Αφηρημένο

Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι οι όγκοι των πνευμόνων επάγει το σχηματισμό των λεμφαγγείων. Πάντως, οι μοριακοί μηχανισμοί ελέγχουν λεμφαγγειογένεση όγκου στον καρκίνο του πνεύμονα δεν έχουν πλήρως οριοθετηθεί. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε προσδιορίσει ένα πάνελ μη μικροκυτταρικό κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC), που επάγουν λεμφαγγειογένεση και τη χρήση mRNA έκφραση γονιδιώματος σε επίπεδο για τον χαρακτηρισμό των μοριακών μηχανισμών που ρυθμίζουν λεμφαγγειογένεση όγκου. Δείχνουμε ότι Calu-1, κυτταρικές γραμμές H1993, HCC461, HCC827, και H2122 NSCLC σχηματίσουν όγκους που επάγουν λεμφαγγειογένεση ενώ Calu-3, H1155, H1975, και κυτταρικές γραμμές H2073 NSCLC σχηματίζουν όγκους που δεν επάγουν λεμφαγγειογένεση. Με την ανάλυση των δεδομένων που έκφραση του mRNA του γονιδιώματος-ευρεία, έχουμε εντοπίσει μια υπογραφή έκφραση 17 γονιδίων που διακρίνει lymphangiogenic από μη lymphangiogenic κυτταρικές σειρές NSCLC. Σημαντικά, VEGF-C είναι ο μόνος λεμφικό αυξητικός παράγοντας σε αυτή την υπογραφή έκφρασης και είναι περίπου 50 φορές υψηλότερη στην ομάδα lymphangiogenic ό, τι στο μη-lymphangiogenic ομάδα. Δείχνουμε ότι η αναγκαστική έκφραση του VEGF-C από H1975 κύτταρα επάγει λεμφαγγειογένεση και ότι knockdown του VEGF-C σε κύτταρα H1993 αναστέλλει λεμφαγγειογένεση. Επιπλέον, έχουμε αποδείξει ότι η τριπλή αναστολέας αγγειοκινάσης, nintedanib (μικρό μόριο που μπλοκάρει όλες FGFRs, PDGFRs και των VEGFR), καταστέλλει λεμφαγγειογένεση όγκου σε H1993 όγκους. Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ο VEGF-C είναι η κυρίαρχη κινητήρια δύναμη της λεμφαγγειογένεσης όγκου σε NSCLC και αποκαλύπτουν μια ειδική θεραπεία που θα μπορούσε ενδεχομένως να μπλοκάρουν λεμφαγγειογένεση όγκου σε ασθενείς με ΜΜΚΠ

Παράθεση:. Regan E, Sibley RC, Ceník BK, Silva Α, Girard L, Minna JD, et al. (2016) Προσδιορισμός των Διαφορές γονιδιακής έκφρασης μεταξύ Lymphangiogenic και μη Lymphangiogenic μη-μικροκυτταρικού καρκίνου καρκίνο του πνεύμονα Lines. PLoS ONE 11 (3): e0150963. doi: 10.1371 /journal.pone.0150963

Επιμέλεια: Sumitra Deb, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 15 Νοέμβρη του 2015? Αποδεκτές: 21, Φεβρουαρίου, 2016? Δημοσιεύθηκε: 7 Μαρτίου 2016

Copyright: © 2016 Regan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Αποτελέσματα μικροσυστοιχιών για τις κυτταρικές σειρές NSCLC χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη είχαν προηγουμένως δημοσιευθεί και αρχειοθετούνται στο Gene Expression Omnibus αποθετήριο (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/? GEO αριθμός ένταξης: GSE32036).

Χρηματοδότηση: το έργο υποστηρίχθηκε από κεφάλαια εκκίνησης από το Τμήμα Χειρουργικής στο UT Southwestern Medical Center για να MTD και από ένα βραβείο εξέλιξη της σταδιοδρομίας από το SPORE P50CA70907 NCI να MTD. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο μεταξύ των ανδρών και των γυναικών στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα συνήθως πεθαίνουν από την επίδραση των μεταστάσεων σε απομακρυσμένα όργανα. Πνεύμονα καρκινικά κύτταρα εμφανίζονται συνήθως σε περιφερειακούς λεμφαδένες πριν παρατηρούνται σε απομακρυσμένα όργανα. Για το λόγο αυτό, οι λεμφαδένες πιστεύεται ότι λειτουργούν ως «καναρίνια σε ανθρακωρυχείο» και αξιολογούνται προκειμένου να διαπιστωθεί κατά πόσον τα καρκινικά κύτταρα έχουν εξαπλωθεί από την αρχική τοποθεσία τους [2]. Η παρουσία των καρκινικών κυττάρων στους λεμφαδένες σχετίζεται με κακή πρόγνωση και είναι ένα από τα πιο σημαντικά πρόβλεψης της έκβασης του ασθενούς για μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) και άλλα καρκινώματα [2, 3]. Αυτή η κλινική παρατήρηση τροφοδότησε έντονες ερευνητικές προσπάθειες για τον εντοπισμό διαδικασίες που ελέγχουν την lymphogenous εξάπλωση του καρκίνου και, το 2001, αναφέρθηκε ότι η λεμφαγγειογένεση, η οποία είναι η βλάστηση των νέων λεμφαγγείων από προϋπάρχοντα αγγεία, διευκολύνει μετάσταση στους λεμφαδένες [4- 6]. Το εύρημα αυτό ορόσημο πυροδότησε μεγάλο ενδιαφέρον για την σκιαγράφηση των μοριακών μηχανισμών που ελέγχουν λεμφαγγειογένεσης όγκου.

