Αφηρημένο

Δυσλειτουργία των σφιχτών συνδέσεων (TJS) συνδέεται συχνά με ανθρώπινες ασθένειες, συμπεριλαμβανομένων καρκινογένεση και τις πρόσφατες μελέτες υποστηρίζουν το ρόλο του αναπόσπαστο πρωτεΐνες TJ στη ρύθμιση της Επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ). Από την άποψη αυτή, η έκφραση της κλαουδίνης-1, ένα βασικό συστατικό του TJs, είναι ιδιαίτερα αυξημένες σε καρκίνο του παχέος εντέρου και αιτιολογικά σχετίζεται με την ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου. Ωστόσο, ο μηχανισμός /s υποκείμενη ρύθμιση του κλαουδίνης-1 έκφραση σε εντερικά επιθηλιακά κύτταρα παραμένει ελάχιστα κατανοητή. Στις μελέτες μας, έχουμε εντοπίσει υποθετικές θέσεις σύνδεσης για εντερικό παράγοντες μεταγραφής Cdx1, -2 και GATA4 στην 5′-πλευρική περιοχή του γονιδίου κλαουδίνης-1. περαιτέρω μελέτες μας με τη χρήση πλήρους μήκους ή /και μετάλλαξη παραλείψεως κατασκευάσματα σε δύο διαφορετικές ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου, SW480 και HCT116, έδειξε βασικό ρόλο των Cdx1, CDX2 και GATA4 στην ρύθμιση της έκφρασης του mRNA κλαουδίνης-1. Ωστόσο, η υπερέκφραση του CDX2 είχε την πιο ισχυρή επίδραση κατά κλαουδίνης-1 mRNA έκφραση και δραστικότητα προαγωγού. Επίσης, σε καρκίνο του παχέος εντέρου δείγματα ασθενών, παρατηρήσαμε μια σημαντική και παράλληλη συσχέτιση μεταξύ κλαουδίνης-1 και εκφράσεις CDX2. Χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (chip) θα δοκιμασία επιβεβαίωσε δεσμευτική η CDX2 με κλαουδίνης-1 υποκινητή

in vivo

. Χρησιμοποιώντας CDX2 μορφώματα διαγραφής μεταλλάκτη, έχουμε χαρτογραφηθεί περαιτέρω η περιοχή C-τελικό άκρο CDX2 να είναι σημαντική στη ρύθμιση της δραστικότητας προαγωγού κλαουδίνης-1. Είναι ενδιαφέρον ότι, η συν-έκφραση της ενεργοποιημένης β-κατενίνης που προκαλείται περαιτέρω την CDX2 εξαρτώμενη αυξητική ρύθμιση της δραστικότητας προαγωγού κλαουδίνης-1 ενώ η έκφραση της κυρίαρχης αρνητικής (dn) -TCF-4 καταργηθεί αυτή την ενεργοποίηση. Στο σύνολό τους, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η μεταγραφή ομοπεδίου παράγοντες Cdx1, CDX2 και GATA4 ρυθμίζουν την έκφραση του γονιδίου κλαουδίνης-1 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Επιπλέον, ένα λειτουργικό στιχομυθία μεταξύ Wnt-σηματοδότησης και μεταγραφική ενεργοποίηση που σχετίζονται με την ουραία σχετίζονται ομοιοακολουθίας πρωτεΐνες (CDX) και GATA-πρωτεΐνες καταδεικνύεται στη ρύθμιση της κλαουδίνης-1 προαγωγό ενεργοποίηση

Παράθεση:. Bhat AA, Sharma Α, Πάπας J, Krishnan Μ, Ουάσιγκτον ΜΚ, Singh AB, et al. (2012) Ουραίο ομοιοκυτίου Πρωτεΐνη CDX-2 Συνεργάζεται με Wnt δρόμος για τη ρύθμιση κλαουδίνης-1 έκφραση στον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. PLoS ONE 7 (6): e37174. doi: 10.1371 /journal.pone.0037174

Επιμέλεια: Frederic Andre, Πανεπιστήμιο Aix-Marseille, Γαλλία

Ελήφθη: 6 Ιανουαρίου, 2012? Αποδεκτές: 17 Απρ 2012? Δημοσιεύθηκε: 15 του Ιουνίου του 2012

Copyright: © 2012 Bhat et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH) CA124977 επιχορήγησης (Π Dhawan) και DK088902 (ΑΒ Singh). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Σφιχτά κόμβους (TJS), η πιο ακραία προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου, βοηθά στη ρύθμιση της πολικότητας και διαφοροποιημένη κατάσταση των επιθηλιακών κυττάρων. Η διακοπή του κυττάρου-κυττάρου διασταυρώσεις μαζί με ταυτόχρονη αλλαγές στην έκφραση των συνδεδεμένων πρωτεϊνών βοηθά επάγουν εισβολή και μεταστατική εξέλιξη στον καρκίνο. Η οικογένεια κλαουδίνης των πρωτεϊνών είναι αναπόσπαστο με τη δομή και τη λειτουργία των σφιχτών συνδέσεων, και αλλοιωμένη έκφραση κλαουδίνης μέλη της οικογένειας? αν και σε έναν ιστό ειδικό τρόπο, έχει ανιχνευθεί σε πολλαπλούς καρκίνους. Αρκετές γραμμές των αποδεικτικών στοιχείων υποδηλώνουν ότι κλαουδίνης-1 είναι ένα βασικό συστατικό του TJs [1], [2], και συμμετέχει άμεσα στις λειτουργίες φραγμού και φράχτη του TJs [3], [4]. Περαιτέρω, οι μελέτες συμπεριλαμβανομένων δική μας απέδειξαν ότι κλαουδίνης-1 έκφραση απορυθμίζεται σε μια ποικιλία καρκίνων συμπεριλαμβανομένου ορθοκολικού καρκίνου [3], [5]. Δείξαμε περαιτέρω χρησιμοποιώντας μια μεγάλη ομάδα των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου ότι η έκφραση του mRNA κλαουδίνης-1 είναι επίσης εξαιρετικά αυξημένη σε καρκίνο του παχέος εντέρου [25]. Είναι περαιτέρω αξίζει εδώ να σημειωθεί ότι σε καρκίνο του παχέος εντέρου, απορρυθμισμένη κλαουδίνης-1 συνεργάτες έκφραση με την εξέλιξη του όγκου και τη μετάσταση [5]. Επίσης, κλαουδίνης-1 είναι ένας στόχος της β-κατενίνης /Tcf σηματοδότηση, ένας ρυθμιστής κλειδί του κόλου ομοιόστασης και νεοπλασματική ανάπτυξη /εξέλιξη [6]. Ωστόσο, τα στοιχεία της μεταγραφικής ρύθμισης του παχέος έκφρασης κλαουδίνης-1 δεν είναι απολύτως κατανοητή.

