Αφηρημένο

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια από τις πιο φρικτές καρκίνους με μια απαισιόδοξη πρόγνωση. Παρά τις πολλές θεραπείες, δεν έχει υπάρξει καμία βελτίωση των ποσοστών επιβίωσης. Σε αυτή τη μελέτη, αξιολογήσαμε τις αντικαρκινικές επιδράσεις του καμπφερόλη, γνωστό φλαβονοειδών που έχουν λειτουργικές βιο-δραστικότητα έναντι διαφόρων κακοηθών όγκων. Kaempferol είχε αντικαρκινικές επιδράσεις επί MIAPaCa-2, Panc-1 και SNU-213 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος. Σε μια δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, kaempferol μειωμένη βιωσιμότητα αυτών παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα με την αύξηση της απόπτωσης. Ειδικότερα, kaempferol ανέστειλε αποτελεσματικά τη μεταναστευτική δραστηριότητα των ανθρώπινων παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων σε σχετικά χαμηλές δόσεις, χωρίς καμία τοξικότητα. Η αντικαρκινική δράση του kaempferol επιτεύχθηκε με τη μεσολάβηση της αναστολής των συγγενικών EGFR Src, ERK1 /2, και τις οδούς ΑΚΤ. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι συλλογικά καμπφερόλη, ένα φυτοχημικό συστατικό αναφερθεί ότι έχουν αντι-βιωσιμότητα και αντιοξειδωτικές ιδιότητες, μπορεί να δράσει ως ένα αντιδραστήριο ασφάλεια αντι-μετανάστευσης σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος, τα οποία παρέχουν την λογική για περαιτέρω διερεύνηση του kaempferol ως ισχυρό υποψήφιο για την πιθανή κλινική δοκιμή των κακοήθων καρκίνων του παγκρέατος

Παράθεση:. Lee J, Kim JH (2016) Kaempferol Αναστέλλει καρκίνο του παγκρέατος ανάπτυξη των κυττάρων και τη μετανάστευση μέσω του αποκλεισμού της EGFR-Σχετικές Διαδρομή

In Vitro

. PLoS ONE 11 (5): e0155264. doi: 10.1371 /journal.pone.0155264

Επιμέλεια: Aldo Scarpa, το Πανεπιστήμιο της Βερόνα, Ιταλία

Ελήφθη: 3η Φεβρουαρίου του 2016? Αποδεκτές: 26, Απρίλη, 2016? Δημοσιεύθηκε: 13 Μαΐου, 2016

Copyright: © 2016 Lee, Kim. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:.. η έρευνα υποστηρίχθηκε από το Πρόγραμμα βασική επιστημονική έρευνα, μέσω του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών της Κορέας (NRF), που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας (2009 – 0.094.059)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια θανατηφόρα ασθένεια. Το ποσοστό επιβίωσης 5-χρόνια των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος είναι κάτω του 1% [1]. Ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά του καρκίνου του παγκρέατος είναι η έγκαιρη διάδοση και την εξέλιξη των τοπικών όγκων. Αυτά τα χαρακτηριστικά να προκαλέσει σοβαρές επιπλοκές σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος. Ως εκ τούτου, οι περισσότεροι ασθενείς έχουν πρόωρο θάνατο [2]. Η μεταστατική τάση των καρκινικών κυττάρων είναι ένα σημαντικό εμπόδιο στη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος. Ωστόσο, οι ερευνητές δεν έχουν να διευκρινίσει πώς κακοήθη καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος μεταναστεύουν από τόπο πρωτογενούς όγκου σε ένα μακρινό όργανο [3]. Επιπλέον, με τις σήμερα διαθέσιμα αντικαρκινικά φάρμακα και ακτινοθεραπείας έχουν ασήμαντος αντίκτυπο στην πλειονότητα των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος. Ως εκ τούτου, εκτεταμένες μελέτες πρέπει να διεξάγονται για να διερευνήσει τις μοριακών μηχανισμών που ευθύνονται για αυτά τα χαρακτηριστικά και να αναπτύξουν πρόσθετες στρατηγικές για τη βελτίωση των αποτελεσμάτων της θεραπείας σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος.

Τα φλαβονοειδή είναι πολυφαινολικές ενώσεις που είναι σε αφθονία βρίσκονται σε διάφορα φυτά [4 ]. Παρέχουν διάφορα οφέλη για την υγεία που οφείλονται σε αντι-οξειδωτικό και αντι-φλεγμονή δραστηριότητές τους. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι τα φλαβονοειδή αναστέλλουν διάφορα στάδια του καρκίνου, όπως ο πολλαπλασιασμός και η αγγειογένεση [5]. Ειδικότερα, καμπφερόλη, ένα πολύ γνωστό φλαβονοειδών, έχει αξιόλογη βιο-δραστικότητα έναντι διαφόρων κακοηθών όγκων. Kaempferol βρίσκεται σε αφθονία στο τσάι, τα μήλα, τις φράουλες, τα φασόλια, και τα εσπεριδοειδή [6]. Kaempferol ρυθμίζει διάφορα χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων, όπως απόπτωση [7-9], του κυτταρικού κύκλου [10,11], και φλεγμονή [12,13]. Επιπλέον, kaempferol αναστέλλει επίσης την μετανάστευση και την εισβολή δραστηριότητα του μυελοβλαστώματος και του μαστού καρκινικά κύτταρα [14,15]. Αλλά «αντί-μεταναστευτική επίδραση της επί καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος είναι άγνωστος.

υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) είναι μία κινάση τυροσίνης υποδοχέα που είναι ιδιαίτερα ενεργοποιείται όταν αλληλεπιδρούν μεταξύ EGFR και παράγοντες ανάπτυξης του EGF-οικογένεια. Αρκετοί μηχανισμοί οδηγούν στην ανώμαλη ενεργοποίηση του EGFR παρατηρήθηκε σε διάφορους καρκίνους,

i

.

e

., EGFR υπερ-έκφραση, η μετάλλαξη και ανεξάρτητη διέγερση συνδετήρα-υποδοχέα. EGFR είναι ο αντιπρόσωπος υποδοχέας υποκείμενο διαφόρων φαινοτύπων όγκου, όπως πολλαπλασιασμό, αντι-αποπτωτικό πλεονέκτημα, μετανάστευση, και εισβολή σε κακοήθεις όγκους, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων του παγκρέατος [16-19]. Προς τα πάνω ρυθμισμένη EGFR βρίσκεται επίσης σε όγκους του παγκρέατος καρκίνο, η οποία συσχετίζεται με μία μελαγχολική πρόγνωση [20].

Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε τη φύση του αντίκτυπου αντικαρκινικών kaempferol για τα ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές μέσω του αποκλεισμού της EGFR που σχετίζονται με ενδοκυτταρική σηματοδότηση. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι kaempferol μπορεί να είναι μια ασφαλής αναστολέας εναντίον κακοήθων καρκίνων του παγκρέατος.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικής καλλιέργειας και αντιδραστηρίων

ΜΙΑΡΑΟΑ-2, Panc-1, και SNU -213 ανθρώπινη παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την κορεατική κυτταρική Γραμμή Τράπεζα (KCLB, Σεούλ, Κορέα). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν είτε σε DMEM (MIAPaCa-2 και Panc-1) ή RPMI-1640 (SNU-213) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA), 1 × 10

5 μονάδα /Ι πενικιλλίνη, and100 mg /L στρεπτομυκίνη (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) στους 37 ° C. Η κυτταρική καλλιέργεια επωάστηκε σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]

. Ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVECs) αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassa, VA, USA). HUVECs αναπτύχθηκαν σε EGM-2 μέσο Bulletkit (Lonza Biologics, Hopkinton, ΜΑ) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO2. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση HUVECs εντός 3-6 περάσματα. αναστολέας του EGFR (Gefitinib) και τηγάνι αναστολέα της κασπάσης (Ζ-VAD-FMK): αυτοί οι αναστολείς αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Τα αντισώματα για φωσφο-EGFR (Tyr1068), EGFR, φωσφο-Src (Tyr416), Src, φωσφο-ΑΚΤ (Ser473), ΑΚΤ, φωσφο-εξωκυτταρικό σήμα κινάση ρυθμιζόμενη (ERK) 1/2 (Thr202 /Tyr204), ΕΚΚ , πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων πυρηνικό αντιγόνο (PCNA), και αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ, USA). Kampferol, kampferol-3-Ο-γλυκοζίτη, και kampferol-4′-Ο-γλυκοζίτη (Σχήμα 1) αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA).

Η

Μέτρηση κυτταρικής βιωσιμότητας

κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα WST-1 λύση: 2- (4-ιωδοφαινυλ) -3- (4-νιτροφαινυλ) -5- (2,4-δισουλφοφαινυλ) διάλυμα -2Η-τετραζόλιο ( Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany). Σε αυτή τη δοκιμασία, MIAPaCa-2, Panc-1 και SNU-213 κύτταρα (5 × 10

3 /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων (Nunc, Roskilde, Denmark). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας για 24 ώρες. Κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου, που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με διάφορες δόσεις του kaempferol. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για επιπλέον 72 ώρες. Δέκα μικρόλιτρα διαλύματος WST-1 προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Μετά από μια 10-λεπτών επώαση σε θερμοκρασία δωματίου, η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλάκας (Bio-Rad, Richmond, CA, USA).

δοκιμασία Μετανάστευση

δοκιμασίες κυτταρικής μετανάστευσης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας Transwell Permeable υποστηρίζει (Corning Costar, Lowell, ΜΑ) που έχουν μέγεθος πόρων 8,0 μm. πολυανθρακικά φίλτρα είχαν προ-επικαλυμμένη με ινονεκτίνη (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) με τη χρήση ενός μέσου που περιέχει 10 mg /L του αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό? η διαδικασία προ-επικάλυψης διεξήχθη για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η κάτω θάλαμος γέμισε με 500 μΙ RPMI-1640 που περιέχει 10% ορό. Μετά από υποβολή των κυττάρων σε ένα 15 ώρες ασιτία σε ελεύθερη RPMI-1640 ορού, εμείς ανέστειλε τα κύτταρα (5 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) σε 100 μΙ μέσου χωρίς ορό και φορτώνονται σε κάθε άνω θαλάμου. Μετά τη διατήρηση αυτών των κυττάρων στο προαναφερθέν μέσον για 6 ώρες στους 37 ° C, αφαιρέσαμε τα κύτταρα επί της άνω επιφάνειας του φίλτρου χρησιμοποιώντας ένα μάκτρο βάμβακος. Στη συνέχεια, σταθεροποιήθηκαν και υπέστησαν χρώση των φίλτρων χρησιμοποιώντας 1% διάλυμα κρυσταλλικού ιώδους. Το εκλουσμένο χρωστική μετρήθηκε στα 560 nm με συσκευή ανάγνωσης ELISA (Bio-Rad).