Κατά τα τελευταία 15 χρόνια, σημαντική πρόοδος έχει σημειωθεί στον τομέα της έρευνας λεμφαγγειογένεσης όγκου. Οι αυξητικοί παράγοντες όπως Adrenomedullin, αγγειοποιητίνη-1, αγγειοποιητίνη-2, HGF, νετρίνη-4, PDGF-ΒΒ, VEGF-A, VEGF-C, και VEGF-D έχουν όλες αναφερθεί για την προώθηση της λεμφαγγειογένεση όγκου [4-12]. Παρά την πρόοδο αυτή, οι ακριβείς μηχανισμοί που διέπουν λεμφαγγειογένεση όγκου παραμένει ελλιπώς κατανοητός. Αυτό συμβαίνει εν μέρει επειδή πολλές μελέτες επί λεμφαγγειογένεση όγκου χρησιμοποιούν κυτταρικές σειρές που έχουν τροποποιηθεί γενετικά για να υπερεκφράζει λεμφικό παράγοντα ανάπτυξης [4-12]. Αν και η αξιολόγηση των γενετικά τροποποιημένων κυτταρικών σειρών έχει παράσχει πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με το ρόλο των λεμφαγγείων εξυπηρετούν σε όγκους, δεν έχουν ρίξει φως σχετικά με τους ακριβείς μηχανισμούς με τους οποίους τα καρκινικά κύτταρα επάγει το σχηματισμό των λεμφαγγείων. Η καλύτερη κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που ελέγχουν λεμφαγγειογένεση όγκου είναι απαραίτητη προκειμένου να αναπτυχθούν θεραπείες που θα μπορούσαν δυνητικά να εμποδίσει την διάδοση του καρκίνου και τη βελτίωση της κλινικής έκβασης ασθενών με νόσο πρώιμο στάδιο. Ως εκ τούτου, στόχος μας ήταν να προσδιορίσει ένα πάνελ των κυτταρικών σειρών που προκαλούν λεμφαγγειογένεση και να χρησιμοποιούν τα δεδομένα της έκφρασης mRNA του γονιδιώματος σε επίπεδο για τον προσδιορισμό των μοριακών μηχανισμών που διέπουν λεμφαγγειογένεση όγκου σε NSCLC.

Αποτελέσματα

Αναγνώριση lymphangiogenic και μη lymphangiogenic κυτταρικές γραμμές NSCLC

Για τον εντοπισμό κυτταρικών σειρών NSCLC που επάγουν λεμφαγγειογένεσης, έχουμε βάφονται ένα πάνελ 13 NSCLC δειγμάτων ξενομοσχεύματος όγκου από προηγούμενα πειράματα σε ζώα με αντισώματα έναντι LYVE-1 και podoplanin (Σχήμα 1). Αυτές είναι δύο συνήθως αξιολόγηση των δεικτών λεμφικά ενδοθηλιακά κύτταρα. Ένα αντίσωμα έναντι ακτίνη των λείων μυών (SMA) συμπεριλήφθηκε στο λεκέ podoplanin για να βοηθήσει στη διάκριση podoplanin θετικά λεμφαγγείων (podoplanin +? SMA-) από podoplanin θετικά ινοβλάστες (podoplanin +? SMA +). Η έκταση της λεμφαγγειογένεσης ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση του αριθμού των ενδοογκική λεμφαγγείων ανά μικροσκοπικό πεδίο και οι όγκοι είχαν ταξινομηθεί ως lymphangiogenic εάν περιείχε περισσότερα από 5 σκάφη λεμφικό ανά μικροσκοπικό πεδίο ή μη lymphangiogenic αν εντελώς έλειπε ενδοογκική λεμφαγγείων. Μέσω αυτής της ανάλυσης, ήμασταν σε θέση να προσδιορίσει μια ομάδα lymphangiogenic (Calu-1, H1993, HCC461, HCC827, και H2122) και μη-lymphangiogenic κυτταρικές σειρές NSCLC (Calu-3, H1155, H1975 και H2073) (Εικόνα 1) .

(Α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες ξενομοσχευμάτων όγκου πνεύμονα χρωματίστηκαν με αντίσωμα έναντι LYVE-1 (κόκκινο) (Β) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του ξενομοσχευμάτων όγκου πνεύμονα χρωματίστηκαν με αντισώματα έναντι podoplanin (πράσινο) και λείου μυός ακτίνη (SMA , κόκκινο). (C) Γράφημα εντός του όγκου του λεμφικού πυκνότητα σκάφους για podoplanin και LYVE-1 θετική λεμφαγγείων στον NSCLC ξενομοσχεύματα αναπτύσσονται σε ποντίκια. Εμείς κατατάσσονται Calu-1, HCC827, HCC461, H1993, H2122 και τα κύτταρα ως lymphangiogenic και Calu-3, H1155, H1975, H2073 και ως μη-lymphangiogenic. Γράφημα δείχνει μέση τιμή ± SEM.

Η

VEGF-C ρυθμίζει λεμφαγγειογένεση από τα κύτταρα NSCLC

Μετά τον εντοπισμό lymphangiogenic και μη lymphangiogenic κυτταρικές σειρές NSCLC, προσπαθούμε να βρούμε τις διαφορές μεταξύ αυτών των δύο ομάδων . Βρήκαμε ότι δεν υπήρχε εμφανής διαφορά στον ρυθμό ανάπτυξης της lymphangiogenic και μη lymphangiogenic υποδόρια ξενομοσχεύματα (Σχήμα 2). Βρήκαμε επίσης ότι η ικανότητα ενός κυττάρου γραμμής να διεγείρει λεμφαγγειογένεση δεν σχετιζόταν με τον υπότυπο του ταξινόμηση (αδενοκαρκίνωμα, καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, ή μεγάλων κυττάρων), το σημείο της προέλευσης (πρωτογενούς όγκου έναντι μετάσταση) ή την κατάσταση μετάλλαξης (Πίνακες 1 και 2 ).