Α. Ανάλυση κηλίδας Western των Cdx1, CDX2, GATA4, έκφραση πρωτεΐνης κλαουδίνης-1 και κλαουδίνης-4 σε κύτταρα SW480. κύτταρα SW480 επιμολύνθηκαν παροδικά με Cdx1, CDX2 ή /και φορείς έκφρασης GATA4, και 20 μg των εκχυλισμάτων ολόκληρων κυττάρων αναλύθηκαν. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Β Πυκνότητας για κλαουδίνης-1 και κλαουδίνης-4 έκφρασης. ανάλυση Γ ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR. κύτταρα SW480 συν-επιμολύνθηκαν με Cdx1, CDX2 και φορείς έκφρασης GATA4 στην παρουσία των ενδεικνυόμενων κατασκευάσματα ανταποκριτή, και ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε. Σαράντα ώρες αργότερα, το ολικό RNA απομονώθηκε και υποβλήθηκε σε πραγματικό χρόνο PCR χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές γονίδιο. Τα αποτελέσματα απεικονίζονται ως μέση ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα και παρουσιάζονται ως φορές μεταβολής. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001, σε σύγκριση με τον έλεγχο. Οι διαφορές μεταξύ δύο ομάδων αναλύθηκαν με t-test δύο ουρών Student και περισσότερων από δύο ομάδες με μονόδρομη ANOVA με post-hoc Bonferroni τεστ πολλαπλής σύγκρισης.

Η

Ο πρωτεΐνες ομοπεδίου Cdx1 και CDX2 είναι τα μέλη της οικογένειας γονιδίων ομοιοακολουθίας ουραίο σχετίζονται [7] – [9]. Μελέτες υποστηρίζουν το ρόλο του Cdx1 και CDX2 στη ρύθμιση των πρώιμων διαφοροποίηση και διατήρηση των εντερικών επιθηλιακών κυττάρων. Μελέτες που χρησιμοποιούν τα επιθηλιακά κύτταρα του εντερικού προέλευσης έχουν δείξει ότι η ρύθμιση της έκφρασης των Cdx1 και /ή CDX2 έχει σημαντικές λειτουργικές επιδράσεις επί της εντερικής διαφοροποίηση [10], [11], του πολλαπλασιασμού [10], [12], και το έντερο-ειδική γονιδιακή μεταγραφή πρόγραμμα [13] – [16]. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι Cdx1 και CDX2 δεσμεύονται σε αρκετούς έντερο-ειδικούς προαγωγούς για τη ρύθμιση έντερο-ειδική μεταγραφής γονιδίου [13] – [15], [17], [18]. Επίσης, GATA4, ένας παράγοντας μεταγραφής δακτύλου ψευδαργύρου, εμπλέκεται στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης των εντερικών επιθηλιακών κυττάρων και βοηθά στη ρύθμιση της εμβρυϊκής ανάπτυξης του γαστρεντερικού σωλήνα [19]. Μελέτες έχουν δείξει επίσης ότι οι αλληλεπιδράσεις των GATA4 με CDX2 και HNF-1α βοήθεια ρυθμίζουν την έκφραση αρκετών γονιδίων προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου, συμπεριλαμβανομένων E-cadherin και κλαουδίνης-2 [19], [20].

Στην έκθεση αυτή, αποδείξαμε ότι γονιδιακή έκφραση του παχέος κλαουδίνης-1 είναι επίσης ένας στόχος της μεταγραφικής ρύθμισης από Cdx1, CDX2 και GATA4 όπου CDX2 φάνηκε να έχει πιο ισχυρή δράση ως επαγωγέα του κόλου έκφρασης κλαουδίνης-1. Εμείς παρέχουν περαιτέρω στοιχεία που υποστηρίζουν παράλληλη συσχέτιση μεταξύ κλαουδίνης-1 και της έκφρασης CDX2 στον καρκίνο του παχέος εντέρου δείγματα ασθενών. Το πιο σημαντικό, τα δεδομένα μας πρότειναν ότι CDX2 ρυθμίζει την έκφραση κλαουδίνης-1 σε συνεργασία με Wnt-σηματοδότηση, ένα γνωστό ρυθμιστή του κλαουδίνης-1 έκφρασης.

Η αλληλουχία του κλαουδίνης-1 προαγωγό και την ταυτοποίηση της transcription- θέση έναρξης έχει περιγραφεί προηγουμένως [21]. Οι υποθετικές σημαντικές θέσεις δέσμευσης συναίνεση υπογράμμισε. Β Cdx1, CDX2 και GATA4 ρύθμιση των κλαουδίνης-1 γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης. SW480 (Β), HCT116 (C), MCF-7 (D) και τα κύτταρα MDCK (Ε) διαμολύνθηκαν παροδικά με ένα 1.2-kb κλαουδίνης-1-λουσιφεράση πλασμίδιο ανταποκριτή μαζί με Cdx1, CDX2 ή /και φορείς έκφρασης GATA4. Αδειάστε pGL3-βασικό φορέα χρησιμοποιήθηκε για σκοπούς ελέγχου. Η μη ειδική DNA πλασμιδίου χρησιμοποιήθηκε για να διατηρήσει ίσες ποσότητες DNA σε όλα τα δείγματα διαμόλυνση. Τα αποτελέσματα εκφράζονται σε πλάσια ενεργοποίηση της σχετικής δραστηριότητας της λουσιφεράσης μετά από κανονικοποίηση με

Renilla

δραστηριότητα από 3 ανεξάρτητα πειράματα, και οι τιμές εκφράζονται ως μέσοι όροι ± SD. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001, σε σύγκριση με τον έλεγχο. Οι διαφορές μεταξύ δύο ομάδων αναλύθηκαν με t-test δύο ουρών Student και περισσότερων από δύο ομάδες με μονόδρομη ANOVA με Bonferroni test-hoc υστέρων πολλαπλή σύγκριση.