δοκιμασία Invasion

δοκιμασίες Invasion διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας αυξητικού παράγοντα-ελαττωμένη Matrigel (BD Biosciences, San Diego, CA , USA) με επικάλυψη σε 24 Transwell πλάκες σύμφωνα με το πρωτόκολλο του προμηθευτή. Τα κύτταρα που εφαρμόζεται στην επάνω θάλαμος περιέχει RPMI χωρίς ορό για 20 ώρες, και τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει στην πίσω πλευρά του φίλτρου μετά χρωματίστηκαν 24 ώρες. Η έκλουση χρωστικής μετρήθηκε στα 560 nm σε μια συσκευή ανάγνωσης ELISA.

Kaempferol επιλογή στόχου

Για την επιλογή των στόχων της καμπφερόλη, χρησιμοποιήσαμε την παραδοσιακή κινεζική ιατρική συστημάτων βάσεων δεδομένων φαρμακολογίας και ανάλυση πλατφόρμα (TCMSP) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22].

Western ανάλυση κηλίδος

Για την αξιολόγηση της διαδικασίας phosphoylation σε διάφορα μόρια, κηλίδωση Western διεξήχθη όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [23]. Σε αυτή τη μέθοδο, υποβάλλαμε σε αγωγή καλλιεργήθηκαν MIAPaCa-2 και Panc-1 κύτταρα με kaempferol για υποδεικνυόμενο σταθερό αριθμό φορών. Στη συνέχεια πλύναμε τα κύτταρα αυτά με προ-ψύξη αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS). Για προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου, τα κύτταρα λύθηκαν σε Μ-PER ρυθμιστικού λύσης (Thermo Scientific, Βοηη, Germany) που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης και φωσφατάσης. Η συνολική ποσότητα της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με την BCA μέθοδο ποσοτικοποίησης (Bio-Rad). Τα κυτταρολύματα διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Amersham Bioscience, Buckinghamshire, UK). Αυτές οι μεμβράνες αποκλείστηκαν χρησιμοποιώντας 5% αλβουμίνη βόειου ορού και 2% Tween σε Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα. Αραιώσαμε τα αντισώματα ειδικά για φωσφο-EGFR (Tyr1068), EGFR, φωσφο-Src (Tyr416), Src, φωσφο-ΑΚΤ (Ser473), ΑΚΤ, φωσφο-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), ΕΚΚ, και GAPDH σε ένα ρυθμιστικό αποκλεισμού σε αναλογία 1: 1000. Στη συνέχεια, επωάσαμε αυτά τα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Για την οπτικοποίηση λωρίδες σε ένα φιλμ ακτίνων Χ, χρησιμοποιήσαμε υπεροξειδάση αρμορακίας συζευγμένη με γαϊδάρου αντι-κουνελιού ή δευτερεύον αντίσωμα αντι-ποντικού γαϊδάρου (Santa Cruz, CA, USA) μαζί με αντιδραστήριο ανίχνευσης στυπώματος Western (Intron, Σεούλ, Κορέα). Οι ζώνες μετρήθηκαν με ανάλυση πυκνομετρίας που πραγματοποιήθηκε με τη χρήση λογισμικού ανάλυσης ImageJ.

Στατιστικές αναλύσεις

Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD). Του σπουδαστή

t-test

χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστούν τα επίπεδα του σημασία, τα οποία στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση δύο ανεξάρτητα δείγματα. Οι ομάδες συγκρίθηκαν με μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA). Σε αυτήν την περίπτωση, κατά Tukey

post-hoc

δοκιμή εφαρμόστηκε σε σημαντικές κύριες επιδράσεις (SPSS 12.0K για τα Windows? SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Αποτελέσματα

Kaempferol αναστέλλει την ανθρώπινη βιωσιμότητα παγκρεατικού κυττάρου μέσω της οδού της απόπτωσης

Kaempferol σε περίπου 10 μΜ προκαλεί σημαντική επίδραση κατά της βιωσιμότητας σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα μέσω της απόπτωσης [9]. Για να εξακριβωθεί η αντικαρκινική επίδραση του καμπφερόλη και τα παράγωγά της, MIAPaCa-2, Panc-1 και SNU-213 παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα επωάστηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις του καμπφερόλη, kaempferol-3-Ο-γλυκοζίτη, και kaempferol-4′ O-γλυκοζίτη (0, 10, 25, και 50 μΜ). Σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου που υποβλήθηκαν σε αγωγή με PBS, 50 μΜ kaempferol ανασταλεί ειδικά η βιωσιμότητα των κυττάρων κατά 40% περίπου σε κύτταρα MIAPaCa-2, 15% σε κύτταρα Panc-1, και 10% σε SNU-213 κύτταρα. Σε αντίθεση, kaempferol-3-Ο γλυκοζίτης και kaempferol-4′-O γλυκοζίτη δεν είχε καμία ανασταλτική επίδραση επί MIAPaCa-2, Panc-1 και κύτταρα SNU-213 υπό τις ίδιες συνθήκες (S1 Σχήμα).

