Αφηρημένο

κερατίνη 23 (KRT23) εκφράζεται έντονα σε αδενοκαρκινώματα παχέος εντέρου, αλλά απουσιάζει από την κανονική βλεννογόνο του παχέος εντέρου. Array βασίζεται μεθυλίωση των χαρακτηριστικών των 40 δείγματα κόλου έδειξε ότι ο υποκινητής του KRT23 μεθυλιώθηκε σε φυσιολογικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου, ενώ μεθυλιωμένος εις τα περισσότερα αδενοκαρκινώματα. Υποστηρικτής μεθυλίωσης συσχετίζεται με απούσα έκφραση, ενώ αυξημένη έκφραση KRT23 σε δείγματα όγκων συσχετίστηκε με υπομεθυλίωση υποκινητή, όπως επιβεβαιώνεται από όξινο θειώδες αλληλουχίας. Απομεθυλίωση επαγόμενη έκφραση KRT23

in vitro.

Έκφραση των χαρακτηριστικών των shRNA μεσολάβηση σταθερά νοκ ντάουν KRT23 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου έδειξε ότι η εξάντληση KRT23 επηρεάζονται μόρια της αντιγραφής του κυτταρικού κύκλου και του DNA, ανασυνδυασμός και επιδιόρθωση.

In vitro

αναλύσεις επιβεβαίωσαν ότι η εξάντληση KRT23 μείωσε σημαντικά την κυτταρικό πολλαπλασιασμό των κυττάρων SW948 και LS1034 και σημαντικά μειωμένη την έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην απόκριση βλάβης του DNA, κυρίως μόρια του διπλού κλώνου επισκευή σπάσιμο μονοπάτι ομόλογο ανασυνδυασμό. KRT23 νοκ ντάουν μείωσε την απομαγνητοφώνηση και πρωτεΐνη έκφρασης των βασικών μορίων, όπως π.χ. MRE11A, E2F1, RAD51 και BRCA1. Εξόντωση KRT23 καθίστανται καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα πιο ευαίσθητα στην ακτινοβολία και μειωμένη πολλαπλασιασμό των KRT23 απεμπλουτισμένο κυττάρων σε σύγκριση με ακτινοβολημένα κύτταρα ελέγχου

Παράθεση:. Birkenkamp-Demtröder Κ, Hahn SA, Mansilla F, Thorsen Κ, Maghnouj Α, Christensen R, et al. (2013) Keratin23 (KRT23) Νοκ ντάουν μειώνει τον πολλαπλασιασμό και επηρεάζει την απόκριση σε καταστροφή του DNA των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (9): e73593. doi: 10.1371 /journal.pone.0073593

Επιμέλεια: Kerstin Borgmann, Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου του Αμβούργου-Eppendorf, Γερμανία

Ελήφθη: 20, Νοέμβρη του 2012? Αποδεκτές: 25 του Ιουλίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 9 Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Birkenkamp-Demtröder et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από τον Ιωάννη και Birthe Ίδρυμα Meyer, το Ίδρυμα Lundbeck, το Ίδρυμα της Novo Nordisk και το Συμβούλιο Έρευνας της Δανίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) αντιπροσωπεύει περίπου το 10% του συνόλου των περιπτώσεων καρκίνου παγκοσμίως με συνολικό πέντε χρόνια επιβίωσης της τάξης του 50% [1]. Η έγκαιρη διάγνωση και την καλύτερη αντιμετώπιση των CRC απαιτεί τον προσδιορισμό νέων βιοδεικτών, καθώς και γνώσεις σχετικά με τους μοριακούς μηχανισμούς του παχέος καρκινογένεσης.

Δύο μείζονος μοριακής υποομάδες του καρκίνου του παχέος εντέρου υπάρχουν, μικροδορυφόρων ασταθής (MSI) και μικροδορυφορικού σταθερή (MSS ) [2], όπου MSI όγκοι αντιπροσωπεύουν περίπου το 15% του συνολικού επίπτωση [3]. Μικροδορυφορικού ασταθή όγκοι παρουσιάζουν μεταλλάξεις ή επιγενετικές αλλοιώσεις στα γονίδια επιδιόρθωσης αναντιστοιχία που οδηγούν σε μεταβολές στην μικροδορυφορικού DNA (σύντομη επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες του DNA). Αύξηση στοιχεία δείχνουν ότι οι MSI όγκων που σχετίζονται με την καλύτερη πρόγνωση [4] και ότι οι ασθενείς με MSI δεν μπορούν να επωφεληθούν από φθοριοουρακίλη χημειοθεραπεία με βάση την επικουρική [5] [6].

