Αφηρημένο

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι ένας από τους συχνότερους καρκίνους στις αναπτυγμένες χώρες και είναι το αποτέλεσμα των δύο περιβαλλοντικών και γενετικών παραγόντων. Πολλές από τις γενετικές αλλοιώσεις που παρατηρήθηκαν σε καρκίνο του παχέος εντέρου μεταβάλλει έκφραση των γονιδίων ομοιοακολουθίας, τα οποία κωδικοποιούν παράγοντες μεταγραφής ομοπεδίου. Η

MEIS1

γονίδιο ομοιοακολουθίας είναι γνωστό ότι εμπλέκεται σε διάφορες αιματολογικές κακοήθειες και συμπαγείς όγκους και πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι η έκφραση του

MEIS1

μεταγραφής μεταβάλλεται σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Παρά αυτό το δυναμικό σύνδεση, λίγα είναι γνωστά για τον ρόλο του γονιδίου στα έντερα. Εμείς ανιχνεύθηκαν δείγματα γαστρεντερικού ιστού ποντικού με ένα Ν-τερματικό αντίσωμα Meis1, αποκαλύπτοντας έκφραση δύο περιγράφηκε προηγουμένως ισομορφές, καθώς και δύο νέα προϊόντα Meis1. Ένα προϊόν 32 kD Meis1 εκφράστηκε στους πυρήνες των μη επιθηλιακών κυττάρων του στομάχου και του παχέος εντέρου, ενώ ένα προϊόν 27 kD εκφράστηκε στο κυτταρόπλασμα των επιθηλιακών κυττάρων στο εγγύς κόλον. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι οι 27 kD και 32 πρωτεΐνες kD Meis1 είναι και οι δύο μορφές της πρωτεΐνης Meis1d, ένα ομοπεδίου-λιγότερο ισομορφή του οποίου η μεταγραφή είχε προηγουμένως εντοπιστεί σε οθόνες cDNA. Τόσο το

MEIS1D

μεταγραφή και πρωτεΐνες εκφράστηκαν σε ανθρώπινο βλεννογόνο του παχέος εντέρου. Η έκφραση της πρωτεΐνης MEIS1D ήταν προς τα κάτω σε 83% (10/12) των πρωτογενών ορθοκολικών δειγμάτων καρκίνο σε σύγκριση με συμφωνημένα φυσιολογικό βλεννογόνο, υποδεικνύοντας ότι MEIS1D είναι ένας βιοδείκτης του παχέος ογκογένεσης. Η μειωμένη έκφραση του MEIS1D σε όγκους του παχέος εντέρου υποδεικνύει επίσης ότι αυτή η συντηρημένη ομοπεδίου-λιγότερο ισομορφή μπορεί να δρα ως καταστολέας όγκων σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Crist RC, Roth JJ, Waldman SA, Buchberg ΑΜ (2011) ένα διατηρημένο ιστο-ειδική ομοπεδίου-Λιγότερο ισομορφή MEIS1 ρυθμίζεται μειωτικά στον Καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 6 (8): e23665. doi: 10.1371 /journal.pone.0023665

Επιμέλεια: Sumitra Deb, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 20, 2011? Αποδεκτές: 22 Ιουλ, 2011? Δημοσιεύθηκε: 17 του Αυγ 2011

Copyright: © 2011 Crist et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας [Τ32-CA09678 σε RCC, Τ32-CA09683 να JJR] και το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία αυτού του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παχέος λογαριασμούς του καρκίνου για το 10% περίπου των δύο διαγνώσεις καρκίνου και θνησιμότητας στις Ηνωμένες Πολιτείες (www.cancer.org). Το ποσοστό θνησιμότητας μειώθηκε κατά τα δύο προηγούμενα χρόνια, αντανακλώντας κυρίως υψηλότερα επίπεδα συμμόρφωσης με τη συνιστώμενη κολονοσκόπηση προβολές, καθώς και τη βελτιωμένη αποτελεσματικότητα των θεραπευτικών επιλογών [1]? Ωστόσο, ορθοκολικό καρκίνο εξακολουθεί να έχει τη δεύτερη υψηλότερη συχνότητα θνησιμότητας στις Ηνωμένες Πολιτείες, σύροντας μόνο καρκίνο του πνεύμονα. Όπως και πολλοί τύποι καρκίνου, καρκίνου του παχέος εντέρου έχει τόσο περιβαλλοντικά όσο και γενετικές συνιστώσες [2], [3], [4]. Και οι δύο είναι σποραδικές και κληρονομικές μορφές της νόσου που συνδέεται με μία συσσώρευση πολλαπλών γενετικών βλαβών [5], [6], η οποία μπορεί να οδηγήσει σε μειωμένα επίπεδα απόπτωσης [7], η απώλεια της ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου [8], και συστατική ενεργοποίηση του η οδός

WNT

σηματοδότησης [9]. Ως ρυθμιστές του κατάντη μεταγραφικής ενεργοποίησης, παράγοντες μεταγραφής συχνά απορυθμίζεται σε καρκίνο του παχέος εντέρου [10], [11].

γονίδια κωδικοποιούν πρωτεΐνες ομοιοακολουθίας με τους τομείς δέσμευσης DNA είναι γνωστή ως homeodomains. Αυτές ομοπεδίου πρωτεΐνες δρουν ως παράγοντες μεταγραφής, πρόσδεσης περιοχές προαγωγού και ενεργοποίησης της μεταγραφής [12].

HOX

μέλη της οικογένειας γονιδίων είναι η πρωτότυπη γονίδια ομοιοκυτίου.

Οι ΗΟΧ

γονίδια που εμπλέκονται σε εμβρυϊκά κατάτμηση και σχηματοποίηση, καθώς και την ανάπτυξη πολλών συστημάτων οργάνων, συμπεριλαμβανομένης της γαστρεντερικής οδού [12]. Αναπτυξιακή γονίδια συχνά εκφράζονται κατά την διάρκεια εκτοπικά καρκινογένεση [13] και διάφορες

ΗΟΧ

γονίδια έχουν συνδεθεί με καρκίνο του παχέος εντέρου.

