oligoEngine, Seattle, WA). Ένα πλασμίδιο TOPFLASH αγοράστηκε από την Upstate Biotechnology (Lake Placid, ΝΥ), ενώ η δεύτερη δημιουργήθηκε με κλωνοποίηση sites και TA-υποκινητή από SUPER8xTOPFLASH (ευγενική δωρεά του Randall Σελήνη) στην λουσιφεράσης-PEST πλασμίδιο pGL4.15 δεσμεύει τον συνδυασμό TCF (Promega , Madison, WI).

οι επιμολύνσεις κυττάρων, Λοιμώξεις και Ανοσοκυτοχημεία

293Τ, LN-ΚΓΠ, DLD1, HCT116 και RKO κύτταρα διατηρούνται σε μέσα ενημέρωσης συνιστάται καλλιέργειας ιστού (American Type Culture Collection ( ATCC), Manassas, VA) και αναπτύχθηκαν σε υγροποιημένο επωαστήρα που περιέχει CO

2 (5% ν /ν) στους 37 ° C. Για υπερέκφραση πειράματα, τα πλασμίδια επιμολύνθηκαν με την μέθοδο Fugene 6 (Roche). Για σταθερή παραγωγή κυτταρικής γραμμής, τα κύτταρα DLD1 επιλέχθηκαν σε υγρομυκίνη για δύο εβδομάδες και απλές αποικίες επιλέχθηκαν και επεκτάθηκαν. Για ρετροϊική παραγωγή, κύτταρα 293Τ επιμολύνθηκαν με την υπερέκφραση ή πλασμίδια RNAi ταυτόχρονα με τη συσκευασία πλασμίδια gag-pol και VSV-G ή pCL-αμφο. Τα μέσα που περιέχουν τον ιό απόγονοι απελευθερώνεται για τα κύτταρα 293Τ συλλέχθηκε και χρησιμοποιήθηκε για να μολύνει τα κύτταρα για 3-6 ώρες υπό την παρουσία 8 μg /ml polybrene (Sigma Aldrich, St. Louis, ΜΟ). Το μέσο αλλάχθηκε και τα κύτταρα επωάστηκαν για επιπλέον επώαση 24-48 ωρών. Επιλέχθηκαν με πουρομυκίνη (Sigma Aldrich) για 24-48 ώρες και στη συνέχεια σε επεξεργασία με θρυψίνη και σπέρνονται για πειράματα.

Για ανοσοκυτταροχημεία, κύτταρα απλώθηκαν σε 8 mm έξι καλά Teflon τυπωμένες διαφάνειες (Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Sciences). Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την επίστρωση, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με επώαση με 4% παραφορμαλδεΰδη για 30 λεπτά. Σταθερή κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα σε SIRT1 (# 1104? Epitomics (αραίωση 1:100) και ενεργός β-κατενίνης (05-665? Chemicon) (αραίωση 1:100) για 2 ώρες που ακολουθείται από επώαση με δευτερογενή αντισώματα (Alexa Fluor 488 κατσίκας αντι-κουνελιού IgG και Alexa Fluor 568 αντι-ποντικού κατσίκας IgG?. Molecular Probes) (αραίωση 1:400) τα κύτταρα επωάστηκαν με 10 μg /ml Hoechst, πλένεται και τοποθετείται με μια καλυπτρίδα τουλάχιστον 20 κύτταρα βαθμολογήθηκαν. ανά πείραμα και λήψη εικόνας διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο Olympus BX50.

Protein Εκχύλιση και Ανοσοκαταβύθιση

κυττάρων εκχυλίσματα αναλύονται απευθείας με κηλίδωση Western παρασκευάστηκαν με λύση των κυττάρων σε 1 × SDS ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης που ακολουθείται από βρασμό και τα εκχυλίσματα ανάλυση Western. κυττάρων για ανοσοκαταβύθιση παρασκευάστηκαν με επανααιώρηση ρυθμισμένο με φωσφορικό σφαιρίδια κυττάρου αλατούχο-πλύθηκαν σε 1 ml Nonidet Ρ-40 (ΝΡ-40) ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης (50 mM Tris-HCI [ρΗ 8,0], 150 mM NaCl, και 1% Nonidet Ρ-40) συμπληρωμένο με EDTA-free δισκία κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche) με 10 mM νικοτιναμιδίου (ΝΑΑ) και 5 μΜ Τριχοστατίνη Α (TSA). Μετά την επώαση σε πάγο για 30 λεπτά, μη-εκχυλίσιμο υλικό απομακρύνθηκε με φυγοκέντρηση στα 17.000

g

για 10 λεπτά στους 4 ° C, και τα υπερκείμενα εκκαθαρίζονται χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοκαθίζηση. Κυτταρολύματα ανοσοκατακρημνίστηκαν (2 ώρες), πλένεται 4 φορές με ΝΡ-40 ρυθμιστικό διάλυμα και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με κηλίδωση Western.

Δοκιμασίες Πολλαπλασιασμού

κυτταρικές γραμμές DLD1, HCT116 και RKO μολυνθεί με τον κατάλληλο κατασκεύασμα ήταν σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε πυκνότητα 10.000 κυττάρων.