Η

Αποτελέσματα

Αναγκαστική έκφραση των Cdx1, CDX2 ή GATA4 Προκαλεί κλαουδίνης-1 έκφραση στον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα

Για να εξεταστεί αν Cdx1, CDX2 ή /και GATA4 βοηθούν στη ρύθμιση του παχέος έκφραση κλαουδίνης-1, προσδιορίσαμε την επίδραση της υπερ-έκφρασης του ανωτέρω παραγόντων μεταγραφής κατόπιν έκφρασης ενδογενούς κλαουδίνης-1. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε SW480 καρκινικά κύτταρα κόλου, τα οποία εκφράζουν χαμηλά επίπεδα του ενδογενούς κλαουδίνης-1 [5]. Θηλαστικών πλασμίδιο έκφρασης κατασκευάσματα που περιέχουν πλήρους μήκους Cdx1, CDX2 ή GATA4 επιμολύνθηκαν παροδικά σε κύτταρα SW480. Αδειάστε πλασμίδια έκφρασης χρησίμευσαν ως έλεγχος. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα δείγματα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν στην παρασκευή του λύματος ή ολικό εκχύλισμα RNA. Ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας ειδικό στο αντιγόνο αντίσωμα έγινε για να επιβεβαιωθεί η υπερέκφραση και παρόμοια επίπεδα υπερέκφρασης των αντιγόνων υπό μελέτη (Σχήμα 1Α). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, παρατηρήσαμε ισχυρή αυξητική ρύθμιση του κλαουδίνης-1 σε κύτταρα που υπερεκφράζουν Cdx1 (3,8 φορές ± 0.451), CDX2 (6,5 φορές ± 0.854) ή GATA4 (3,3 φορές ± 0.115) σε επίπεδο πρωτεΐνης. Ποσοτική RT-PCR έδειξαν παρόμοια επαγωγή της έκφρασης του mRNA κλαουδίνης-1 κατόπιν υπερέκφραση όλων των ανωτέρω παραγόντων μεταγραφής και για μία ακόμη φορά αυτό επαγωγή ήταν μέγιστη σε κύτταρα που υπερεκφράζουν CDX2 (Σχήμα 1 C). Αυτή η επίδραση του Cdx1, CDX2 ή GATA4 κατόπιν κλαουδίνης-1 έκφραση ήταν ειδική επειδή η έκφραση του κλαουδίνης-4, μια ακόμη άλλη κλαουδίνης μέλος της οικογένειας, δεν επηρεάστηκε από την αναγκαστική έκφραση οποιουδήποτε από τους ανωτέρω παράγοντες μεταγραφής (Σχήμα 1Α & amp? Β).

κύτταρα SW480 διαμολύνθηκαν ταυτόχρονα με διαφορετικούς συνδυασμούς Cdx1, CDX2 και φορείς έκφρασης GATA4 παρουσία ενδεικνυόμενη κατασκευασμάτων ρεπόρτερ, και προσδιορισμοί λουσιφεράσης διεξήχθησαν. Σαράντα ώρες αργότερα, τα κύτταρα λύθηκαν και μετρήθηκε η δραστικότητα λουσιφεράσης. Τα αποτελέσματα απεικονίζονται ως μέση ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα και κανονικοποιούνται δραστικότητα λουσιφεράσης σε κάθε κυτταρική σειρά παρουσιάστηκε ως σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης. Η μέση τιμή των κυττάρων επιμολυσμένων με pGL3-βασικό φορέα απουσία φορέων έκφρασης ορίσθηκε σε 1. Β και ανάλυση κηλίδας Western C. έκφρασης πρωτεΐνης κλαουδίνης-1 σε κύτταρα SW480. SW480 κύτταρα επιμολύνθηκαν με διαφορετικούς συνδυασμούς Cdx1, CDX2 και φορείς έκφρασης GATA4 και 20 μg των πρωτεϊνών αναλύθηκαν. ** P & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001, **** p & lt? 0,0001 σε σύγκριση με τον έλεγχο. Οι διαφορές μεταξύ δύο ομάδων αναλύθηκαν με t-test δύο ουρών Student και περισσότερων από δύο ομάδες με μονόδρομη ANOVA με post-hoc Bonferroni τεστ πολλαπλής σύγκρισης.

Η

A. Τα κατασκευάσματα που περιέχουν ανταποκριτή διαδοχικώς διαγράφεται 5′-πλευρικές θραύσματα του 1,2 kb κλαουδίνης-1 (-1160 /-260) παρασκευάστηκαν και διαμολύνθηκαν σε SW480 (Β) και κύτταρα HCT116 (C) όπως περιγράφεται στο «Πειραματικές Διαδικασίες». Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης των τριών διαφορετικών πειραμάτων που διεξάγονται εις τριπλούν (μέσο ± S.D.). Οι διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων αναλύθηκαν με t-test δύο ουρά του Student και περισσότερες από δύο ομάδες από μονόδρομη ANOVA με Bonferroni test-hoc μετά την πολλαπλή σύγκριση.

Η

Cdx1, CDX2 και GATA4 Ρυθμίζουν κλαουδίνης-1 μεταγραφή του γονιδίου για τον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα

στο παραπάνω μελέτες, ανάγκασε την έκφραση της Cdx1, CDX2 ή GATA4 είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της κλαουδίνης-1 πρωτεΐνη και τις εκφράσεις του mRNA. Ως εκ τούτου, έχουμε προσδιορίζεται περαιτέρω εάν Cdx1, CDX2 ή /και GATA4 βοηθούν στη ρύθμιση κλαουδίνης-1 μεταγραφής. Από αυτή την άποψη, πραγματοποιήσαμε ποσοτικό προσδιορισμό λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας ανθρώπινο κλαουδίνης-1 προαγωγό (-1160 /+ 160) -luciferase κατασκεύασμα ανταποκριτή που περιγράφηκε προηγουμένως [21] που αναφέρεται ως pGL3 /-1.2Cld-1 (Σχήμα 2Α) σε όλο το χειρόγραφο. Η bp περιοχή -1160 να +160 της ανθρώπινης κλαουδίνης-1 προαγωγέα περιέχει υποθετικές θέσεις πρόσδεσης CDX, HNF και GATA μαζί με τις υποθετικές θέσεις πρόσδεσης για TCF /Lef-1 (Σχήμα 2Α). κύτταρα SW480 επιμολύνθηκαν παροδικά με το pGL3 /-1.2Cld-1 ή pGL3-βασικό (φορέας μόνο) μαζί με ένα πλασμίδιο ρεπόρτερ αναφοράς. Η δραστικότητα λουσιφεράσης του pGL3 /-1.2Cld-1 ομαλοποιήθηκε με εκείνη της pGL3-βασικό επιπλέον του διανύσματος αναφοράς. Έκτοπη έκφραση Cdx1 ή GATA4 δεν μεταβάλλουν το επίπεδο έκφρασης της CDX2, ούτε CDX2 υπερέκφραση έχουν αξιοσημείωτη επίδραση επί Cdx1 ή εκφράσεις πρωτεΐνης GATA4 (Εικόνα 1Α). Υπερ-έκφραση του είτε Cdx1 ή GATA4 οδήγησε σε ~ 3-πλάσια αύξηση στην δραστικότητα προαγωγού του pGL3 /-1.2Cld-1. Ωστόσο, παρόμοιες υπερ-έκφραση του CDX2 είχε ως αποτέλεσμα μια 6-πλάσια αύξηση της δραστικότητας του ίδιου μορφώματος (Εικόνα 2Β). Παρατηρήσαμε μια παρόμοια τάση επαγωγής της pGL3 /-1.2Cld-1-καθοδηγείται δραστικότητα λουσιφεράσης σε καρκίνο του παχέος εντέρου HCT116, η οποία ήταν 2,5-3 φορές κατά υπερέκφραση Cdx1 και GATA4 και ~ 4-φορές κατά την υπερέκφραση του CDX2 (Σχήμα 2C). Έχουμε λάβει παρόμοια αποτελέσματα χρησιμοποιώντας ένα μεγαλύτερο 3.3 Kb (-3 140 έως 160) δοκιμασία ανταποκριτή κλαουδίνης-1 προαγωγέα, η οποία δεν ήταν σημαντικά διαφορετική σε σχέση με το 1,2 Kb κλαουδίνης-1 προαγωγό (Σχήμα S1). Ως εκ τούτου, συνεχίσαμε τη χρήση της 1,2 Kb κλαουδίνης-1 προαγωγό για περαιτέρω μελέτες. περαιτέρω μελέτες μας υποστηρίζονται ιδιαιτερότητα των παραπάνω ευρημάτων μας ως υπερ-έκφραση ενός ακόμη παράγοντα μεταγραφής HNF-1α δεν επηρέασε δράση προαγωγού κλαουδίνης-1 είτε σε SW480 κύτταρα (Σχήμα S2). Εμείς επιβεβαίωσε περαιτέρω εξειδίκευση των ευρημάτων μας στο παχέος κλαουδίνης-1 έκφραση ως παρόμοια παροδική υπερέκφραση Cdx1, CDX2 ή GATA4 σε καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου μαστού (MCF-7) ή της νεφρικής επιθηλιακά κύτταρα (MDCK κύτταρα II) δεν αύξησε κλαουδίνης-1 υποκινητή δραστηριότητα (Εικόνα 2D & amp? Ε)

HD:. ομοπεδίου? A, B, C: συντηρημένες περιοχές. δραστηριότητα B. λουσιφεράσης μετά συν-επιμόλυνση με CDX2 άγριου τύπου και μεταλλάγματα κολόβωση. Διαγραφή της CDX2 C-τελικό άκρο (Cdx2CD) σημαντικά (***

σ

& lt? 0.001) μειώνεται κλαουδίνης-1 δραστηριότητα δημοσιογράφος. Η ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιώντας C. αντίσωμα αντι-Flag να ελέγξει ισοδύναμη έκφραση περικομμένων μεταλλαγμάτων CDX2 σε κύτταρα SW480 παροδικά επιμολυσμένα με CDX2 κολόβωση φορείς μεταλλαγμένου έκφρασης. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Δ CDX2 σύνδεση προς το 5′-πλαγιοκοπική περιοχή του κλαουδίνης-1 γονίδιο υποκινητή δείχνεται με δοκιμασία chip. Φορμαλδεΰδη διασυνδεδεμένη χρωματίνης παρασκευάζεται από 5 × 10

7 SW480 κύτταρα επωάστηκαν με αντισώματα για CDX2 ή με IgG (αρνητικός έλεγχος). Εγκάρσια σύνδεση των ανοσοϊζημάτων αντιστράφηκε και το DNA καθαρίστηκε και αναλύθηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές ειδικούς για είτε την περιοχή προαγωγού κλαουδίνης-1 ή για αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η επαγωγή της δραστικότητας υποκινητή κλαουδίνης-1 με CDX2 απαιτεί τομέα CDX2-C-τελικό άκρο.

Η

Cdx1, CDX2 και παράγοντες μεταγραφής GATA4 λειτουργούν συνεργικά για να ρυθμίζουν την έκφραση διαφορετικών γονιδίων [19]. Ως εκ τούτου, εμείς καθοριστεί αν υπήρχε μια παρόμοια συνέργεια μεταξύ Cdx1, CDX2 και GATA4 στη ρύθμιση της κλαουδίνης-1 μεταγραφή του γονιδίου. Για να ελέγξετε, θα συν-επιμολυσμένα Cdx1 με CDX2, Cdx1 με GATA4 και CDX2 με GATA4 στα κύτταρα SW480. Πράγματι, η συν-έκφραση της Cdx1 με CDX2, Cdx1 με GATA4 ή CDX2 με GATA4, όλοι οδήγησαν σε σημαντική αύξηση (9-13 φορές) σε δραστηριότητα υποκινητή κλαουδίνης-1 (Σχήμα 3Α). Αυτό συνέργεια στη ρύθμιση της κλαουδίνης-1 έκφραση επιβεβαιώθηκε περαιτέρω στα επίπεδα πρωτεΐνης όπου προκλήθηκε κλαουδίνης-1 έκφρασης (8-10 φορές) σε σύγκριση με (3-6 φορές) με Cdx1, CDX2 ή GATA4 μόνο του (Σχήμα 3Β & amp ? C)

δραστικότητα προαγωγού κλαουδίνης-1 σε SW480 (Α) και HCT 116 κύτταρα (Β).. Τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν παροδικώς με κατασκευάσματα φορέα έκφρασης για ενεργοποιημένη β-κατενίνης (S33Y) μαζί με Cdx1, CDX2 ή φορείς έκφρασης GATA4. δραστικότητα κλαουδίνης-1 προωθητής καταργήθηκε κατόπιν συν-επιμόλυνση των dnTcf-4 με Cdx1, CDX2 ή έκφραση GATA4 φορείς SW480 (C) και HCT116 (D) κύτταρα.