HOXB6

,

HOXB8

,

HOXC8

,

HOXC9

, και

HOXD13

υπερεκφράζονται στα δύο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές και τα πρωτογενή όγκων του παχέος εντέρου [14], [15], [16].

HOXB13

, ωστόσο, είναι συνήθως εκφράζεται σε κολονικό βλεννογόνο, αλλά ρυθμίζεται μειωτικά στον ιστό του όγκου [10]. Απορρύθμιση των μη

HOX

γονίδια ομοιοκυτίου έχει επίσης παρατηρηθεί σε ορθοκολικό καρκίνωμα.

CDX1

και

CDX2

είναι μειωτικά κατά τη διάρκεια του παχέος καρκινογένεση [17], [18], ενώ η παρεκκλίνουσα

PROX1

έκφραση στα αποτελέσματα του παχέος εντέρου σε αυξημένη δυσπλασία [19].

ομοπεδίου παράγοντες μεταγραφής συχνά δεσμεύουν περιοχές προαγωγού είτε ως ομοδιμερή ή ετεροδιμερή συμπλέγματα [20]. Αυτό διμερισμός παρέχει αυξημένη εξειδίκευση της μεταγραφικής ενεργοποίησης [21]. Η πρωτεΐνη MEIS1 ομοπεδίου είναι μία γνωστή εταίρος δέσμευσης αρκετών άλλων πρωτεϊνών ομοπεδίου, συμπεριλαμβανομένων HOXA7, HOXA9, και ΡΒΧ1 [22].

MEIS1

παίζει ένα ρόλο στην φυσιολογική ανάπτυξη του αιμοποιητικής γραμμής και υπερεκφράζεται σε ένα υποσύνολο της οξείας μυελοειδούς λευχαιμίας [23]. Αυξημένη

MEIS1

έκφρασης έχει επίσης παρατηρηθεί σε νευροβλάστωμα και το επίπεδο έκφρασης του

MEIS1

μεταγραφή είναι ένας προγνωστικός δείκτης για τον καρκίνο του μαστού [24]. Προς τα κάτω ρύθμιση του συνόλου των

MEIS1

μεταγραφή παρατηρήθηκε σε αδενώματα του παχέος εντέρου, γεγονός που υποδηλώνει ένα ρόλο για

MEIS1

στην εντερική ογκογένεση [25].

Λόγω των δεσμών μεταξύ των γονιδίων και του παχέος ομοιοκυτίου καρκίνο, εξετάσαμε την κατάσταση του Meis1 στο παχύ έντερο. Σε αυτή τη μελέτη, περιγράφουμε δύο νέα προϊόντα Meis1 εκφράζεται στο μυϊκό γαστρεντερική οδό. Αυτές οι δύο πρωτεΐνες εκφράζονται σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων και υποκυτταρικά διαμερίσματα. Και οι δύο πρωτεΐνες μεταφράζεται από το

Meis1d

μεταγραφή, μια παραλλαγή ματίσματος ομοπεδίου-λιγότερο από

Meis1

.

MEIS1D

, το ανθρώπινο ομόλογο του

Meis1d

, ταυτοποιήθηκε σε φυσιολογικό ιστό ανθρώπινου κόλον τόσο σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης. Επιπλέον, παρατηρούμε την προς τα κάτω ρύθμιση του

MEIS1D

έκφραση στην ανθρώπινη παχέος εντέρου. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το

MEIS1D

είναι ένα μυθιστόρημα καταστολέας του παχέος ογκογένεσης και ένα πιθανό θεραπευτικό στόχο για τον καρκίνο του παχέος εντέρου.

Υλικά και Μέθοδοι

αποικία Ποντίκι

C57BL /6J (Β6) ποντίκια ελήφθησαν από το εργαστήριο Jackson (Bar Harbor, ΜΕ). Τα ποντίκια διατηρήθηκαν στο AALAC διαπιστευμένο εγκατάσταση ζώων TJU. Η μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Το πρωτόκολλο, 343C, εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση Πανεπιστήμιο Τόμας Τζέφερσον, ο αριθμός αδείας A3085-01.

ρετροϊική μόλυνση

κύτταρα HCT116 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Cat. Νο CCL-247), όπου η ταυτότητα της κυτταρικής γραμμής επιβεβαιώθηκε με ανάλυση STR. MSCV-

Meis1d

και MSCV-

Νέο

πλασμίδια επιμολύνθηκαν σε κύτταρα χρησιμοποιώντας το Φοίνιξ profection κιτ φωσφορικού ασβεστίου (Promega, Madison, WI). Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες για να παράγει ιικό media. Viral μέσων προστέθηκε σε κύτταρα HCT116 σε έξι φρεατίων και περιστράφηκε σε 1800 rpm για 45 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν στους 32 ° C για 3 ώρες, το ιικό μέσο απομακρύνθηκε και προστέθηκε νέο ιικό μέσων. Τα κύτταρα περιστράφηκαν πάλι στις 1800 rpm για 45 λεπτά και επωάζονται στους 32 ° C για 3 επιπλέον ώρες. Viral μέσο αντικαταστάθηκε με DMEM και τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε 37 ° C για 48-72 ώρες για να επιτραπεί η μετάφραση της εισαχθείσας αλληλουχίας.

Western ανάλυση κηλίδος

Β6 ποντίκια σε ηλικία των 120 ημερών υποβλήθηκαν σε ευθανασία με CO

2 ασφυξία ακολουθούμενη από αυχενική εξάρθρωση. Δείγματα ιστών και κυττάρων πλύθηκαν σε 1 χ PBS και ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης (50 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4? 150 mM NaCl? 2 mM EDTA? 10% γλυκερόλη? 1% Triton-X-100) με αναστολείς πρωτεάσης (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε ποσοτικά με τη χρήση Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). 20 μg από κάθε δείγμα διαχωρίζεται με SDS-PAGE (10% ακρυλαμίδιο) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε 1 χ TBST (20 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4? 150 mM NaCl? 0,05% Tween 20). Πρωτογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για όλη τη νύχτα στους 4 ° C: Meis1-Ν? Meis1d-C? GAPDH (Abcam, Cambridge, ΜΑ)? ακτίνης, ιστόνης Η1 και κυτοκερατίνη 18 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Χρένου δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση (Vector Laboratories, Berlingame, CA) χρησιμοποιήθηκε σε μια αραίωση 1:2500 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας SuperSignal χημειοφωταυγές υπόστρωμα (Thermo Scientific, Rockford, IL).