(Α) Διάγραμμα που δείχνει την ανάπτυξη της lymphangiogenic (Calu-1, HCC827, HCC461, H1993, H2122 και) όγκους. (Β) Διάγραμμα που δείχνει την ανάπτυξη του μη-lymphangiogenic (Calu-3, H1155, H1975, H2073 και) όγκους. Γράφημα δείχνει μέση τιμή ± SEM.

Η

Η

Στη συνέχεια, αναλύονται τα δεδομένα της έκφρασης mRNA του γονιδιώματος σε επίπεδο για τον εντοπισμό γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ lymphangiogenic (Calu-1, H1993, HCC461, HCC827 και H2122 ) και μη-lymphangiogenic (Calu-3, H1155, H1975, H2073 και) κύτταρα. Αυτή η ανάλυση δημιουργείται μια υπογραφή έκφραση 17-γονιδίου το οποίο διακρίνεται lymphangiogenic από μη lymphangiogenic κύτταρα NSCLC (Σχήμα 3). Ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας C (VEGF-C), ένα πρόσδεμα του υποδοχέα κινασών τυροσίνης VEGFR2 και VEGFR3, ήταν το μόνο γονίδιο σε αυτή την υπογραφή αναφερθεί ότι διεγείρει τη λεμφαγγειογένεση και ήταν περίπου 50 φορές υψηλότερη στην lymphangiogenic ομάδα από το μη-lymphangiogenic ομάδα . Επιβεβαιώσαμε ότι ο VEGF-C εκφράζεται σε υψηλότερο επίπεδο σε κύτταρα lymphangiogenic από μη lymphangiogenic κύτταρα με ποσοτική PCR (Σχήμα 3).

(Α) Αποτελέσματα Microarray δείχνει γονίδια εκφράζονται διαφορικά μεταξύ lymphangiogenic (Calu-1, HCC827, HCC461, H1993, H2122 και) και μη lymphangiogenic (Calu-3, H1155, H1975, H2073 και) κύτταρα. Αποτελέσματα (Β) Ποσοτική PCR που δείχνουν ότι ο VEGF-C εκφράζεται σε υψηλότερο επίπεδο σε lymphangiogenic από ότι σε μη-lymphangiogenic κυτταρικές γραμμές NSCLC. τιμές VEGF-C κανονικοποιούνται στο γονίδιο βασικών GAPDH. Οι τιμές για τις κυτταρικές γραμμές NSCLC κανονικοποιούνται σε αθανατοποιημένα ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κυτταρική γραμμή (HBEC3KT).

Η

Για να καθοριστεί εάν η έκφραση του VEGF-C ήταν επαρκής για να επάγει λεμφαγγειογένεση από κύτταρα NSCLC, εμείς γενετικά H1975 κύτταρα ώστε να εκφράζουν σταθερά είτε κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (RFP? H1975-Ctrl) ή πλήρους μήκους ανθρώπινο VEGF-C (H1975-VEGFC). Αντίστροφη μεταγραφή-PCR ανάλυση έδειξε ότι H1975-VEGFC κύτταρα εξέφρασαν υψηλά επίπεδα του VEGF-C (Σχήμα 4). Επιπλέον, η ποσοτική ανάλυση PCR έδειξε ότι το επίπεδο της VEGF-C mRNA είναι περίπου 3-φορές υψηλότερη σε H1975-VEGFC κύτταρα από H1993 κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Εμείς εγχέονται αυτά τα κύτταρα στα πλευρά του NOD ποντίκια /SCID και διαπίστωσαν ότι H1975-VEGFC όγκους αυξήθηκε ελαφρά ταχύτερα από H1975-Ctrl όγκους (Σχήμα 4). Η πυκνότητα των αιμοφόρων αγγείων εντός του όγκου δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ H1975-VEGFC όγκους (16,18 ± 1,998, η = 7) και οι όγκοι H1975-Ctrl (13,75 ± 1,263, η = 7? Σχήμα 4). Ωστόσο, η πυκνότητα του ενδοογκική λεμφαγγείων ήταν σημαντικά μεγαλύτερη στην H1975-VEGFC όγκους (11,83 ± 3,125, η = 7) από H1975-Ctrl όγκους (0,4286 ± 0,4286 N = 7? Σχήμα 4). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η αναγκαστική έκφραση του VEGF-C είναι επαρκής για να επάγει λεμφαγγειογένεση από μια κυτταρική γραμμή NSCLC.

(Α) RT-PCR αποτελέσματα δείχνουν ότι τα κύτταρα H1975-VEGFC, αλλά όχι τα κύτταρα H1975-Ctrl, εκφράζουν VEGF -ΝΤΟ. καμπύλες (Β) Η ανάπτυξη του όγκου για ποντίκια που ενέθηκαν υποδορίως είτε με H1975-Ctrl ή H1975-VEGFC κύτταρα. (C, D) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του H1975-Ctrl τομές όγκων και H1975-VEGFC βάφτηκαν με ένα αντι-αντίσωμα endomucin. (Ε) Ο αριθμός των αιμοφόρων αγγείων ανά μικροσκοπικό πεδίο δεν είναι σημαντικά διαφορετική μεταξύ H1975-Ctrl όγκων (13,75 ± 1.263, n = 7) και οι όγκοι H1975-VEGFC (16.18 ± 1.998, n = 7). (F, G) Εκπρόσωπος εικόνες της H1975-Ctrl και τα τμήματα του όγκου H1975-VEGFC βάφονται με ένα αντι-LYVE-1 αντίσωμα. (H) Υπάρχουν σημαντικά περισσότερο λεμφαγγείων ανά μικροσκοπικό πεδίο στην H1975-VEGFC όγκους (11,83 ± 3,125, η = 7) σε σχέση με H1975-Ctrl όγκους (0,4286 ± 0,4286 η = 7). **