Η

κλαουδίνης-1 Promoter περιέχει σημεία σύνδεσης για το CDX και GATA παράγοντες μεταγραφής

με βάση τα παραπάνω ευρήματα μας, εξετάσαμε περαιτέρω υποθετικές θέσεις πρόσδεσης για Cdx1, CDX2 και GATA4 σε κλαουδίνης-1 υποκινητή. Χρησιμοποιήσαμε υπολογιστική ανάλυση χρησιμοποιώντας το λογισμικό MatInspector (Oxford Molecular Group) για τον εντοπισμό των υποθετικές θέσεις πρόσδεσης για συναίνεση Cdx- και στοιχεία GATA-πρόσδεσης (Σχήμα 2Α). Για να επιβεβαιωθεί η λειτουργική αποτελεσματικότητα αυτών των υποθετικών θέσεων πρόσδεσης και για τον εντοπισμό των περιοχών που εμπλέκονται στη ρύθμιση της κλαουδίνης-1 μεταγραφή γονιδίου, δημιουργήσαμε μορφώματα διαγραφής προαγωγού κλαουδίνης-1 ξεκινώντας από την περιοχή 5′-πλευρικές όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Η Εικόνα 4Α απεικονίζει την κατασκευή πλήρους μήκους υποκινητή (-1160 /+ 160) και εννέα κατασκευάσματα διαγραφής (-850 /+ 160, -740 /+ 160, -665 /+ 160, -550 /+ 160, -490 /+ 160, -420 /+ 160, -350 /+ 160 και -260 /+ 160). Τα κατασκευάσματα αναφοράς που δημιουργείται πάνω στην συνέχεια συν-επιμολύνθηκαν με Cdx1, CDX2 ή έκφραση GATA4 κατασκευάσματα σε SW480 και HCT116 κύτταρα. Το κατασκεύασμα υποκινητή πλήρους μήκους περιείχε τις θέσεις για CDX και GATA4 δεσμευτική συναίνεση, μαζί με την θέση σύνδεσης για Tcf /Lef-1, και που προκαλείται από δραστικότητα προαγωγού κλαουδίνης-1 5-6πλάσια στα κύτταρα SW480 (Σχήμα 4Β). Ωστόσο, αυτή η επαγωγή χάθηκε μετά την διαγραφή του εγγύς 310 bp (-1.160 έως -850), ο οποίος πρότεινε ότι αυτή η περιοχή 310 bp έχει θέσεις σημαντικές για την επαγωγή υποκινητή κλαουδίνης-1 από παράγοντες μεταγραφής υπό διερεύνηση. Παρόμοια ευρήματα από τα κύτταρα HCT116 υποστήριξε αυτή την ιδέα (Σχήμα 4C). Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές παρουσίασαν παρόμοια πρότυπα δραστηριότητας προαγωγού, αν και τα σήματα σε γενικές γραμμές ήταν ισχυρότερη σε κύτταρα SW480. Αυτή η περιοχή 310 bp περιείχε ένα CDX, δύο θέσεις πρόσδεσης συναίνεση GATA και θέση δέσμευσης τρισεκατομμυρίων κυβικών μέτρων /Λεφ-1 υποδηλώνει πιθανή σημασία αυτών των χώρων στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης κλαουδίνης-1.

Α. Συσχέτιση μεταξύ κλαουδίνης-1 και CDX2 εκφράσεις στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Τα δεδομένα από συστοιχίες έθιμο καρκίνο του παχέος εντέρου ιστού (μικροσυστοιχίες ιστό που αναπτύχθηκε στο Vanderbilt) που περιέχουν χειρουργικά δείγματα από 50 πρωτοβάθμια και αντιστοιχισμένο μεταστατικό φρέσκο ​​κατεψυγμένο ανθρώπινο ορθοκολικό καρκίνο δείγματα εμφανίζονται. Μια σημαντική άμεση συσχέτιση μεταξύ κλαουδίνης-1 και της έκφρασης CDX2 παρατηρήθηκε (** P & lt? 0,01) με τη χρήση της δοκιμής πλατεία chi Yates του. B. αντιπροσωπευτική χρώση για κλαουδίνης-1 (α) και CDX2 (β) στον καρκίνο του παχέος εντέρου δείγματα ασθενών. Οι τομές με αιματοξυλίνη για να καθοριστούν οι δομικές λεπτομέρειες.

Η

Το Ο-τερματικό πεδίο απαιτείται για CDX2 διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της κλαουδίνης 1-μεταγραφική δραστηριότητα

πάνω μελέτες πρότειναν ένα ρόλο Cdx1 , CDX2 και GATA4 στη ρύθμιση της κλαουδίνης-1 προαγωγό. Ωστόσο, CDX2 φάνηκε να έχει την πιο ισχυρή επίδραση στην δραστικότητα προαγωγού κλαουδίνης-1. Ως εκ τούτου, σε περαιτέρω μελέτες, προσδιορίσαμε τον τομέα CDX2 που απαιτείται για τη μεταγραφική ενεργοποίηση του κλαουδίνης-1 προαγωγό. Από αυτή την άποψη, εξετάσαμε την επίδραση της CDX2 κατασκευασμάτων διαγραφής μεταλλάκτη για την ικανότητά τους να επάγουν δραστικότητα προαγωγού κλαουδίνης-1 (Σχήμα 5Α) [22]. ανάλυση ανοσοστυπώματος χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-flag επιβεβαίωσε παρόμοια επίπεδα έκφρασης CDX2 κατασκευασμάτων διαγραφής μεταλλάκτη (Σχήμα 5C). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η διαγραφή του τομέα ενεργοποίησης κανονική μεταγραφή (CDX2 δ55-136), τα Ν-τερματικά πεδία (CDX2 δ15 ή CDX2 δ50) ή η περιοχή μεταξύ των αμινοξέων 140 και 180 (CDX2 δ140-180) δεν είχε σημαντική επίδραση επί κλαουδίνης -1 δραστηριότητα του υποκινητή. Σε αντίθεση, η διαγραφή της CDX2 C-άκρο 244-311 (Cdx2CD) μειωμένη δραστικότητα προαγωγέα κλαουδίνης-1 με 5 φορές σε σύγκριση με τον άγριο τύπο CDX2 (Σχήμα 5Β). Λαμβανόμενες μαζί, αυτές οι μελέτες προτείνουν ότι ο τομέας CDX2 Ο-άκρο απαιτείται για την CDX2 εξαρτώμενη επαγωγή της ενεργοποίησης υποκινητή κλαουδίνης-1.