Υποκυτταρική κλασματοποίηση

Δείγματα ιστών και κυττάρων πλύθηκαν σε 1 χ PBS και ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης (10 mM Tris- HCl, ρΗ 7.4? 5 mM MgCl

2? 1 mM DTT? 1 mM PMSF) με αναστολείς πρωτεάσης (Roche Applied Science, Indianapolis, ΙΝ). Τα προϊόντα λύσης στη συνέχεια διέρχεται μέσω μιας βελόνας 25½g και φυγοκεντρήθηκε στα 600 χ g στους 4 ° C για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο σημάνθηκε το κυτταροπλασματικό κλάσμα. Το ίζημα επαναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης και επισημασμένο το πυρηνικό κλάσμα.

απομόνωση επιθηλιακό κύτταρο

Το εγγύς και άπω δείγματα κόλου κόπηκαν σε 1 mm πλάτος λωρίδες. Τα δείγματα επωάστηκαν σε 1 Χ PBS με 0,15% DTT επί 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με συνεχή ανάδευση με ράβδο ανάδευσης για να απομακρυνθεί βλέννα. Βλεννογόνου λωρίδες και ράβδο ανάδευσης πλύθηκαν σε 1 χ PBS και στη συνέχεια επωάστηκαν σε 1 × PBS με 1 mM EDTA, ρΗ 7,2 ανάδευση επί 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για να απομακρυνθεί επιθηλιακά κύτταρα. Το διάλυμα EDTA συλλέχθηκε και φυγοκεντρήθηκε στα 470 χ g για 5 λεπτά. Παραμένοντας ιστός επωάστηκε στο διάλυμα EDTA για την απομάκρυνση υπολειμμάτων των επιθηλιακών κυττάρων και στη συνέχεια ομογενοποιούνται σε ρυθμιστικό λύσης όπως περιγράφεται ανωτέρω. Η επιθηλιακή σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε RPMI 1640 και επωάστηκαν με κολλαγενάση (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) στους 50 μονάδες /mL για 30 λεπτά στους 37 ° C, στροβιλισμό ήπια κάθε πέντε λεπτά. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 200 χ g για 5 λεπτά. Το σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε 1 × PBS, φυγοκεντρήθηκαν ξανά, και επαναιωρήθηκαν σε RPMI. Το εναιώρημα των κυττάρων RPMI επικαλύφθηκε σε 50% μίγμα Percoll /PBS. Η κλίση Percoll φυγοκεντρήθηκε στα 470 χ g για 20 λεπτά. Τα επιθηλιακά κύτταρα ελήφθησαν από την κορυφή της κλίσης, αραιώνεται με RPMI, και φυγοκεντρήθηκαν στις 830 χ g για 5 λεπτά. Το κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε σε RPMI και φυγοκεντρήθηκαν πάλι στα 470 χ g για 5 λεπτά. Το τελικό κυτταρικό σφαιρίδιο ομογενοποιήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης δυτική κηλίδα χρησιμοποιώντας μια βελόνα 25½g.

RT-PCR

Τα δείγματα ιστού ομογενοποιήθηκαν σε 1 mL διαλύματος αντιδραστηρίου TRI (Ambion, Inc, Austin, ΤΧ) και φυγοκεντρήθηκε στα 12.000 χ g για 15 λεπτά στους 4 ° C. Προστέθηκαν 200 μλ χλωροφόρμιο. Τα δείγματα αναμίχθηκαν για 15 δευτερόλεπτα, επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 3 λεπτά, και φυγοκεντρήθηκε στα 12.000 χ g για 20 λεπτά στους 4 ° C. Η άνω στρώση αναμίχθηκε με 500 μι 2-προπανόλη, επωάζεται σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά, και φυγοκεντρήθηκε στα 12.000 χ g για 20 λεπτά στους 4 ° C. Το σφαιρίδιο του RNA πλύθηκε με 75% αιθανόλη και φυγοκεντρήθηκαν στα 7500 χ g για 5 λεπτά. Το RNA στη συνέχεια ξηραίνεται με αέρα και επαναιωρήθηκε σε DEPC-επεξεργασμένο νερό. SuperScript II ανάστροφης μεταγραφάσης (Invitrogen, Carlsbad, CA) χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή cDNA. Όλες οι μεταγραφές Meis1 ενισχύθηκαν σε ποντικού δείγματα, ενώ MEIS1D-ειδικών εκκινητών χρησιμοποιήθηκαν σε ανθρώπινα δείγματα.

Ανοσοϊστοχημεία

Οι ιστοί μονιμοποιήθηκαν σε Formalde-Fresh διάλυμα ρυθμισμένη φορμαλίνη 10% (Fisher Scientific) για όλη τη νύχτα στους 4 ° C και αποθηκεύτηκαν σε 70% EtOH. Σταθερή ιστοί εγκλείστηκαν σε παραφίνη και τους ιστούς κόπηκαν και τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες από τη Διευκόλυνση KCC Translational Research Core. Οι ιστοί αποπαραφινοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα, ρΗ 6,0 (Vector Laboratories, Berlingame, CA) και βάφτηκαν με Meis1-Ν αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Αντι-κουνελιού δευτερογενές αντίσωμα (Vector Laboratories, Burlingame, CA) χρησιμοποιήθηκε σε μια αραίωση 1:200 για 1 ώρα στους 37 ° C ακολουθούμενη από ABC Linker Kit (Vector Laboratories, Berlingame, CA) για 30 λεπτά στους 37 ° C. Τα δείγματα αναπτύχθηκαν με χρήση του υποστρώματος υπεροξειδάσης DAB Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Χρώση οπτικοποιήθηκε σε ένα μικροσκόπιο Nikon Eclipse E600 είτε 4 × ή 20 × μεγέθυνση.