P

& lt? 0.01

Η

Για να καθοριστεί εάν η έκφραση του VEGF-C που απαιτούνται για τα κύτταρα NSCLC να προκαλέσουν λεμφαγγειογένεση, είμαστε γενετικά H1993 κυττάρων ώστε να εκφράζουν σταθερά είτε πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη. (GFP? H1993-Ctrl) ή shRNA έναντι VEGF-C (H1993-shVEGFC). Αποτελεσματική knockdown του VEGF-C σε H1993-shVEGFC κύτταρα δείχθηκε με ποσοτική PCR (Σχήμα 5). Βρήκαμε ότι δεν υπήρχε καμία διαφορά στην ανάπτυξη μεταξύ H1993-shVEGFC και οι όγκοι H1993-Ctrl (Σχήμα 5) και ότι η πυκνότητα του εντός του όγκου αιμοφόρα αγγεία δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ H1993-shVEGFC όγκους (10.42 ± 1.182, n = 7) και H1993 -Ctrl όγκων (11,17 ± 0,7817, η = 6? Σχήμα 5). Ωστόσο, η πυκνότητα του ενδοογκική λεμφαγγείων ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε H1993-shVEGFC όγκων (0,61 ± 0,400, η ​​= 7) από H1993-Ctrl όγκους (27,61 ± 1,391, η = 6? Σχήμα 5). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ο VEGF-C είναι απαραίτητη για τα κύτταρα να επάγουν NSCLC λεμφαγγειογένεσης όγκου.

αποτελέσματα (A) qPCR δείχνοντας ότι H1993-shVEGFC κύτταρα εκφράζουν ένα χαμηλότερο επίπεδο του VEGF-C από τα κύτταρα H1993-Ctrl. καμπύλες (Β) Η ανάπτυξη του όγκου για ποντίκια που ενέθηκαν υποδορίως είτε με H1993-Ctrl ή H1993-shVEGFC κύτταρα. (C, D) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του H1993-Ctrl τομές όγκων και H1993-shVEGFC βάφτηκαν με ένα αντι-αντίσωμα endomucin. (Ε) Ο αριθμός των αιμοφόρων αγγείων ανά μικροσκοπικό πεδίο δεν είναι σημαντικά διαφορετική μεταξύ H1993-Ctrl όγκους (11.17 ± 0,7817, n = 6) και οι όγκοι H1993-shVEGFC (10.42 ± 1.182, n = 7). (F, G) Εκπρόσωπος εικόνες της H1993-Ctrl και τα τμήματα του όγκου H1993-shVEGFC βάφονται με ένα αντι-LYVE-1 αντίσωμα. (Η) Η πυκνότητα εντός του όγκου λεμφαγγείων είναι σημαντικά χαμηλότερη σε H1993-shVEGFC όγκους (0.61 ± 0.400, n = 7) από H1993-Ctrl όγκων (27,61 ± 1.391, n = 6). ****

P

& lt? 0.0001.

Η

Nintedanib αναστέλλει όγκου λεμφαγγειογένεση

Στη συνέχεια, προσπάθησαν να προσδιορίσουν κατά πόσον η αναστολή του VEGF-C /VEGFR3 άξονα σηματοδότησης με μια κλινικά σχετική ένωση θα μπορούσε να καταστείλει λεμφαγγειογένεση όγκου. Nintedanib είναι ένα μικρό μόριο αναστολέας που εμποδίζει όλα τα FGFRs (IC

50 = 37 – 108 nM), PDGFRs (IC

50 = 59-65 nM), και VEGFRs (IC

50 = 13-34 ηΜ ) με σύνδεση προς την θέση σύνδεσης ΑΤΡ στην περιοχή της κινάσης των υποδοχέων [13]. Nintedanib έχει προηγουμένως δειχθεί ότι αναστέλλουν την αγγειογένεση των όγκων και την ανάπτυξη σε αρκετά μοντέλα ποντικού [13, 14]. Επιπλέον, η συνδυαστική θεραπεία του nintedanib με docetaxel έχει αναφερθεί ότι παρατείνουν την επιβίωση του σταδίου III /IV ασθενείς με NSCLC προηγουμένως υποβληθεί σε θεραπεία με μια θεραπεία με βάση την πλατίνα [15]. Για να καθοριστεί εάν θα μπορούσε να μπλοκάρει nintedanib λεμφαγγειογένεσης όγκου, αναλύσαμε όγκους από μία προηγούμενη μελέτη η οποία αξιολόγησε την επίδραση της nintedanib στην ανάπτυξη των όγκων H1993 [14]. Βρήκαμε ότι η πυκνότητα του ενδοογκική λεμφαγγείων ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε nintedanib αγωγή H1993 όγκους (5,254 ± 2,745, η = 5) από όχημα σε επεξεργασία H1993 όγκων (22,19 ± 2,536, η = 6? Σχήμα 6). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι είναι nintedanib αποτελεσματικό στην αναστολή λεμφαγγειογένεσης όγκου.

(Α, Β) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του LYVE-1-χρωματισμένων τομών από H1993 όγκων από το όχημα και nintedanib ποντίκια με αγωγή. (Γ) Η πυκνότητα των λεμφαγγείων σε H1993 ξενομοσχεύματα είναι σημαντικά χαμηλότερη σε nintedanib ποντικούς που έλαβαν αγωγή (5,254 ± 2,745, η = 5) από ό, τι στα ποντίκια που έλαβαν φορέα (22,19 ± 2,536, η = 6). **

P

& lt? 0.01.