Για να διερευνηθεί περαιτέρω το ειδικό αντικαρκινικό αποτέλεσμα των καμπφερόλη, MIAPaCa-2, Panc-1 και SNU-213 κύτταρα επωάστηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις καμπφερόλη (0, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 10, 100, και 200 ​​μΜ). Η έκθεση σε kaempferol προκαλείται καμία σημαντική αλλαγή στην βιωσιμότητα των κυττάρων υπό την προϋπόθεση ότι ήταν παρούσα σε σχετικά χαμηλές δόσεις: έως 0,5 μΜ σε MIAPaCa-2, έως 1 μΜ σε Panc-1, και μέχρι 10 μΜ σε SNU-213 κύτταρα. Ωστόσο, υψηλότερες δόσεις του kaempferol είχε σημαντική ανασταλτική επίδραση στην βιωσιμότητα των κυττάρων. Σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου που υποβλήθηκαν σε αγωγή με PBS, 200 μΜ kaempferol ανέστειλε την κυτταρική βιωσιμότητα κατά 70% περίπου σε κύτταρα MIAPaCa-2, 45% σε Panc-1 κύτταρα, και 50% στις SNU-213 κύτταρα (σχήμα 2Α, 2Β και 2C).

(AC) MIAPaCa-2, Panc-1 και SNU-213 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος επωάστηκαν με διάφορες δόσεις kaempferol για 72 ώρες. Η βιωσιμότητα μετρήθηκε με WST-1 δοκιμασία (Data αντιπροσωπεύουν το ποσοστό ± SD και είναι αντιπροσωπευτικά των τριών ξεχωριστών πειραμάτων, *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt? 0,01, * **

σ

& lt? 0.001). κύτταρα (D) MIAPaCa-2 επωάστηκαν είτε με την απουσία ή παρουσία καμπφερόλη (0, 0,1, και 10 μΜ) και /ή Ζ-VAD (1 μΜ) για 72 ώρες. Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε Ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως με τη χρήση αντισωμάτων έναντι συνολικού κασπάσης-3, διασπασμένη κασπάση-3-και GAPDH. κύτταρα (Ε) Panc-1 επωάστηκαν με διαφορετικές δόσεις του καμπφερόλη (0, 10, και 100 μΜ) για 72 ώρες. Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε Ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως με τη χρήση αντισωμάτων έναντι PCNA, σύνολο κασπάση 3, διασπασμένη κασπάση-3-και GAPDH.

Η

Για να εξακριβωθεί η επίδραση αντι-βιωσιμότητα των καμπφερόλη, ερευνήσαμε περαιτέρω το κασπάσης -3-μεσολαβούμενη απόπτωση σε MIAPaCa-2 καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος που ήταν πιο ευαίσθητα στην θεραπεία kaempferol. Αρχικά πιστοποιηθεί ότι 10 μΜ kaempferol σημαντικά μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων, η οποία ήταν σημαντικά καταστέλλεται με προ-επεξεργασία του αναστολέα παν-κασπάσης, z-VAD (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, kaempferol επαγόμενη τη διάσπαση της κασπάσης-3, η οποία καταστέλλεται αποτελεσματικά όταν τα κύτταρα MIAPaCa-2 προ-επεξεργασία με ένα z-VAD (Σχήμα 2D). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε 100 μΜ kaempferol αγωγή Panc-1 και SNU-213 κύτταρα (Σχ 2Ε και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η αφθονία των PCNA επίσης μειώθηκε κατά τη διάρκεια της απόπτωσης, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [24]

Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι kaempferol μπορεί να αναστείλει αποτελεσματικά την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος με την προϋπόθεση ότι χορηγείται σε κατάλληλες δόσεις.? επάγει

in vitro

απόπτωση των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος.

Kaempferol αναστέλλει τη μετανάστευση των ανθρώπινων παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων, ακόμη και σε χαμηλές δόσεις