Ηθική

Οι ασθενείς είχαν συναινέσει χρησιμοποιώντας μια γραπτή χειρουργική έντυπο συγκατάθεσης το οποίο αναφέρει τα απόβλητα από τη χειρουργική επέμβαση θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για ερευνητικούς σκοπούς. Όλα τα δείγματα λήφθηκαν σε Thomas Jefferson University Hospital. Ο Τόμας Τζέφερσον Πανεπιστήμιο Διοικητικό Institutional Review (IRB) εξαιρούνται αυτής της μελέτης από την αναθεώρηση, διότι θεωρείται ότι η μελέτη δεν αποτελεί ανθρώπινα υποκείμενα της έρευνας και παραιτήθηκε από την ανάγκη για συναίνεση, λόγω του γεγονότος ότι τα δείγματα που λαμβάνονται κωδικοποιήθηκαν για να καταργήσετε την αναγνώριση.

Αποτελέσματα

Δύο νέες ισομορφές Meis1 υπάρχουν στο μυϊκό γαστρεντερικό σωλήνα

Αν και αρνητική ρύθμιση του

MEIS1

στον ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου έχει πρόσφατα παρατηρηθεί, ο ρόλος του γονιδίου σε γαστρεντερική (GI) ομοιόσταση και ογκογένεση είναι ελάχιστα κατανοητή. Για να προσδιοριστεί η έκφραση των ισομορφών Meis1 ποντικού στον γαστρεντερικό σωλήνα, μια κηλίδα western πραγματοποιήθηκε σε C57BL /6J (Β6) λύματα GI χρησιμοποιώντας ένα πολυκλωνικό αντίσωμα που στοχεύει προς το Ν-άκρο της Meis1 (Meis1-N). Προϊόντα από 43 kD και 51 kD παρατηρήθηκαν στα περισσότερα δείγματα (Σχήμα 1α). Αυτά τα μοριακά βάρη αντιστοιχούν με τις γνωστές μεγέθη των δύο περιγράφηκε προηγουμένως ισομορφές, Meis1a και Meis1b, αντίστοιχα. Δύο επιπλέον ζώνες παρατηρήθηκαν σε μερικά από τα δείγματα: μία πρωτεΐνη ~32 kD που υπάρχει στο στομάχι και το παχύ έντερο και μία πρωτεΐνη ~27 kD που εκφράζεται στο εγγύς κόλον και το τυφλό έντερο (Σχήμα 1α). Το προϊόν ~27 kD είναι το ίδιο με το προβλεπόμενο βάρος για Meis1d, μια άλλη ισομορφή Meis1. Η μεταγραφή για

Meis1d

είχε προηγουμένως εντοπιστεί κατά τη διάρκεια οθόνες των cDNA ποντικού [26], [27]. Η ισομορφή στερείται όλα του εξονίου 8 με αποτέλεσμα ένα πρόωρο κωδικόνιο τερματισμού στο εξόνιο 9 και ένα θεωρητικό προϊόν κολοβωμένη πρωτεΐνη (Σχήμα 1γ, δ). Η ύπαρξη ενός

in vivo

προϊόν πρωτεΐνης, όμως, δεν έχει ποτέ επιβεβαιωθεί.

Α) ανάλυση Western blot της Β6 γαστρεντερικού λύματα χρησιμοποιώντας το Meis1-N αντίσωμα. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. PSI, MSI, και DSI υποδεικνύουν λύματα από το εγγύς, μέση και άπω λεπτό έντερο, αντίστοιχα. PC και DC υποδεικνύουν λύματα από το εγγύς και άπω παχύ έντερο. Β) Ενίσχυση του

Meis1

ισομορφές από Β6 εγγύς κόλον cDNA χρησιμοποιώντας RT-PCR. Τα διαγράμματα των C) μεταγραφές και Δ) τα προϊόντα των ισομορφών Meis1a, Meis1b και Meis1d περιλαμβάνονται. Οι θέσεις των δύο περιοχών Meinox (Μ1 και Μ2) και η ομοιοπεριοχή (HD) επισημαίνονται.

Η

Meis1d, μια κολοβωμένη Meis1 ισομορφή, εκφράζεται στο τυφλό έντερο ποντικού και εγγύς κόλον

Εάν το προϊόν 27 kD Meis1 είναι Meis1d, τότε το

Meis1d

μεταγραφή θα πρέπει να είναι ανιχνεύσιμη στο εγγύς παχέος εντέρου. Για να προσδιορίσετε αν το

Meis1d

μεταγραφή είναι παρούσα,

Meis1

παραλλαγές ματίσματος ενισχύθηκαν από Β6 δείγματα εγγύς cDNA του παχέος εντέρου με τη χρήση RT-PCR. Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν για να ενισχύσουν όλη εξόνιο 8, διακρίνοντας

Meis1d

από τις ισομορφές πλήρους μήκους,

Meis1a

και

Meis1b

. Η αντίδραση PCR ενισχυμένα προϊόντα από περίπου 758 και 904 bp σε μήκος, το προβλεπόμενο μέγεθος των προϊόντων που προέρχονται από

Meis1d

και

Meis1a /b

μεταγραφές (Σχήμα 1β). Η διαφορά μεγέθους μεταξύ των δύο προϊόντων αντιστοιχεί με το γνωστό μήκος του εξονίου 8 (146 bp), γεγονός που υποδηλώνει ότι το μικρότερο προϊόν λείπει αυτό το εξώνιο. Εκχύλιση και προσδιορισμός της αλληλουχίας του μικρότερου προϊόντος PCR επιβεβαίωσε την απουσία του εξωνίου 8 από το PCR προϊόν (τα δεδομένα δεν δείχνονται), καταδεικνύοντας την παρουσία του