Για να καθοριστεί περαιτέρω εάν CDX2 δεσμεύεται στον προαγωγό κλαουδίνης-1

in vivo

, εκτελέσαμε ανάλυση chip και σύγκριση SW480 κύτταρα που υπερεκφράζουν CDX2 με κύτταρα SW480 επιμολύνθηκαν με το κενό πλασμίδιο φορέα έκφρασης. Το Σχήμα 5D δείχνει το προκύπτον DNA τραβιέται κάτω από αντι-CDX2 αντίσωμα που περιέχει την αλληλουχία που πλαισιώνει την θέση πρόσδεσης CDX. Αυτό πρότεινε ότι CDX2 προσδένεται στα στοιχεία CDX-αλληλουχία εντός του 310 bp του κλαουδίνης-1 υποκινητή και αυτή η σύνδεση αυξήσεις κατά υπερέκφραση της CDX2 σε SW480 κύτταρα, τα οποία, με τη σειρά του, αυξάνει τη δράση υποκινητή κλαουδίνης-1. Για να καθοριστεί περαιτέρω εάν C-τερματικό είναι σημαντική για τη δέσμευση CDX2 να κλαουδίνης-1 προαγωγέα, εμείς υπερεκφράζεται Cdx2CD (C-τερματική διαγραφή μεταλλαγμένο) ή μία Ν- τερματική διαγραφή μεταλλάγματος που δεν επηρεάζει την κλαουδίνης-1 μεταγραφικής δραστικότητας (CDX2 δ50 ) σε κύτταρα SW480 και εκτελείται ανάλυση chip. Η ανάλυση ChIP κατέδειξε ότι η αυξημένη σύνδεση λόγω της πλήρους μήκους υπερέκφραση CDX2 καταργήθηκε μετά την υπερέκφραση του Cdx2CD αλλά όχι την απαλοιφή Ν-τερματικού (CDX2 δ50) μετάλλαξη (Εικόνα 5D). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι CDX2 C-τερματικό τομέα είναι σημαντική για τη δέσμευση της CDX2 να κλαουδίνης-1 υποκινητή και CDX2 εξαρτώμενη επαγωγή της δραστικότητας κλαουδίνης-1 προαγωγό.

Μια λειτουργική Παρεμβολή του σηματοδότηση Wnt και CDX σχετίζονται μεταγραφικού η ενεργοποίηση Ρυθμίζει κλαουδίνης-1 Ανάδοχος Δραστηριότητα

κλαουδίνης-1 είναι ένας γνωστός στόχος των τρισεκατομμυρίων κυβικών μέτρων /Λεφ-1 σηματοδότηση [6] και η TCF /Λεφ-1 στοιχεία βρίσκονται εντός του -1.160000000–850000000 εκατομμύρια περιοχή των claudin- 1 προαγωγό. Για να δοκιμαστεί η επίδραση του β-κατενίνης /Tcf /Lef-1, κλαουδίνης-1 προωθητής υποβλήθηκε σε συν-επιμόλυνση με την παρουσία ή απουσία του ενεργοποιημένου β-κατενίνης (S33Y) μαζί με Cdx1, 2 ή GATA4. Παροδικές επιμολύνσεις έγιναν εις SW480 και κύτταρα HCT116 και δραστικότητα λουσιφεράσης του pGL3 /-1.2Cld-1 κανονικοποιήθηκε σε pGL3-Basic επιπλέον του διανύσματος αναφοράς. Η υπερέκφραση των ενεργοποιημένων β-κατενίνης (S33Y) με Cdx1, CDX2 ή GATA4 είχε ως αποτέλεσμα τουλάχιστον δύο φορές ακόμη επαγωγή κλαουδίνης-1 έκφραση γονιδίου υποκινητή μεσολάβηση σε σύγκριση με Cdx1, CDX2 ή GATA4 μόνο του (Σχήμα 6Α & amp? Β). Αντιστρόφως, όταν υπερεκφράζονται Cdx1, CDX2 ή GATA4 με dnTcf-4, η επαγωγή κλαουδίνης-1 προωθητής καταργήθηκε υποδηλώνοντας πιθανή εγκάρσια talk μεταξύ αυτών των παραγόντων (Σχήμα 6C & amp? D). Στο σύνολό τους, τα δεδομένα μας πρότεινε ότι η διαφοροποίηση των β-κατενίνης /δραστηριότητας τρισεκατομμυρίων κυβικών μέτρων /Λεφ παίζει κεντρικό ρόλο στην CDX, GATA4 μεσολάβηση ρύθμιση της έκφρασης κλαουδίνης-1.

κλαουδίνης-1 και CDX2 Εκφράσεις συσχετίζονται ανθρώπων του παχέος εντέρου δείγματα καρκινώματος

έκφραση της πρωτεΐνης CDX2 σχετίζεται με προχωρημένα στάδια της ογκογένεσης του παχέος εντέρου [23]. έκφραση κλαουδίνης-1 συσχετίζεται θετικά με την εξέλιξη του όγκου και τη μετάσταση σε καρκίνο του παχέος εντέρου [5]. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε την πιθανή συσχέτιση μεταξύ CDX2 και κλαουδίνης-1 εκφράσεις στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Εξετάσαμε την πιθανή συσχέτιση μεταξύ κλαουδίνης-1 και εκφράσεις CDX2 σε ένα μεγάλο πληθυσμό δειγμάτων ανθρώπινου ιστού. Διεξήχθη? ανοσοϊστοχημική ανάλυση για κλαουδίνης-1 και CDX2 σε συστοιχίες καρκινικού ιστού έθιμο του παχέος εντέρου (που περιέχουν χειρουργικά δείγματα από 50 πρωτοβάθμια και αντιστοιχισμένο μεταστατικό ορθοκολικό κατεψυγμένα δείγματα ανθρώπινων καρκινικών μικροσυστοιχίες ιστό που αναπτύχθηκε στο Πανεπιστήμιο Vanderbilt από τον Δρ Μ.Κ. Ουάσινγκτον). Τα αποτελέσματα έδειξαν κυρίαρχη πυρηνική ανοσοχρώση για CDX2 ενώ χρώση κλαουδίνης-1 ήταν κυρίως κυτοσολικό αν και κάποια χρώση μεμβράνη στικτή παρατηρήθηκε επίσης (Σχήμα 7Β). Είναι σημαντικό ότι, η περαιτέρω ανάλυση έδειξε μια σημαντική συσχέτιση (ρ & lt? 0,01) μεταξύ κλαουδίνης-1 και εκφράσεις CDX2 σε 36:50 δείγματα (72%) καρκίνου του παχέος εντέρου (Εικ 7Α.). Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι υπάρχει άμεση συσχέτιση μεταξύ των εκφράσεων του CDX2 και κλαουδίνης-1 σε ορθοκολικό καρκίνωμα.