Για να επαληθεύσετε περαιτέρω την αντικαρκινική δράση των kaempferol , ερευνήσαμε την ανασταλτική δράση της kaempferol σχετικά με τη μετανάστευση MIAPaCa-2, Panc-1 και SNU-213 κύτταρα. Σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με PBS, μετανάστευση κυττάρων MIAPaCa-2 στον ορό που προκαλείται μειώθηκε μέχρι περίπου 30%, μετά την επεξεργασία με 1 μΜ kaempferol (Σχήμα 3Α). Μετά την επεξεργασία με 1 μΜ kaempferol κάτω από τις ίδιες συνθήκες, η μετανάστευση των Panc-1 και SNU-213 κύτταρα αναστέλλεται μέχρι περίπου 20% και 30%, αντίστοιχα (Σχ 3Β και 3C). Η θεραπεία με 1 μΜ έως kaempferol-3-Ο-γλυκοζίτη και kaempferol-4′-Ο-γλυκοζίτη δεν είχε επιπτώσεις σχετικά με τη μετανάστευση MIAPaCa-2, Panc-1 και SNU-213 κύτταρα (S2 Εικ). Στη συνέχεια, μελετήθηκε η βασική τοξικότητα του kaempferol χρησιμοποιώντας HUVECs ως αντιπροσωπευτικά φυσιολογικά κύτταρα. θεραπεία Kaempferol (0, 0.005, 0.01, 0.2, 0.5, και 1 μΜ) δεν επηρέασε τη μετανάστευση και τη βιωσιμότητα των HUVECs (Σχ 3D και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, αξιολογήσαμε επεμβατική δραστηριότητες μετά την δοσο-εξαρτώμενη επεξεργασία των kaempferol σε MIAPaCa-2, Panc-1 και SNU-213 κύτταρα. Σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με PBS, εισβολή MIAPaCa-2 στον ορό που προκαλείται από, Panc-1 και SNU-213 κύτταρα ανεστάλη μέχρι το 40%, 30% και 40%, αντίστοιχα, μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ kaempferol (Σχήμα 3Ε, 3F και 3G). Σχήμα 3Η δείχνει τις αντιπροσωπευτικές εικόνες των αντι-εισβολής που παράγεται με κατεργασία kaempferol 1 μΜ. Kaempferol ανέστειλε ειδικά την μετανάστευση ορό που προκαλείται και εισβολή ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος σε σχετικά χαμηλή δοσολογία χωρίς καμία τοξικότητα.

(AD) MIAPaCa-2, Panc-1, SNU-213 κύτταρα, και HUVECs επωάζονται με μεταβαλλόμενες δόσεις kaempferol για 6 ώρες. Οι δραστηριότητες της μετανάστευσης αξιολογήθηκαν με τη χρήση της δοκιμασίας transwell-μετανάστευσης (Data αντιπροσωπεύουν το ποσοστό ± SD και είναι αντιπροσωπευτικά των τριών ξεχωριστών πειραμάτων, ns σημαίνει μη σημαντικό, *

σ

& lt? 0,05, **

p

& lt? 0,01, ***

σ

& lt? 0.001). (Ε-G) MIAPaCa-2, Panc-1 και SNU-213 κύτταρα επωάστηκαν με κυμαινόμενες δόσεις kaempferol για 20 ώρες. Οι επεμβατικές δραστηριότητες αξιολογήθηκαν με τη χρήση της δοκιμασίας προσδιορισμού Transwell-εισβολή (δεδομένα αντιπροσωπεύουν το ποσοστό ± SD και είναι αντιπροσωπευτικά των τριών ξεχωριστών πειραμάτων, *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt? 0,01, ***

σ

& lt? 0.001). (Η) αντιπροσωπευτική εικόνα της δοκιμασίας εισβολής Trans-καλά (γραμμή κλίμακας = 50 μm).

Η

Kaempferol έχει αντικαρκινικές επιδράσεις μέσω του EGFR σχετίζονται μονοπάτι σηματοδότησης σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος

Διάφορα στόχοι θα μπορούσαν να προϋπέθετε, σύμφωνα με τις χημικές ουσίες από τα φυτικά φάρμακα που χρησιμοποιούν τη δημόσια βάση δεδομένων TCMSP [22]. Έχουμε επιλέξει 24 του παγκρέατος στόχους των καρκινικών κυττάρων του kaempferol χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων TCMSP? περιελάμβαναν έξι υποδοχείς συμπεριλαμβανομένων των υποδοχέων του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), 16 κινάσες, και δύο αταξινόμητη-πρωτεΐνες (Σχήμα 4Α και 4Β).

Είκοσι τέσσερις πιθανούς στόχους χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων TCMSP υποδιαιρέθηκαν σε υποδοχέα (Α) και κινάσες /αταξινόμητη-πρωτεΐνης (Β), όπως οι λειτουργίες τους.