Meis1d

μεταγραφής στο εγγύς κόλον ποντικού

Απομάκρυνση. του εξονίου 8 από το

Meis1d

μεταγραφής προκαλεί μια μετατόπιση πλαισίου στο εξόνιο 9. το αποτέλεσμα αυτής της μετατόπισης πλαισίου είναι η παραγωγή του προϊόντος κομμένης πρωτεΐνης με πέντε νέα αμινοξέα στο C-άκρο (Σχήμα 1δ). Δεδομένου ότι τα κατάλοιπα αυτά δεν υπάρχουν σε πλήρη ισομορφές Meis1 μήκους, ένα έθιμο αντίσωμα που στοχεύει το μοναδικό επιτόπιο (Meis1d-C) δημιουργήθηκε. Για να προσδιορίσετε αν το έθιμο αντίσωμα αναγνωρίζει το προϊόν ~27 kD Meis1, λύματα του παχέος εντέρου από Β6 ποντίκια ανιχνεύτηκαν με τις Meis1d-C και Meis1-Ν αντισώματα. Εγγύς κόλον και άπω κόλον προϊόντα λύσης χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι, αντίστοιχα. Όπως αναμενόταν, το Meis1-Ν αντίσωμα σήκωσε το προηγουμένως ταυτοποιηθεί ~27 μπάντα kD στο εγγύς κόλον, αλλά όχι το περιφερικό κόλον (Σχήμα 2α). Το ίδιο πρότυπο έκφρασης παρατηρήθηκε στα δείγματα ανιχνεύθηκαν με το αντίσωμα Meis1d-C, αποδεικνύοντας ότι το αντίσωμα Meis1d-C ανιχνεύει το προϊόν ~27 kD Meis1 και υποδεικνύει ότι το προϊόν είναι Meis1d (Σχήμα 2α). Για να προσδιοριστεί το πρότυπο χωρικής έκφρασης της πρωτεΐνης Meis1d, προϊόντα λύσης από ένα πάνελ οργάνων Β6 ανιχνεύθηκαν με το αντίσωμα Meis1d-C. Meis1d έκφραση περιορίστηκε στην τυφλό έντερο και εγγύς κόλον (Εικόνα 2b, c).

Α) ανάλυση κηλίδας Western των Β6 εγγύς και άπω κόλον κυτταρολύματα με τις Meis1-Ν και Meis1d-C αντισώματα. Οι θέσεις των Meis1, Meis1b, και τα δύο νέα προϊόντα Meis1 επισημανθεί. Β) και Γ) Κυτταρολύματα από ένα πάνελ οργάνων Β6 ανιχνεύθηκαν με το αντίσωμα Meis1d-C. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

μετα-μεταφραστική τροποποίηση του Meis1d συσχετίζεται με υποκυτταρική εντόπιση

έχουν ομοπεδίου-λιγότερο ισομορφές άλλων πρωτεϊνών ομοπεδίου δειχθεί ότι λειτουργεί μέσω δύο μηχανισμών. Οι ομοπεδίου-λιγότερο πρωτεΐνες μπορεί να απομονώσει ισομορφές πλήρους μήκους στο κυτταρόπλασμα μέσω της δεσπόζουσας αρνητικές αλληλεπιδράσεις. Ομοπεδίου-λιγότερο ισομορφές μπορούν επίσης να δράσουν ως πυρηνικοί εταίροι δέσμευσης για άλλους παράγοντες μεταγραφής, μεταβάλλοντας την ενεργοποίηση των κατάντη γονιδίων στόχων. Ως εκ τούτου, η υποκυτταρική εντόπιση του Meis1d μπορεί να υποδεικνύει ο λειτουργικός ρόλος της ισομορφής του παχέος εντέρου. Για να προσδιοριστεί η υποκυτταρική εντόπιση της Meis1d, Β6 εγγύς λύματα του παχέος εντέρου χωρίστηκαν σε πυρηνικά και κυτταροπλασματικά κλάσματα και ανιχνεύθηκαν με Meis1-Ν αντισώματος. Όπως ήταν αναμενόμενο, πλήρους μήκους Meis1 ήταν παρούσα στο πυρηνικό κλάσμα (Εικόνα 3α). Το προϊόν 32 kD Meis1 ήταν επίσης παρούσα στον πυρήνα. Η πρωτεΐνη 27 kD Meis1d, ωστόσο, παρατηρήθηκε μόνο στην κυτταροπλασματική κλάσμα (Εικόνα 3α). Αυτά τα δεδομένα εντοπισμού υποδεικνύουν ότι Meis1d δεν ενεργεί ως παράγοντας μεταγραφής ή απομόνωσης πλήρους μήκους Meis1 έξω από τον πυρήνα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ισομορφή έχει νέα κυτταροπλασματική λειτουργίες.

Α) Β6 εγγύς κόλον δείγματα διαχωρίστηκαν σε πυρηνικά και κυτταροπλασματικά κλάσματα και ανιχνεύθηκαν με το Meis1-Ν αντίσωμα. Ιστόνη Η1 χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει την υποκυτταρική κλασματοποίηση. ανάλυση Β) Western στύπωμα της Β6 εγγύς κόλον και κυττάρων HCT116 που εκφράζουν το Meis1d ORF χρησιμοποιώντας το Meis1-Ν αντίσωμα. C) κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν ρετροϊό μολύνθηκαν με το Meis1d ORF ή ένα άδειο φορέα MSCV. Τα κύτταρα ελήφθησαν 72 ώρες μετά τη μόλυνση, κλασματοποιημένο, και ανιχνεύθηκαν με το Meis1-Ν αντίσωμα. Οι θέσεις των Meis1a, πυρηνική Meis1d (Meis1d

32), και κυτταροπλασματική Meis1d (Meis1d

27) επισημαίνονται κατά περίπτωση.

Η

Για τη μελέτη των επιπτώσεων της

Meis1d

έκφραση

in vitro

, το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF) του

Meis1d

ήταν ρετροϊό μολυσμένα μέσα στην κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου HCT116. Η ανάλυση στυπώματος Western των προϊόντων λύσης κυττάρου αποκάλυψε την παρουσία μιας πρωτεΐνης kD 32 που ανιχνεύεται από τον Meis1-Ν αντίσωμα, αλλά όχι το αντίσωμα Meis1d-C (σχήμα 3β). Αυτή η

in vitro

Meis1d προϊόν είναι περίπου 5 kD μεγαλύτερο από το αναμενόμενο 27 kD πρωτεΐνη που προβλέπεται από την μεταγραφή Meis1d και παρατηρήθηκαν

in vivo

(σχήμα 3β). Ωστόσο, το μοριακό βάρος συμφωνεί με το νέο 32 kD ισομορφή Meis1 παρατηρηθεί προηγούμενα σε Β6 στομάχι και τα προϊόντα λύσης του κόλου (Σχήμα 1α). Το μοριακό βάρος του

in vitro

Meis1d επιβεβαιώθηκε τόσο ποντικού 3Τ3 και πιθήκου Cos-1 κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι η αύξηση του μεγέθους δεν είναι κυτταρική γραμμή ειδική (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μετα-μεταφραστική τροποποίηση των

in vitro

Meis1d προϊόν μπορεί να είναι η αιτία της αυξημένης μοριακού βάρους, καθώς και η αδυναμία του αντισώματος Meis1d-C για την ανίχνευση της πρωτεΐνης.