Συζήτηση

Δυσλειτουργία της διαφοροποίησης Κολονοκύτταρο βρίσκεται στον πυρήνα της καρκινογένεσης του παχέος εντέρου. Κλαουδίνης-1 έκφραση είναι ιδιαίτερα αυξημένη σε καρκίνο του παχέος εντέρου και αιτιολογικά σχετίζεται με την ανάπτυξη του όγκου και της εξέλιξης [5]. Ενδιαφέρον, εκτός από την απορρυθμισμένη έκφραση πρωτεΐνης και ο εντοπισμός, η έκφραση mRNA κλαουδίνης-1 αυξάνει επίσης σε καρκίνο του παχέος εντέρου [25]. Αξίζει επίσης να σημειωθεί ότι ο γενετικός χειρισμός του κλαουδίνης-1 έκφρασης σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου οδήγησε σε απότομη και αντίστροφη αλλαγές στην κατάσταση διαφοροποίησης τους, συμπεριλαμβανομένων έκφραση Ε-καδερίνης [5], [24]. Επίσης, η επαγωγή της διαφοροποίησης επιθηλιακών σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα χρησιμοποιώντας ιστόνης αποακετυλάσης αναστολείς (HDAC) που σχετίζεται με μια συγκεκριμένη μείωση στην κλαουδίνης-1 έκφραση μεταξύ των μελών της οικογένειας κλαουδίνης [25]. Στο σύνολό τους, κλαουδίνης-1 έκφραση φαίνεται να επηρεάζει την καρκινογένεση κόλον μέσω της διαφοροποίησης του κόλου διαφοροποίησης επιθηλιακών κυττάρων. Επομένως, εξετάσαμε το ρόλο των παραγόντων μεταγραφής σημαντική στη ρύθμιση της εντερικής επιθηλιακής διαφοροποίησης καθώς και καρκινογένεση του παχέος εντέρου στη ρύθμιση της κλαουδίνης-1 μεταγραφή mRNA. Το βασικό αποτέλεσμα των μελετών μας χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικά και χρησιμοποιείται ευρέως κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου ήταν (i) Cdx1, CDX2 και GATA4 βοήθεια ρυθμίζουν κλαουδίνης-1 γονιδιακής μεταγραφής και αυτός ο κανονισμός ήταν ειδική για τα κύτταρα του κόλου προέλευσης, (ii) CDX2 είναι η πιο ισχυρός επαγωγέας της δραστικότητας προαγωγού κλαουδίνης-1 μεταξύ Cdx1, CDX2 και GATA4, και φυσικά δεσμεύεται με το CDX-συναινετική θέση πρόσδεσης /s σε κλαουδίνης-1 προαγωγέα, όπως καθορίζεται από την ανάλυση ChIP, (iii) Cdx1, CDX2 και GATA4 ρυθμίζουν παχέος κλαουδίνης-1 έκφραση μέσα από το δυναμικό συνέργεια μεταξύ τους, άλλα και μέσα από τις δυνατότητες cross-talk με το μονοπάτι Wnt σηματοδότησης. Στο σύνολό τους, στην έκθεση αυτή θα παρέχει τις πρώτες γνώσεις σχετικά με τις πολύπλοκες γεγονότα ενεργοποίησης της μεταγραφής, οι οποίες ρυθμίζουν την έκφραση του παχέος κλαουδίνης-1.

Το ουραίο πρωτεΐνη ομοιοκυτίου Cdx1 εκφράζεται κυρίως στο διαμέρισμα κρύπτη, ενώ η πρωτεΐνη CDX2 είναι ανιχνεύεται τόσο στην κρύπτη και τα διαμερίσματα λάχνης [26]. Είναι σημαντικό ότι, το αποτέλεσμα από πολλαπλές μελέτες υποδεικνύουν ότι ο ρόλος των Cdx1 και CDX2 στη ρύθμιση της ομοιόστασης εντερικής είναι συχνά συμπληρωματική και μπορεί να εξαρτάται από την ωρίμανση των εντερικών επιθηλιακών κυττάρων [27]. Τα ευρήματα αυτά συμπληρώνονται με την επίδειξη μιας μάλλον διακριτό ρόλο του Cdx1 στη ρύθμιση της εντερικής πολλαπλασιασμό επιθηλιακών κυττάρων, ενώ CDX2 παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της κατάστασης διαφοροποίησης των εντερικών επιθηλιακών κυττάρων [28]. GATA4 ανήκει επίσης στην οικογένεια των μεταγραφικών παραγόντων που παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της εμβρυογένεσης και ενδεχομένως πρόωρη ωρίμανση των εντερικών επιθηλιακών κυττάρων [29]. GATA4 μαζί με GATA5 /6 έχει συσχετισθεί με την κυτταρική επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, και νεοπλαστικό μετασχηματισμό των διαφόρων τύπων κυττάρων [8] – [15]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, μεταξύ των γαστρεντερικών καρκίνων, GATA4 ενισχύεται σε ~ 10% των αδενοκαρκινωμάτων του οισοφάγου Barrett και μεταπλασία [30]. Ο ρόλος της GATA4 στη ρύθμιση της καρκινογένεσης του παχέος εντέρου δεν είναι καλά μελετηθεί αν και περιορισμένες μελέτες πρότειναν ότι αυτό μπορεί να λειτουργεί ως καταστολέας όγκου στο καρκίνο του παχέος εντέρου [31]. Ωστόσο, μια ανάγκη να είναι προειδοποίησε στη συγκεκριμένη λειτουργική διαμόρφωση αυτών των μεταγραφικών παραγόντων όπως η λειτουργία τους /s είναι συχνά πλαίσιο εξαρτώνται και την αλληλεπίδραση με άλλους μεταγραφικούς ρυθμιστές είναι επίσης σημαντικό.