Πολλά επιγενετικές ανωμαλίες έχουν περιγραφεί για CRC [ ,,,0],7]. Η παρεκκλίνουσα μεθυλίωση στο παχύ έντερο μπορεί να παρατηρηθεί ήδη στις αρχές προκαρκινικές αλλοιώσεις, καθώς και σε φυσιολογικά εμφανιζόμενο βλεννογόνο του όγκου γειτονικά. Επιγενετικές ενεργοποίησης γονιδίου βασίζονται σε απομεθυλίωση DNA ή υπομεθυλίωση της περιοχής προαγωγού εμπλέκεται στην έναρξη και την πρόοδο του καρκίνου του [7].

κεράτινες είναι το ενδιάμεσο νήμα που σχηματίζει πρωτεΐνες των επιθηλιακών κυττάρων. Σήμερα, οι 54 κεράτινες θηλαστικών είναι γνωστά, 28 τύπου Ι (όξινο) και 26 τύπου II (βασικό προς ουδέτερο) κεράτινες [8]. Αρκετές μελέτες έχουν δώσει στοιχεία για την ενεργό συμμετοχή σε κερατίνη πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, εισβολή και μετάσταση, καθώς και σε ανταπόκριση της θεραπείας. Επιπλέον, έχει προταθεί να διερευνήσει περαιτέρω το ρόλο της keratins ως πολυλειτουργικών ρυθμιστές των επιθηλιακών ογκογένεση [9].

κερατίνη 23 (

KRT23

) ανήκει στο όξινο τύπου keratins Ι [10] . Η μεταγραφή KRT23 βρέθηκε να είναι εξαιρετικά επάγεται στο ανθρώπινο παγκρεατικό καρκίνο κυτταρική γραμμή AsPC-1 κατά την αγωγή με έναν αναστολέα αποακετυλάσης ιστόνης (HDACi) [11]. Περαιτέρω, K23 ταυτοποιήθηκε ως σχετιζόμενου με τον όγκο αντιγόνου σε ορούς από ασθενείς με ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [12]. Σε προηγούμενες μελέτες, προσδιορίσαμε το μεταγράφημα KRT23 και πρωτεΐνη K23 να ρυθμίζεται προς τα πάνω έντονα αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου σε σύγκριση με την κανονική βλεννογόνο [13] [14]. Ούτε η μεταγραφή KRT23 ούτε η πρωτεΐνη Κ23 έχει δειχθεί ότι είναι ένας προγνωστικός δείκτης για τον καρκίνο του παχέος εντέρου? Ωστόσο, παρατηρήσαμε μια τάση που οι ασθενείς με στάδιο ΙΙ αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου με υψηλά επίπεδα μεταγραφής KRT23 φάνηκε να έχουν χαμηλότερο ποσοστό υποτροπής. Η φωσφοπρωτεΐνη K23 συσσωρεύεται στο Golgi της πλειοψηφίας των όγκων MSS, ενώ οι περισσότεροι από τους όγκους MSI έδειξε ελάσσονες κυτταροπλασματική έκφραση ή ήταν τελείως αρνητικά για έκφραση πρωτεΐνης Κ23 [14]. Η υπερέκφραση του KRT23 μείωσε την κυτταρική βιωσιμότητα των κυτταρικών γραμμών MSI ενώ δεν είχε καμία σημαντική λειτουργική επίδραση στις κυτταρικές σειρές MSS [14]. Υποστηρικτής ανάλυση δέσμευσης εντοπιστεί αρκετά γονίδια που συσχετίζεται με την έκφραση KRT23 σε αδενοκαρκινώματα. Πρόσφατα, η Smad4 επαγώγιμη πρωτεΐνη K23 ταυτίστηκε να αλληλεπιδρούν με κεράτινες Κ8 και Κ18, πρωτεΐνες θερμικού σοκ 60 και 70, plectin 1, καθώς και 14-3-3epsilon και γάμα [15], υποδηλώνοντας έναν σημαντικό ρόλο για K23 σε ρυθμιστικές διεργασίες . ρυθμιστικό ρόλο του μπορεί επίσης να υποστηρίζεται από πολύ πρόσφατα ευρήματα από Starman et al εντοπισμό KRT23 ως πιθανό βιοδείκτη για στεατοηπατίτιδα [16].

Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να προσδιορίσει ένα ρυθμιστικό μηχανισμό για την έκφραση KRT23. Επιπλέον, έχουμε ως στόχο τον εντοπισμό κατάντη γονίδια-στόχους και τις συναφείς οδούς κατά KRT23 νοκ ντάουν, να διευκρινιστεί η επίδραση της εξάντλησης KRT23 για τις μοριακές και κυτταρικές λειτουργίες των κυττάρων του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

επιγνώσει συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς και όλες οι μελέτες εγκρίθηκαν από την Κεντρική Δανία Περιοχή επιτροπές Ιατροβιολογικών Ερευνών Δεοντολογίας.

ολόκληρο το γονιδίωμα Ανάλυση μεθυλίωσης

το γονιδιακό DNA από σειριακή κρυοτομές εξήχθη χρησιμοποιώντας Puregene DNA κιτ καθαρισμού (Gentra Systems, Plymouth, ΜΝ). Όταν είναι απαραίτητο, βιοψίες όγκου μακροσκοπικά στολισμένα να εμπλουτίσουν το κλάσμα των νεοπλασματικών κυττάρων σε ένα ελάχιστο 60% πριν από την απομόνωση DNA. διάμεσο ποσοστό των καρκινικών κυττάρων ήταν 80%. Ένα μικρογραμμάριο DNA ήταν όξινο θειώδες τροποποιηθεί χρησιμοποιώντας EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen, Κοπεγχάγη, Δανία) χρησιμοποιώντας EZ-96 DNA μεθυλίωση D5004 (Zymo Research, Orange, CA) για μικροσυστοιχίες και όξινο θειώδες αλληλούχιση. Bisulfite τροποποιημένου DNA ήταν ολόκληρο το γονιδίωμα ενισχύεται και υβριδοποιήθηκε σε Infinium HumanMethylation27 BeadChips (Illumina, San Diego, CA) όλη τη νύχτα όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή. BeadChips σαρώθηκαν με ένα όργανο BeadXpress Reader (Illumina) και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Στεφάνη Studio Μεθυλίωση Software Module (Illumina) όπως περιγράφεται λεπτομερώς στο [17]. επίπεδα μεθυλίωσης δόθηκαν σε τιμές βήτα, με μια τιμή βήτα 0 αντιστοιχεί σε κανένα μεθυλίωση, και 1 αντιστοιχεί σε πλήρη μεθυλίωση. Για σύγκριση της κατάστασης της μεθυλίωσης έναντι δεδομένα έκφρασης, εντάσεις έκφραση log2 ελήφθησαν με προφίλ έκφρασης μικροσυστοιχιών των ίδιων δειγμάτων, τα δείγματα ομαλοποιήθηκαν με RMA και μεταγραφής εντάσεις log2 & lt? 5 θεωρήθηκαν ως «δεν εξέφρασε«

Bisulfite Sequencing.