Σε αντίθεση με τις 27 kD Meis1d προϊόν, το 32 kD ισομορφή Meis1 είναι εντοπισμένη στον πυρήνα στο εγγύς κόλον. Για να προσδιοριστεί εάν

in vitro

Meis1d επίσης εντοπίζεται στον πυρήνα, τα κύτταρα HCT116 που εκφράζουν Meis1d κλασματοποιήθηκαν. Οι 32 kD

in vitro

Meis1d προϊόν ήταν παρούσα στις πυρηνικές λύματα, ανακεφαλαιώνοντας το

in vivo

υποκυτταρικός εντοπισμός του μυθιστορήματος 32 kD ισομορφή (Σχήμα 3γ). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι τόσο οι 27 kD και 32 kD Meis1 ισομορφών που παρατηρείται στον γαστρεντερικό σωλήνα ποντικών μεταφραστεί από το

Meis1d

μεταγραφή. Η κυτταροπλασματική μορφή (Meis1d

27) είναι το προβλεπόμενο μοριακό βάρος του Meis1d, ενώ το πυρηνικό μορφή (Meis1d

32) είναι μεγαλύτερη, πιθανότατα λόγω μετα-μεταφραστική τροποποίηση.

Πυρηνική και κυτταροπλασματική Meis1d είναι αλληλοαναιρούνται στο

κόλον

το κόλον αποτελείται από ένα μόνο στρώμα επιθηλιακών κυττάρων που καλύπτει την lamina propria και διάφορα μυϊκά στρώματα. Καρκίνο του παχέος εντέρου προέρχεται από βλαστικά κύτταρα που βρίσκονται στην επιθηλιακό στρώμα [28]. Για να προσδιοριστεί εάν είτε Meis1d

27 ή Meis1d

32 εκφράζονται στο κολονικό επιθήλιο, επιθηλιακά κύτταρα απομονώθηκαν από Β6 εγγύς και άπω δείγματα κόλου. Τα υλικά λύσεως από τα απομονωμένα επιθηλιακά κύτταρα και υμένα /μυϊκά στρώματα ανιχνεύθηκαν με Meis1-Ν αντίσωμα. Η Meis1d

27 πρωτεΐνη εκφράστηκε αποκλειστικά στα επιθηλιακά κύτταρα του εγγύς κόλον (Σχήμα 4α). Meis1d

32, ωστόσο, εκφράστηκε στα χορίου /μυός στρώματα τόσο από το εγγύς και άπω κόλον (Σχήμα 4α). Οι ισομορφές Meis1 πλήρους μήκους, Meis1a και Meis1b, ήταν επίσης παρόντες μόνο στα δείγματα propria /μυών ελάσματος (Σχήμα 4α). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα πυρηνικά και κυτταροπλασματικά μορφές Meis1d δεν υπάρχουν στα ίδια κυτταρικούς πληθυσμούς στο κόλον ποντικού. Επιπλέον, Meis1d

27 εκφράζεται σε επιθηλιακά κύτταρα του κόλου απουσία πλήρους μήκους Meis1. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η επιθηλιακή κυτταρική έκφραση του Meis1d

27, τα δείγματα κόλου Β6 βάφτηκαν με Meis1-Ν αντίσωμα. Ισχυρή κυτταροπλασματική χρώση παρατηρήθηκε στο επιθήλιο του εγγύς κόλον, αλλά όχι το περιφερικό κόλον (σχήμα 4β). Αυτό το πρότυπο έκφρασης ανακεφαλαιώνει την έκφραση Meis1d

27, υποδεικνύοντας και πάλι ότι Meis1d

27 είναι παρούσα στα επιθηλιακά κύτταρα του εγγύς κόλον.

Α) Β6 εγγύς και άπω κόλον δείγματα διαχωρίστηκαν σε επιθηλιακά και μη-επιθηλιακών κλάσματα. Τα μη επιθηλιακά κλάσματα αποτελούνται από τις lamina propria και μυϊκά στρώματα του παχέος εντέρου. Τα κλάσματα και προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου από τα δύο τμήματα του παχέος εντέρου ανιχνεύθηκαν με το Meis1-Ν αντίσωμα. Cos-1 κύτταρα που εκφράζουν Meis1d χρησιμοποιήθηκαν για να συγκρίνουν το

in vitro

και

in vivo

μοριακά βάρη Meis1d

32. Β) Β6 εγγύς και άπω δείγματα κόλου κηλιδώνονται με Meis1-Ν αντίσωμα. Χρώση οπτικοποιήθηκε σε 20 × μεγέθυνση.

Η

Η έκφραση της πρωτεΐνης MEIS1D ρυθμίζεται μειωτικά σε ανθρώπινους καρκίνους του παχέος

Meis1 είναι εξαιρετικά διατηρημένη σε ευκαρυωτικά και απομάκρυνση του εξονίου 8 από το mRNA ανθρώπινης MEIS1 θα κωδικοποιούν ένα προβλεπόμενο προϊόν πρωτείνη με 99% ομολογία σε μυϊκή Meis1d. Με βάση την εξελικτική διατήρηση του Meis1, επιχειρήσαμε να χαρακτηρίζουν την έκφραση του MEIS1D στο ανθρώπινο κόλον. Ένα στύπωμα western πραγματοποιήθηκε σε λύματα ανθρώπινου κόλον χρησιμοποιώντας την Meis1-Ν αντίσωμα. Μια μπάντα το προβλεπόμενο μέγεθος του MEIS1D

27 παρατηρήθηκε σε δείγματα ανθρώπινου κόλον (Σχήμα 5β). Για να επιβεβαιωθεί η έκφραση του μεταγράφου MEIS1D, RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε cDNA ανθρώπινου κόλον (Σχήμα 5α). Μία ζώνη 758 bp ενισχύθηκε, υποδεικνύοντας ότι

MEIS1D

mRNA μεταγράφεται στο ανθρώπινο κόλον.