Η

VEGF-C αντιγράφων παραλλαγή αριθμός επηρεάζει την έκφραση VEGF-C

Τα καρκινικά κύτταρα υφίστανται συχνά γονιδιωματικές μεταβολές που έχουν ως αποτέλεσμα την ενίσχυση και τη διαγραφή των γονιδίων. Αυτές οι γονιδιωματικές αλλαγές μπορούν να επηρεάσουν την έκφραση των γονιδίων. Για να προσδιορίσετε αν το

VEGF-C

γονίδιο ενισχύεται ή διαγράφεται στον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων, αναλύσαμε SNP δεδομένων συστοιχία διαθέσιμα για κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα 59. Αυτό αποκάλυψε ότι το

VEGF-C

γονίδιο ενισχύθηκε στο 22% (13/59? Κυμαίνονται μεταξύ 3-5 αντίγραφα του

VEGFC

), υπάρχει ως 2 αντίγραφα σε 54% (32 /59) και να διαγραφεί στο 24% (14/59) από τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα που αναλύθηκαν (Σχήμα 7). Για να προσδιορίσετε αν οι αλλαγές στον αριθμό των αντιγράφων του

VEGF-C

γονίδιο επηρέασε την έκφραση του

VEGF-C

, αξιολογήσαμε μετατραπεί τιμές log μικροσυστοιχιών για

VEGF-C

σε αυτό το πάνελ των κυτταρικών γραμμών καρκίνου του πνεύμονα 59. Αυτό αποκάλυψε ότι το επίπεδο του

VEGF-C

ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε κύτταρα που είχαν διαγραφή (3.582 ± 0.3033) από το

-C VEGF

γονιδίου σε σύγκριση με κύτταρα που είχαν είτε 2 αντίγραφα (7.029 ± 0,5023) ή ενίσχυσης (8.742 ± 0.6856) του

VEGF-C

γονίδιο (Σχήμα 7). Αυτά τα στοιχεία δείχνουν ότι

VEGF-C

μεταβολής αριθμού αντιγράφων μπορεί να επηρεάσει το επίπεδο έκφρασης του

VEGF-C

.

(Α) Εικόνα που δείχνει

VEGFC

αντίγραφο παραλλαγή αριθμό για διαφορετικές κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα. Σειρές δείχνουν τα στοιχεία για τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα μεμονωμένα. Στήλες σηματοδοτούν διαφορετικές θέσεις κατά μήκος του

VEGFC

γονίδιο. ενισχύονται θέσεις κόκκινο χρώμα, τα διπλοειδή θέσεις χρώματος μαύρου, και διαγράφονται περιοχές χρώμα πράσινο ή λευκό. (Β) Διάγραμμα που δείχνει καταγραφής μετατραπεί

VEGF-C

επίπεδα mRNA από τα δεδομένα μικροσυστοιχιών για κυτταρικές σειρές που έχουν περισσότερα από 2 αντίγραφα (εύρος είναι μεταξύ 3-5 αντίγραφα του

VEGFC

), 2 αντίγραφα , ή λιγότερο από 2 αντίγραφα του

VEGFC

γονίδιο. Γράφημα δείχνει μέση τιμή ± SEM. ****

P

& lt? 0.0001

Η

Συζήτηση

Η μελέτη της μοριακής σχολιασμένη κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα έχει αυξηθεί η κατανόηση των οδών ογκογένεσης οδήγηση και έχει οδηγήσει στην ταυτοποίηση νέων βιολογικών δεικτών και θεραπευτικών στόχων για καρκίνο του πνεύμονα . Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιούμε ένα πάνελ μοριακά σχολιασμένη NSCLC κυτταρικές σειρές για τη διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών που ελέγχουν λεμφαγγειογένεση όγκου. Δείχνουμε ότι η έκφραση του VEGF-C ρυθμίζει λεμφαγγειογένεση όγκου από τα κύτταρα NSCLC και ότι η αναστολή του VEGF-C-επαγόμενη σηματοδότηση με nintedandinb μπορεί να εμποδίσει λεμφαγγειογένεση όγκου από τα κύτταρα NSCLC.

VEGF-C έχει αναδειχθεί ως κεντρικό πρόσωπο στο πεδίο έρευνας λεμφαγγειογένεσης. VEGF-C έχει αποδειχθεί ότι είναι επαρκής για να επάγει λεμφαγγειογένεση όγκου με μελάνωμα [16, 17], του καρκίνου του μαστού [4, 12, 18], ινοσάρκωμα [17], και τα κύτταρα γαστρικού καρκινώματος [19]. Επιπροσθέτως, η αναστολή της VEGF-C έχει αναφερθεί ότι καταστέλλει λεμφαγγειογένεση από προστάτη [20, 21], παγκρεατικό [22], του μαστού [23-25], γαστρικό [26], και καρκινικά κύτταρα πνεύμονα [27]. έκφραση VEGF-C έχει επίσης αναφερθεί ότι συσχετίζονται με λεμφική πυκνότητα αγγείου σε πολλά διαφορετικά ανθρώπινα νεοπλάσματα, συμπεριλαμβανομένων NSCLC [28-31]. Δείχνουμε ότι η έκφραση VEGF-C διακρίνει κυτταρικές γραμμές NSCLC που επάγουν λεμφαγγειογένεση από κυτταρικές γραμμές NSCLC που δεν επάγουν λεμφαγγειογένεση. Επιπλέον, δείχνουμε με υπερέκφραση και νοκ ντάουν πειράματα που VEGF-C ρυθμίζει λεμφαγγειογένεση όγκου από τα κύτταρα NSCLC. Τα ευρήματα αυτά καταδεικνύουν περαιτέρω τη σημασία του VEGF-C στην προώθηση λεμφαγγειογένεση όγκου και δείχνουν ότι είναι η κυρίαρχη κινητήρια δύναμη της λεμφαγγειογένεσης όγκου σε NSCLC.