Bisulfite τροποποιημένο DNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές που σχεδιάστηκαν με MethPrimer (https://www.urogene.org/methprimer/index1.html). Τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν επί πηκτής και κλωνοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ΤΟΡΟ ΤΑ Cloning Kit ® για αλληλούχιση (Invitrogen, Taastrup, Δανία). PCR ενίσχυση για αλληλούχιση διεξήχθη απευθείας στις αποικίες με Μ13 εκκινητές (DNA Technology, Risskov, Δανία) και TEMPase DNA πολυμεράσης (αμπλικονίου, Skovlunde, Δανία). Για κάθε γονίδιο, 10 κλώνοι επιλέχθηκαν τυχαία και αλληλουχήθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ αλληλούχισης BigDye κύκλου τερματιστή και 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA). Αναλυτικότερα, αναλύσαμε μία αλληλουχία η οποία περιλαμβάνει 253 bp επικαλύπτοντας το ξεκίνημα μεταγραφής (1) και το πρώτο εξόνιο KRT23. Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από δύο διαφορετικές ομάδες, 23 βιοψία όγκου δείγματα των ασθενών (4 φυσιολογικού βλεννογόνου, 3 αδενώματα, 5 MSI και 12 MSS) και τα κύτταρα ΑΖΑ κατεργασμένα κύτταρα HCT116 περιγράφεται ανωτέρω χρησιμοποιώντας το DNA Gentra Puregene Purification Kit (Qiagen). DNA ήταν όξινο θειώδες μετατρέπεται με τη χρήση της MethylEasy DNA τροποποίηση όξινου θειώδους Kit (Diagenode)

Το amplicon 253 bp KRT23 ενισχύθηκε με PCR με TEMPase Hot Start DNA πολυμεράσης (αμπλικονίου) χρησιμοποιώντας ένα μείγμα που περιέχει εκκινητές F1 (C):. 5 ‘ – GTGGTTTTCGTTTTTAGATTGTTT-3 ‘και F1 (Τ) 5′- GTGGTTTTTGTTTTTAGATTGTTT και R1:5′- TCAAAACCAAACAACCCTAACCTA-3’. Τα αμπλικόνια καθαρίστηκαν επί πηκτής (Gel 11Band Purification Kit? GE Healthcare) και υποκλωνοποιήθηκε στον φορέα pCR4-ΤΟΡΟ (Invitrogen) ήταν 12-16 κλώνοι από κάθε πείραμα αλληλουχήθηκαν χρησιμοποιώντας Μ13 προς τα εμπρός εναρκτήρες. Για την απεικόνιση της κατάστασης μεθυλίωσης, χρησιμοποιήσαμε το ακόλουθο λογισμικό:. https://quma.cdb.riken.jp/

Colon τηλέφωνα Γραμμές

Λαμβάνεται από το American Type Culture Collection (ATCC-LGC πρότυπα, Borås, Σουηδία) ή λαμβάνονται από το εργαστήριο Hahn εκ νέου έλεγχο ταυτότητας μέσω ανάλυσης STR [18] χρησιμοποιώντας το Cell-ID-σύστημα (G9500, Promega, Nacka, Σουηδία), τα προϊόντα αναλύθηκαν σε μια Εφαρμοσμένων-Biosystems3130 Γενετική Analyzer. Δεν μόλυνσης από μυκόπλασμα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ανίχνευση μυκόπλασμα ένθετη PCR-based. καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές σε αυτή τη μελέτη ήταν HCT116 (MSI), DLD1 (MSI), SW480 (MSS, ρ53 μεταλλαγμένη), SW948 (MSS, Dukes ‘τύπου C, βαθμού ΙΙΙ, ογκογόνο, p53 μεταλλαγμένα), LS1034 (MSS, Dukes C , μεταλλάξεις σε ρ53 (G245S), APC (E1309fs * 4) και KRAS (A146T). Η ανθρώπινη εμβρυϊκή νεφρική κυτταρική γραμμή ΗΕΚ293 που χρησιμοποιούνται για E2F1 υπερέκφραση επίσης εκ νέου έλεγχο ταυτότητας μέσω ανάλυσης STR.

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με απόξεση των φιάλες με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης 1 ml και το ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας GenElute θηλαστικών Ολικό RNA Miniprep Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, Cat RTN350) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και την ακεραιότητα του RNA εκτιμήθηκε με μια . Bioanalyzer (RIN & gt? = 9,9) RNA αναλύθηκε σε U133plus2.0 ή συστοιχίες ExonST1.0 (Affymetrix), ανάλυση σύγκριση διεξήχθη χρησιμοποιώντας το λογισμικό MAS5.0 Πιστόνια συνοδεύεται από μια κλήση Inc /Δεκ και αναλογία log2