Α) RT-PCR ενίσχυση του

MEIS1D

μεταγραφής από cDNA ανθρώπινου κόλον. Β) Ανάλυση στυπώματος Western των προϊόντων λύσης από ανθρώπινους ορθοκολικούς όγκους (Τ) και συμφωνημένα φυσιολογικού βλεννογόνου (Ν) με τη χρήση του Meis1-Ν αντίσωμα. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Δείγματα αντιπροσωπεύουν τα τέσσερα τμήματα του ανθρώπινου παχέος εντέρου:. Αύξουσα, εγκάρσια, φθίνουσα και σιγμοειδές

Η

Η έκφραση της πλήρους μήκους MEIS1 είναι γνωστό ότι απορυθμίζεται σε πολλές συμπαγείς όγκους [29], [30]. Για να προσδιορίσετε την κατάσταση της MEIS1 σε καρκίνο του παχέος εντέρου, κηλίδες Western πραγματοποιήθηκαν σε συμφωνημένα φυσιολογικό κόλον και λύματα πρωτοπαθή όγκο παχέος εντέρου με τη χρήση του Meis1-N αντίσωμα. MEIS1A και MEIS1B εκφράστηκαν τόσο όγκου και φυσιολογικών δειγμάτων, ενώ MEIS1D

32 δεν ήταν παρούσα σε οποιαδήποτε σειρά δειγμάτων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, 83% (10/12) των κανονικών δειγμάτων βλεννογόνου του παχέος εντέρου αποκωδικοποιούσε ανιχνεύσιμα επίπεδα MEIS1D

27 πρωτεΐνης (Σχήμα 5Β). Η έκφραση ήταν μειωμένη ή εντελώς χαθεί σε όλα τα αντίστοιχα δείγματα όγκου από αυτούς τους ασθενείς (Σχήμα 5β). Οι υπόλοιποι δύο ασθενείς εξέφρασαν ανιχνεύσιμα επίπεδα του MEIS1D

27 τόσο φυσιολογικό βλεννογόνο και ιστό του όγκου (Σχήμα 5β). Αυτές

in vivo

στοιχεία δείχνουν ότι MEIS1D

27 έκφραση ρυθμίζεται προς τα κάτω κατά τη διάρκεια του εντέρου ογκογένεσης.

Συζήτηση

Το εναλλακτικό μάτισμα είναι γνωστό ότι παράγουν δύο

Meis1

ισομορφές,

Meis1a

και

Meis1b

, τόσο στα ποντίκια όσο και στους ανθρώπους. Τόσο οι πρωτεΐνες Meis1a και Meis1b είναι πλήρους μήκους, που περιέχει τα δύο Meinox περιοχών που εμπλέκονται σε αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης και την ομοιοπεριοχή δέσμευσης DNA (Σχήμα 2d). Τα προϊόντα πρωτεΐνης αυτών των παραλλαγών ματίσματος διαφέρουν στο Ο-άκρο, λόγω της συνένωσης από εξωνίου 12 από το

Meis1b

κωδικοποίησης αλληλουχίας (Σχήμα 2c, d). Τα στοιχεία δείχνουν ότι οι δύο ισομορφές παρόμοια μπορεί να ενεργοποιήσει μεταγραφή διαφορετικά υποσύνολα γονιδίων [31]. Οθόνες βιβλιοθηκών cDNA δείχνουν ότι ένας μεγάλος αριθμός των συμπληρωματικών εναλλακτικά ματισμένων μεταγράφων παράγονται από το

Meis1

τόπο [26], [27], [32]. Σε αντίθεση με

Meis1a

και

Meis1b

, ωστόσο, πρωτεϊνών για άλλα

Meis1

μεταγραφές δεν έχουν παρατηρηθεί

in vivo

. Ως εκ τούτου, παραμένει ασαφές αν αυτές οι μεταγραφές είναι λειτουργικά σχετικές ή απλά αντικείμενα που δημιουργούνται από λανθασμένη εναλλακτικό μάτισμα.

Σε αυτό το έγγραφο, έχουμε περιγράψει δύο προϊόντα πρωτεΐνης του

Meis1d

παραλλαγή ματίσματος, μία ισομορφή προηγουμένως ταυτοποιηθεί σε οθόνες cDNA. Η

Meis1d

μεταγραφής στερείται το εξόνιο 8, με αποτέλεσμα μία προβλεπόμενη 27 κϋ πρωτεΐνη που στερείται του ομοπεδίου (Σχήμα 2c, d). Αυτό το προϊόν 27 kD παρατηρήθηκε στο κυτταρόπλασμα των επιθηλιακών εγγύς κόλον κυττάρων (σχήματα 3α, 4α). Μια δεύτερη, 32 kD Meis1d προϊόν εμφανίζεται στους πυρήνες των μη επιθηλιακών κυττάρων του στομάχου και του παχέος εντέρου (σχήματα 3α, 4α). Τα κυτταροπλασματικών και πυρηνικών μορφών Meis1d ονομαστεί Meis1d

27 και Meis1d

32, αντίστοιχα. Το μεγαλύτερο μοριακό βάρος και πυρηνικό εντοπισμό του Meis1d

32 πρωτεΐνης ανακεφαλαιώνονται σε κύτταρα επιμολυσμένα με το

Meis1d

ORF (σχήμα 3β). Έκφραση MEIS1D

27 σε δείγματα ανθρώπινου κόλον παρατηρήθηκε επίσης, καταδεικνύοντας εξελικτική διατήρηση αυτής της νέας ισομορφής (Σχήμα 5).