η

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι EGFR σχετίζονται μονοπάτι σηματοδότησης είναι ζωτικής σημασίας για τα μεταναστευτικά δραστηριότητα των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος [25]. Επιπλέον, ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) σηματοδοτώντας οδούς είναι επίσης κρίσιμη για τη μετανάστευση και την εισβολή σε διάφορα καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων του παγκρέατος [25-27]. Ειδικά, kaempferol επάγει απόπτωση σε δύο κυτταρικές σειρές λευχαιμίας μέσω της οδού ΡΙ3Κ /ΑΚΤ [28]. Ως εκ τούτου, να κατανοήσουν την μεταναστευτικά μονοπάτια αναστολή της θεραπείας kaempferol σηματοδότησης σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος, εξετάσαμε το επίπεδο phosphoylation του EGFR, Src, ΑΚΤ, και ERK1 /2 μετά από την υποβολή παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα να εξαρτώμενη από το χρόνο θεραπείες kaempferol. Θεραπεία της καμπφερόλη, το οποίο χορηγήθηκε εξωγενώς σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, μειώθηκαν σημαντικά τα επίπεδα phosphoylation του EGFR, Src, ΑΚΤ, και ERK1 /2 σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο σε MIAPaCa-2 και τα κύτταρα Panc-1 (Σχήμα 5Α). Επιπλέον, αναστολή του EGFR μονοπάτι σηματοδότησης με χρήση φαρμακολογικών αναστολέα, gefinitib καταστέλλεται Src, ΑΚΤ, και ERK1 /2 phosphoylation σε ένα εξαρτώμενο από την δόση τρόπο με τον Panc-1 κύτταρα (Σχήμα 5Β). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν επίσης από κύτταρα MIAPaCa-2 (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επαληθεύσαμε περαιτέρω την εμπλοκή μονοπατιού EGFR σε τροποποίηση της μεταγωγής σήματος μέσω επεξεργασίας kaempferol. Δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε επεξεργασία με καμπφερόλη (0, 0.2, 0.5, και 1 μΜ) ανέστειλε σημαντικά τη μετανάστευση των MIAPaCa-2, Panc-1 και SNU-213 κύτταρα, τα οποία ήταν αποτελεσματικά καταστέλλεται με προ-επεξεργασία του υπο-θανατηφόρος δόση του gefitinib (0,01 μΜ) σε MIAPaCa-2, Panc-1 και SNU-213 κύτταρα, αντίστοιχα (Σχήμα 5C, 5D και 5Ε). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι kaempferol ειδικώς αναστέλλει την μετανάστευση ορού που προκαλείται μέσω της παρεμπόδισης των σχετίζονται EGFR οδού σηματοδότησης.

(Α) MIAPaCa-2 και τα κύτταρα Panc-1 επωάστηκαν με kaempferol (1 μΜ) για διαφορετικές χρονικές περιόδους , και τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western χρησιμοποιώντας αντισώματα ειδικά για φωσφο-EGFR (Tyr1068), EGFR, φωσφο-Src (Tyr416), Src, φωσφο-ΑΚΤ (Ser473), ολική Akt, φωσφο-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), ολική ΕΚΚ, και GAPDH. Σχετικές εντάσεις pixel για ρ-EGFR, ρ-Src, ρ-ΑΚΤ, και ρ-ERK1 /2 μετρήθηκαν με p-EGFR /EGFR, ρ-Src /Src, ρ-ΑΚΤ /ΑΚΤ, και ρ-ERK1 /2 /ERK2 χρησιμοποιώντας Image J λογισμικού. (Β) κύτταρα Panc-1 επωάστηκαν με διαφορετικές δόσεις του gefitinib για 60 λεπτά, και τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western χρησιμοποιώντας αντισώματα ειδικά για φωσφο-EGFR (Tyr1068), EGFR, φωσφο-Src (Tyr416), Src, φωσφο-ΑΚΤ (Ser473), η συνολική ΑΚΤ, φωσφο-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), ολική ΕΚΚ, και GAPDH. Σχετικές εντάσεις pixel για ρ-EGFR, ρ-Src, ρ-ΑΚΤ, και ρ-ERK1 /2 μετρήθηκαν με p-EGFR /EGFR, ρ-Src /Src, ρ-ΑΚΤ /ΑΚΤ, και ρ-ERK1 /2 /ERK2 χρησιμοποιώντας Image J λογισμικού. (C-D) MIAPaCa-2, Panc-1 και SNU-213 κύτταρα επωάστηκαν απουσία ή παρουσία του gefitinib (0.01 μΜ) για 1 ώρα, και περαιτέρω κατεργασία με διάφορες δόσεις kaempferol για 6 ώρες. Οι δραστηριότητες της μετανάστευσης αξιολογήθηκαν με τη χρήση της δοκιμασίας Transwell-μετανάστευσης (

σ

-τιμή από

t

test του Student και είναι αντιπροσωπευτικά των τριών ξεχωριστών πειραμάτων, αστερίσκοι δείχνουν μία σημαντική διαφορά σε σύγκριση με την απουσία και την παρουσία gefitinib *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt?. 0.01)

η

Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν σαφώς ότι kaempferol αναστέλλει αποτελεσματικά την μεταναστευτική δραστηριότητα από εμποδίζοντας την EGFR σχετίζονται Src, ΑΚΤ, και ERK1 /2 μονοπατιού σηματοδότησης σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος (Σχήμα 6).

η

Συζήτηση

σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι η μεταναστευτική δραστηριότητα ανθρώπινων παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα ανεστάλη σημαντικά ακόμη και σε σχετικά χαμηλές δοσολογίες της θεραπείας kaempferol. Έχουμε πιστοποιηθεί επίσης ότι αναστέλλει αποτελεσματικά kaempferol παγκρεατικού ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων μέσω της απόπτωσης

in vitro

με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, επιλέξαμε 24 στόχους της kaempferol χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων TCMSP, και διαπιστώθηκε ότι αντικαρκινικές επιδράσεις της θεραπείας kaempferol σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα που προκαλούνται από τον αποκλεισμό του EGFR σχετίζεται Src, ΑΚΤ, ERK1 /2 μονοπάτι σηματοδότησης.