Από ενδιαφέρον, ο ρόλος του μεταγραφικού παράγοντα CDX2 στην η ρύθμιση της καρκινογένεσης του παχέος εντέρου παραμένει αμφιλεγόμενο και οι μελέτες δείχνουν το ρόλο της ως θετικό ή αρνητικό »διαμορφωτή όγκου». Από αυτή την άποψη, τα ποντίκια που είναι ετερόζυγα-null για γονιδιακή CDX2 αναπτυχθεί κολονική αμαρτώματα μετά το απομένον αλλήλιο CDX2 χάνεται [32], [33]. Αυτά τα ετερόζυγα-null ποντίκια CDX2 είναι επίσης ευαίσθητα στην αζοξυμεθάνιο (ΑΟΜ) προκληθείσα αδενοκαρκινώματος παχέως εντέρου [34]. Επίσης, η ένωση ετεροζυγώτες για CDX2 και αδενωματώδη πολυποδίαση coli (APC) τα γονίδια αναπτύξουν πιο αδενωματώδεις πολύποδες στο παχύ έντερο σε σύγκριση με ετερόζυγο τους

Αρο

νεογνά [35]. Μαζί, παραπάνω ευρήματα θα πρότεινα τη λειτουργία της CDX2 ως καταστολέας των όγκων του παχέος εντέρου. Ωστόσο, ανοσοϊστοχημική ανάλυση εντόπισε ισχυρή έκφραση CDX2 σε -90% των ανθρώπινων δειγμάτων καρκίνου του παχέος εντέρου [38], [39]. Περαιτέρω, CDX2-υπερέκφραση σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου προκαλεί ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη και την επιβίωση των κυττάρων [36]. Ενδιαφέρον, CDX2 προωθεί ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη μέσω της μεταγραφικής καταστολής της IGFBP-3 [37]. Έτσι, μπορεί να προβλεφθεί ένας ρόλος προαγωγής του καρκίνου της CDX2 στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Στο σύνολό τους, μπορεί να υποτεθεί ότι ο ρόλος του CDX2 στη ρύθμιση του καρκίνου του παχέος εντέρου μπορεί να εξαρτάται από την κατάσταση διαφοροποίησης των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου και την αλληλεπίδραση με άλλους παράγοντες μεταγραφής.

Ευρήματα από πολλαπλές μελέτες αποκάλυψαν την ύπαρξη του μια σύνθετη αλληλεπίδραση μεταξύ Cdx1, CDX2, GATA4 και HNF-1α στην επαγωγή της εντερικής γονιδιακής έκφρασης συμπεριλαμβανομένων μέλος της οικογένειας κλαουδίνης, κλαουδίνης-2 [40], [41]. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι παρόμοια με κλαουδίνης-1, η έκφραση κλαουδίνης-2 επίσης ρυθμίζεται αυξητικά στην καρκινογένεση κόλον [42]. CDX2 έχει αποδειχθεί να παίζει ρόλο στη ρύθμιση άλλων πρωτεϊνών προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου, συμπεριλαμβανομένων LI-καδερίνης, κλαουδίνης-3 και κλαουδίνης-4 [20]. Στην παρούσα μελέτη μας, έχουμε εντοπίσει συναίνεση ιστοσελίδα CDX-δέσμευσης, καθώς και το site GATA-πρόσδεσης στο κλαουδίνης-1 υποκινητή άνθρωπο. Το γεγονός που ανάγκασε την έκφραση του Cdx1, CDX2 ή GATA4 επάγεται όχι μόνο κλαουδίνης-1 πρωτεΐνη και mRNA έκφραση, αλλά επίσης προκάλεσε δραστικότητα λουσιφεράσης-ανταποκριτή εξαρτάται από το πλήρους μήκους ανθρώπινο κλαουδίνης-1 προαγωγό (-1160 να 160) υποστηρίζει ένα αιτιολογικό ρόλο του ανωτέρω παράγοντες μεταγραφής στη ρύθμιση της κλαουδίνης-1 έκφρασης. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η διαγραφή της αλληλουχίας προαγωγού κλαουδίνης-1 από -1160 να -840 bp (310 bp διαγραφή) της 5′-πλευρική περιοχή που περιέχει τις θέσεις δέσμευσης Cdx- και GATA4 κατήργησε την αύξηση της δραστικότητας λουσιφεράσης που παρατηρείται με τη χρήση της πλήρους μήκους κατασκεύασμα υποκινητή. Περαιτέρω, το εύρημα μας ότι το Cdx1, CDX2 ή GATA4 εξαρτώμενη επαγωγή της δραστικότητας κλαουδίνης-1 προαγωγός μπορεί να ενισχυθεί περαιτέρω, όταν πάνω από παράγοντες μεταγραφής συν-εκφράζεται υποστηρίζει ένα συγκρότημα αλληλεξάρτηση μεταξύ αυτών των παραγόντων μεταγραφής στη ρύθμιση της κλαουδίνης-1 έκφραση . Το γεγονός ότι παρόμοιες αναγκαστική έκφραση του HNF-1α δεν επηρέασε την έκφραση κλαουδίνης-1 καθιστά ειδικότητας με τα ευρήματά μας (Εικόνα S2). Περαιτέρω, το εύρημα μας ότι παρόμοιες υπερέκφραση Cdx1, CDX2 ή GATA4 στα νεφρικών επιθηλιακών και του μαστού καρκινικά κύτταρα δεν είχε εμφανή επίδραση επί κλαουδίνης-1 έκφραση δείχνουν ότι αυτό δεν είναι μια καθολική μηχανισμός κλαουδίνης-1 έκφραση και είναι μάλλον ειδική κόλον. Είναι πιθανό ότι αυτοί οι παράγοντες μπορεί να απαιτούν άλλους συμπαράγοντες για να είναι ενεργό, τα οποία είναι παρόντα μόνο στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου.

Τα στοιχεία μας πρότειναν περαιτέρω ότι μερικοί από τους παράγοντες μεταγραφής υπό έρευνα, CDX2 είναι το πιο ισχυρό επαγωγέα του κλαουδίνης-1 έκφρασης. Πράγματι, οι μελέτες μας χρησιμοποιώντας ανάλυση ChIP επέδειξε μια άμεση σύνδεση της CDX2 με κλαουδίνης-1 προαγωγού και έτσι πρότεινε ότι κλαουδίνης-1 είναι ένας άμεσος στόχος για ρύθμιση μεταγραφικής CDX2-εξαρτώμενη.