Nintedanib είναι ένα μικρό αναστολέας της κινάσης της τυροσίνης μόριο που μπλοκάρει όλες FGF, PGDF, και υποδοχείς VEGF. Nintedanib είχε προηγουμένως δειχθεί ότι εμφανίζουν αντικαρκινικές επιδράσεις σε έναν αριθμό προκλινικά μοντέλα NSCLC και σε ασθενείς με NSCLC [14, 15]. Δείχνουμε ότι nintedanib μπορεί να μπλοκάρει λεμφαγγειογένεση όγκου σε ένα μοντέλο ποντικού NSCLC. Αν και δείχνουμε ότι nintedanib έχει αντι-lymphangiogenic δραστικότητα, η ένωση αυτή δεν έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ότι αναστέλλει λεμφαγγειογένεση όγκου σε ένα διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού παγκρεατικού όγκου νευροενδοκρινικών (ΡΝΕΤ) το οποίο γενετικά ώστε να υπερεκφράζουν VEGF-C [32]. Η έλλειψη ενός αντι-lymphangiogenic αποτέλεσμα με nintedanib στο

RIP1-TaG2? RIP1-Vegfc

διαγονιδιακά ποντίκια θα μπορούσε να είναι επειδή ένα εκτεταμένο δίκτυο των παράνομων λεμφαγγείων μπορεί να ήταν παρόντες στο πάγκρεας πριν από την έναρξη της θεραπείας. Έχει αναφερθεί ότι νεοσχηματισθείσα λεμφαγγείων μπορεί να παραμείνουν για μεγάλο χρονικό διάστημα μετά την αποχώρηση του VEGF-C ή στο πρόσωπο του αντι-lymphangiogenic θεραπεία [33]. Ως εκ τούτου, τυχόν λεμφαγγείων που σχηματίζεται στο

RIP1-TaG2? RIP1-Vegfc

διαγονιδιακά ποντίκια πριν από την έναρξη της θεραπείας, θα μπορούσε δυνητικά να είναι ανθεκτικά στις αντι-lymphangiogenic επιπτώσεις της nintedanib. Εναλλακτικά, η διαφορά μεταξύ των ευρημάτων μας και εκείνων του Bill et al., (2015) θα μπορούσε να είναι επειδή εξετάσαμε διαφορετικούς τύπους όγκων ή επειδή χρησιμοποιήσαμε ένα μη κατεργασμένου δείγματος κυτταρικής γραμμής και χρησιμοποίησαν ένα γενετικά μοντέλο για να υπερεκφράζουν VEGF-C.

Οι μοριακοί μηχανισμοί που ελέγχουν

VEGF-C

επίπεδα mRNA δεν είναι πλήρως κατανοητή. Δείχνουμε ότι οι αλλαγές στον αριθμό των αντιγράφων του

VEGF-C

γονίδιο επηρεάζει την έκφραση του

VEGF-C

. Βρήκαμε ότι οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα που έχουν χάσει ένα από τα αντίγραφά τους από το

VEGF-C

γονίδιο τείνουν να εκφράζουν ένα χαμηλό επίπεδο του

VEGF-C

. Ωστόσο, πρόσθετους μηχανισμούς πιθανό ελέγχουν επίσης την έκφραση του VEGF-C από τα κύτταρα NSCLC. Τα ΜΑΡΚ, mTOR, και NF-kB οδών σηματοδότησης έχουν όλες αναφερθεί ότι ελέγχουν την έκφραση VEGF-C από τα καρκινικά κύτταρα [34-37]. Αυτές οι οδοί μπορούν επίσης να διαδραματίσουν κάποιο ρόλο στον έλεγχο της έκφρασης του VEGF-C από τα κύτταρα NSCLC. Οι μελλοντικές μελέτες με πάνελ μας των κυτταρικών γραμμών θα βοηθήσει τον προσδιορισμό του δυναμικού ρόλου αυτών και άλλων οδών για τον έλεγχο της έκφρασης του VEGF-C από τα κύτταρα NSCLC.

Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης δείχνουν ότι η VEGF-C είναι ένα κρίσιμο ρυθμιστή της λεμφαγγειογένεσης όγκου σε NSCLC και δείχνουν ότι nintedanib αναστέλλει λεμφαγγειογένεση όγκου. Τα ευρήματα αυτά ρίχνουν φως στους μοριακούς μηχανισμούς που οδηγούν λεμφαγγειογένεση όγκου και έχουν τη δυνατότητα να επηρεάσουν το σχεδιασμό των μελλοντικών κλινικών δοκιμών με σκοπό την παρεμπόδιση της εξάπλωσης της πρώιμο στάδιο NSCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Τα πειράματα σε ζώα που περιγράφονται σε αυτό το χειρόγραφο διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο των ζώων (APN 2.013 με 0.121) που εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών ζωικά Φροντίδα και Χρήση (IACUC) του UT Southwestern Medical Center. Όλα τα ποντίκια σε αυτή τη μελέτη είχαν αγοραστεί από έναν προμηθευτή στις πανεπιστημιουπόλεις. Τα ποντίκια διατηρήθηκαν σε αεριζόμενα κλουβιά microisolater σε εγκατάσταση άνευ παθογόνου και σιτίστηκαν με πρότυπη ακτινοβοληθεί κατά βούληση διατροφή. Τα ποντίκια δόθηκαν nestlets και ιγκλού ως εμπλουτισμός στοιχεία. Τα ποντίκια παρακολουθήθηκαν για σημάδια δυσφορίας, όπως λήθαργος και αλλαγές στην εμφάνιση της γούνας. Εάν ποντίκια εμφανίστηκαν σοβαρά άρρωστος ή ετοιμοθάνατα, θα πρέπει να υποβάλλονται σε ευθανασία με υπερβολική δόση διοξειδίου του άνθρακα ακολουθούμενη από αυχενική εξάρθρωση. Δεν ποντίκια έγιναν σοβαρά άρρωστος ή πέθανε πριν από την πειραματική τελικό σημείο. Η μέθοδος της ευθανασίας για τα πειραματικά τελικά σημεία αποτελούνταν από ένα εισπνευστικό υπερβολική δόση διοξειδίου του άνθρακα ή ισοφλουράνιο ακολουθούμενη από αυχενική εξάρθρωση. Οι μέθοδοι αυτές είναι σύμφωνες με τις συστάσεις των American Veterinary Medical Association (AVMA) Κατευθυντήριες γραμμές σχετικά με την ευθανασία.