Αν και οι ερευνητές έχουν αναπτύξει state-of-the-art εργαλεία διάγνωσης και ολοκληρωμένη στοχευμένες θεραπείες για την αναστολή του καρκίνου του παγκρέατος, το συνολικό ποσοστό επιβίωσης των ασθενών δεν έχει ακόμη βελτιωθεί [27,28]. Ένα από τα κρίσιμα χαρακτηριστικά του καρκίνου του παγκρέατος είναι επιθετικός μεταναστευτική δραστηριότητα, η οποία είναι υπεύθυνη για την ανάπτυξη του unrespectable, τοπικά προχωρημένο ή μεταστατικό καρκίνο του παγκρέατος [29]. Στην έκθεση αυτή, kaempferol είχαν σημαντικές αντι-μεταναστευτικά αποτέλεσμα σε καρκίνους του παγκρέατος.

Η αντικαρκινική δράση του kaempferol επί παγκρεατικού ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων μπορεί να οφείλεται σε αντι-οξείδωση και κυτταροτοξική δραστικότητα του [30,31]. Επιπλέον, kaempferol αναστέλλει τη δράση από τα ακόλουθα ένζυμα που συνδέονται με την ανάπτυξη των κυττάρων και οδού σηματοδότησης: οΑΜΡ-φωσφοδιεστεράσης, τυροσινικής κινάσης, το DNA τοποϊσομεράσης II, τοποϊσομεράσης Ι, και κινάση ελαφριά αλυσίδα μυοσίνης [32-34]. θεραπεία Kaempferol αναστέλλει επίσης τη σύνθεση λιπαρών οξέων (FAS) και την ανάπτυξη των κυττάρων, και επάγει την απόπτωση σε τόσο προστάτη και κύτταρα καρκίνου του μαστού. Αυτό δείχνει ότι η επαγωγή της απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα διαφόρων μπορεί να συνδέεται με την αναστολή της FAS [35,36]. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες, παρατηρήσαμε ότι kaempferol ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων, προκαλώντας την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων μέσω της μειωμένης PCNA και διασπασμένη κασπάση 3 μονοπάτι? αυτή η αναστολή των καρκινικών κυττάρων επιτεύχθηκε με χορήγηση kaempferol σε διαφορετικές δοσολογίες. Όμως, η ανασταλτική επίδραση μειώνεται όταν τα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε προ-θεραπεία του z-VAD-FMK. Zhang et al. ανέφεραν τη δραματική επίδραση του

Ginkgo biloba

εξαγάγετε kaempferol στην αναστολή της βιωσιμότητας σε χαμηλές συγκεντρώσεις [9]. Στη μελέτη μας, kaempferol έδειξε μέτρια αναστολή της βιωσιμότητας σε υπερβολικές δόσεις kaempferol σε ΜΙΑΡΑΟΑ-2 και Panc-1 κύτταρα. Οι διαφορές μεταξύ των μελετών μπορούν να αντανακλούν τις συνθήκες κυτταρικής γραμμής [37] ή διαφορετική πηγή kaempferol.

Η χημική δομή της φλαβονοειδών έχει συσχετιστεί με βιο-δραστηριότητα της [38-40]. Das et al. απέδειξε ότι βιο-δραστηριότητα επηρεάζεται από τη δομή των φλαβονοειδών στην εκλεπτυσμένη φοινικέλαιο. Φλαβονοειδών μόρια με μία ομάδα υδροξυλίου στο Α και Β δακτυλίους και τη θέση C3 είχε την τάση ισχυρών βιο-δραστηριότητα [41]. Σε συμφωνία, η πιο αποτελεσματική kaempferol έχει τις ισχυρές ομάδες πολυυδροξυλίου για Α, Β, και Γ δαχτυλίδια σε σύγκριση με kaempferol-3-Ο-γλυκοζίτη και να kaempferol-4′-Ο-γλυκοζίτη.

Kaempferol μπορεί να εμποδίσει την ανάπτυξη του μεταστατικού καρκίνου με αναστολή μήτρα δραστικότητα μεταλλοπρωτεϊνάσης-3 σε υψηλά διεισδυτική τον καρκίνο του μαστού κυτταρική γραμμή MDA-MB-231 [15]. θεραπεία Kaempferol επίσης ανέστειλε την μετανάστευση των κυττάρων MDA-MB-231 κύτταρα μέσω της παρεμπόδισης των ο-ΜΕΤ και ΑΚΤ μονοπάτια σηματοδότησης [14]. Ωστόσο, δεν υπάρχουν προηγούμενες αναφορές σχετικά με τις επιδράσεις της θεραπείας kaempferol σχετικά με τη μετανάστευση των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων. Αξιοσημείωτα, kaempferol έχει τη δυνατότητα να αναστέλλει αποτελεσματικά την μεταναστευτική δραστηριότητα των ανθρώπινων παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων χωρίς καμία τοξικότητα, ακόμη και σε σχετικά χαμηλές δόσεις. Επιπλέον, οι υψηλές δοσολογίες καμπφερόλη (10 και 100 μΜ) ανέστειλε σημαντικά περισσότερο τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος. Ωστόσο, η μέγιστη δοσολογίες επηρεάζεται επίσης σημαντικά HUVEC μετανάστευση.