Meis1d

είναι μόλις η τρίτη

Meis1

ισομορφή για τα οποία μεταφράζονται πρωτεϊνικό προϊόν έχει επιβεβαιωθεί και είναι επίσης η πρώτη ομοπεδίου-λιγότερο Meis1 προϊόντος που παρατηρείται είτε σε ποντίκια ή ανθρώπινους ιστούς.

ομοπεδίου-λιγότερο ισομορφές έχουν περιγραφεί για πολλά γονίδια ομοιοακολουθίας, συμπεριλαμβανομένων αρκετών μελών της οικογένειας Ηοχ. Μόνο μερικές από αυτές τις ισομορφές, ωστόσο, έχουν ταυτοποιηθεί σε TALE υπεροικογένεια γονιδίων, μια ομάδα που περιλαμβάνει Meis1. Η απώλεια της ομοιοπεριοχή εμποδίζει την άμεση σύνδεση προς αλληλουχίες στόχους του DNA και κανονική μεταγραφική ενεργοποίηση. Ομοπεδίου-λιγότερο ισομορφές των παραγόντων μεταγραφής TALE, ωστόσο, έχουν προηγουμένως δειχθεί ότι ακόμη ρυθμίζει μεταγραφή μέσω δύο διακριτών μηχανισμών. Οι κολοβωμένες ισομορφές μπορούν να έχουν αρνητικές επιπτώσεις κυρίαρχη, απομόνωσης πρωτεΐνες πλήρους μήκους στο κυτταρόπλασμα και την πρόληψη μεταγραφική ενεργοποίηση των κατάντη στόχων [33], [34]. Οι ομοπεδίου-λιγότερο πρωτεΐνες μπορούν επίσης να αλληλεπιδράσουν με το DNA έμμεσα με σύνδεση άλλους παράγοντες μεταγραφής για να σχηματίσουν ετεροδιμερή. Η παρουσία των κομμένων πρωτεϊνών μεταβάλλει τη θέση δέσμευσης του DNA του συμπλόκου πρωτεΐνης, ενεργοποιώντας μια ξεχωριστή υποσύνολο των μεταγενέστερων στόχων [35].

Από ομοπεδίου-λιγότερο ισομορφές σχετικών γονιδίων έχουν διακριτούς μηχανισμούς στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα, οι υποκυτταρική εντοπισμοί των Meis1d και ενδεχόμενους εταίρους δέσμευσης μπορεί να προτείνει μια κυτταρική λειτουργία. Στην παρούσα μελέτη, Meis1d παρατηρήθηκε είτε ο πυρήνας ή κυτταρόπλασμα ανάλογα με τον τύπο κυττάρου. Meis1d

27 εκφράζεται στο κυτταρόπλασμα του εγγύς επιθηλιακών κυττάρων παχέως εντέρου (Σχήματα 3, 4). ισομορφές πλήρους μήκους είναι παρόντα στο πυρηνικό κλάσμα εγγύς προϊόντων λύσης του παχέος εντέρου, υποδεικνύοντας ότι Meis1d

27 δεν απομονώνουν άλλες ισομορφές Meis1 στο κυτταρόπλασμα (Σχήματα 3, 4). Περαιτέρω στοιχεία δείχνουν ότι Meis1d

27 δεν εκφράζεται στα ίδια κύτταρα όπως Meis1a ή Meis1b, αποτρέποντας κάθε είδους κυρίαρχων αρνητικών αλληλεπίδραση (Σχήμα 4). Η κυτταροπλασματική μορφή Meis1d μπορεί ακόμα να δεσμεύσει άλλους παράγοντες άγνωστο μεταγραφής και να αποτρέψει την πυρηνική εντόπιση. Η ισομορφή μπορεί επίσης να έχει μια νέα λειτουργία ομοπεδίου-ανεξάρτητο άσχετη με μεταγραφική ενεργοποίηση.

Η πιθανή λειτουργία των Meis1d

27 είναι ασαφής, επειδή τα δεδομένα δεν ταιριάζει ούτε γνωστός μηχανισμός ομοπεδίου-λιγότερο πρωτεΐνες ουράς. Η πρωτεΐνη δεν μπορεί να ενεργεί ως κυρίαρχο αρνητικό, δεδομένου ότι δεν εκφράζεται στα ίδια κύτταρα όπως άλλες ισομορφές Meis1. Meis1d

27 επίσης δεν μπορεί να ενεργοποιεί καθοδικά μεταγραφή στο εσωτερικό του πυρήνα, επειδή η πρωτεΐνη εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα. Η πυρηνική μορφή Meis1d, ωστόσο, μπορεί να εξακολουθεί να ταιριάζει είτε από τους μηχανισμούς αυτούς στο χορίο ή των μυών που περιβάλλουν το κόλον. Η πυρηνική εντόπιση του Meis1d

32 σημαίνει ότι η πρωτεΐνη θα μπορούσε να ενεργεί σαν ένα συνεταίρο δέσμευσης για άλλους παράγοντες μεταγραφής. Meis1d

32 εξακολουθεί να διατηρεί τα μοτίβα που απαιτούνται για την Pbx αλληλεπίδραση και ομοδιμερισμό [36]. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η κολοβωμένη ισομορφή θα μπορούσε να εξακολουθεί να λειτουργεί ως συν-παράγοντας με αυτές τις άλλες πρωτεΐνες ομοπεδίου. Η Meis1d

32 πρωτεΐνη μπορεί επίσης να ενεργεί ως κυρίαρχος αρνητικός ισομορφή στο εσωτερικό του πυρήνα, αποτρέποντας σύνδεση μεταξύ πρωτεϊνών Meis1 πλήρους μήκους και περιοχών προαγωγού στο DNA. Περαιτέρω ανατομή της propria ελάσματος και της υποκείμενης στιβάδας μυών είναι απαραίτητη για να προσδιοριστεί εάν Meis1d

32 και πιθανά εταίρων δέσμευσης που εκφράζεται με τον ίδιο πληθυσμό κυττάρων. Προσδιορισμός των λειτουργικών ρόλων τόσο για Meis1d

32 και Meis1d

27 θα βοηθήσει να εξηγήσει τη σημασία του

Meis1

splicing στην εντερική λειτουργία και την ομοιόσταση.

Παρά την έλλειψη ενός καθορισμένη λειτουργία