Οι κυτταρικές σειρές

Το ανθρώπινο βρογχικά επιθηλιακά κυτταρική σειρά (HBEC3KT) και το μεγαλύτερο μέρος του ανθρώπινου κυττάρου NSCLC γραμμές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη (H1993, HCC461, HCC827, H2122, H1155, H1975, H2073 και) ιδρύθηκαν στα εργαστήρια του Dr. Adi Gazdar και ο Δρ John Minna [38-40]. Οι κυτταρικές γραμμές NSCLC Calu-1 και Calu-3 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Οι κυτταρικές γραμμές NSCLC καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ + 10% FBS κάτω από κανονικές συνθήκες (5% CO

2 στους 37 ° C). Η κυτταρική γραμμή HBEC3KT καλλιεργήθηκε σε κερατινοκυττάρων μέσου χωρίς ορό που περιείχε 5 ng /mL του EGF και 50 μg /ml εκχυλίσματος βόειας υπόφυσης υπό κανονικές συνθήκες (5% CO

2 στους 37 ° C). Όλες οι κυτταρικές σειρές ήταν NSCLC DNA-δακτυλικά αποτυπώματα και μυκόπλασμα δοκιμασμένη

Ποσοτική PCR και RT-PCR

RNA απομονώθηκε από τις διάφορες κυτταρικές σειρές με ένα κιτ RNeasy μίνι (Qiagen, Cat ηο.: 74104) και cDNA δημιουργήθηκε με ένα κιτ iScript cDNA σύνθεσης (BioRad, cat Νο: 170 έως 8890). Gene-ειδικούς ανιχνευτές TaqMan χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των επιπέδων

VEGFC

(Applied Biosystems, Hs01099206_m1) και

GAPDH

(Applied Biosystems, Hs02758991_g1) και η συγκριτική

C

t μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των σχετικών επιπέδων έκφρασης mRNA. Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν σε αντιδράσεις RT-PCR για να ενισχύσουν

VEGF-C

(5′-GTTCGTACATGGCCGTCTGT-3 ‘και 5′-GGACCAAACAAGGAGCTGGA-3’) και

GAPDH

(5′- CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3 ‘και 5′-GTTAAAAGCAGCCCTGGTGA-3’).

Δημιουργία σταθερών κυτταρικών σειρών

Για να υπερεκφράζουν VEGF-C σε ένα μη-lymphangiogenic κυτταρική σειρά NSCLC, έχουμε μολυνθεί H1975 κυττάρων με εμπορικά διαθέσιμο λεντοϊού σωματίδια που περιέχουν ένα πλασμίδιο που εκφράζει πλήρους μήκους ανθρώπινο VEGF-C (Precision LentiORF VEGFC w /Stop κωδικονίου? Open Biosystems, cat Νο: OHS5899-202618255). Για να δημιουργήσει κύτταρα ελέγχου, που έχουν μολυνθεί H1975 κυττάρων με λεντοϊού σωματίδια που εκφράζουν RFP (Precision LentiORF RFP Θετικός μάρτυρας? Ανοικτό Biosystems, η γάτα δεν: OHS5833). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσα που περιέχουν βλαστισιδίνη (30 μg /ml) για αρκετές εβδομάδες για να επιλεγούν σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα.

Για να σταθερώς knockdown VEGF-C σε ένα lymphangiogenic κυτταρική γραμμή NSCLC, μολύναμε H1993 κυττάρων με εμπορικά διαθέσιμα λεντοϊού σωματίδια που εκφράζουν ένα shRNA στόχευση VEGF-C (TRCN0000425238? Sigma, cat όχι: SHCLNV-NM_005429). Για να δημιουργήσει κύτταρα ελέγχου, που έχουν μολυνθεί H1993 κυττάρων με λεντοϊού σωματίδια που εκφράζουν GFP (MISSION® TRC2 pLKO.5-puro-CMV-TurboGFP ™ Θετικός μάρτυρας Μεταγωγή Σωματίδια? Sigma, cat όχι: SHC203V). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσα που περιέχουν πουρομυκίνη (1 μg /ml) για αρκετές εβδομάδες για να επιλεγούν σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα.

Τα πειράματα σε ζώα

NOD /SCID ποντικοί έλαβαν υποδόρια ένεση από 1 εκατομμύριο H1975- Ctrl, H1975-VEGFC, H1993-Ctrl, ή H1993-shVEGFC κύτταρα. Οι ποντικοί ζυγίστηκαν και όγκοι μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα. Οι όγκοι των όγκων υπολογίστηκαν με τον τύπο

V = (α

2

xb) /2

, με

μια

και

β

που εκπροσωπούν τις μικρές και μεγάλες διαμέτρους όγκου, αντίστοιχα. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία πριν οι όγκοι τους έφθασαν 1.500 χιλιοστά

3 και οι ιστοί τους συλλέχθηκαν για ιστολογική ανάλυση

Αντισώματα

Τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοϊστοχημεία ή ανοσοφθορισμού χρώση των όγκων:. Κατσίκα αντι-LYVE-1 (R &? D Systems, cat ηο AF2125.), αντι-endomucin αρουραίου (Santa Cruz, cat Νο sc-65495.), Cy3-συζευγμένο αντι-λείου μυός ακτίνης (Sigma, cat Νο C6198.) , και χάμστερ αντι-podoplanin (Abcam, cat ηο. ab11936). Όλα τα δευτερογενή αντισώματα αγοράστηκαν από την Jackson ImmunoResearch.