Λόγω της αξιοσημείωτη ανάπτυξη της βιοπληροφορικής πεδία που σχετίζονται με καρκίνους, θα μπορούσαμε να επιλέξει 24 του παγκρέατος στόχους των καρκινικών κυττάρων του kaempferol [42]. Ειδικότερα, το γεγονός ότι υποδοχέα EGFR και αυξητικού παράγοντα ηπατοκυττάρων (HGFR) ήταν οι στόχοι σε καρκίνους του παγκρέατος να kaempferol ήταν πιο εμπνευσμένη. Είναι ενδιαφέρον, δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ καρκίνων του παγκρέατος και παράγωγα kampferol, kaempferol-3-Ο-γλυκοζίτη, και kaempferol-4′-Ο-γλυκοσίδιο στη βάση δεδομένων TCMSP. Θα μπορούσε να είναι η πιθανή αιτία της αναποτελεσματικά δραστηριοτήτων της kaempferol-3-Ο-γλυκοζίτη και kaempferol-4′-Ο-γλυκοσίδιο σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να κατανοήσουν το πρόστιμο μηχανισμό για τη διάκριση των καμπφερόλη και τα παράγωγά της .

EGFR και HGFR είναι αντιπροσωπευτικά κινάσες τυροσίνης υποδοχέα που είναι κρίσιμες αιτίες επιθετικά κακοήθων καρκίνων του παγκρέατος [17,43,44]. Εδώ, διαπιστώσαμε ότι η θεραπεία της kaempferol μειώνει αποτελεσματικά την phosphoylation του EGFR, Src, ΑΚΤ, και το /2 οδό ERK1. Gefinitib ανέστειλε επίσης την phosphoylation του EGFR, Src, ΑΚΤ, και ERK1 /2 μονοπατιού, και επιπλέον προεπεξεργασία των gefinitib μειωθεί η επίδραση της kaempferol σχετικά με τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος. Έτσι, επικύρωσε την πληροφορία από τη βάση δεδομένων TCMSP που EGFR θα μπορούσε να είναι ο στόχος των kaempferol σε καρκίνους του παγκρέατος. Επιπλέον, δεν μπορεί να αγνοηθεί η συσχέτιση μεταξύ HGFR και kaempferol. Ακριβής μελέτη του μηχανισμού θα πρέπει να διεξαχθεί για να κατανοήσουμε τις αντικαρκινικές επιδράσεις του kaempferol σε HGFR εκφράζονται καρκίνους του παγκρέατος.

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε δείξει ότι kaempferol θα μπορούσε να λειτουργήσει ως ισχυρός αναστολέας της παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα μεταναστευτικών φαινότυπο , που λειτουργεί μέσω του αποκλεισμού του που σχετίζονται με EGFR Src, ΑΚΤ, και ERK1 /2 σηματοδοτικό μονοπάτι. Ως εκ τούτου, kaempferol είναι ένα προστατευτικό και εύκολα διαθέσιμο αντιδραστήριο καρκίνο αντι-παγκρέατος που μπορεί να εμποδίσει την επιθετική ανάπτυξη και την ξέφρενη μεταναστευτική δραστηριότητα των καρκίνων του παγκρέατος.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. Ευαισθησίες του καμπφερόλη και τα παράγωγά της σε ανθρώπινα pancratic καρκινικά κύτταρα βιωσιμότητα.

MIAPaCa-2, Panc-1 και SNU-213 ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα επωάστηκαν σε διάφορες δόσεις καμπφερόλη και των παραγώγων του καμφερόλης-3-Ο-γλυκοζίτη και kaempferol-4′-Ο-γλυκοζίτη για 72 ώρες. Η βιωσιμότητα μετρήθηκε με WST-1 δοκιμασία (δεδομένα που αντιπροσωπεύουν το ποσοστό ± SD και είναι αντιπροσωπευτικά των τριών ξεχωριστών πειραμάτων, *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt? 0,01).

doi: 10.1371 /journal.pone.0155264.s001

(EPS)

S2 Εικ. Η επίδραση των διαφορετικών δόσεων του deriviates kaempferol σχετικά με τη μετανάστευση των ανθρώπινων παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων.

Κύτταρα (AC) MIAPaCa-2, Panc-1 και SNU-213 επωάστηκαν με διάφορες δόσεις kaempferol-3-Ο-γλυκοζίτη και kaempferol -4′-Ο-γλυκοζίτη για 6 ώρες. Οι δραστηριότητες της μετανάστευσης αξιολογήθηκαν με τη χρήση της δοκιμασίας Transwell-μετανάστευσης (δεδομένα αντιπροσωπεύουν το ποσοστό ± SD και είναι αντιπροσωπευτικά των τριών ξεχωριστών πειραμάτων, *

σ

& lt? 0,05)

doi:. 10.1371 /journal.pone. 0155264.s002

(EPS)

Ευχαριστίες

Αυτή η εργασία (επιχορηγήσεις αρ C0301723) υποστηρίχθηκε από τις επιχειρήσεις για την Ακαδημαϊκή-βιομηχανικές εγκαταστάσεις Συνεταιρισμός χρηματοδοτείται Κορέα Μικρών και Μεσαίων Επιχειρήσεων Διοίκηση το 2015.