ανοσοφθορισμού /ανοσοϊστοχημείας χρώση

Τα πλακίδια-παραφινοποιήθηκαν με ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν μέσα από μια φθίνουσα σειρά EtOH. Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη με 0.01 Μ κιτρικό οξύ (ρΗ 6.0) σε μια χύτρα ταχύτητας. Τα πλακίδια στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και αποκλείστηκαν για 1 ώρα με TBST + 20% Aquablock. Πρωτογενή αντισώματα αραιώθηκαν σε TBST + 5% BSA στη συνέχεια προστέθηκαν και αφέθηκαν να επωαστούν όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Τα πλακίδια πλύθηκαν με TBST κατόπιν προστέθηκαν και αφέθηκαν να επωαστούν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου δευτερεύοντα αντισώματα αραιωμένα σε TBST + 5% BSA. Διαφάνειες πλύθηκαν στη συνέχεια πάλι με TBST και καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν με παρατείνουν Χρυσό συν DAPI. Η ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα παρόμοιο πρωτόκολλο εκτός ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποκλείστηκε με επώαση πλακίδια με υπεροξείδιο του υδρογόνου αραιωμένο σε MeOH και το σήμα ανιχνεύθηκε μέσω του συστήματος χρωμογόνου DAB (Dako, cat ηο. K3468).

Ποσοτική ανάλυση του αίματος και του λεμφικού πλοία

Διαφάνειες αναλύθηκαν με μικροσκόπιο Nikon Eclipse E600 και εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό απεικόνισης NIS-Elements. Για την ανάλυση των αιμοφόρων αγγείων, 4 εικόνες λήφθηκαν από κάθε όγκο και ο αριθμός των σκαφών μετρήθηκε ανά μικροσκοπικό πεδίο. Να αναλύσει λεμφαγγείων, 3-5 φωτογραφίες τραβήχτηκαν από «καυτά σημεία» σε κάθε όγκου και τον αριθμό των σκαφών που μετρήθηκε ανά μικροσκοπικό πεδίο.

κατάσταση μετάλλαξης των κυτταρικών σειρών

Η κατάσταση μετάλλαξης των κυτταρικών σειρών προσδιορίστηκε από την ανάλυση των δεδομένων από δημοσιευμένες πηγές [38-42] και COSMIC (Sanger Institute, UK).

μικροσυστοιχιών ανάλυση

ποιότητας του RNA και η συγκέντρωση ελέγχθηκαν από το βιο Rad Experion Bioanalyzer σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. 500 ng ολικού RNA από κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκε για σήμανση των ανιχνευτών cRNA με κιτ Ambion Illumina TotalPrep RNA Amplification (Cat Νο: IL1791). 1.5 ug των ενισχυμένων και επισημασμένους ανιχνευτές cRNA υβριδίστηκε σε Illumina Human WG-6 Εκφραση v3.0 BeadChip (Cat Νο: BD-101 – 0203) επί μία νύκτα στους 58 ° C, μετά πλύθηκαν, δεσμεύτηκαν και ανιχνεύθηκαν με στρεπταβιδίνη Cy3 ανά κατασκευαστή πρωτόκολλο. Μετά την ξήρανση, τα τσιπ σαρώθηκαν από το σύστημα Illumina iScan. Ελήφθησαν δεδομένα χάντρα-επίπεδο, και προ-επεξεργασία χρησιμοποιώντας το mbcb πακέτο R για διόρθωση υποβάθρου και περιλήψεων καθετήρα (Ding et al, Ναοί Acids Res, 36: E58, 2008). Προ-επεξεργασία δεδομένων ήταν τότε quantile-κανονικοποιημένη και log-μετασχηματιστεί. αποτελέσματα μικροσυστοιχιών για τις κυτταρικές σειρές NSCLC είχαν δημοσιευθεί προηγουμένως [43] και αρχειοθετούνται στο Gene Expression Omnibus αποθετήριο (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/? GEO αριθμός ένταξης: GSE32036).

διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων μεταξύ δύο κατηγοριών δείγματα προσδιορίζεται με υπολογισμό φορές αλλαγή και T-test

P

τις αξίες και χρησιμοποιώντας αυθαίρετες αποκοπές για την επιλογή (π.χ. & gt? 4 φορές αλλαγή και

P

& lt ? 0,01). Λόγω του μικρού αριθμού των δειγμάτων σε κάθε τάξη, δεν είχαμε προσαρμόσει τα

P

τιμές με πολλαπλές διόρθωση δοκιμές.

συστοιχίες SNP

Ολόκληρο το γονιδίωμα πολυμορφισμού ενός νουκλεοτιδίου (SNP ) φάσμα χαρακτηριστικών έγινε με την Illumina Human1M-Duo DNA BeadChip Ανάλυση (Illumina, Inc.) [44]. Η επεξεργασία έγινε με Illumina BeadStudio και τον αριθμό αντιγράφων του DNA προέρχεται από το «Log R Λόγος», η οποία μετρά τη σχετική ένταση ανιχνευτή σε σύγκριση με το φυσιολογικό διπλοειδή ελέγχους

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism λογισμικό στατιστικής ανάλυσης (έκδοση 6.0). Όλα τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM. Για πειράματα με δύο ομάδες, Τ-τεστ unpaired σπουδαστή διεξήχθησαν για να δοκιμαστεί μέσα για την σημαντικότητα. Για πειράματα με περισσότερες από δύο ομάδες, οι διαφορές αξιολογήθηκαν με ANOVA ακολουθούμενο από το τεστ πολλαπλών συγκρίσεων του Tukey. Τα δεδομένα θεωρήθηκαν σημαντικές στο

P

& lt? 0.05.

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Rolf Brekken, καθώς και τα μέλη της JMST και TIG για τις χρήσιμες συζητήσεις και κριτική ανάγνωση του χειρογράφου.